FR2959228A1 - Nucleotides modifies - Google Patents

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Abstract

Nucléotides modifiés, et procédés pour modifier les nucléotides avec un fragment ou un marqueur, tel que la biotine, qui permet leur détection et donne un nucléotide modifié, et procédés d'utilisation du nucléotide modifié dans des analyses quantitatives et qualitatives. 790431

Description

NUCLÉOTIDES MODIFIÉS
La présente demande revendique la priorité par rapport à la demande provisoire conjointement en instance numéro de série 61/326 450, déposée le 21 2010, qui est expressément incluse à titre de référence ici dans sa totalité.
Nucléotides modifiés, procédés pour modifier des nucléotides avec un fragment ou marqueur, tel que la biotine, qui permettent leur détection et donnent un nucléotide modifié, procédés d'utilisation du nucléotide modifié dans des analyses quantitatives et qualitatives, et procédés de synthèse des nucléotides modifiés décrits.
Les nucléotides modifiés ont la structure P1-P2-Nus-Alk-Lnk-Obs, et comprennent un sel, une base conjuguée, un tautomère, ou une forme ionisée, où P1 est un groupe phosphate ; P2 est un groupe phosphate ; Nus est un fragment nucléoside comprenant un sucre lié à une base purine ou pyrimidine ; Alk est un groupe de raccordement ayant la structure -//-(CH2)m-Y-//- où Y est une liaison ou un groupe formant liaison choisi parmi
O O H R II II ùNù,ùN---, ùOù'-Cù,ùSù'ùSù'ùSi I O et m est un nombre entier allant de 3 à 6 inclus, et où la liaison la plus à gauche est à Nus et la liaison la plus à droite est à Lnk ; Lnk est un groupe de liaison ayant la structure Ai-CH2-(-CH2OCH2-)ùCH2-A2 I / A7-X-A3-CH2--(-CH2OCH2- --CH2-A2 n or n où n est un nombre entier allant de 2 à 48 inclus ; AI est un groupe formant liaison choisi parmi
O O O O S NR Il II II II II II ùCH2ù Cù ,ùCùNHù,ùCùOù,ùSù CùNHù C-NH
O H R ùNù N ùO A2 est un groupe formant liaison choisi parmi H R H Il H Il H S H H Il H ùN ùN ùNùCù, NùSù NùCùN-- NùCùN Il O H O H O O O O O
ùNùCùN ùOùC ùSùC C-, -CùNH- -Cù0 1 A3, lorsqu'il est présent, est un groupe formant liaison choisi parmi R H R H IIll H 101 H S H H II H ùNù' Nù NùCù NùSù NùCùNù NùCùN Il O
O O O O O O H Il H II II II II Il ùNùCùNù OùCù SùCù Cù CùNHù,ùCùO- X est un groupe clivable qui peut subir un clivage silicium-carbone, un clivage nucléophile, un clivage redox, un clivage photochimique, un clivage enzymatique, ou un clivage basé sur un échange, et la liaison la plus à gauche est à Alk et la liaison la plus à droite est à Obs ; et Obs est un fragment marqueur observable.
De tels nucléotides modifiés, également dénommés analogues de nucléotide, conservent une activité biologique. Par exemple, ils sont des substrats pour une diversité d'ADN et/ou ARN polymérases. Le nucléotide modifié est ajouté à un oligonucléotide ou un acide nucléique par des procédés de routine, par exemple, déplacement de brèche, amorçage aléatoire, réaction d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), marquage à l'extrémité 3', transcription d'ARN en utilisant des ARN polymérases SP6, T3, ou T7, etc.
On peut se servir des nucléotides modifiés pour former des sondes marquées qui peuvent être utilisées, par exemple, dans un criblage biologique, un diagnostic, etc. À titre d'exemple, le criblage d'une matrice permet de déterminer différents constituants d'un échantillon complexe. Par exemple, une sonde d'oligonucléotide contenant un nucléotide biotinylé se lie spécifiquement aux analytes de l'échantillon qui contiennent une séquence complémentaire, donnant un motif de liaison observable, détectable lorsqu'on interroge la matrice. À titre d'exemple supplémentaire, une sonde d'oligonucléotide contenant un nucléotide biotinylé peut être utilisée pour étudier de petits acides ribonucléiques (ARN), tels que des micro-ARN (miARN), et leurs interactions fonctionnelles avec d'autres molécules d'ARN ou protéines cellulaires.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 montre la synthèse de biotine-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine biphosphate.
La figure 2 montre la synthèse de biotine-lieur-alcyne 31,5' cytidine biphosphate. La figure 3 montre la synthèse de biotine-lieur-alcène 3',5' cytidine biphosphate.
La figure 4 montre la fonctionnalité d'un nucléotide modifié contenant une liaison alcyne. La figure 5 montre la fonctionnalité d'un nucléotide modifié contenant une liaison alcène. La figure 6 montre la fonctionnalité d'un nucléotide modifié contenant une liaison alcane. La figure 7 montre la fonctionnalité d'un nucléotide modifié contenant une liaison alcane. La figure 8 montre la fonctionnalité d'un nucléotide modifié contenant une liaison alcane. 2 Comme décrit par la suite, le nucléotide peut être modifié en ajoutant au moins un des substituants suivants qui fonctionnent en tant que molécules détectrices, ou directement ou indirectement : la biotine et dérivés, un azothydrure, une alcyne, un aldéhyde, un diène, une amine, un disulfure, un fluorophore, un marqueur de spin, le polyéthylène glycol (PEG). Ces substituants sont ajoutés en diverses permutations, entités spécifiques, et longueurs de chaîne.
