WO2012091091A1 - 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット - Google Patents

化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット Download PDF

Info

Publication number
WO2012091091A1
WO2012091091A1 PCT/JP2011/080386 JP2011080386W WO2012091091A1 WO 2012091091 A1 WO2012091091 A1 WO 2012091091A1 JP 2011080386 W JP2011080386 W JP 2011080386W WO 2012091091 A1 WO2012091091 A1 WO 2012091091A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
present
nucleic acid
independently
atomic
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/080386
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
岡本　晃充
修司 池田
Original Assignee
独立行政法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人理化学研究所 filed Critical 独立行政法人理化学研究所
Priority to US13/997,700 priority Critical patent/US9499576B2/en
Priority to JP2012551041A priority patent/JP5975524B2/ja
Priority to EP11854241.4A priority patent/EP2660246A4/en
Publication of WO2012091091A1 publication Critical patent/WO2012091091A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/04—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups one >CH- group, e.g. cyanines, isocyanines, pseudocyanines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines

Definitions

  • the present invention relates to a compound and a nucleic acid having a dye exhibiting an exciton effect, a method for producing a nucleic acid using this compound, and a kit for producing a nucleic acid.
  • Patent Document 1 describes a probe containing a compound having a structure derived from a mononucleoside or a mononucleotide. For example, two fluorescent molecules are bound to this compound. This probe is strained when not bound to DNA, etc., and the fluorescence is extremely weak due to quenching caused by exciton coupling. However, when the probe is hybridized with DNA or RNA, the structure strain is eliminated. Immobilized and exhibits strong fluorescence.
  • Patent Document 1 As a method for producing a nucleic acid probe, as described in Patent Document 1, a method of synthesizing by a phosphoramidite method using a nucleoside phosphoramidite body is known.
  • Patent Document 1 as a method for producing a nucleic acid probe for detecting a nucleic acid using the exciton effect, first, a nucleoside phosphoramidite body containing no fluorescent molecule is synthesized, and a DNA oligomer is synthesized using this nucleoside phosphoramidite body. A method of introducing a fluorescent molecule after creation is described.
  • this method requires a two-step synthesis process, that is, a DNA oligomer synthesis process and a synthesis process for introducing fluorescent molecules, and further requires a purification process for each synthesis process. Further, when the introduction efficiency of the fluorescent molecule is not 100%, an incomplete nucleic acid probe in which only one fluorescent molecule is introduced may be created.
  • the fluorescent molecule is introduced after the DNA oligomer is synthesized, it is difficult to introduce different types of dyes (fluorescent molecules) at different positions of the DNA oligomer.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is to provide a compound capable of easily producing a nucleic acid having a dye exhibiting an exciton effect, as well as a nucleic acid and a nucleic acid. And a kit for producing a nucleic acid.
  • the present inventors paid attention to a method of synthesizing oligonucleic acid using a phosphoramidite compound having a dye in order to facilitate the production of a nucleic acid having a dye exhibiting an exciton effect.
  • a molecule having a charge (positive charge) considered to be related to the exertion of the exciton effect is generally used as a dye exhibiting the exciton effect.
  • the present inventors tried to synthesize nucleic acids using molecules having such conventional dyes, but there were cases where the synthesis efficiency was not sufficient.
  • the present inventors have tried to synthesize nucleic acids using a phosphoramidite compound having a dye using a dye having no charge, and found that the synthesis can be performed with sufficient synthesis efficiency. That is, the present inventors have found that this phosphoramidite compound can be used for nucleic acid synthesis as a nucleoside substrate. Moreover, it discovered that the nucleic acid manufactured using this phosphoramidite compound can exhibit an exciton effect.
  • the compound according to the present invention is represented by the following formula (1), (2) or (3).
  • G is a phosphoramidite group or a hydroxyl group represented by the following formula (33),
  • B is an atomic group having a base skeleton
  • E is a deoxyribose skeleton or an atomic group having a ribose skeleton or a derivative thereof
  • Z 11 and Z 12 are atomic groups having fluorescence independently and exhibiting an exciton effect, and are atomic groups having no charge, and Z 11 and Z 12 are the same.
  • X is a hydrogen atom, a protective group for a hydroxyl group that can be deprotected by an acid, a phosphate group, a diphosphate group, or a triphosphate group;
  • R 41 is a protecting group for a phosphate group;
  • R 42 and R 43 are each independently an alkyl group or an aryl group,
  • R 1 and R 2 are each independently a linker having a main chain, and atoms constituting the main chain may have a substituent,
  • R 3 may be a linker having a main chain or may not be present, and an atom constituting the main chain may have a substituent,
  • D may be CR 11 , N, P, P ⁇ O, B (boron atom) or SiR 11 , or may not be present, and
  • R 11 may be a hydrogen atom, an alkyl group or any substitution It can be a group, If R 3 is not present and D is present, D may be directly bonded to B; if R 3
  • the compound according to the present invention is not particularly limited to the more specific examples shown below, but in the above formulas (1) and (3), the atomic group represented by the following formula (1a) is represented by the following formula: (4) or (5) is an atomic group, and in the above formula (2), the atomic group represented by the following formula (2a) is an atom represented by the following formula (6) or (7) A group is preferred.
  • A is a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, or an electron withdrawing group
  • M and J are each independently CH 2 , NH, O or S.
  • the main chain of R 1 , R 2 and R 3 is independently composed of two or more atoms, although not particularly limited to the more specific examples shown below. Preferably it is.
  • the compound according to the present invention is not particularly limited to the more specific examples shown below, but is preferably represented by the following formula (8), (9), (10) or (11).
  • l, m and n are each independently a positive integer; R 4 may be a single bond, a double bond or a triple bond, or may not be present.
  • the compounds according to the present invention in particular, but not limited to the specific examples from below, l, m and n are each 2, R 4 is preferably a double bond.
  • Z 11 and Z 12 are each independently represented by the following formula (12), (28) or (29). It is preferable that it is an atomic group.
  • X 1 and X 2 are each independently O, S, Se or Te; n is 0 or a positive integer; R 21 to R 30 , R 32 to R 34 , and R 51 to R 60 are each independently a hydrogen atom, a halogen, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a nitro group, or an amino group, and R 28 and R 29 may be bonded to each other, and R 58 and R 59, may be bonded to each other, R 31 is a bond that binds to R 1 or R 2 in the above formula (1), (2), or (3), or NH in the above formula (8), (9), (10), or (11). Group, When n is an integer of 2 or more, R 33 may be the same or different, and R 34 may be the same or different. ).
  • R 31 is a polymethylene having 2 or more carbon atoms.
  • R 41 is a cyanoethyl group
  • R 42 and R 43 are each an isopropyl group.
  • the method for producing a nucleic acid according to the present invention comprises a condensation reaction of an oligonucleic acid with any of the compounds described above, wherein G is a phosphoramidite group represented by the above formula (33).
  • the nucleic acid according to the present invention is characterized by including an atomic group represented by the following formula (25), (26) or (27) as a nucleotide moiety.
  • B is an atomic group having a base skeleton
  • E is a deoxyribose skeleton or an atomic group having a ribose skeleton or a derivative thereof
  • Z 11 and Z 12 are atomic groups having fluorescence independently and exhibiting an exciton effect, and are atomic groups having no charge, and Z 11 and Z 12 are the same.
  • R 1 and R 2 are each independently a linker having a main chain, and atoms constituting the main chain may have a substituent
  • R 3 may be a linker having a main chain or may not be present
  • an atom constituting the main chain may have a substituent
  • D may be CR 11 , N, P, P ⁇ O, B (boron atom) or SiR 11 , or may not be present
  • R 11 may be a hydrogen atom, an alkyl group or any substitution It can be a group, If R 3 is not present and D is present, D may be directly bonded to B; if R 3 is present and D is not present , R 1 and R 2 may be directly bonded to R 3, if R 3 and D is not present, R 1 and R 2 may be bonded directly to B, T is phosphoric acid crosslinking, and one or more oxygen atoms may be substituted with sulfur atoms during the phosphoric acid crosslinking. ).
  • nucleic acid according to the present invention is not particularly limited, but it is preferably produced by the above-described method for producing nucleic acid.
  • the kit for producing the nucleic acid according to the present invention includes any one of the compounds described above.
  • a nucleic acid probe having a dye exhibiting an exciton effect can be easily produced.
  • phosphoramidite compounds and “compounds” include tautomers and stereoisomers thereof, and salts thereof.
  • the compound according to the present invention is a phosphoramidite compound (hereinafter also referred to as “dye-containing phosphoramidite compound”) containing a dye exhibiting an exciton effect (fluorescent dye) or a synthetic intermediate thereof.
  • the compound according to the present invention is represented by the following formula (1), (2) or (3).
  • B is an atomic group having a base skeleton.
  • the atomic group having a base skeleton include an atomic group having a natural nucleobase (adenine, guanine, cytosine, thymine, or uracil) skeleton or an artificial nucleobase skeleton.
  • B is preferably a pyrimidine base having a skeleton represented by the following formula (14), a purine base having a skeleton represented by the following formula (15), or a derivative thereof.
  • the N atom at the 1-position has a covalent bond bonded to E in the above formulas (1) to (3), and any one of the atoms other than the N atom at the 1-position One may be linked (covalently bonded) to a linker (ie, R 1 , R 2 , R 3 or D) that leads to the dye (Z 11 or Z 12 ).
  • a linker ie, R 1 , R 2 , R 3 or D
  • At least one carbon atom among the atoms constituting the 6-membered ring may be substituted with an N, S or O atom, and at least one nitrogen atom is a C, S or O atom.
  • the N, C, S or O atom may have a charge, a hydrogen atom or a substituent.
  • the N atom at the 9th position has a covalent bond bonded to E in the above formulas (1) to (3), and is any atom other than the 9th N atom.
  • One may be linked (covalently bonded) to a linker (ie, R 1 , R 2 , R 3 or D) that leads to the dye (Z 11 or Z 12 ).
  • a linker ie, R 1 , R 2 , R 3 or D
  • At least one of the atoms constituting the 5-membered ring and the 6-membered ring may be substituted with an N, S or O atom.
  • at least one nitrogen atom may be substituted with a C, S or O atom, and the N, C, S or O atom may have a charge, a hydrogen atom or a substituent.
  • E is a deoxyribose skeleton or an atomic group having a ribose skeleton or a derivative thereof.
  • E is preferably an atomic group having a main chain structure of DNA, modified DNA, RNA, or modified RNA, because synthesis is easy.
  • the atomic group represented by the following formula (1a) is preferably an atomic group represented by the following formula (4) or (5).
  • A is a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an electron withdrawing group.
  • a methoxy group etc. are mentioned as an alkyl group or an alkoxy group.
  • Examples of the electron withdrawing group include halogen.
  • M and J are each independently CH 2 , NH, O or S.
  • the atomic group represented by the following formula (2a) is preferably an atomic group represented by the following formula (6) or (7).
  • A represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an electron withdrawing group.
  • a methoxy group etc. are mentioned as an alkyl group or an alkoxy group.
  • Examples of the electron withdrawing group include halogen.
  • M and J are each independently CH 2 , NH, O or S.
  • Z 11 and Z 12 are each independently an atomic group having fluorescence (hereinafter also referred to as “dye”) and exhibiting an exciton effect.
  • Z 11 and Z 12 are atomic groups having no charge.
  • Z 11 and Z 12 may be the same or different.
  • exciton effect (exciton coupling)” (also referred to as exciton coupling effect) means that Z 11 and Z 12 are assembled in parallel to each other, or Z 11 or Z 12 and other atomic groups Are gathered in parallel to form an H-aggregate. “Showing an exciton effect” means that fluorescence is emitted when no exciton effect occurs, and quenching occurs when an exciton effect occurs.
  • the exciton effect is such that the excited state of the atomic group represented by Z 11 and Z 12 is split into two energy levels by forming a D-association by forming an H-aggregate, and after being excited to an upper energy level, the lower energy level It is considered that this is caused by the internal conversion of the light and the light emission is thermally inhibited.
  • these descriptions do not limit the present invention.
  • “having no charge” means having no charge (positive charge or negative charge) in at least an aprotic solvent.
  • the dipole moment in the atomic group represented by Z 11 and Z 12 is small.
  • the atomic groups represented by Z 11 and Z 12 may be those having no charge in the aprotic solvent, and may be polarized and charged in the protic solvent.
  • the aprotic solvent refers to, for example, acetonitrile, N, N-dimethylformamide, and the like
  • the protic solvent refers to water or the like.
  • Z 11 and Z 12 may be, for example, each independently an atomic group represented by the following formula (12).
  • X 1 is O, S, Se or Te, and preferably O or S.
  • n is 0 or a positive integer. This n is preferably 5 or less, and in one example, is an integer of 0 to 2, preferably 0 or 1.
  • R 21 to R 30 and R 32 to R 34 are each independently a hydrogen atom, a halogen, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a nitro group or an amino group.
  • the lower alkyl group may be, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the lower alkoxy group may be, for example, a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 28 and R 29, may be bonded to each other. That is, R 28 and R 29 may be bonded to each other to form a cyclic structure, and examples of the cyclic structure include an aryl group. Moreover, this cyclic structure or aryl group may have a substituent.
  • R 31 is R 1 or R 2 in the above formula (1), (2) or (3), or the following formula (8), (9), (10) or (11) It is a linking group that binds to NH.
  • R 31 preferably has a main chain having 2 or more atoms.
  • the upper limit of the number of atoms constituting the main chain is not particularly limited, but is preferably 100 or less, more preferably 50 or less, still more preferably 30 or less, and particularly preferably 10 or less.
  • R 31 is preferably a polymethylene carbonyl group having 2 or more carbon atoms.
  • n is an integer of 2 or more
  • the plurality of R 33 may be the same or different
  • the plurality of R 34 may be the same or different. It may be.
  • Z 11 and Z 12 include dyes represented by the following formulas (17) to (20).
  • R 31 may be the same as those exemplified in the above formula (12).
  • Z 11 and Z 12 may be, for example, each independently an atomic group represented by the following formula (28) or (29).
  • R 21 to R 34 , X 1 and n may be the same as those exemplified in the above formula (12).
  • X 2 is O, S, Se or Te, and preferably O or S.
  • X 1 and X 2 may be the same or different.
  • R 51 to R 60 are each independently a hydrogen atom, a halogen, a lower alkyl group, a lower alkoxy group, a nitro group or an amino group.
  • the lower alkyl group may be, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the lower alkoxy group may be, for example, a linear or branched alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 58 and R 59 may be bonded to each other. That is, R 58 and R 59 may be bonded to each other to form a cyclic structure, and examples of the cyclic structure include an aryl group. Moreover, this cyclic structure or aryl group may have a substituent.
  • Z 11 and Z 12 may each independently be an atomic group represented by any one of the above formulas (12), (28), or (29).
  • X is a hydrogen atom, a hydroxyl protecting group which can be deprotected by an acid, a phosphate group, a diphosphate group, or a triphosphate group.
  • a hydroxyl-protecting group that can be deprotected by an acid include a dimethoxytrityl group (DMTr group).
  • G represents a phosphoramidite group or a hydroxyl group represented by the following formula (33).
  • R 41 is a protecting group of a phosphate group, for example, cyanoalkyl group. Of these, a cyanoethyl group is preferable.
  • R 42 and R 43 are each independently an alkyl group or an aryl group.
  • the alkyl group include an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an isopropyl group is particularly preferable.
  • the aryl group include an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, and among them, a phenyl group is preferable.
  • R 1 and R 2 are each independently a linker having a main chain.
  • the atoms constituting the main chain of R 1 and R 2 may have a substituent.
  • R 3 may be a linker having a main chain, but may not be present. When R 3 has a main chain, the atoms constituting the main chain may have a substituent.
  • the number of atoms constituting the main chain of R 1 and R 2 , and the main chain of R 3 when R 3 has a main chain is independently a positive integer. is there.
  • the number of main chain atoms of R 1 , R 2 and R 3 is preferably independently an integer of 2 or more.
  • the upper limit of the number of main chain atoms is not particularly limited, but is preferably 100 or less, more preferably 30 or less, and further preferably 10 or less.
  • Backbone having R 1, R 2 and R 3 are, C, N, O, S, may comprise at least one of P and Si, also a single bond, double bond, triple bond, an amide bond , At least one of an ester bond, a disulfide bond, an imino group, an ether bond, a thioether bond and a thioester bond.
  • R 1 , R 2 and R 3 may be the same as or different from each other.
  • D may be CR 11 , N, P, P ⁇ O, B (boron atom) or SiR 11 , and R 11 is a hydrogen atom, It may be an alkyl group or an arbitrary substituent. D may not be present.
  • D when R 3 is not present and D is present, D may be directly bonded to B. Further, when R 3 is present and D is not present, R 1 and R 2 may be directly bonded to R 3 . Further, when R 3 and D are not present, R 1 and R 2 may be directly bonded to B.
  • T is phosphoric acid crosslinking.
  • one or more oxygen atoms may be substituted with sulfur atoms.
  • the compound according to the present invention is preferably a compound represented by the following formula (8), (9), (10) or (11).
  • l, m and n are each independently a positive integer. It is preferable that l, m and n are each independently an integer of 2 or more. Moreover, although the upper limit of l, m, and n is not specifically limited, Preferably it is 100 or less, More preferably, it is 30 or less, More preferably, it is 10 or less. Here, the upper limit of l, m and n may be 5 or less or 4 or less.
  • R 4 may be a single bond, a double bond or a triple bond, or may not exist. Of these, a double bond is preferable.
  • the compound according to the present invention is preferably, for example, a compound represented by the following formula (16).
  • X, G, Z 11 and Z 12 may be the same as those exemplified in the above formulas (1) to (3).
  • A the same as those exemplified in the above formulas (4) to (7) can be used.
  • the compound according to the present invention in which G is a hydroxyl group, can be used as a synthetic intermediate for synthesizing a phosphoramidite body.
  • the compound according to the present invention wherein G is a phosphoramidite group represented by the above formula (33) (hereinafter also referred to as “phosphoramidite compound according to the present invention”), is a phosphoramidite method.