Dans un mode de réalisation, le nucléotide modifié est un nucléotide biotinylé de formule biotine-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-nucléotide avec PEG ayant au moins 7 atomes de carbone et jusqu'à 100 atomes de carbone. Pour n'importe lequel des composés de l'invention décrits, le composé comprend la forme sel, la base conjuguée, le tautomère, et/ou la forme ionisée. Dans un mode de réalisation, le nucléotide modifié est un ribonucléotide. Dans un mode de réalisation, le ribonucléotide peut être, mais sans s'y limiter, la cytidine. Dans un mode de réalisation, le nucléotide biotinylé est une cytidine 3'-5'-bisphosphate ayant un lieur PEG4 avec la structure montrée plus bas. H )'L/" H' HN1f NH 0 0 O O HOùPùO 1 OH HO` 0 HOùP I O Cette structure avait une efficacité de ligature améliorée par rapport aux composés de la technique antérieure du fait de la présence de l'alcane adjacent à la cytidine. Un mode de réalisation est un procédé pour le marquage d'une sonde d'ARN avec un nucléotide biotinylé ayant la structure OH O O OSj H H H ~"(r H HNir NH
O O HOùPùO OH HO\ /O OH HOùP O dans des conditions qui marquent la sonde d'ARN. Le ribonucléotide modifié est incubé avec une enzyme susceptible de ligaturer le ribonucléotide biotinylé à la sonde d'ARN (par exemple, une ligase telle que la ligase T4), pour donner une sonde d'ARN marquée à la biotine. Dans un mode de réalisation, simple brin ligase T4 on utilise. Dans un mode de réalisation, double brin ligase T4 est utilise. Dans un mode de réalisation, on utilise une ligase T4 thermostable. Des exemples des ligases 3 appropriées comprennent l'ARN ligase T4 1 (les applications comprennent le marquage des terminaisons 3' d'ARN avec 5'-[32P] pCp, le raccordement inter- et intra-moléculaire de molécules d'ARN et d'ADN ; la synthèse d'oligodésoxyribonucléotides à simple brin ; et l'incorporation d'acides aminés non naturels dans des protéines) ; l'ARN ligase T4 2 (les applications comprennent la ligature d'une coupure simple brin dans du dsARN, une ligature d'ARN éclaté, et la ligature du 3' OH de l'ARN au 5' phosphate de l'ADN dans une structure à double brin) ; l'ARN ligase T4 2, tronquée (les applications comprennent le raccordement d'une amorce adénylée à simple brin à des ARN en vue d'un clonage, et le clonage d'un petit ARN) ; l'ARN ligase T4 2, tronquée K227Q (les applications comprennent le raccordement d'une amorce adénylée à simple brin à des ARN en vue d'un clonage, le clonage d'un petit ARN, et la ligature avec le sous-produit de ligature le plus inférieur possible) ; dont chacun est commercialisé par New England BioLab ; et l'ARN ligase thermostable, qui est capable d'effectuer des ligatures à des températures élevées, supérieures à 40° environ par exemple, commercialisée par Epicentre. Dans un mode de réalisation, le nucléotide modifié est purifié avant ligature. Une analyse ultérieure pour détecter la sonde biotinylée permet une détection de la présence, quantité, etc. du ribonucléotide dans l'échantillon. Le procédé est utilisé avec, par exemple, et sans limitation, des dosages de mobilité, des transferts de Northern, une hybridation in situ, etc. La sonde d'ARN marquée à la biotine peut être détectée en utilisant une molécule reporter conjuguée à la streptavidine telle que, par exemple, et sans limitation, des enzymes (par exemple, des peroxydases), des teintures fluorescentes, etc. Un mode de réalisation est un procédé de synthèse d'un biotine-PEG-4-alcane-3',5'-cytidinebisphosphate. Un mode de réalisation est une trousse contenant un composé ayant la structure NH2 O O N H O O H H- HNIf NH O HO O ` / HOùP il O et des instructions pour marquer un acide nucléique en utilisant le composé. La trousse peut également contenir une enzyme, un ARN témoin (ou marqué ou non marqué avec le nucléotide modifié), et un tampon. Le nucléotide modifié a une efficacité de ligature améliorée par rapport aux composés connus compte tenu de la présence d'une liaison alcane. La liaison alcane améliore également la fonctionnalité du nucléotide modifié en diminuant la réactivité du nucléotide modifié avec des lysats cellulaires. Le segment espaceur PEG augmente l'hydrophilie du nucléotide modifié pour augmenter l'accessibilité de la biotine pour la détection. O I I HOùPùO OH OH 4 2959228 Dans un mode de réalisation, les composés de nucléotide biotinylés ont la structure suivante :
P1-P2-Nus-Alk-Lnk-Obs (I) ou son sel, base conjuguée, tautomère, ou forme ionisée où P1 et P2 sont des groupes phosphate ;
Nus est un nucléoside (un sucre (par exemple, ribose) lié à une base purine ou pyrimidine) ;
Alk est un groupe de raccordement qui peut être directement ou indirectement lié entre Nus et Lnk, ayant la structure -//-(CH2)m Y-//- dans laquelle Y est un groupe formant liaison choisi parmi
O O H R II II ù N-,ùNù, -0ù,ùCù,ùSù,ùSù,ùSi Il O et m est un nombre entier allant de 3 à 6 inclus, et la liaison la plus à gauche est à Nus et la liaison la plus à droite est à Lnk ;
Lnk est un groupe de liaison entre Alk et Obs, ayant les structures suivantes ù/ùA1- CH2-(-CH20CH2*CH2 A2 Ae_ / A1-X-A3-CH2-(-CH2OCH+CH2•A2 Aùn ou n dans lesquelles n est un nombre entier allant de 2 à 48 inclus ; AI est un groupe formant liaison choisi parmi
O O O O S NR Il II II II II II ù CH2ù ,ùCù,ùCùNHù,ùCùOù,ùSù, ùCùNHù,ùCùNHù, O H R ù Nù Nù,ùO-
A2 est un groupe formant liaison choisi parmi
O O S NR H R H Il H II H II H H Il H ùN--, ùNù, ùNùCù, ùNùSù,ùNùCùNù, ùN--CùN I I O O O O O O O H II H II II II II II ù NùCùNù, ùOùCù, ùSùCù, Cù, ùCùNHù, ùCùO- A3 est un groupe formant liaison choisi parmi :
O O S NR H R H Il H Il H Il H H Il H ùNù, ùNù, ùNùCù,ùNùSù NùCùNù,ùNùCùNù, Il O H O H O O O O O
ù NùCùNù,ùOùCù,ùSùCù,ùCù,ùCùNHù,ùCùO-
X est un groupe clivable qui peut subir un clivage silicium-carbone, un clivage nucléophile, un clivage redox, un clivage photochimique, un clivage enzymatique, ou un clivage basé sur un échange ; et5 Obs est un marqueur observable. Y fonctionne en tant que poignée pour permettre l'attachement des molécules détectrices (par exemple, fluorophore, biotine, etc.) Lorsque le sucre est le ribose, il a les attachements suivants : P1 est fixé à la position 5' ; P2 est fixé à la position 3' ; et la base purine ou pyrimidine est fixée à la position 1'. La base purine ou pyrimidine est choisie parmi cytosine (C), uracile (U), adénine (A), thymine (T), guanine (G) ou inosine (I) et peut être modifiée ou non modifiée. Des modes de réalisation comprennent, mais sans s'y limiter, 1-méthyladénine, N6-méthyladénine, N6-isopentyladénine, N,N-diméthyladénine, 7-déaza-adénine, 2-thiocytosine, 3-méthylcytosine, N4-acétylcytosine, 2-thiocytosine, 1-méthylguanine, 2-méthylguanine, 7-méthylguanine, N2,N2-diméthylguanine, 7-déazaguanine, 2-thiouracile, 6-thiopurine, ou 2,6-diaminopurine. La modification peut être un marqueur observable. Les marqueurs observables comprennent, mais sans s'y limiter, une fraction chromogène, un fluorophore tel que la fluorescéine, la rhodamine, une teinture commerciale (par exemple, DyLight® (Dyomics), Alexa®, Cy3, Cy5), un marqueur de masse, un marqueur de spin, ou un fragment susceptible de lier un marqueur observable, tel qu'un fragment de liaisons de streptavidine comme la biotine, la desthiobiotine ou l'iminobiotine, ou un marqueur de détection secondaire tel que l'azothydrure, alcyne, aldéhyde, ou diène susceptibles de former une liaison covalente avec un alcyne, une phosphine, un azothydrure, une hydrazide, une alcoxyamine, ou un alcène présent sur un marqueur observable. Dans un mode de réalisation, le marqueur observable est la biotine, et le composé est le biotine-PEG4-alcane-3',5'-cytidinebiphosphate. Dans un mode de réalisation, le marqueur observable est un azothydrure, et le composé est l'azido-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate. Dans un mode de réalisation, le marqueur observable est un fluorophore, et le composé est Cy5-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate. Le marquage se produit avec une efficacité élevée et une sensibilité comparable au marquage de radio-isotope, mais évite l'utilisation de radioactivité avec ses inconvénients concomitants. Dans un mode de réalisation, n est un nombre entier allant de 2 à 24 inclus, le sucre est le ribose, la base purine ou pyrimidine est A, C, G, U ou I, m est 3, n est 4, et le marqueur observable est un marqueur de liaison de streptavidine choisi parmi la biotine, la desthiobiotine, ou l'iminobiotine. Dans un mode de réalisation, les composés du nucléotide modifié ont la structure suivante (Il) : 0=P OH 0-~ Base*-AlkùLnkùObs HO OH PùO 0 ou son sel, base conjuguée, tautomère, ou forme ionisée où Base* est une base purine ou pyrimidine ; R est H, OH, CH3, ou un groupe de protection hydroxyle ; 6 Alk est un groupe de raccordement entre Base* et Lnk, ayant la structure -//-(CH2)m Y-//- dans laquelle Y est un groupe formant liaison choisi parmi
O O H R II 11 ùNù,ùN ù, -0ù,ùCù, ùSù, ùSù, ùSi 0 ,et
m est un nombre entier allant de 3 à 6 inclus ;
Lnk est un groupe de liaison ayant les structures suivantes : -1ùAI-CH2--(_CH2OCH2*CH2-A2 I / AI-XùA3-CH2-(ùCH2OCH2--CH2-A2 A_ n ou n
dans lesquelles n est un nombre entier allant de 2 à 48 inclus ;
AI est un groupe formant liaison choisi parmi
O O O O S NR 11 ùCH2ù ,ùCù,ùCùNHù CùOù,ùSù, ùCùNHù,ùCùNHù,
O H R ùNù,ùNù,ùO-
A2 est un groupe formant liaison choisi parmi
H R H IIll H I Ill H Il S H H Il IIlRH ùNù, ùNù, ùNùCù, ùNùSù, ùNùCùNù, ùNùCùNù, Il O
O O O O O O H II H II II II II II ù NùCùNù, ùOùCù, ùSùCù, ùCù, ùCùNHù, ùCùO-
A3 est un groupe formant liaison choisi parmi
H R H Il H IIll H S H H Il H ùNù, ùNù, ùNùCù,ùNùSù,ùNùCùNù,ùNùCùNù, Il O
O O O O O O H Il H II II Il II II ù NùCùNù,ùOùCù'ùSùCù'ùCù'ùCùNHù,ùCùO--
X est un groupe clivable qui peut subir un clivage silicium-carbone, un clivage nucléophile, un clivage redox, un clivage acide, un clivage basique, un clivage photochimique, un clivage enzymatique, ou un clivage basé sur un échange ;
Obs est un fragment marqueur observable.