  • the nucleic acid synthesized using the phosphoramidite compound according to the present invention can be suitably used as, for example, a primer, a nucleic acid probe for detecting a nucleic acid, a labeling substance, and the like. That is, the compound according to the present invention can be used as a nucleic acid labeling reagent (nucleic acid labeling reagent).
  • the phosphoramidite compound according to the present invention can be produced by various routes. Hereinafter, examples of several routes for producing the phosphoramidite compound according to the present invention will be described, but the present invention is not particularly limited thereto.
  • the phosphoramidite compound according to the present invention adds a linker composed of R 1 , R 2 , D, R 3 and the like to a DMTr nucleoside, then adds dyes Z 11 and Z 12 , and then This may be produced by amidite formation (see formulas (1) to (3)). Further, after adding Z 11 and Z 12 to which a linker comprising R 1 , R 2 , D, R 3 and the like has been added in advance to the DMTr form of nucleoside, this may be amidated (formulas (1) to ( See 3)).
  • the phosphoramidite compound according to the present invention can be produced by synthesizing a synthetic intermediate represented by the following formula (21), (22) or (23) and then amidating it. .
  • Z 11 and Z 12 are dyes having no charge in an aprotic solvent
  • Z 12 have no charge in the aprotic solvent. Therefore, it is easy to amidite these synthetic intermediates in an aprotic solvent, and the phosphoramidite compound according to the present invention can be easily produced.
  • the type of aprotic solvent used as a solvent in the amidation is not particularly limited, and examples thereof include acetonitrile and N, N-dimethylformamide.
  • nucleic acid in the present specification means a polynucleotide, and includes DNA, RNA, and the like.
  • the nucleic acid includes an oligonucleic acid.
  • the nucleic acid may be single-stranded or double-stranded.
  • oligonucleic acid means an oligonucleotide and may be composed of one or more nucleotides.
  • the length of the nucleic acid according to the present invention is not particularly limited, but is preferably 10 bp to 10 kb, for example, and more preferably 10 bp to 1 kb.
  • the nucleic acid according to the present invention may be an oligonucleic acid, and the length thereof is not particularly limited, but is preferably, for example, 10 bp to 100 bp, more preferably 10 bp to 50 bp, more preferably 10 bp. More preferably, it is 30 bp or less.
  • the nucleic acid according to the present invention contains an atomic group represented by the following formula (25), (26) or (27) as a nucleotide moiety.
  • the nucleic acid according to the present invention only needs to contain at least one atomic group represented by the above formula (25) or (26) as a nucleotide moiety, but may contain two or more. Thereby, the nucleic acid according to the present invention includes one nucleotide portion having two dyes or two nucleotide portions having one dye in succession.
  • the nucleic acid according to the present invention preferably contains the atomic group represented by the above formula (27) as a nucleotide moiety together with another atomic group having a structure exhibiting an exciton effect.
  • This other atomic group may be an atomic group having any one of those exemplified as Z 11 and Z 12, for example.
  • the nucleic acid contains at least two atomic groups represented by the above formula (27) as nucleotide portions. These two atomic groups may be arranged in succession in the nucleic acid, or may be arranged across several nucleotides that do not contain other dyes. It is preferably arranged so as to exhibit the exciton effect.
  • the nucleic acid according to the present invention is preferably produced using the phosphoramidite compound according to the present invention.
  • the nucleic acid produced using the phosphoramidite compound according to the present invention contains a portion other than the phosphoramidite group in the phosphoramidite compound (hereinafter also referred to as “dye-containing nucleoside”) as a constituent element.
  • the nucleic acid according to the present invention contains a dye exhibiting an exciton effect, and can be suitably used as a probe (nucleic acid probe) for detecting the nucleic acid to be detected using this exciton effect.
  • the nucleic acid according to the present invention may constitute a part of such a probe.
  • the nucleic acid according to the present invention can also be suitably used as a labeling substance that utilizes the fluorescence emission of the dye contained therein.
  • a labeling substance used for tissue staining or the like may be used.
  • the nucleic acid according to the present invention can also be suitably used as a primer, for example, a primer for PCR.
  • the nucleic acid according to the present invention may be a primer, a probe, a labeling substance, or the like for use in research, clinical practice, diagnosis, in vitro gene detection, in vivo gene detection and the like.
  • the compound represented by the above formula (1) or (2) having two dyes At least one molecule may be used for nucleic acid synthesis.
  • the nucleic acid contains one molecule of a nucleoside having two dyes or two molecules of a nucleoside having one dye in succession.
  • the compound represented by the above formula (3) having one dye is used for nucleic acid synthesis together with other compounds having an atomic group exhibiting an exciton effect. It is preferable.
  • the other compound may be a compound having any one of those exemplified as Z 11 and Z 12, for example.
  • the nucleic acid may be synthesized using at least two molecules of the compound having one dye described above.
  • this nucleic acid probe contains at least two dyes exhibiting an exciton effect. When the nucleic acid probe is in a single-stranded state, these dyes associate with each other, thereby causing an exciton binding effect and quenching. On the other hand, when the nucleic acid probe is in a double-stranded state bound to the nucleic acid to be detected, these dyes intercalate or groove bind to the double-stranded nucleic acid to eliminate exciton coupling and to emit fluorescence. happenss. By detecting this fluorescence emission, the nucleic acid can be detected.
  • the nucleic acid according to the present invention may have at least two regions containing a nucleoside (pigment-containing nucleoside) derived from the phosphoramidite compound according to the present invention. These regions in one nucleic acid are configured so that the dye contained in the dye-containing nucleoside contained in one region does not exhibit an exciton effect with the dye contained in the dye-containing nucleoside contained in another region. Is preferred. Moreover, it is preferable that the pigment
  • the nucleic acid according to the present invention has a plurality of different dyes, when used as a nucleic acid probe, by simultaneously observing the light emission and quenching of each dye, which region of the nucleic acid probe is to be detected. It can be detected whether it is bound to a nucleic acid. That is, when only a part of the nucleic acid probe forms, for example, a double strand with the nucleic acid to be detected, it is possible to detect which sequence in the nucleic acid probe forms a double strand, etc. Become.
  • a dye-containing nucleoside having a red dye and a dye-containing nucleoside having a blue dye may be introduced into separate regions of the nucleic acid probe.
  • the region into which the dye-containing nucleoside having a blue dye is introduced is hybridized with the nucleic acid to be detected, but the red dye It can be seen that the region into which the dye-containing nucleoside having ⁇ is introduced is not hybridized with the nucleic acid to be detected.
  • the nucleic acid probe which can detect various nucleic acid structures can be manufactured.
  • the nucleic acid probe can be used for investigating the translocation of genes related to cancer, the splicing position of RNA, and the like, and can be suitably used for diagnosis of various diseases, elucidation of causes, and the like.
  • the nucleic acid according to the present invention is used as a probe for detecting hybridization with a complementary strand, it is preferably used in an environment having a pH of 10.5 or less from the viewpoint of obtaining stronger fluorescence intensity.
  • the following environment is more preferable, and an environment having a pH of 8 or less is more preferable. Note that background noise from a probe that is not hybridized under any conditions is sufficiently low.
  • the method for producing a nucleic acid according to the present invention includes a dye-containing nucleoside addition step (addition step) in which the phosphoramidite compound according to the present invention and an oligonucleic acid are subjected to a condensation reaction.
  • a dye-containing nucleoside addition step in which the phosphoramidite compound according to the present invention and an oligonucleic acid are subjected to a condensation reaction.
  • a nucleoside having an atomic group having fluorescence and exhibiting an exciton effect can be added to the oligonucleic acid.
  • the dye-containing nucleoside addition step is a step of subjecting the phosphoramidite compound according to the present invention, that is, the dye-containing phosphoramidite compound, to a condensation reaction with the 5'-hydroxyl of the nucleotide in the oligonucleic acid by the phosphoramidite method. Thereby, the dye-containing nucleoside is added to the oligonucleic acid, and the oligonucleic acid containing the dye-containing nucleoside is synthesized.
  • the dye-containing phosphoramidite compound and the oligonucleic acid are preferably reacted at room temperature for 2 to 20 minutes. About other reaction conditions, the normal conditions used in the phosphoramidite method can be used conveniently.
  • the method for producing a nucleic acid according to the present invention includes a step of obtaining a phosphoramidite compound by amidating a compound according to the present invention, wherein G is a hydroxyl group, prior to the dye-containing nucleoside addition step. May be.
  • the aforementioned dye-containing nucleoside addition step may be incorporated into a known nucleic acid production method.
  • the known nucleic acid production methods include, for example, a nucleoside addition step of adding a normal nucleoside substrate to an oligonucleic acid by a phosphoramidite method, and a deprotection step of deprotecting the oligonucleic acid synthesized by the nucleoside addition step.
  • a set including a purification step for purifying the oligonucleic acid deprotected by the deprotection step is repeated a predetermined number of times.
  • the method for producing a nucleic acid according to the present invention may be such that in this known nucleic acid production method, the nucleoside addition step in at least one set is replaced with the above-described dye-containing nucleoside addition step.
  • the present invention may be a known nucleic acid production method in which each of the nucleoside addition steps in a plurality of sets is replaced with a dye-containing nucleoside addition step.
  • a nucleic acid containing a plurality of dye-containing nucleosides derived from the compound according to the present invention can be produced.
  • the plurality of sets may be a set that is continuously performed or a set that is performed with one or more other sets interposed therebetween.
  • a nucleic acid having at least two regions containing a dye-containing nucleoside derived from the compound according to the present invention can be produced.
  • each of the dye-containing nucleoside addition steps may use phosphoramidite compounds having different dyes.
  • a plurality of different dyes can be introduced into one nucleic acid, that is, a nucleic acid having a plurality of different dyes can be produced.
  • These dye-containing nucleoside addition step, nucleoside addition step, deprotection step, and purification step can be performed by known methods, conditions, apparatuses, etc., for example, using a known automatic nucleic acid synthesizer. Therefore, a known nucleic acid synthesizer or the like can be used in the method for producing a nucleic acid according to the present invention.
  • the production method according to the present invention can be used to produce a nucleic acid containing a dye-containing nucleoside, that is, a nucleic acid according to the present invention.
  • the present invention does not require a two-step synthesis process of synthesis of a DNA oligomer and synthesis for introducing a dye, a nucleic acid having a dye exhibiting an exciton effect can be easily produced. Furthermore, since a nucleoside into which a dye has been introduced in advance is used for DNA synthesis, it is possible to avoid the possibility of synthesizing an incomplete nucleic acid into which a desired number of dyes have not been introduced.
  • the kit for producing the nucleic acid according to the present invention includes the above-described compound according to the present invention. Thereby, a nucleic acid can be easily manufactured by performing the nucleic acid manufacturing method described above using the phosphoramidite compound according to the present invention, that is, the dye-containing phosphoramidite compound.
  • the kit according to the present invention may contain a plurality of types of dye-containing phosphoramidite compounds each containing different types of dyes. Moreover, various nucleosides which do not contain a pigment may be further included. These nucleosides are preferably contained in an embodiment that can be suitably used for nucleic acid synthesis, for example, as a phosphoramidite.
  • the kit according to the present invention includes an apparatus for synthesizing nucleic acid, a reagent used for nucleic acid synthesis, a detection reagent for detecting nucleic acid using the produced nucleic acid, and a kit instruction manual (manufacturing nucleic acid using the kit). And the like) may be further included.
  • Example 1 Synthesis of fluorescent dye
  • the NHS active form of a fluorescent dye (fluorescent atomic group) represented by the following formula (24) was synthesized by the following reaction formulas (A) to (D). The specific method used is shown below.
  • the obtained powder was washed with 500 mM distilled water, the precipitate was filtered, further washed with distilled water, and then dried under reduced pressure. This powder was similarly washed with 500 mL of acetonitrile and dried under reduced pressure to obtain 8.31 g (15.7 mmol, 30%) of a red powder as a target compound.
  • the measurement data of the target compound is shown below.
  • the resulting red powder was mixed with 300 mL of methanol and mixed well. The precipitate was then filtered and dried under reduced pressure. Thereafter, 300 mL of dichloromethane was added to the obtained red powder, mixed well, and the supernatant was discarded by decantation. Thereafter, 300 mL of acetone was added, and the resulting precipitate was filtered and dried under reduced pressure to obtain 2.24 g (5.95 mmol, 51%) of a red powder as the target compound.
  • the measurement data of the target compound is shown below.
  • the solvent was evaporated by evaporation and purified using a silica gel column (5% MeOH, 1% Et 3 N / CH 2 Cl 2 ). The solvent was evaporated by evaporation, dissolved in a small amount of acetone, and then diethyl ether was added. The produced orange powder was filtered, washed with ether and dried to obtain 83 mg (FW 14445.75, yield 18%) as a target compound.
  • the measurement data of the target compound is shown below.
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • Example 3 DNA probe
  • a DNA probe (nucleic acid) containing a nucleoside having a fluorescent dye was synthesized. A specific method will be described below.
  • FIG. 1 is a diagram showing a mass spectrum of a DNA probe in one example of the present invention.
  • the calculated molecular weight of the DNA probe 5′-d (TTTTTTNTTTTT) -3 ′ is a calculated value of 4793.7, and the actually measured value is 4793.2. Met.
  • a DNA probe containing a fluorescent dye could be easily synthesized by using a nucleoside phosphoramidite having a fluorescent dye. That is, when a DNA probe is synthesized, a set composed of a nucleoside addition step, a deprotection step and a purification step is repeated in order to introduce a nucleoside, one of which is used with the compound according to the present invention. It was shown that a DNA probe containing a fluorescent dye can be easily produced by carrying out the process.
  • the compound according to the present invention already contains a fluorescent dye, and it is not necessary to introduce a fluorescent dye separately after DNA synthesis. Therefore, according to the present invention, it was shown that a DNA probe can be produced easily and with low labor.
  • Example 4 UV absorption spectrum measurement and fluorescence spectrum measurement using a DNA probe
  • UV absorption spectrum measurement and fluorescence spectrum measurement were performed.
  • Shimadzu UV-2550 (trade name) spectrophotometer manufactured by Shimadzu Corporation was used for UV absorption spectrum measurement
  • RF-5300PC trade name fluorescence spectrophotometer was used for fluorescence spectrum measurement.
  • the UV absorption spectrum measurement and the fluorescence spectrum measurement a sample having a DNA strand concentration of 0.4 ⁇ M, a phosphate buffer of 50 mM (pH 7.0), and NaCl of 100 mM was used.
  • the complementary strand 5′-d (AAAAAAAAAAAA) -3 ′ of the DNA probe is 0 ⁇ M (that is, only the DNA probe; the result is indicated by a in the figure) or 0.4 ⁇ M (the result in the figure is the result). Is indicated by b).
  • 488 nm (1.5 nm width) light was used as excitation light.
  • FIG. 2 is a diagram showing a UV absorption spectrum of a DNA probe in one example of the present invention
  • FIG. 3 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a DNA probe in one example of the present invention.
  • the DNA probe emits fluorescence by binding to complementary strand DNA. Therefore, it was shown that the DNA probe of this example has a clear fluorescence emission switching function.
  • Example 5 A DNA probe 5′-d (TACCANCCCAT) -3 ′ (N is a nucleoside having a fluorescent dye) was synthesized by the same method and conditions as in Example 3, and then purified. Next, using this DNA probe, UV absorption spectrum measurement and fluorescence spectrum measurement were performed under the same method and conditions as in Example 4.
  • FIG. 4 is a diagram showing a UV absorption spectrum of a DNA probe in another example of the present invention
  • FIG. 5 is a diagram showing a fluorescence spectrum of a DNA probe in another example of the present invention. 4 and 5, the result when the complementary strand of the DNA probe is not added to the sample is indicated by c, and the result when the complementary strand is added is indicated by d.
  • the DNA probe emits fluorescence by binding to complementary strand DNA. Therefore, it was shown that the DNA probe of this example has a clear fluorescence emission switching function.
  • Example 6 Synthesis of DMTr body of nucleoside having fluorescent dye
  • a nucleoside DMTr body having a fluorescent dye represented by the following formula (32) was synthesized by the following reaction formulas (H) to (J). Specifically, a nucleoside NHTr active DMTr body and a fluorescent dye were respectively synthesized, and then a nucleoside DMTr body having a fluorescent dye was synthesized. The specific method used is shown below.
  • nucleoside NHS active DMTr body represented by the following formula (30) was synthesized.
  • the target compound (593 mg, FW863.15, yield 28%) was obtained as an orange powder.
  • the measurement data of the target compound is shown below.
  • the solvent was removed by evaporation and separated on a silica gel column (7-15% MeOH, 1% Et 3 N / CH 2 Cl 2 ). Dissolved in a small amount of methanol, diethyl ether was added, and the precipitate was filtered and dried. The powder was washed with water, filtered and dried.
  • the target compound (256 mg, FW 14445.75, yield 25%) was obtained as an orange powder.
  • the measurement data of the target compound is shown below.
  • the DMTr nucleoside having a fluorescent dye synthesized by this method can be converted to a dye-containing phosphoramidite compound by amidation using the method described in 2-3 of Example 2.
  • the present invention can easily produce a nucleic acid having a dye exhibiting an exciton effect, it can be suitably used for production of a primer, a probe capable of effectively detecting a detection target, a labeling substance, and the like. . Therefore, the present invention can be suitably used for nucleic acids for a wide range of uses such as research, clinical, diagnostic, in vitro gene detection, and in vivo gene detection, and the production thereof.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