Le groupe sucre peut être ribose ou désoxyribose. La base purine ou pyrimidine est choisie parmi C, U, A, G, T, ou I et peut être modifiée ou non modifiée. Des modes de réalisation comprennent, mais sans s'y limiter, 1-méthyladénine, N6-méthyladénine, N6-isopentyladénine, N,N-diméthyladénine, 7-déaza-adénine, 2-thiocytosine, 3-méthylcytosine, N4-acétylcytosine, 2-thiocytosine, 1-méthylguanine, 2-méthylguanine, 7-méthylguanine, N2,N2-diméthylguanine, 7-déazaguanine, 2-thiouracile, 6-thiopurine, ou 2,6-diaminopurine. 7 Le marqueur observable peut être une fraction chromogène, un fluorophore tel que la fluorescéine, la rhodamine, une teinture commerciale (par exemple, DyLight® (Dyomics), Alexa®, Cy3, Cy5), un marqueur de masse, un marqueur de spin, ou un fragment susceptible de lier un marqueur observable, tel qu'un marqueur de liaison de streptavidine tel que la biotine, la desthiobiotine ou l'iminobiotine, ou un marqueur de détection secondaire tel que l'azothydrure, alcyne, aldéhyde, ou diène. Dans un mode de réalisation, n est un nombre entier allant de 2 à 24 inclus. Dans un mode de réalisation, le sucre est le ribose, la base purine ou pyrimidine est A, C, G, U ou I, m est 3, n est 4, et le marqueur observable est un marqueur de liaison de streptavidine choisi parmi la biotine, la desthiobiotine, ou l'iminobiotine. Dans un mode de réalisation, le sucre est le ribose, la base purine ou pyrimidine est C, m est 3, Lnk est A1-CH2-(-CH2OCH2*CH2-A2 I / A1-X-A3-CH2--(-CH2OCH2--CH2-A2 A_ n ou n 0 O O n is 4, AI est ùCùNH--, A2 est ùNHùCù, et lorsqu'il est présent, A3 est ùNHùCù et Obs est choisi dans le groupe constitué de la biotine, un fluorophore, et un azothydrure. Un mode de réalisation est un procédé de marquage d'ARN en chauffant l'échantillon d'ARN souhaité à au moins 75 °C jusqu'à 95 °C. Dans un mode de réalisation, la solution de l'échantillon d'ARN contenait du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) à une concentration allant de 0 % à 25 %. L'échantillon d'ARN a été chauffé pendant 1 à 5 minutes, puis refroidi rapidement sur de la glace à une température entre 2 et 10 °C pendant au moins une minute. L'ARN a été ensuite mis en contact avec un des composés de nucléotide modifié ayant la structure P1-P2-Nus-Alk-Lnk-Obs telle que décrite précédemment. Le nucléotide a été ligaturé à l'ARN pour donner un ARN marqué. Le nucléotide modifié a été ligaturé à l'ARN en utilisant une enzyme telle que, mais sans caractère limitatif, l'ARN ligase T4, pour donner un ARN marqué. Dans ce mode de réalisation, l'ARN a été chauffé à au moins 75 °C, et jusqu'à 95 °C, puis refroidi pendant au moins une minute à moins de 10 °C. L'ARN refroidi a été ensuite mis en contact avec le biphosphate de cytidine biotinylé dans des conditions de réaction en utilisant de l'ARN ligase T4 et comprenant du PEG ayant une masse moléculaire comprise entre environ 1500 et 24 000 inclus et à une concentration allant de 5 % de PEG à 20 % de PEG inclus. La réaction a été incubée entre 30 minutes et 16 heures à une température comprise entre 16 °C et 37 °C pour ligaturer le biphosphate de cytidine biotinylé à l'ARN, en donnant un ARN modifié. La synthèse de composés spécifiques exemplaires parmi chacun des nucléotides modifiés suivants est décrite par la suite. Un spécialiste de la technique gardera à l'esprit que de tels schémas de synthèse sont représentatifs et non limitatifs ; un spécialiste de la technique saura comment synthétiser d'autres exemples spécifiques en utilisant des procédés connus et sans expérimentation 8 excessive. Ils comprennent, mais sans s'y limiter : des modifications biotine-PEG4: une vue d'ensemble du biotine-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (BPA-3',5'-pCp, composé 6), une vue d'ensemble du biotine-PEG4-SS-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (BP4SSA-3',5'-pCp, composé 12), biotine-PEG4-SS-alcane-cytidine (BP4SSAC, composé 11), et des réactions détaillées pour biotine-PEG4-SS-alcane-3',5'-cytidine-biphosphate (BP4SSA-3',5'-pCp, composé 12) ; des modifications biotine-PEG12 ; des modifications azido-PEG4 ; des modifications fluorophore-PEG4, DyLight 550-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (Dy55OP4A-3',5'-pCp, composé 14). Modification biotine-PEG4 Un mode de réalisation est un procédé de préparation de biotine-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate. Le procédé fait réagir de la propargyl amine avec du trifluoroacétate de méthyle pour donner du propargyl-trifluoro-acétamide. Le propargyl-trifluoro-acétamide réagit avec la 5-iodocytidine pour donner de la 5-[3-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine. La 543-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine est ensuite convertie en 5-[3-(trifluoro-acétamido)propyl]cytidine. La 5-[3-(trifluoro-acétamido)propyl]cytidine est ensuite convertie en 5-(3-aminopropyl)cytidine. La 5-(3-aminopropyl)cytidine est ensuite mise en réaction avec NHS-PEG-biotine pour donner la biotine-PEG-alcane-cytidine. La biotine-PEG-alkane-cytidine est ensuite mise en réaction avec du chlorure de diphosphoryle pour donner du biotine-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine-biphosphate. Le propargyl-trifluoro-acétamide (1) a été préparé selon la réaction suivante : 1 ~CF3 1 Propargyl trifluoroacetamide MW = 151.09 On a ajouté de la propargyl-amine (4,00 g, 72,62 mmol, 1,00 équiv.) goutte à goutte à du trifluoroacétate de méthyle (11,16 g, 87,15 mmol, 1,20 équiv.) à 0 °C. Le mélange réactionnel a été