　下記式（１）、（２）または（３）で表されることを特徴とする、化合物。（上記式（１）、（２）および（３）中、Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団である。）

Description

化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット
　本発明は、エキシトン効果を示す色素を有する化合物および核酸、この化合物を用いた核酸の製造方法ならびに核酸を製造するためのキットに関する。
　核酸を検出する方法として、「エキシトン効果（励起子結合効果）」によって蛍光のｏｎ／ｏｆｆを制御可能なプローブを用いる方法がある。
　このようにエキシトン効果を利用して核酸を検出するためのプローブとして、特許文献１には、モノヌクレオシドまたはモノヌクレオチドから誘導される構造を有する化合物を含むプローブが記載されている。この化合物には、例えば２分子の蛍光性分子が結合している。このプローブは、ＤＮＡ等と結合していない状態では、構造がひずみ、エキシトンカップリングによる消光が引き起こされることにより蛍光が極めて弱いが、ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズした状態では、構造のひずみが解消・固定化され、強い蛍光発光を示すものである。
国際公開第２００８／１１１４８５号パンフレット（２００８年９月１８日公開）
　核酸プローブを製造する方法としては、特許文献１に記載されているように、ヌクレオシドホスホロアミダイト体を用いたホスホロアミダイト法により合成する方法が知られている。特許文献１には、エキシトン効果を利用して核酸を検出するための核酸プローブを製造する方法として、まず蛍光性分子を含まないヌクレオシドホスホロアミダイト体を合成し、これを使用してＤＮＡオリゴマーを作成した後に、蛍光性分子を導入する方法が記載されている。
　しかし、この方法では、ＤＮＡオリゴマーの合成工程と蛍光性分子を導入するための合成工程との２段階の合成工程が必要であり、それぞれの合成工程についてさらに精製工程が必要である。また、蛍光性分子の導入効率が１００％でない場合には、蛍光性分子が１分子のみ導入された不完全な核酸プローブが作成されてしまう可能性もある。
　また、従来の方法では、ＤＮＡオリゴマーを合成した後に蛍光性分子を導入するため、ＤＮＡオリゴマーの異なる位置にそれぞれ異なる種類の色素（蛍光性分子）を導入することが困難である。
　本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、エキシトン効果を示す色素を有する核酸の製造を容易に行なうことができる化合物を提供し、ならびに核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキットを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行ない、以下の点を見出すことにより本発明を完成させた。
　まず、本発明者らは、エキシトン効果を示す色素を有する核酸の製造を容易にするため、色素を有するホスホロアミダイト化合物を用いてオリゴ核酸を合成する方法に着目した。ここで、従来は、エキシトン効果を示す色素として、エキシトン効果の発揮に関わると考えられている電荷（正電荷）を持つ分子を用いるのが一般的である。本発明者らは、このような従来の色素を持つ分子を利用して、核酸の合成を試みたが、合成効率が十分ではない場合があった。
　また、エキシトン効果を示す色素として上記電荷を持つ分子を用いた場合、当該色素を組み込んだアミダイト体の前駆体（ＯＨ体）が製造できたとしても、この前駆体を効率よくアミダイト化することが出来なかった。
　そこで、本発明者らは、電荷を有さない色素を用いて、色素を有するホスホロアミダイト化合物を利用して核酸合成を試みたところ、充分な合成効率にて合成できることを見出した。すなわち、このホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオシド基質として用いて核酸の合成に供することができることを見出した。また、このホスホロアミダイト化合物を用いて製造した核酸がエキシトン効果を発揮できることを見出した。
　すなわち、本発明に係る化合物は、下記式（１）、（２）または（３）で表されることを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（上記式（１）、（２）および（３）中、
　Ｇは、下記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基または水酸基であり、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
　Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
　Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
　Ｘは、水素原子、酸により脱保護が可能な水酸基の保護基、リン酸基、二リン酸基、または三リン酸基であり、
　Ｒ４１はリン酸基の保護基であり、
　Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ独立してアルキル基またはアリール基であり、
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
　Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
　Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
　Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
　Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）
　また、本発明に係る化合物は、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、上記式（１）および（３）中、下記式（１ａ）で表される原子団が、下記式（４）または（５）で表される原子団であり、上記式（２）中、下記式（２ａ）で表される原子団が、下記式（６）または（７）で表される原子団であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（上記式（４）～（７）中、
　Ａは水素原子、水酸基、アルキル基、または電子吸引基であり、
　ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。）
　また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が有する主鎖は、それぞれ独立して２以上の原子により構成されていることが好ましい。
　また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、下記式（８）、（９）、（１０）または（１１）で表されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、
　ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して正の整数であり、
　Ｒ４は、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、または存在していなくてもよい。）
　また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ２であり、Ｒ４は、二重結合であることが好ましい。
　また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立して下記式（１２）、（２８）または（２９）で表される原子団であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（上記式（１２）、（２８）および（２９）中、
　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、
　ｎは、０または正の整数であり、
　Ｒ２１～Ｒ３０、Ｒ３２～Ｒ３４、Ｒ５１～Ｒ６０は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基であり、Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されていてもよく、Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されていてもよく、
　Ｒ３１は、上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合する連結基であり、
　ｎが２以上の整数である場合には、Ｒ３３は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ３４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）。
　また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、上記式（１２）、（２８）および（２９）中、Ｒ３１は、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分において上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合することが好ましい。
　また、本発明に係る化合物では、特に、以下に示すより具体的な例示に限定されないが、Ｒ４１がシアノエチル基であり、Ｒ４２およびＲ４３がそれぞれイソプロピル基であることが好ましい。
　本発明に係る核酸の製造方法は、上述したいずれかの化合物であって、Ｇが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物と、とオリゴ核酸とを縮合反応させることを特徴とする。
　本発明に係る核酸は、下記式（２５）、（２６）または（２７）で表される原子団をヌクレオチド部分として含むことを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（上記式（２５）、（２６）および（２７）中、
　Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
　Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
　Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
　Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
　Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
　Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
　Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）。
　また、本発明に係る核酸は、特に限定されないが、上述した核酸の製造方法により製造されたことが好ましい。
　本発明に係る核酸を製造するためのキットは、上述したいずれかの化合物を含むことを特徴とする。
　本発明に係る化合物によれば、エキシトン効果を示す色素を有する核酸プローブの製造を容易に行なうことができる。
本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのマススペクトルを示す図である。 本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図である。 本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。 本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図である。 本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。
　以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。
　なお、本明細書において、「ホスホロアミダイト化合物」および「化合物」には、その互変異性体および立体異性体、ならびにその塩などが含まれる。
　〔化合物〕
　まず、本発明に係る化合物について説明する。
　本発明に係る化合物は、エキシトン効果を示す色素（蛍光色素）を含有するホスホロアミダイト化合物（以下、「色素含有ホスホロアミダイト化合物」ともいう。）またはその合成中間体である。本発明に係る化合物は、下記式（１）、（２）または（３）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｂは、塩基骨格を有する原子団である。塩基骨格を有する原子団とは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団が挙げられる。
　Ｂは、下記式（１４）で表される骨格を有するピリミジン塩基もしくは下記式（１５）で表される骨格を有するプリン塩基、またはこれらの誘導体であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　上記式（１４）中、１位のＮ原子は、上記式（１）～（３）中のＥと結合している共有結合を有しており、１位のＮ原子以外の原子のいずれか１つは、色素（Ｚ１１またはＺ１２）につながるリンカー（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＤ）と結合（共有結合）していてもよい。なかでも、５位の原子がリンカーと結合していることが好ましい。
　上記式（１４）中、６員環を構成する原子のうち、少なくとも１つの炭素原子は、Ｎ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、少なくとも１つの窒素原子はＣ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、当該Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、電荷、水素原子または置換基を有していてもよい。
　上記式（１５）中、９位のＮ原子は、上記式（１）～（３）中のＥと結合している共有結合を有しており、９位のＮ原子以外の原子のいずれか１つは、色素（Ｚ１１またはＺ１２）につながるリンカー（すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＤ）と結合（共有結合）していてもよい。なかでも、８位の原子がリンカーと結合していることが好ましい。
　上記式（１５）中、５員環および６員環を構成する原子、好ましくは５員環を構成する原子のうち、少なくとも１つの炭素原子は、Ｎ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、少なくとも１つの窒素原子はＣ、ＳまたはＯ原子で置換されていてもよく、当該Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、電荷、水素原子または置換基を有していてもよい。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体である。Ｅは、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾ＲＮＡの主鎖構造を有する原子団であれば、合成が容易であるため好ましい。
　例えば、上記式（１）および（３）中、下記式（１ａ）で表される原子団は、下記式（４）または（５）で表される原子団であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記式（４）～（５）中、Ａは、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基または電子吸引基である。アルキル基またはアルコキシ基としては、メトキシ基等が挙げられる。また、電子吸引基としては、ハロゲン等が挙げられる。ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
　また、例えば、上記式（２）中、下記式（２ａ）で表される原子団は、下記式（６）または（７）で表される原子団であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　上記式（６）～（７）中、Ａは、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基または電子吸引基である。アルキル基またはアルコキシ基としては、メトキシ基等が挙げられる。また、電子吸引基としては、ハロゲン等が挙げられる。ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有する原子団（以下、「色素」ともいう。）であり、かつ、エキシトン効果を示す原子団である。また、Ｚ１１およびＺ１２は、電荷を有さない原子団である。Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよい。
　ここで、「エキシトン効果（エキシトンカップリング）」（励起子結合効果ともよばれる。）とは、Ｚ１１とＺ１２とが互いに並行に集合し、または、Ｚ１１もしくはＺ１２と他の原子団とが並行に集合し、Ｈ会合体（Ｈ－ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することにより生じるものである。「エキシトン効果を示す」とは、エキシトン効果が生じていないときには蛍光発光し、エキシトン効果が生じているときには消光することをいう。エキシトン効果は、Ｚ１１およびＺ１２で表される原子団の励起状態が、Ｈ会合体を形成することによりＤａｖｙｄｏｖ　ｓｐｌｉｔｔｉｎｇにより２つのエネルギーレベルに分裂し、上位エネルギーレベルに励起した後、下位エネルギーレベルに内部変換（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）し、発光が熱的に禁制されることにより生じると考えられる。ただし、これらの説明は、本発明を何ら限定するものではない。
　また、「電荷を有さない」とは、少なくとも非プロトン性溶媒中において電荷（正電荷または負電荷）を有さないことをさす。換言すれば、Ｚ１１およびＺ１２で表される原子団内の双極子モーメントが小さいことをいう。なお、Ｚ１１およびＺ１２で表される原子団は、非プロトン性溶媒中において電荷を有さないものであればよく、プロトン性溶媒中においては分極して電荷を帯びるものであってもよい。ここで、非プロトン性溶媒とは、例えばアセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等をさし、プロトン性溶媒とは、水等をさす。
　Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立して下記式（１２）で表される原子団であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　上記式（１２）中、Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、ＯまたはＳであることが好ましい。
　上記式（１２）中、ｎは、０または正の整数である。このｎは５以下であることが好ましく、一例では０～２の整数であり、好ましくは０または１である。
　上記式（１２）中、Ｒ２１～Ｒ３０、Ｒ３２～Ｒ３４は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１～６の直鎖または分岐アルキル基であってもよい。また、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１～６の直鎖または分岐アルコキシ基であってもよい。
　Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されていてもよい。すなわち、Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されて環状構造を構成していてもよく、環状構造としては、例えばアリール基等が挙げられる。また、この環状構造またはアリール基は、置換基を有していてもよい。