agité à 0 °C pendant 2 h, puis concentré sous pression réduite pour éliminer le méthanol. Le produit a été purifié par distillation sous vide donnant du propargyl-trifluoro-acétamide en tant que liquide incolore (9,59 g, 87 %). La structure a été confirmée par 1H- et 19F-RMN. La 5-[3-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine (2) a été préparée selon la réaction suivante : Propargyl trifluoroacetamide MW = 151.09 HO OH OH 5-Iodocytidine MW 369.11 2 OH OH MW = 392.29 5-[3-(trifluoroacetam ido)propynyl]cytidine O + McO~CF3 Methyl trifluoroacetate MW = 128.05 /"-''NH2 Propargyl amine MW = 54.08 9 Un flacon tricol de 100 mL a été chargé avec de la 5-iodocytidine (2,66 g, 7,00 mmol, 1,00 équiv.), de l'iodure cuivreux (0,267 g, 1.40 mmol, 0,20 équiv.) et du DMF sec (35 mL). Après dissolution complète du mélange réactionnel, on a ajouté le propargyl-trifluoro-acétamide (3,17 g, 21,00 mmol, 3,00 équiv.), la triéthylamine (1,42 g, 14,00 mmol, 2,00 équiv.) et enfin du tétrakis (triphénylphosphine) palladium(0) (0,809 g, 0,70 mmol, 0,10 équiv.) au mélange réactionnel sous N2. La réaction a été agitée à température ambiante (environ 19 à 22 °C) sous N2 pendant 18 à 24 h. La réaction a été ensuite diluée avec 70 mL d'un mélange 1:1 méthanol-dichlorométhane et on a ajouté la forme bicarbonate de la résine AGI X8 (12,00 g). Après agitation pendant environ une heure, le mélange réactionnel a été filtré et la résine a été lavée avec un mélange 1:1 méthanol-dichlorométhane. Les filtrats combinés ont été rapidement concentrés avec un évaporateur rotatif. Le résidu a été immédiatement purifié par chromatographie éclair. L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 1,84 g (67 %) de 5-[3-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine en tant que solide brun clair, qui a été confirmé par 1H-RMN. La 5-[3-(trifluoro-acétamido)propyl]cytidine (3) a été préparée selon la réaction suivante : O N I fVH2 / ÂCF3 H N, O N HO OH OH MW = 396.32 5-[3-(trifluoroacetamido)propyl]cytid i ne On a dissous de la 5-[3-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine (1,25 g, 3,19 mmol, 1,00 équiv.) dans du méthanol (30 mL). On a ajouté de l'hydroxyde de palladium (0,25 g, 20 % poids/poids sur base de propynyl cytidine) et du triéthylsilane (3,71 g, 31,90 mmol, 10,00 équiv.) au mélange réactionnel. Après 20 à 24 heures à température ambiante, le mélange réactionnel a été filtré au travers de la fibre de verre et le filtrat a été concentré sous pression réduite en donnant un résidu brun foncé. Le résidu a été purifié par chromatographie éclair. L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 0,85 g (71 %) de 5-[3-(trifluoro-acétamido)propyl]cytidine en tant que solide de couleur crème, qui a été confirmé par 1H-RMN. La 5-(3-aminopropyl)cytidine (4) a été préparée selon la réaction suivante : OH OH 2 NH2 O 20% Pd(OH)2 NH~CF3 MeOH HSiEt3 HO 3 O N MW = 392.29 5-[3-(trifl uoroacetamido)propynyl]cytid i ne 10 NH2 O N I H)LCF3 O NH2 N I NH2 O 4 NH4OH H2O 3 OH OH HO OH OH HO MW = 396.32 5-[3-(trifluoroacetamido)propyl]cytidine MW = 300.31 5-(3-aminopropyl)cytidine On a dissous de la 5-[3-(trifluoro-acétamido)propyl]cytidine (0,69 g, 1,74 mmol) dans Dl H2O (8,5 mL). Après dissolution complète, on a ajouté de l'hydroxyde d'ammonium concentré (NH4OH) (8,5 mL) au mélange réactionnel. La solution de réaction a été agitée à température ambiante pendant 2 à 3 h, puis concentrée sous pression réduite en donnant le produit brut en tant que résidu jaune-orange. Le produit brut a été dissous dans H2O désionisée (10 mL) et on a ajouté de la résine AG50W-X8 (2,5 g) à la solution. La suspension a été agitée pendant 15 min et filtrée sur un lit de résine AG50W-X8 (2,5 g). La résine a été lavée avec Dl H2O et le produit a été ensuite élué de la résine par lavage de la résine avec H2O désionisée/ NH4OH conc., 4:1, collecte des fractions (surveillée par CCM). L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 0,51 g (98 %) de 5-(3-aminopropyl)cytidine en tant que solide brun pâle, qui a été confirmé par 1H-RMN. La biotine-PEG4-alcane-cytidine (BPAC, 5) a été préparée selon la réaction suivante : OH OH MW = 300.31 5-(3-aminopropyl)cytidine HO NH2 DMF NH2 O IO N N Ne,,,. I H H MW = 773.89 BPAC HO OH OH
On a dissous de la NHS-PEG4-biotine (0,196 g, 0,333 mmol, 1,00 équiv.) dans du DMF (10 mL). On a ajouté de la 5-(3-aminopropyl)cytidine) (0,100 g, 0,333 mmol, 1,00 équiv.) à la solution de réaction. La solution de réaction a été agitée à température ambiante sous une atmosphère de N2. Après 20 à 24 h, 11 le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite en donnant le produit brut. Le produit brut a été ensuite purifié par chromatographie éclair. L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 0,18 g (69 %) de BPAC en tant que solide blanc, qui a été confirmé par 1H-RMN. Le biotine-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (BPA-3',5'-pCp, 6) a été préparé selon la réaction suivante : NH2 O IOI N N ~/~/'' •. H H ON MW = 773.89 HN)r NH BPAC O HO OH OH 1. O O
CI' PP~CI CI Cl 1. chlorure de diphosphoryle 2. Tampon TEAB 0,5M pH = 8,5 3. C18, FPLC, C18 O NO~~O~~O~iO~~ IOI N ~/~/' ••. H H MW = 933.85 BPA-3',5'-pCp NH2 N J 6 0 On a partiellement dissous du BPAC (0,061 g, 0,079 mmol, 1,00 équiv.) dans du chlorure de diphosphoryle (196 pL, 1,66 mmol, 21,00 équiv.), précédemment refroidi à -10 oc à -15 °C dans un Reacti-Vial de 1 mL. Le mélange a été ensuite agité à -10 °C à -15 °C. Après 5 h, la réaction a été neutralisée par l'addition d'eau glacée (1 à 2 mL) et, immédiatement après, avec une solution refroidie de tampon TEAB 0,5 M, pH 8,5 (17 mL). À la stabilisation à pH neutre, la solution incolore a été agitée à température ambiante pendant 30 min et concentrée en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à élimination complète du TEAB. La solution a été dessalée en utilisant une cartouche C18 (Waters) et purifiée par FPLC (colonne MonoQ 10/100GL, GE) en utilisant un gradient de pH. Après un dessalage final en utilisant de nouveau une cartouche C18 (Waters), le BPA-3',5'-pCp a été isolé après lyophilisation en tant que solide blanc (10 mg, 9 %), qui a été confirmé par 1H-RMN et HPLC. VUE D'ENSEMBLE DE LA PRÉPARATION DE BIOTINE-PEG4-SS-ALCANE-3',5'-CYTIDINE- BISPHOSPHATE (BP4SSA-3',5'-pCp, composé 12) 12 NH2 NNH2 ON- + OH OH 4 HO HO 11 OH OH NH2 O O 0 N Hi~/~S•S~~HH 1. Phosphorylation =R~~ O 2. C18, FPLC, C18 0 12 H-p- OH 8 Le schéma de réaction pour préparer le biotine-polyéthylène glycol (PEG)-SS-alcane-3',5'-cytidinebisphosphate est le suivant. On fait réagir la 5-(3-aminopropyl)cytidine (composé 4) avec la NHS-SSPEG-biotine pour donner de la biotine-PEG-SS-alcane-cytidine (composé Il). La biotine-PEG-SS-alcane-cytidine (composé 11) est ensuite mise en réaction avec du chlorure de diphosphoryle pour donner du biotine-polyéthylène glycol (PEG)-SS-alcane-3',5'-cytidine-biphosphate (composé 12). PRÉPARATION DE BIOTINE-PEG4-SS-ALCANE-CYTIDINE (BP4SSAC, composé 11) NH2^ 00 O IOI N~ i v `NH2 + O N O H H DM F HO OH OH 4 MW = 300.31 5-(3-aminopropyl)cytidi ne MW =751.93 NHS-SS-PEG4-Biotine HO NH2 O II II H H H 0 N MW = 937.16 Biotine-PEG4-SS-Alkane-Cytidine HN)r N (BP4SSAC) O OH OH 13 On a dissous de la NHS-SS-PEG4-biotine (0,250 g, 0,333 mmol, 1,00 équiv.) dans du DMF (10 mL). On a ajouté de la 5-(3-aminopropyl)cytidine) (0,100 g, 0,333 mmol, 1,00 équiv.) à la solution de réaction. La solution de réaction a été agitée à la température ambiante sous une atmosphère de N2. Après 20 à 24 heures, le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite en donnant le produit brut. Le produit brut a été ensuite purifié par chromatographie éclair. L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 0,19 g (61 %) de BP4SSAC (composé 11) en tant que solide blanc, qui a été confirmé par 1H-RMN. PRÉPARATION DE BIOTINE-PEG4-SS-ALCANE-3',5'-CYTIDINE-BISPHOSPHATE (BP4SSA-3',5'-pCp, composé 12)
N NHz N S~S~/~NO~iO~/~O~iO~/~N~/~/''•. 1 H H H O~N OH OH O O II II CI' PRO" P'CI Cl Cl Chlorure de diphosphoryle 2. Tampon TEAB 0,5M pH=8.5 3. C18, FPLC,C18 NH2 " N S•S~/~NO~~O~/~O~iO~/` N~/~/°•. y i n H H H O=P 12 HN MW =1097.12 N HO Biotine-PEG4-SS-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine HO;p~O OH (BP4SSA-3',5'-pCp) O On a partiellement dissous du BP4SSAC (0,074 g, 0,079 mmol, 1,00 équiv.) dans du chlorure de diphosphoryle (196 pL, 1,66 mmol, 21,00 équiv.), précédemment refroidi à -10 °C à -15 °C dans un Reacti-Viala de 1 mL. Le mélange a été ensuite agité à -10 °C à -15 °c. Après cinq heures, la réaction a été neutralisée par l'addition d'eau glacée (1 à 2 mL) et, immédiatement après, avec une solution refroidie de tampon TEAB 0,5 M, pH 8,5 (17 mL). À la stabilisation à pH neutre, la solution incolore a été agitée à la température ambiante pendant 30 min et concentrée en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à élimination complète du TEAB. La solution a été dessalée en utilisant une cartouche C18 (Waters) et purifiée par FPLC (colonne MonoQ 10/100GL, GE) en utilisant un gradient de pH. Après un dessalage final en utilisant de nouveau une cartouche C18 (Waters), le BP4SSA-3',5'-pCp (composé 12) a été isolé après lyophilisation en tant que solide blanc (5 mg, 6 %), qui a été confirmé par 'H-RMN et HPLC. HO 11 MW=937.16 Bioti ne-PEG4-SS-Alkane-Cytid i ne (BP4SSAC) 1. 14 Modification biotine-PEG12 PRÉPARATION DE BIOTINE-PEG12-ALCANE-CYTIDINE (BP12AC, composé 7) NH0o o N I NH2 N.Oi~/~O~iON ~9 H/,. ON + 0 OH OH 4 MW = 300.31 5-(3-a mi nopropy I)cytidine MW = 941.09 HN)rNH NHS-PEG12-Biotine O HO N NFiN)Ç-- i---O.~ o H `v H ON 7 MW =1126.31 Biotine-PEG12-Alkane-Cytid i ne (BP12AC) HO OH OH On a dissous de la NHS-PEG12-biotine (0,313 g, 0,333 mmol, 1,00 équiv.) dans du DMF (10 mL). On a ajouté de la 5-(3-aminopropyl)cytidine) (0,100 g, 0,333 mmol, 1,00 équiv., composé 4) à la solution de réaction. La solution de réaction a été agitée à la température ambiante sous une atmosphère de N2. Après 20 à 24 h, le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite en donnant le produit brut. Le produit brut a été ensuite purifié par chromatographie éclair. L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 0,27 g (72 %) de BP12AC (composé 7) en tant que mousse jaune pâle, qui a été confirmée par 1H-RMN. PRÉPARATION DE BIOTINE-PEG12-ALCANE-3',5'-BISPHOSPHATE-CYTIDINE (BP12A-3',5'-pCp, composé 8) 15 NH2 O IOI HOC/OO Fi O N 7 MW =1126.31 HNyNH Biotine-PEG12-Alkane-Cytidine O (BP12AC) OH OH O O CI-PRO" P~CI CI CI 1. Chlorure de diphosphoryle 2. Tampon TEAB 0,5 M pH = 8,5 3. C18. FPLC. C18 8 MW = 1286.27 OH Biotine- •PEG12-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (BP12A-3',5'-PCp)