　上記式（１２）中、Ｒ３１は、上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または下記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合する連結基である。Ｒ３１は、原子数２以上の主鎖を有することが好ましい。また、この主鎖を構成する原子数の上限は、特に限定されないが、好ましくは１００以下であり、より好ましくは５０以下であり、さらに好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。
　また、Ｒ３１は、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であることが好ましく、このうちカルボニル基部分において上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または下記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合することが好ましい。
　上記式（１２）中、ｎが２以上の整数である場合には、複数のＲ３３は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ３４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。
　Ｚ１１およびＺ１２としては、例えば下記式（１７）～（２０）で表される色素等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　上記式（１７）～（２０）中、Ｒ３１は、上記式（１２）中において例示したものと同じものを用いることができる。
　また、Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立して下記式（２８）または（２９）で表される原子団であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　上記式（２８）および（２９）中、Ｒ２１～Ｒ３４、Ｘ１およびｎとしては、上記式（１２）中において例示したものと同じものを用いることができる。
　上記式（２８）中、Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、ＯまたはＳであることが好ましい。なお、Ｘ１とＸ２とは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
　上記式（２８）および（２９）中、Ｒ５１～Ｒ６０は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基である。低級アルキル基としては、例えば炭素数１～６の直鎖または分岐アルキル基であってもよい。また、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１～６の直鎖または分岐アルコキシ基であってもよい。
　Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されていてもよい。すなわち、Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されて環状構造を構成していてもよく、環状構造としては、例えばアリール基等が挙げられる。また、この環状構造またはアリール基は、置換基を有していてもよい。
　Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して上記式（１２）、（２８）または（２９）のいずれかで表される原子団であってもよい。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｘは、水素原子、酸により脱保護が可能な水酸基の保護基、リン酸基、二リン酸基、または三リン酸基である。酸により脱保護が可能な水酸基の保護基としては、たとえばジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）などが挙げられる。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｇは、下記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基または水酸基である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　上記式（３３）中、Ｒ４１はリン酸基の保護基であり、例えば、シアノアルキル基等が挙げられる。なかでも、シアノエチル基が好ましい。
　上記式（３３）中、Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ独立してアルキル基またはアリール基である。アルキル基としては、例えば、炭素数１～６のアルキル基等が挙げられ、なかでもイソプロピル基が好ましい。アリール基としては、例えば、炭素数６～１０のアリール基等が挙げられ、なかでもフェニル基が好ましい。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーである。Ｒ１およびＲ２が有する主鎖を構成する原子は、置換基を有していてもよい。また、Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよいが、存在していなくてもよい。Ｒ３が主鎖を有する場合には、この主鎖を構成する原子は、置換基を有していてもよい。
　Ｒ１およびＲ２が有する主鎖、ならびにＲ３が主鎖を有する場合にはＲ３が有する主鎖、を構成する原子の数（主鎖原子数）は、それぞれ独立して正の整数である。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の主鎖原子数は、それぞれ独立して２以上の整数であることが好ましい。また、この主鎖原子数の上限は、特に限定されないが、好ましくは１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、さらに好ましくは１０以下である。
　Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が有する主鎖は、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉの少なくとも１つを含んでいてもよく、また、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合の少なくとも１つを含んでいてもよい。また、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよい。また、Ｄは、存在していなくてもよい。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよい。また、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよい。また、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよい。
　上記式（１）、（２）および（３）中、Ｔは、リン酸架橋である。このリン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。
　また、本発明に係る化合物は、下記式（８）、（９）、（１０）または（１１）で表される化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して正の整数である。ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して２以上の整数であることが好ましい。また、ｌ、ｍおよびｎの上限は、特に限定されないが、好ましくは１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、さらに好ましくは１０以下である。なお、ここで、ｌ、ｍおよびｎの上限は、５以下または４以下でもありえる。
　上記式（８）中、Ｒ４は、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、または存在していなくてもよい。なかでも、二重結合であることが好ましい。
　上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｘ、Ｒ４１、Ｒ４２、Ｒ４３、およびＴとしては、上記式（１）～（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。
　本発明に係る化合物は、例えば下記式（１６）で表される化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　上記式（１６）中、Ｘ、Ｇ、Ｚ１１、Ｚ１２としては、上記式（１）～（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。また、上記式（１６）中、Ａとしては、上記式（４）～（７）中において例示したものと同じものを用いることができる。
　本発明に係る化合物であって、Ｇが水酸基である化合物は、ホスホロアミダイト体を合成する合成中間体として用いることができる。
　本発明に係る化合物であって、Ｇが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物（以下、「本発明に係るホスホロアミダイト化合物」ともいう。）は、ホスホロアミダイト法による核酸合成に供するヌクレオシド基質として用いることができる。本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて合成された核酸は、例えば、プライマー、核酸を検出するための核酸プローブ、標識物質等として好適に利用され得る。すなわち、本発明に係る化合物は、核酸の標識化試薬（核酸ラベル化試薬）として用いることができる。
　〔ホスホロアミダイト化合物の製造方法〕
　本発明に係るホスホロアミダイト化合物は、種々の経路にて製造することができる。以下に、本発明に係るホスホロアミダイト化合物を製造するいくつかの経路の例について説明するが、本発明は、特にこれに限定されるものではない。
　例えば、本発明に係るホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオシドのＤＭＴｒ体に、Ｒ１、Ｒ２、ＤおよびＲ３等からなるリンカーを付加した後、色素であるＺ１１およびＺ１２を付加し、その後これをアミダイト化することによって製造してもよい（式（１）～（３）を参照）。また、ヌクレオシドのＤＭＴｒ体に、Ｒ１、Ｒ２、ＤおよびＲ３等からなるリンカーを予め付加したＺ１１およびＺ１２を付加した後、これをアミダイト化してもよい（式（１）～（３）を参照）。
　例えば、本発明に係るホスホロアミダイト化合物は、下記式（２１）、（２２）または（２３）で表される合成中間体を合成した後、これをアミダイト化することによって、製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　上記式（２１）、（２２）および（２３）中、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＤおよびＴとしては、上記式（１）～（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。
　本発明においては、Ｚ１１およびＺ１２が非プロトン性溶媒中において電荷を有さない色素であるため、上記式（２１）、（２２）または（２３）で表される合成中間体におけるＺ１１およびＺ１２は、非プロトン性溶媒中において電荷を有さない。したがって、これらの合成中間体を非プロトン性溶媒中においてアミダイト化することが容易であり、本発明に係るホスホロアミダイト化合物を容易に製造することができる。なお、アミダイト化に際して溶媒として用いる非プロトン性溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等である。
　〔核酸〕
　次に、本発明に係る核酸について説明する。
　ここで、本明細書中「核酸」とは、ポリヌクレオチドを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。また、核酸には、オリゴ核酸が含まれる。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。また、本明細書中「オリゴ核酸」とは、オリゴヌクレオチドを意味し、１つ以上のヌクレオチドにより構成されていればよい。
　本発明に係る核酸の長さは、特に限定されないが、例えば１０ｂｐ以上１０ｋｂ以下であることが好ましく、１０ｂｐ以上１ｋｂ以下であることがより好ましい。また、本発明に係る核酸は、オリゴ核酸であってもよく、その長さは、特に限定されないが、例えば１０ｂｐ以上１００ｂｐ以下であることが好ましく、１０ｂｐ以上５０ｂｐ以下であることがより好ましく、１０ｂｐ以上３０ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
　本発明に係る核酸は、下記式（２５）、（２６）または（２７）で表される原子団をヌクレオチド部分として含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　上記式（２５）、（２６）および（２７）中、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、ＤおよびＴとしては、上記式（１）～（３）中において例示したものと同じものを用いることができる。
　本発明に係る核酸は、上記式（２５）または（２６）で表される原子団を、ヌクレオチド部分として少なくとも１つ含んでいればよいが、２つ以上含んでいてもよい。これにより、本発明に係る核酸は、色素を２個有するヌクレオチド部分を１つ含むか、色素を１個有するヌクレオチド部分を連続して２つ含む構成となる。
　また、本発明に係る核酸は、上記式（２７）で表される原子団を、ヌクレオチド部分として、エキシトン効果を示す構造を有する他の原子団とともに含むことが好ましい。この他の原子団とは、例えばＺ１１およびＺ１２として例示したもののいずれかを有する原子団であってもよい。また、核酸は、上記式（２７）で表される原子団を、ヌクレオチド部分として、少なくとも２つ含んでいることが好ましい。これらの２つの原子団は、核酸中に連続して配置されてもよいし、数個の他の色素を含まないヌクレオチドを挟んで配置されてもよいが、それぞれが有する色素が互いに集合してエキシトン効果を示すように配置されることが好ましい。
　また、本発明に係る核酸は、本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて製造されたものであることが好ましい。本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて製造される核酸は、このホスホロアミダイト化合物におけるホスホロアミダイト基以外の部分（以下、「色素含有ヌクレオシド」ともいう。）を構成要素として含む。
　すなわち、本発明に係る核酸は、エキシトン効果を示す色素を含有しており、このエキシトン効果を利用して、検出対象の核酸を検出するためのプローブ（核酸プローブ）として好適に用いることができる。また、本発明に係る核酸は、このようなプローブの一部を構成するものであってもよい。このような核酸プローブを用いれば、本発明に係る核酸が有する色素による、蛍光発光と、エキシトン効果による消光とを観察することにより、検出対象の核酸を容易に検出することができる。
　また、本発明に係る核酸は、含有する色素の蛍光発光を利用した標識物質としても好適に用いることができる。例えば、組織の染色等に用いる標識物質であってもよい。さらに、本発明に係る核酸は、プライマー、例えばＰＣＲ用のプライマーとしても好適に用いることができる。
　以上のように、本発明に係る核酸は、研究、臨床、診断、試験管内遺伝子検出、生体内遺伝子検出などに用いるためのプライマー、プローブ、標識物質等であってもよい。
　本発明に係るホスホロアミダイト化合物を用いて核酸を合成する場合、本発明に係るホスホロアミダイト化合物のうち、上記式（１）または（２）で表される、色素を２つ有する化合物は、核酸の合成に、少なくとも１分子用いればよい。これにより、核酸は、色素を２個有するヌクレオシドを１分子含むか、色素を１個有するヌクレオシドを連続して２分子含む。
　また、本発明に係るホスホロアミダイト化合物のうち、上記式（３）で表される、色素を１個有する化合物は、エキシトン効果を示す原子団を有する他の化合物とともに、核酸の合成に用いられることが好ましい。この他の化合物とは、例えばＺ１１およびＺ１２として例示したもののいずれかを有する化合物であってもよい。また、核酸は、上述した色素を１個有する化合物を、少なくとも２分子用いて合成されてもよい。
　ここで、本発明に係る核酸が、検出対象の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）を検出する核酸プローブである場合に、この検出対象の核酸を検出する原理について、説明する。上述したように、この核酸プローブは、エキシトン効果を示す色素を少なくとも２個含んでいる。この核酸プローブが一本鎖状態のときには、これらの色素は、互いに会合することで、励起子結合効果を生じさせて消光する。一方、この核酸プローブが、検出対象の核酸と結合した二本鎖状態のときには、これらの色素は、この二本鎖の核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディングしてエキシトンカップリングが解消され、蛍光発光が起こる。この蛍光発光を検出することにより、核酸を検出することができる。
　なお、本発明に係る核酸は、本発明に係るホスホロアミダイト化合物由来のヌクレオシド（色素含有ヌクレオシド）を含む領域を、少なくとも２個有していてもよい。１つの核酸におけるこれらの領域は、ある領域に含まれる色素含有ヌクレオシドが有する色素が、他の領域に含まれる色素含有ヌクレオシドが有する色素との間でエキシトン効果を示さないように構成されていることが好ましい。また、それぞれの領域に含まれる色素含有ヌクレオシドが有する色素は、互いに異なる波長の蛍光を発光するものであることが好ましい。
　これにより、本発明に係る核酸は、複数の異なる色素を有するため、核酸プローブとして用いる場合には、それぞれの色素の発光および消光を同時に観察することによって、この核酸プローブのどの領域が検出対象の核酸と結合しているかを検出することができる。すなわち、この核酸プローブの一部のみが検出対象の核酸と例えば二本鎖を形成している場合に、核酸プローブ中のどの配列が二本鎖を形成しているか等を検出することが可能となる。
　例えば、赤色色素を有する色素含有ヌクレオシドと、青色色素を有する色素含有ヌクレオシドとを、それぞれ核酸プローブの離れた領域に導入してもよい。この核酸プローブを用いて核酸を検出した際に、例えば青色のみが発光した場合には、青色色素を有する色素含有ヌクレオシドを導入した領域は、検出対象の核酸とハイブリダイズしているが、赤色色素を有する色素含有ヌクレオシドを導入した領域は、検出対象の核酸とハイブリダイズしていないことが分かる。
　このように、本発明では、上述した方法によって、１つの核酸に複数の異なる色素を導入することができる。そのため、本発明を用いれば、多様な核酸構造を検出できる核酸プローブを製造することができる。例えば、この核酸プローブは、癌に関係する遺伝子の転座、ＲＮＡのスプライシング位置等の調査に用いることができ、様々な病気の診断、原因解明などに好適に利用することができる。
　なお、本発明に係る核酸を相補鎖とのハイブリダイゼーション検出用のプローブとして用いる場合、より強い蛍光強度を得るという観点では、ｐＨが１０．５以下の環境で用いられることが好ましく、ｐＨが９以下の環境がより好ましく、ｐＨが８以下の環境がさらに好ましい。なお、何れの条件でもハイブリダイズしていないプローブからのバックグラウンドノイズは充分に低く抑えられている。
　〔核酸の製造方法〕
　次に、本発明に係る核酸の製造方法について説明する。
　本発明に係る核酸の製造方法は、上述した本発明に係るホスホロアミダイト化合物とオリゴ核酸とを縮合反応させる、色素含有ヌクレオシド付加工程（付加工程）を含む。この色素含有ヌクレオシド付加工程により、蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団を有するヌクレオシド（色素含有ヌクレオシド）を、オリゴ核酸に付加させることができる。
　色素含有ヌクレオシド付加工程は、本発明に係るホスホロアミダイト化合物、すなわち色素含有ホスホロアミダイト化合物を、ホスホロアミダイト法によりオリゴ核酸におけるヌクレオチドの５’－水酸基と縮合反応させる工程である。これにより、色素含有ヌクレオシドがオリゴ核酸に付加され、色素含有ヌクレオシドを含むオリゴ核酸が合成される。
　色素含有ヌクレオシド付加工程では、色素含有ホスホロアミダイト化合物とオリゴ核酸とを、室温において２～２０分反応させることが好ましい。その他の反応条件については、ホスホロアミダイト法において用いる通常の条件を好適に用いることができる。