On a partiellement dissous de la biotine-PEG12-alcane-cytidine (0,135 g, 0,120 mmol, 1,00 équiv., composé 7) dans du chlorure de diphosphoryle (315 pL, 2,40 mmol, 20,00 équiv.), précédemment refroidi à -10 à -15 °C dans un Reacti-VialTM de 1 mL. Le mélangea été agité à -10 à -15 °C. Après cinq heures, la réaction a été neutralisée en ajoutant de l'eau glacée (1 à 2 mL) et immédiatement après avec une solution refroidie de tampon TEAB 0,5 M, pH 8,5 (40 mL). À la stabilisation à pH neutre, la solution incolore a été agitée à la température ambiante pendant 30 min et concentrée en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à ce que le TEAB ait été complètement éliminé. La solution a été dessalée en utilisant un cartouche C18 (Waters) et purifiée par FPLC (colonne MonoQ 10/100GL, GE) en utilisant un gradient de pH. Après un dessalage final en utilisant une cartouche C18 (Waters), le biotine-PEG12-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (composé 8) a été isolé après lyophilisation en tant que solide blanc collant (8 mg, 5 %), qui a été confirmé par 1H-RMN et HPLC. Modification azido-PEG4 Azido-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate, composé 9 HO NFi N O~i0 0 N) ,,,. 1 H H 16 NH2 N i H2 O N + MW = 388.37 NHS-P E G4-Azoth yd ru re OH OH HO DMF 4 MW = 300.31 5-(3-aminopropyl)cytidine NH2 O N N 000i.,0 N3 1 H O N~ 9 MW= 573.59 Azido-PEG4-Alkane-Cytidine(AzP4AC) OH OH HO Un mode de réalisation est un procédé de préparation d'azido-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate. La 5-(3-aminopropyl)cytidine a été synthétisée comme décrit précédemment, puis a été mise en réaction avec du NHS-PEG4-azothydrure pour donner de l'azido-PEG4-alcane-cytidine. L'azido-PEG4-alcane-cytidine a été ensuite mise en réaction avec du chlorure de diphosphoryle pour donner de l'azido-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate. On a dissous du NHS-PEG4-azothydrure (0,408 g, 1,05 mmol, 1,00 équiv.) dans du DMF (32 mL). On a ajouté la 5-(3-aminopropyl)cytidine) (0,315 g, 1,05 mmol, 1,00 équiv.) à la solution de réaction. La solution de réaction a été agitée à la température ambiante sous une atmosphère de N2. Après 20 à 24 heures, le mélange réactionnel a été concentré sous pression réduite en donnant le produit brut. Le produit brut a été ensuite purifié par chromatographie éclair. L'élimination du solvant des fractions appropriées a donné 0,378 g (63 %) d'azido-PEG4-alcane-cytidine (composé 9) en tant que verre pratiquement incolore, qui a été confirmé par 1H-RMN. Azido-PEG4-alcane-3',5'-biphosphate-cytidine (AzP4A-3',5'p-C-p), composé 10 17 NH2 O V v HN ~--,- O~ O..-- N, O N 9 MW = 573.59 Azido-PEG4-Alkane-Cytidine (AzP4AC) HO OH OH 1 O O CI' P'i O"ri P•CI r Chlorure de diphosphoryle Tampon TEAB 0,5 M pH = 8,5 C18. FPLC. C18 NH2 0 N N 0O0 N3 10 2 3 yy 1 H 0_pPOH O'N' O r--T HHO~p-O 0H 0 MW 733.55 Azido-PEG4-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (AzP4A-3',5'-pCp) On a partiellement dissous de l'azido-PEG4-alcane-cytidine (0,150 g, 0,262 mmol, 1,00 équiv., composé 9) dans du chlorure de diphosphoryle (688 pL, 5,24 mmol, 20,00 équiv.), précédemment refroidi à -10 à -15 °C dans un Reacti-VialTM de 1 mL. Le mélange a été ensuite agité à -10 à -15 °C. Après cinq heures, la réaction a été neutralisée en ajoutant de l'eau glacée (2 à 3 mL) puis immédiatement avec une solution refroidie de tampon TEAB 0,5 M, pH 8,5 (87 mL). À la stabilisation à pH neutre, la solution incolore a été agitée à la température ambiante pendant 30 min et concentrée en utilisant un évaporateur rotatif jusqu'à ce que le TEAB ait été complètement éliminé. La solution a été dessalée en utilisant un cartouche C18 (Waters) et purifiée par FPLC (colonne MonoQ 10/100GL, GE) en utilisant un gradient de pH. Après un dessalage final en utilisant de nouveau une cartouche C18 (Waters), l'azido-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (composé 10) a été isolé après lyophilisation en tant que solide blanc collant (10 mg, 6 %), confirmé par 1H-RMN et HPLC. Modifications fluorophore-PEG4 VUE D'ENSEMBLE - PRÉPARATION DE DyLight 550-PEG4-ALCANE-3',5'-CYTIDINE- BISPHOSPHATE (Dy55OP4A-3',5'-pCp, 14) 18 O P0 1,& 1. DyLight 550 NHS Ester 2. FPLC 10 14 HOHe,p-O OH O Le DyLight 550-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (composé 14) est préparé comme suit. L'azido-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (composé 10) a été synthétisé comme décrit précédemment, puis on l'a laissé réagir avec du chlorhydrate de tris(2-carboyéthyl)phosphine (TCEP) pour donner de l'amino-PEG4-alcane-3,'5'-cytidine bisphosphate (composé 13). On a ensuite fait réagir l'amino-PEG4-alcane-3,'5'-cytidine bisphosphate (compound 13) avec du DyLight 550 NHS ester pour donner du 550-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (composé 14). PRÉPARATION D'AMINO-PEG4-ALCANE-3',5'-BISPHOSPHATE-CYTIDINE (AmP4A-3',5'-pCp, 13) 19 NH2 O NN" 3 1 H O=PO16H O~N O 10 MW = 733.55 Azido-PEG4-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (AzP4A-3',5'-pCp) 1. TCEP 2. FPLC On a dissous de l'azido-PEG4-alcane-3',5'-bisphosphate-cytidine (3,56 pmol, 1,00 équiv., composé 10) dans 200 mM de Tris/HCI, pH 7,5 (800 pL). On a dissous du chlorhydrate de tris(2-carboyéthyl)phosphine (TCEP) (17,54 mg, environ 5,00 équiv.) dans 200 mM de Tris/HCI, pH 7,5 (688 pL). On a ajouté la solution de TCEP (200 pL) à la solution d'azothydrure et la réaction a été mélangée à la température ambiante. Après 1 à 3 h, le mélange réactionnel a été purifié par FPLC et les fractions contenant le produit ont été traitées directement avec du DyLight 550 NHS ester pour donner l'amino-PEG4-alcane-3',5'-bisphosphate cytidine (composé 13). PRÉPARATION DE DyLight550-PEGa-ALCANE-3',5'-BISPHOSPHATE-CYTIDINE (Dy55OP4A-3',5'- pCp, 14) NH2 O 1( N N v 0 H2 13 OH MW = 707.56 A m i n o-PEG4-A I k a n e-3', 5'-B i s p h os p