　なお、本発明に係る核酸の製造方法は、色素含有ヌクレオシド付加工程の前に、本発明に係る化合物であって、Ｇが水酸基である化合物をアミダイト化してホスホロアミダイト化合物を得る工程を含んでいてもよい。
　本発明は、上述した色素含有ヌクレオシド付加工程を、公知の核酸製造方法に組み込んだものであってもよい。ここで、公知の核酸製造方法とは、例えば、通常のヌクレオシド基質をホスホロアミダイト法によりオリゴ核酸に付加させるヌクレオシド付加工程と、ヌクレオシド付加工程により合成されたオリゴ核酸を脱保護する脱保護工程と、脱保護工程により脱保護されたオリゴ核酸を精製する精製工程とを含むセットを、所定の回数にて繰り返す方法である。本発明に係る核酸の製造方法は、この公知の核酸製造方法において、少なくともある１つのセットにおけるヌクレオシド付加工程を、上述した色素含有ヌクレオシド付加工程に置き換えたものであってもよい。
　また、本発明は、公知の核酸製造方法において、複数のセットにおけるヌクレオシド付加工程のそれぞれを、色素含有ヌクレオシド付加工程に置き換えたものであってもよい。これにより、本発明に係る化合物由来の色素含有ヌクレオシドを複数含む核酸を製造することができる。なお、この複数のセットは、連続して実施されるセットであってもよいし、他の１つ以上のセットを挟んで実施されるセットであってもよい。これにより、本発明に係る化合物由来の色素含有ヌクレオシドを含む領域を、少なくとも２個有している核酸を製造することができる。
　また、本発明に係る製造方法が、複数の色素含有ヌクレオシド付加工程を含む場合には、それぞれの色素含有ヌクレオシド付加工程は、互いに異なる色素を有するホスホロアミダイト化合物を用いるものであってもよい。これにより、１つの核酸に複数の異なる色素を導入することができ、すなわち複数の異なる色素を有する核酸を製造することができる。
　これらの色素含有ヌクレオシド付加工程、ヌクレオシド付加工程、脱保護工程、および精製工程は、公知の方法、条件、装置などにより行なうことができ、例えば公知の自動核酸合成装置を用いて行なってもよい。したがって、本発明に係る核酸の製造方法には、公知の核酸合成装置等を使用することができる。
　以上のように、本発明に係る製造方法を使用して、色素含有ヌクレオシドを含む核酸、すなわち本発明に係る核酸を製造することができる。
　また、本発明は、ＤＮＡオリゴマーの合成と色素を導入するための合成との２段階の合成工程を必要としないため、エキシトン効果を示す色素を有する核酸を容易に製造することができる。さらに、予め色素が導入されているヌクレオシドをＤＮＡ合成に用いるため、所望の数の色素が導入されていない不完全な核酸が合成されるおそれを回避することができる。
　〔核酸を製造するためのキット〕
　本発明に係る核酸を製造するためのキットは、上述した本発明に係る化合物を含むものである。これにより、本発明に係るホスホロアミダイト化合物、すなわち色素含有ホスホロアミダイト化合物を用いて、上述した核酸の製造方法を行なうことにより、核酸を容易に製造することができる。
　なお、本発明に係るキットは、それぞれ異なる種類の色素を含有する、複数種類の色素含有ホスホロアミダイト化合物を含んでいてもよい。また、色素を含まない各種のヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。これらのヌクレオシドは、核酸の合成に好適に用いることができる態様、例えばホスホロアミダイト体として含まれていることが好ましい。また、本発明に係るキットは、核酸を合成する装置、核酸合成に用いる試薬、製造した核酸を用いて核酸を検出するための検出用試薬、キットの取扱い説明書（キットを用いて核酸を製造する具体的な手法を記載）などをさらに含んでいてもよい。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　以下の実施例において、試薬、溶媒等は、一般に市販されているものを使用した。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ（日本電子株式会社）のＪＮＭ－α４００（商品名）により測定した。カップリング定数（Ｊ値）は、ヘルツ（Ｈｚ）で表している。ケミカルシフトは、ｐｐｍで表し、内部標準には、ジメチルスルホキシド（δ＝２．４８　ｉｎ　１ＨＮＭＲ，δ＝３９．５　ｉｎ　１３ＣＮＭＲ）及びメタノール（δ＝３．３０　ｉｎ　１ＨＮＭＲ，δ＝４９．０　ｉｎ　１３ＣＮＭＲ）を用いた。ＥＳＩマススペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ社のＢｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ　ＡＰＥＣ－ＩＩ（商品名）を用いて測定した。
　〔実施例１：蛍光色素の合成〕
　下記反応式（Ａ）～（Ｄ）により、下記式（２４）で表される蛍光色素（蛍光性を有する原子団）のＮＨＳ活性体を合成した。用いた具体的な方法を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　（１－１：1-(2-Carboxyethyl)quinolinium bromideの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　キノリン（Ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（１１．８ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）と３－ｂｒｏｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（１５．３ｇ、１００ｍｍｏｌ）とを、１５０℃にて１０分間加熱および撹拌した。これに５００ｍＬのジクロロメタンを加え、生じた固体を砕いて粉末状にし、１時間撹拌した。白色沈殿をろ過した後、ジクロロメタンで洗浄し、減圧下にて乾燥させ、目的の化合物として２０．７ｇ（７３．７ｍｍｏｌ、７４％）の白色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１２．６９（ｂｒ，１Ｈ），９．６２（ｄｄ，Ｊ＝５．９，１．５Ｈｚ，１Ｈ），９．３３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．６３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．５Ｈｚ，１Ｈ），８．２８－８．２４（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｄｄ，Ｊ＝８．３，５．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０６－８．０２（ｍ，１Ｈ），５．２７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；
　１３Ｃ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１７１．４，１５０．７，１４７．７，１３７．３，１３５．７，１３０．８，１２９．８，１２９．６，１２１．９，１１８．９，５３．２，３３．３。
　（１－２：4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzothiazol-2-ylidene]methyl}-1-(2-carboxyethyl)quinolinium bromideの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　3-(4-Carboxybutyl)-2-methylbenzothiazolium bromide（１７．０ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）と、1-(2-Carboxyethyl)quinolinium bromide（１４．５ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）とを、３００ｍＬのジクロロメタンに懸濁させた。この懸濁液に、トリエチルアミン（７２ｍＬ、５１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。次に、溶媒を減圧留去し、５００ｍＬのアセトンを加えた。生じた沈殿をろ過し、アセトンで洗浄した後、減圧下で乾燥させた。
　得られた粉末を、５００ｍＭの蒸留水にて洗浄し、沈殿をろ過し、さらに蒸留水で洗浄した後に減圧下で乾燥させた。この粉末を、５００ｍＬのアセトニトリルで同様に洗浄し、減圧下で乾燥させ、目的の化合物として８．３１ｇ（１５．７ｍｍｏｌ、３０％）の赤色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．５３（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９１－７．８８（ｍ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５５－７．５２（ｍ，１Ｈ），７．３４－７．３０（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），４．４８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９７－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．８７－１．８１（ｍ，２Ｈ）；
　１３Ｃ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１７８．０，１７６．４，１６１．１，１５０．７，１４５．６，１４１．２，１３８．５，１３４．４，１２９．４，１２８．２，１２６．６，１２６．０，１２５．８，１２５．７，１２３．７，１１８．７，１１３．７，１０９．５，８８．８，５３．２，４７．３，３７．２，３５．１，２７．７，２３．５。
　（１－３：4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzothiaazol-2-ylidene]methyl}quinolineの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzothiazol-2-ylidene]methyl}-1-(2-carboxyethyl)quinolinium bromide （６．１５ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）と、O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate （１３．２ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）とを、６０ｍＬのＤＭＦに懸濁した。この懸濁液に、トリエチルアミン（９．７ｍＬ、６９．７ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１６時間撹拌した。次に、この反応溶液に１０ｍＬの蒸留水を加えた後、さらに３０分間撹拌した。この反応溶液に、５００ｍＬの蒸留水と１５ｍＬの酢酸とを加え、生じた沈殿をろ過し、蒸留水で洗浄し、減圧下で乾燥させた。
　得られた赤色粉末に３００ｍＬのメタノールを加え、よく混合した。次に、沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させた。その後得られた赤色粉末に、３００ｍＬのジクロロメタンを加え、よく混合し、上澄み液をデカンテーションによって捨てた。その後、３００ｍＬのアセトンを加え、生じた沈殿をろ過し、減圧下で乾燥させ、目的の化合物として２．２４ｇ（５．９５ｍｍｏｌ、５１％）の赤色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１２．１８（ｂｒ，１Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８３－７．７９（ｍ，２Ｈ），７．６６－７．６２（ｍ，１Ｈ），７．５１－７．４１（ｍ，３Ｈ），７．２３－７．２０（ｍ，１Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），４．４１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８３－１．７７（ｍ，２Ｈ），１．７３－１．８１（ｍ，２Ｈ）；
　１３Ｃ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１７４．２，１５３．５，１４５．８，１４４．９，１４２．６，１４０．５，１３０．８，１２７．４，１２６．１，１２４．７，１２４．２４，１２４．１９，１２３．０，１２２．８，１２２．２，１１１．０，１１０．６，８５．８，４４．６，３３．２，２５．８，２１．７。
　（１－４：4-{[3-(4-Succinimidoxycarbonylbutyl) -2(3H)-benzothiazolylidene]methyl}quinolineの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　4-{[3-(4-carboxybutyl)-2(3H)-benzothiazolylidene]methyl}quiniline（７５５ｍｇ、ＦＷ３７６．４７）と、N-hydroxy succinimide（４６２ｍｇ、ＦＷ１１５．０９）と、N,N-Diisopropyl carbodiimide（５０６ｍｇ、ＦＷ１２６．２０）とに、ＤＭＦ（１２ｍｌ）を加え、２５℃で一晩撹拌した。これに塩化メチレンと水とをそれぞれ５０ｍｌずつ加えて、分液した。有機相を、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過した。ろ液をエバポレーションにより濃縮し、ジエチルエーテルを加えた。沈殿をろ過した後、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。乾燥した沈殿をクロロホルムで洗浄した後、乾燥させた。目的の化合物として、２２７ｍｇ（ＦＷ４７３．５４、収率２４％）の赤色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：８．６８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），８．６０（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９１（ｍ，２Ｈ），７．７４（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ），４．６３（ｍ，２Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｓ，４Ｈ），１．８９（ｍ，４Ｈ）；
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１７０．２，１６９．０，１５８．３，１４９．０，１４０．８，１４０．０，１３７．８，１３２．７，１２８．１，１２６．９，１２５．０，１２４．２，１２３．６，１２３．３，１２２．８，１２０．６，１１２．７，１０８．４，８７．２，４５．０，２９．８，２５．８，２５．４，２１．５；
　ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ２６Ｈ２４Ｎ３Ｏ４Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）４７４．１５；ｆｏｕｎｄ，４７４，１２。
　〔実施例２：ホスホロアミダイト体の合成〕
　次に、下記反応式（Ｅ）～（Ｇ）により、蛍光色素を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト体（色素含有ホスホロアミダイト化合物）を合成した。用いた具体的な方法を以下に示す。
　（２－１：5'-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis(2-aminoethyl)}aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridineの合成）
　まず、下記反応式（Ｅ）により、ヌクレオシドのＤＭＴｒ体において、アミノ基の脱保護を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　5'-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)}aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine（５００ｍｇ、ＦＷ９２０．８５）を、アンモニア水（２８％）１０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを混ぜた溶液に加え、２５℃で終夜撹拌した。この反応液は、エバポレーションにより濃縮し、少量のアセトンに溶解させ、ジエチルエーテルを加えた。生じた沈殿をろ過して分離し、その沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した後、乾燥させた。目的の化合物として２７３ｍｇ（ＦＷ７２８．８３、収率６９％）の白色粉末を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：７．９７（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３３－７．２７（ｍ，６Ｈ），７．２０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｔｄ，Ｊ＝２．２，６．９Ｈｚ，４Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｑ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝３．５，７．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．３９－３．２７（ｍ，４Ｈ），３．０３（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，４Ｈ），２．６５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４７－２．３３（ｍ，２Ｈ）；
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１６９．３，１６３．７，１６０．２，１５１．０，１４６．１，１４３．４，１３７．１，１３７．０，１３４．６，１３１．３，１３１．２，１２９．３，１２８．９，１２８．０，１２２．４，１１４．３，１１０．８，８８．２，８８．０，７２．７，６５．０，５５．８，５４．５，５２．８，４１．８，３８．５，３８．４；
　ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ３９Ｈ４９Ｎ６Ｏ８（［Ｍ＋Ｈ］＋），７２９．３６；ｆｏｕｎｄ，７２９．３１１４。
　（２－２：Double dye-labeled nucleosideの合成）
　次に、下記反応式（Ｆ）により、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　5'-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis(2-aminoethyl)}aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine（232mg、FW728.83）と、4-{[3-(4-Succinimidoxycarbonylbutyl) -2(3H)-benzothiazolylidene]methyl}quinoline（色素のＮＨＳ活性体）（３３１ｍｇ、ＦＷ４７３．５４）とに、ピリジン１３ｍｌを加え、２５℃で一晩撹拌した。エバポレーションにより溶媒を蒸発させ、シリカゲルカラムを用いて精製した（５％ＭｅＯＨ、１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。エバポレーションにより溶媒を蒸発させ、少量のアセトンに溶解させた後、ジエチルエーテルを加えた。生成した橙色粉末をろ過し、エーテルにて洗浄した後乾燥させ、目的の化合物として８３ｍｇ（ＦＷ１４４５．７５、収率１８％）を得た。当該目的の化合物の測定データは以下に示す。
　ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ８３Ｈ８５Ｎ１０Ｏ１０Ｓ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）１４４５．５９；ｆｏｕｎｄ，１４４５．４９。
　（２－３：アミダイト合成）
　次に、下記反応式（Ｇ）により、上記２－２で合成したＤＭＴｒ体を非プロトン性溶媒中においてアミダイト化し、色素含有ホスホロアミダイト化合物を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　２１２ｍｇのＤＭＴｒ体（上記反応式（Ｇ）の左側の化合物）（ＦＷ１４４５．７５，０．１４７ｍｍｏｌ）、２１ｍｇの１Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｅ（ＦＷ７０．０５，０．３０ｍｍｏｌ）、４ｍＬのアセトニトリル、および２ｍＬのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を混合し、これに２４０μＬのアミダイト化剤（ＦＷ３０１．４１，ｄ＝０．９４９，０．７５ｍｍｏｌ）を加えた。その３０分後に、重曹水と酢酸エチルとの混合溶液を加え、分液した。有機相を塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過後、溶媒を留去した。
　得られたホスホロアミダイト体は、ＤＭＦ：アセトニトリル＝１：１の溶媒を用いて０．１Ｍ溶液とし、フィルターに通した後、実施例３におけるＤＮＡ合成に用いた。
　〔実施例３：ＤＮＡプローブ〕
　実施例２で合成した色素含有ホスホロアミダイト化合物を用いて、蛍光色素を有するヌクレオシドを含むＤＮＡプローブ（核酸）を合成した。具体的な方法について、以下に説明する。
　（３－１．ＤＮＡ合成）
　ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems社の392 DNA/RNA synthesizer（商品名））を用い、固相合成法にしたがってＤＮＡプローブ５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＴ）－３’（Ｎは、蛍光色素を有するヌクレオシド）を合成した。蛍光色素を有するヌクレオシド（Ｎ）を導入する際の反応時間を１５分とし、蛍光色素を有さないヌクレオシド（Ｔ）を導入する際の反応時間を２分とした。これ以外の条件については、通常のホスホロアミダイト法において用いる条件を用いた。固相担体からの切り出しは、通常用いられる方法（２８％アンモニア水を用いる方法）により行なった。また、脱保護は、２５℃、終夜（１６時間）にて行なった。
　（３－２．ＤＮＡプローブの精製）
　次に、合成したＤＮＡプローブを、逆相ＨＰＬＣ（ギルソン社の装置Gilson Chromatograph, Model 305（商品名））により精製した。カラムには、ＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ　５－ＯＤＳ－Ｈカラム（商品名、１０×１５０ｍｍ）を使用した。溶媒には、５－５５％ＣＨ３ＣＮ／１００ｍＭのＴＥＡＡ　ｂｕｆｆｅｒ　１００ｍＭ（ｐＨ７．０）を用い、４０分の勾配にて３ｍＬ／分の流速で流した。ＵＶ検出器Ｍｏｄｅｌ　１１８（商品名）により、２６０ｎｍのＵＶ吸収をモニターすることによってＤＮＡプローブを検出した。
　精製したＤＮＡプローブは、ＥＳＩ法を用いたマススペクトル測定により同定された。図１は、本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのマススペクトルを示す図である。本実施例におけるＤＮＡプローブ５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＴ）－３’（分子式Ｃ１８２Ｈ２２２Ｎ３４Ｏ９２Ｓ２Ｐ１２）の分子量は、計算値が４７９３．７であり、実測値が４７９３．２であった。
　以上のように、蛍光色素を有するヌクレオシドのホスホロアミダイト体を用いることにより、蛍光色素を含むＤＮＡプローブを容易に合成することができた。すなわち、ＤＮＡプローブを合成する際には、ヌクレオシドを導入するためにヌクレオシド付加工程、脱保護工程および精製工程により構成されるセットが繰り返されるが、そのうちの１セットを本発明に係る化合物を用いて行なうことにより、蛍光色素を含むＤＮＡプローブを容易に製造できることが示された。
　以上のように、本発明に係る化合物は、既に蛍光色素を含んでおり、ＤＮＡ合成後に蛍光色素を別途導入する必要がない。したがって、本発明によれば、容易かつ低労力にてＤＮＡプローブを製造することが可能であることが示された。
　〔実施例４：ＤＮＡプローブを用いたＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定〕
　実施例３によって合成されたＤＮＡプローブを用いて、ＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定を行なった。ＵＶ吸収スペクトル測定には、株式会社島津製のＳｈｉｍａｄｚｕ　ＵＶ－２５５０（商品名）分光光度計を用い、蛍光スペクトル測定には、ＲＦ－５３００ＰＣ（商品名）蛍光分光光度計を用いた。
　まず、ＤＮＡプローブ５’－ｄ（ＴＴＴＴＴＴＮＴＴＴＴＴＴ）－３’について、ＵＶ吸収測定により濃度を決定した（２６０ｎｍにおけるモル吸光定数ε＝１０５，９００とし、Ｎ＝Ｔと近似した）。
　ＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定には、ＤＮＡストランド濃度０．４μＭ、リン酸バッファー５０ｍＭ（ｐＨ７．０）、ＮａＣｌ１００ｍＭの試料を用いた。また、試料中に、ＤＮＡプローブの相補鎖５’－ｄ（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ）－３’を、０μＭ（すなわち、ＤＮＡプローブのみ。図中、結果をａにて示す）または０．４μＭ（図中、結果をｂにて示す）となるように加えた。蛍光スペクトル測定においては、４８８ｎｍ（１．５ｎｍ幅）の光を励起光として用いた。
　これらの測定の結果を図２および図３に示す。図２は、本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図であり、図３は、本発明の一実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。
　図２および図３に示すように、ＤＮＡプローブは、相補鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光発光することが示された。したがって、本実施例のＤＮＡプローブは、明確な蛍光発光スイッチング機能を備えていることが示された。
　〔実施例５〕
　実施例３と同様の方法および条件により、ＤＮＡプローブ５’－ｄ（ＴＡＣＣＡＧＮＣＡＣＣＡＴ）－３’（Ｎは、蛍光色素を有するヌクレオシド）を合成し、その後精製した。次に、このＤＮＡプローブを用いて、実施例４と同様の方法および条件により、ＵＶ吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定を行なった。
　これらの測定の結果を図４および図５に示す。図４は、本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブのＵＶ吸収スペクトルを示す図であり、図５は、本発明の他の実施例におけるＤＮＡプローブの蛍光スペクトルを示す図である。なお、図４および図５では、試料中にＤＮＡプローブの相補鎖を加えなかった場合の結果をｃ、相補鎖を加えた場合の結果をｄにて示す。
　図４および図５に示すように、ＤＮＡプローブは、相補鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光発光することが示された。したがって、本実施例のＤＮＡプローブは、明確な蛍光発光スイッチング機能を備えていることが示された。
　〔実施例６：蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体の合成〕
　下記反応式（Ｈ）～（Ｊ）により、下記式（３２）で表される、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。具体的には、ヌクレオシドのＮＨＳ活性体のＤＭＴｒ体と、蛍光色素とをそれぞれ合成した後、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。用いた具体的な方法を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　（６－１：5’-O-DMTr 5-(2-Succinimidoxycarbonyl-(E)-vinyl)-2’-deoxyuridineの合成）
　まず、ヌクレオシドのＮＨＳ活性体を合成した。
　(E)-5-(2-carbxyvinyl)-2’-deoxyuridine（１０ｇ，ＦＷ２９８．２５）とN -hydroxy succinimide（７．７ｇ，ＦＷ１１５．０９）とN,N -Diisopropyl carbodiimide（８．５ｇ，ＦＷ１２６．２０）とに、ＤＭＦ（６０ｍｌ）を加えて、２５℃で４時間撹拌した。酢酸（９３．８ｍｌ）を加え、ジクロロメタン（３００ｍｌ）と水（３００ｍｌ）との混合溶液を激しく撹拌した中に滴下した。生じた沈殿をろ過し、超純水で洗浄し、乾燥した。
　次に、下記式（３０）で表される、ヌクレオシドのＮＨＳ活性体のＤＭＴｒ体を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　得られた沈殿（２ｇ，ＦＷ３９５．３２）とＤＭＴｒＣｌ（１．９ｇ，ＦＷ２２８．８３）とにピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）（２０ｍｌ）を加え、２５℃で終夜撹拌した。塩化ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。エバポレーションで溶媒を留去し、シリカゲルカラムで分離した（２－１０％ＭｅＯＨ，１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。目的化合物を含むフラクションの溶媒をエバポレーションで留去した。少量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサンを加え、沈殿をろ過し、ヘキサンにより洗浄し、乾燥した。目的化合物１．６ｇ（ＦＷ６９７．６９，収率４６％）を白色粉末として得た。当該目的化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．０７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．２８（ｍ，６Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８５（ｍ，４Ｈ），６．２１（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｑ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝６．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），３．３７（ｓ，２Ｈ），２．６５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５４（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４５（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，６．３，３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３８ｐｐｍ（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ）。
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１７４．４，１７１．９，１６６．８，１６３．４，１６０．２３，１６０．２１，１５０．９，１４５．９，１４５．５，１３６．９，１３６．６，１３１．３，１３１．２，１２９．２，１２８．９，１２８．１，１１４．２７，１１４．２５，１１０．０，８８．３７，８８．０６，７２．７１，６４．９６，５５．７７，５２．２９，４７．７３，４２．０３，２９．８４，２８．３６，２６．５０，９．３７ｐｐｍ。
　（６－２：N,N-bis({[3-(4-valeryl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quioline))-2-amidoethyl)ethylamineの合成）
　次に、下記式（３１）で表される蛍光色素を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　4-{[3-(4-Carboxybutyl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quinoline（１．９ｇ，ＦＷ３７６．４７）とＰｙＢＯＰ（５．２ｇ，ＦＷ５２０．３９）とに、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加えて、２５℃で３０分撹拌した。反応溶液をトリス（２－アミノエチル）アミン（３１４ｍｇ，ＦＷ１４６．２３）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に滴下し、２５℃で終夜撹拌した。溶媒をエバポレーションで留去し、シリカゲルカラムで分離した（７－２０％ＭｅＯＨ，１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。目的化合物を含むフラクションの溶媒をエバポレーションで留去した。少量のメタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加え、沈殿をろ過し、乾燥した。目的化合物５９３ｍｇ（ＦＷ８６３．１５，収率２８％）を橙色粉末として得た。当該目的化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：８．７２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），８．３５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．２Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｍ，２Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝７．７，１．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｔｄ，Ｊ＝７．６，０．９０Ｈｚ，２Ｈ），６．４４（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），３．０５（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，４Ｈ），１．７０ｐｐｍ（ｍ，８Ｈ）。
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１７２．１，１４９．７，１４８．５，１４８．１，１４２．５，１４１．２，１２９．３，１２９．０，１２６．９，１２５．４，１２５．３，１２３．９，１２２．４，１２１．９，１２１．４，１１３．２，１０９．５，８４．４，５４．９，５３．６，４３．９，３７．０，３６．７，３５．０，２５．５，２２．７，７．４ｐｐｍ。
　ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ５０Ｈ５４Ｎ８Ｏ２Ｓ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）８６３．３９，ｆｏｕｎｄ　８６３．３９０７。
　（６－３：5’-O-DMTr-5-(2-[2-{N,N-bis({[3-(4-valeryl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quioline)-2-amidoethyl)aminoethyl]carbomoyl-(E)-vinyl)-2-deoxyuridineの合成）
　次に、下記式（３２）で表される、蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　5’-O-DMTr 5-(2-Succinimidoxycarbonyl-(E)-vinyl)-2’-deoxyuridine（５００ｍｇ，ＦＷ６９７．６９）とN,N-bis({[3-(4-valeryl)benzoxazol-2-ylidene]methyl}quioline))-2-amidoethyl)ethylamine（６２１ｍｇ，ＦＷ８６３．１５）とに、ＤＭＦ（１０ｍｌ）を加え、２５℃で２時間撹拌した。反応溶液にＤＭＡＰ（８．８ｍｇ，ＦＷ１２２．１７）を添加し、２５℃で終夜撹拌した。溶媒はエバポレーションで留去し、シリカゲルカラムで分離した（７－１５％ＭｅＯＨ，１％Ｅｔ３Ｎ／ＣＨ２Ｃｌ２）。少量のメタノールに溶解し、ジエチルエーテルを加え、沈殿をろ過し、乾燥した。粉末を水で洗浄し、ろ過し、乾燥した。目的化合物２５６ｍｇ（ＦＷ１４４５．７５，収率２５％）を橙色粉末として得た。当該目的化合物の測定データは以下に示す。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：８．５７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），８．４８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｍ，９Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４５－７．１５（ｍ，１６Ｈ），７．０８（ｓ，２Ｈ），６．８５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，６．０Ｈｚ，４Ｈ），６．６４（ｓ，２Ｈ），６．１１（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２８（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．８７（ｄｄ，Ｊ＝９．５，４．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），６．６８（ｓ，３Ｈ），３．１９－３．０６（ｍ，１０Ｈ），２．４４（ｍ，４Ｈ），２．２６（ｑｕｉ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，４Ｈ），１．７１ｐｐｍ（ｍ，８Ｈ）。
　１３Ｃ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）：１７２．０，１６５．７，１６１．７，１５８．０，１５４．４，１４９．２，１４６．３，１４４．８，１４３．９，１４２．７，１４１．５，１４０．４，１３５．５５，１３５．４６，１３２．３，１３１．１，１２９．６，１２７．８，１２７．６，１２７．５，１２６．６，１２６．２，１２４．４，１２３．９，１２３．８，１２３．１，１２３．０，１２２．４，１２１．８，１１３．２，１１１．３，１１０．１，１０９．３，８６．０，８５．６，８４．７，７０．２，６３．９，５５．０，５４．９，５３．４，５３．２，４４．８，３４．８，２５．９，２２．５ｐｐｍ。
　ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）ｃａｌｃｄ　ｆｏｒ　Ｃ８３Ｈ８５Ｎ１０Ｏ１０Ｓ２（［Ｍ＋Ｈ］＋）１４４５．５９，ｆｏｕｎｄ１４４５．５９３０１。
　以上の方法を用いることにより、より高い合成効率を得ることができる。この方法により合成した蛍光色素を有するヌクレオシドのＤＭＴｒ体は、実施例２の２－３に記載した方法を用いてアミダイト化することによって、色素含有ホスホロアミダイト化合物とすることができる。
　本発明は、エキシトン効果を示す色素を有する核酸の製造を容易に行なうことができるので、プライマー、検出対象を効果的に検出できるプローブ、標識物質等およびこれらの製造に好適に利用することができる。したがって、本発明は、研究用、臨床用、診断用、試験管内遺伝子検出用、生体内遺伝子検出用などの幅広い用途のための核酸およびその製造に好適に利用することができる。

Claims (13)

  1. 　下記式（１）、（２）または（３）で表されることを特徴とする、化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （上記式（１）、（２）および（３）中、
    　Ｇは、下記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基または水酸基であり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
    　Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
    　Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
    　Ｘは、水素原子、酸により脱保護が可能な水酸基の保護基、リン酸基、二リン酸基、または三リン酸基であり、
    　Ｒ４１はリン酸基の保護基であり、
    　Ｒ４２およびＲ４３は、それぞれ独立してアルキル基またはアリール基であり、
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
    　Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
    　Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
    　Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
    　Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）
  2. 　上記式（１）および（３）中、下記式（１ａ）で表される原子団が、下記式（４）または（５）で表される原子団であり、
    　上記式（２）中、下記式（２ａ）で表される原子団が、下記式（６）または（７）で表される原子団であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （上記式（４）～（７）中、
    　Ａは水素原子、水酸基、アルキル基、または電子吸引基であり、
    　ＭおよびＪは、それぞれ独立してＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。）
  3. 　Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が有する主鎖は、それぞれ独立して２以上の原子により構成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の化合物。
  4. 　下記式（８）、（９）、（１０）または（１１）で表されることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （上記式（８）、（９）、（１０）および（１１）中、
    　ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ独立して正の整数であり、
    　Ｒ４は、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、または存在していなくてもよい。）
  5. 　ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ２であり、Ｒ４は、二重結合であることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
  6. 　Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立して下記式（１２）、（２８）または（２９）で表される原子団であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （上記式（１２）、（２８）および（２９）中、
    　Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立してＯ、Ｓ、ＳｅまたはＴｅであり、
    　ｎは、０または正の整数であり、
    　Ｒ２１～Ｒ３０、Ｒ３２～Ｒ３４、Ｒ５１～Ｒ６０は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基またはアミノ基であり、Ｒ２８とＲ２９とは、互いに結合されていてもよく、Ｒ５８とＲ５９とは、互いに結合されていてもよく、
    　Ｒ３１は、上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合する連結基であり、
    　ｎが２以上の整数である場合には、Ｒ３３は、それぞれ同一であっても異なっていてもよく、Ｒ３４は、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）
  7. 　上記式（１２）、（２８）および（２９）中、Ｒ３１は、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分において上記式（１）、（２）もしくは（３）中のＲ１もしくはＲ２、または上記式（８）、（９）、（１０）もしくは（１１）中のＮＨに結合することを特徴とする請求項６に記載の化合物。
  8. 　Ｒ４１がシアノエチル基であり、Ｒ４２およびＲ４３がそれぞれイソプロピル基であることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｇが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物と、オリゴ核酸とを縮合反応させることを特徴とする核酸の製造方法。
  10. 　下記式（２５）、（２６）または（２７）で表される原子団をヌクレオチド部分として含むことを特徴とする核酸。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （上記式（２５）、（２６）および（２７）中、
    　Ｂは、塩基骨格を有する原子団であり、
    　Ｅは、デオキシリボース骨格もしくはリボース骨格を有する原子団またはその誘導体であり、
    　Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立して蛍光性を有し、かつエキシトン効果を示す原子団であって、電荷を有さない原子団であり、Ｚ１１とＺ１２とは、同一であっても異なっていてもよく、
    　Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して主鎖を有するリンカーであり、当該主鎖を構成する原子が置換基を有していてもよく、
    　Ｒ３は、主鎖を有するリンカーであってもよく、または存在していなくてもよく、当該主鎖を構成する原子は置換基を有していてもよく、
    　Ｄは、ＣＲ１１、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、Ｂ（ホウ素原子）もしくはＳｉＲ１１であってもよく、または存在していなくてもよく、Ｒ１１は、水素原子、アルキル基もしくは任意の置換基であってもよく、
    　Ｒ３が存在しておらず、かつＤが存在している場合には、ＤはＢに直接結合していてもよく、Ｒ３が存在しており、かつＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＲ３に直接結合していてもよく、Ｒ３およびＤが存在していない場合には、Ｒ１およびＲ２はＢに直接結合していてもよく、
    　Ｔは、リン酸架橋であり、当該リン酸架橋中、１つ以上の酸素原子が硫黄原子で置換されていてもよい。）
  11. 　請求項９に記載の核酸の製造方法により製造されたことを特徴とする請求項１０に記載の核酸。
  12. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物を含むことを特徴とする核酸を製造するためのキット。
  13. 　請求項１～８の何れか1項に記載の化合物であって、式中のＧが上記式（３３）で表されるホスホロアミダイト基である化合物を製造する方法であって、
    　請求項１～８の何れか1項に記載の化合物であって、式中のＧが水酸基である化合物を、非プロトン性溶媒中でホスホロアミダイト化する工程を含むことを特徴とする製造方法。
PCT/JP2011/080386 2010-12-28 2011-12-28 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット WO2012091091A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/997,700 US9499576B2 (en) 2010-12-28 2011-12-28 Compound, nucleic, acid, method for producing nucleic acid, and kit for producing nucleic acid
JP2012551041A JP5975524B2 (ja) 2010-12-28 2011-12-28 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット
EP11854241.4A EP2660246A4 (en) 2010-12-28 2011-12-28 COMPOUND, NUCLEIC ACID, METHOD FOR THE PRODUCTION OF NUCLEIC ACID AND KIT FOR THE PRODUCTION OF NUCLEIC ACID

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-293074 2010-12-28
JP2010293074 2010-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012091091A1 true WO2012091091A1 (ja) 2012-07-05

Family

ID=46383179

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/080386 WO2012091091A1 (ja) 2010-12-28 2011-12-28 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9499576B2 (ja)
EP (1) EP2660246A4 (ja)
JP (1) JP5975524B2 (ja)
WO (1) WO2012091091A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014034818A1 (ja) * 2012-08-30 2014-03-06 株式会社ダナフォーム 標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器
WO2014038561A1 (ja) * 2012-09-04 2014-03-13 株式会社ダナフォーム 化合物、核酸、標識物質および検出方法
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
US11981703B2 (en) 2016-08-17 2024-05-14 Sirius Therapeutics, Inc. Polynucleotide constructs

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA032769B1 (ru) * 2012-07-16 2019-07-31 КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ Способ конструирования экситонного зонда на основе нуклеиновой кислоты и способ обнаружения последовательности-мишени
CN107502318A (zh) * 2017-08-08 2017-12-22 中国石油集团渤海钻探工程有限公司 一种高密度盐水完井液用复配缓蚀剂及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656449A (en) * 1995-03-06 1997-08-12 Molecular Probes, Inc. Neutral unsymmetrical cyanine dyes
WO2008111485A1 (ja) 2007-03-09 2008-09-18 Riken モノヌクレオシドまたはモノヌクレオチドから誘導される構造を有する化合物、核酸、標識物質、核酸検出方法およびキット
US20100093992A1 (en) * 2004-11-05 2010-04-15 Dmitry Cherkasov Macromolecular Nucleotide Compounds and Methods for Using the Same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2622649C (en) 2007-03-09 2018-04-24 Riken Nucleic acid amplification method using primer exhibiting exciton effect

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5656449A (en) * 1995-03-06 1997-08-12 Molecular Probes, Inc. Neutral unsymmetrical cyanine dyes
US20100093992A1 (en) * 2004-11-05 2010-04-15 Dmitry Cherkasov Macromolecular Nucleotide Compounds and Methods for Using the Same
WO2008111485A1 (ja) 2007-03-09 2008-09-18 Riken モノヌクレオシドまたはモノヌクレオチドから誘導される構造を有する化合物、核酸、標識物質、核酸検出方法およびキット

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IKEDA, SHUJI ET AL.: "pH-Dependent fluorescence of uncharged benzothiazole-based dyes binding to DNA", PHOTOCHEMICAL & PHOTOBIOLOGICAL SCIENCES, vol. 6, no. 11, 2007, pages 1197 - 1201, XP055113969 *
OKAMOTO, AKIMITSU: "Excitonic Interaction: Another Photophysical Process for Fluorescence- Controlled Nucleic Acid Sensing", THE CHEMICAL RECORD, vol. 10, 2010, pages 188 - 196, XP055113970 *
See also references of EP2660246A4

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014034818A1 (ja) * 2012-08-30 2014-03-06 株式会社ダナフォーム 標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器
JP5598784B2 (ja) * 2012-08-30 2014-10-01 株式会社ダナフォーム 標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器
JPWO2014034818A1 (ja) * 2012-08-30 2016-08-08 株式会社ダナフォーム 標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器
US10066264B2 (en) 2012-08-30 2018-09-04 Kabushiki Kaisha Dnaform Method for analyzing target nucleic acid, kit, and analyzer
EA032482B1 (ru) * 2012-08-30 2019-06-28 КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени
WO2014038561A1 (ja) * 2012-09-04 2014-03-13 株式会社ダナフォーム 化合物、核酸、標識物質および検出方法
JPWO2014038561A1 (ja) * 2012-09-04 2016-08-12 株式会社ダナフォーム 化合物、核酸、標識物質および検出方法
US10294261B2 (en) 2012-09-04 2019-05-21 Kabushiki Kaisha Dnaform Compound, nucleic acid, labeling substance, and detection method
EA034342B1 (ru) * 2012-09-04 2020-01-29 КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ Соединение, нуклеиновая кислота, вещество, несущее метку, и способ обнаружения
US11981703B2 (en) 2016-08-17 2024-05-14 Sirius Therapeutics, Inc. Polynucleotide constructs
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use

Also Published As

Publication number Publication date
EP2660246A4 (en) 2014-09-10
US9499576B2 (en) 2016-11-22
EP2660246A1 (en) 2013-11-06
JPWO2012091091A1 (ja) 2014-06-05
JP5975524B2 (ja) 2016-08-23
US20130289263A1 (en) 2013-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2130835B1 (en) Compound having structure derived from mononucleoside or mononucleotide, nucleic acid, labeling substance, and method and kit for detection of nucleic acid
JP5364380B2 (ja) ポリヌクレオチド標識試薬
US5986086A (en) Non-sulfonated cyanine dyes for labeling nucleosides and nucleotides
JP5975524B2 (ja) 化合物、核酸、核酸の製造方法および核酸を製造するためのキット
CA2622649C (en) Nucleic acid amplification method using primer exhibiting exciton effect
AU2019203624A1 (en) Polymethine Compounds and Their Use as Fluorescent Labels
JP5195757B2 (ja) 核酸合成用ダイマーアミダイド及び核酸合成方法
WO2019021945A1 (ja) 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
EP1152010B1 (en) Oligonucleotide labeling reactants and their use
CN101631796B (zh) 具有由单核苷或单核苷酸衍生的结构的化合物、核酸、标记物以及核酸检测方法和试剂盒
EP2894158B1 (en) Compound, nucleic acid, labeling substance, and detection method
US9353142B2 (en) Protecting group for indole group, nucleic acid-synthesizing amidite and nucleic acid-synthesizing method
ES2271036T3 (es) Analogos de bases.
JP5467275B2 (ja) 電子移動抑制剤とその利用
ES2931081T3 (es) Compuestos a base de cumarina y métodos relacionados
JP2015104329A (ja) 核酸プライマー又は核酸プローブの設計方法、およびターゲット配列の検出方法
EP1112281B1 (en) Pteridine nucleotide analogs
JP6491486B2 (ja) ８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオシド誘導体、８−アザ−３，７−ジデアザアデニンヌクレオチド誘導体及びポリヌクレオチド誘導体ならびにプローブ
JPWO2005085270A1 (ja) ピリジン環５位にピロリル基を導入した核酸誘導体
JP2021020883A (ja) 光応答性ヌクレオチドアナログ
Mishra et al. Di (tert-butyl)[(pyren-1-yl) methoxy] silyl Chloride: Synthesis and Application in Purification of Synthetic Deoxyribonucleotides
Singh et al. Synthesis and fluorescence studies of fluorescently labelled phosphoramidites: synthons for multiple labelled oligonucleotides
JP2006052148A (ja) ヌクレオシド誘導体
JP2007070308A (ja) 動的カチオン感受性部位を挿入した新規ヌクレオシド誘導体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11854241

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13997700

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012551041

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2011854241

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011854241

Country of ref document: EP