h a te -Cyti d î n e (AmP4A-3',5'-pCp) HO HO-'p OH 0 20 . DyLight 550 NHS Ester 2. FPLC Le pH d'une fraction FPLC (2 mL) contenant de I'amino-PEG4-alcane-3',5'-bisphosphate-cytidine (composé 13) a été ajusté à pH 7,0 en ajoutant une solution 1 M d'HEPES, pH 7,3. Séparément, on a préparé une solution 1 mM de DyLight 550 NHS ester en dissolvant du DyLight 550 NHS ester (Mr = 1040,05, 1 mg) dans de l'eau ultra pure (960 pL). On a combiné l'amino-PEG4-alcane-3',5'-bisphosphate-cytidine (0,25 mL) et le DyLight 550 NHS ester (0,25 mL) dans une cuve à réaction indépendante et on les a mélangés par rotation pendant 1 h à la température ambiante. Le mélange réactionnel a été purifié par FPLC (colonne MonoQ 10/100GL, GE) en utilisant un gradient de pH et de sel. Les fractions contenant le produit ont été dialysées et ultérieurement lyophilisées, donnant du DyLight550-PEG4-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate (composé 14) en tant que résidu rose sombre. D'autres composés exemplaires suivent. Des exemples de composés fluorescents comprennent, mais sans s'y limiter, les suivants : 13 HO O OH MW = 707.56 HO - 0 Ami n o-PEG4-Al kane-3',5'-Bisphosphate-Cytidi ne (AmP4A-3',5'-pCp) NH2 O O NH N H N ON O=P\ O HÔ~p-0 OH o 14 MW = 1632.52 Dy Light550-PEG4-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (Dy55OP4A-3',5'-pCp) 21 NH2 O N NN H H Dy Lig ht488-P EG4-Al kane-3',5'-Bis ph os phate-Cytidine (Dy488 P4A-3',5'-pCp) O DyLig ht650-PEG4-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (Dy650P4A-3',5'-pCp) Cy3-PEG4-AI kane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (Cy3P4A-3',5'-pCp) NH2 O O N NN N H H SO3K O 22 HO-p-O OH O NH2 O N N H H O~N 5/6-Carboxytetramethy I rhodam i ne-PEG4-Alkane-3',5'-Bisphos phate-Cyti d i ne (5/6-RP4A-3', 5'-pCp) 't- O=POOH Cy5-PEG4-Alkane-3', 5'-Bis phosphate-Cyti d i ne (Cy5P4A-3',5'-pCp) OH -+ SO3K OH OH 516-Carboxyfl uorescei n-PEG4-A I kane-3',5'-Bisphos ph ate-Cytid ine (5/6-FP4A-3',5'-pCp) NH2 O I~..~I INI NN u .. H H OrFi O=P\ Des exemples de composés avec des marqueurs de masse comprennent, mais sans s'y limiter, les suivants : 23 Mass Reporter H2p0 OH O TMT-PEG4-AI ka ne-3',5'-Bisphos phate-Cytidine (TMTP4A-3',5'-pCp) NH2 0 O; N'es NN N J H H] Balance Reporter Group Group iTRAQ-PEG4-AI kane-3',5'-Bisphos phate-Cytidine (1TRAQP4A-3', 5'-pCp) Cleavable Linker O O O HH H Balancer R e p o rt e r Des exemples de composés avec un marqueur de spin comprennent, mais sans s'y limiter, les suivants : O=P\ Mass 0~ Normalizer NH2 O O N N N N P-16H O'N' Cleavable Linker D iART-P EG4-Alkane-3',5'-Bis phos phate-Cytidine (DIARTP4A-3',5'-pCp) NH2 O O NN" H H OH Proxy I-PEG4-AI kane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (PP4A-3',5'-pCp) 24 TEMPO-PEG4-AI kane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (TP4A-3',5'-pCp) Un exemple de composé contenant de la desthiobiotine est : NH2 O O NN" OOON H H 0N Desthiobiotine-PEG4-Alkane-3',5'-BIsphosphate-Cytidine (DP4A-3',5'-pCp) OH Des exemples de composés avec un clivage alternatif comprennent, mais sans s'y limiter, les suivants : 0 HN)NH H H"' ON Base clivable Bioti ne-PEG4-Ester-Alkane-3',5'-Bisphos phate-Cytidine (BP4EA-3',5'-pCp) NH2 O N NÂO H ON O 0 N 0 N H H Photoclivable Biotine-PEG4-Photo-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (BP4PA-3',5'-pCp) 25 O HN)LNH H
Hl H H S Biotine-PEG4-Acide-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (BP4AA-3',5'-pCp) clivable par acide Un mode de réalisation est une trousse pour marq er l'ARN avec le composé décrit précédemment. Dans un mode de réalisation, la trousse contient le ou les composé(s), la ligase, le tampon de ligase, et des instructions de marquage. Dans un mode de réalisation, la trousse contient des composants supplémentaires de trousse pour améliorer l'efficacité de ligature, y compris du polyéthylène glycol en tant que réactif d'exclusion stérique et DMSO pour relaxer la structure secondaire. Dans un mode de réalisation, la trousse comprend également un ARN témoin qui ligature avec plus de 75 % d'efficacité, et un témoin d'AN biotinylé synthétique pour évaluer l'efficacité de ligature. Les instructions comprennent les procédés pour une réaction typique de ligature en utilisant les réactifs énumérés et/ou des instructions pour une utilisation d'un acide nucléique comprenant le nucléotide marqué dans un procédé, tel que mobilité, transfert de Northern, pull-down assay, ou hybridation in situ. Dans un mode de réalisation, la trousse contient un composé décrit où le sucre est le ribose, la base purine ou pyrimidine est C, m est 3, Lnk est HN NHH H H,,,, O Biotine-PEG4-NN-Alkane-3',5'-Bisphosphate-Cytidine (BP4NNA-3',5'-pCp) réductible par clivage NH2 O yy N~/~ /~ H ÂO O=P- H ON' HÔ=PRO OH 0 AI-CH2-(-CH2OCH2*CH2-A2 X n Al-X-A3-CH2-(-CH2OCH2*CH2-A2 Aùn ou O Il o n est 4, AI est ùCùNHù, A2 est ùNHùCù, et lorsqu'il est présent, A3 est ùNHùCù et Obs est choisi dans le groupe constitué de la biotine, un fluorophore, et un azothydrure.
Pour les analyses de mobilité, un excès de l'ARN marqué a été incubé avec une solution contenant la protéine, l'ARN, ou l'ADN d'intérêt dans un tampon de liaison optimisé. Les conditions 26 d'incubation ont été déterminées de façon empirique ; le temps d'incubation allait typiquement de 5 minutes à 1 heure, les températures d'incubation allaient typiquement de 4 °C à la température ambiante (19 °C à 22 °C). La réaction de liaison a été ensuite soumise à une électrophorèse pour séparer les complexes de liaison d'ARN de la sonde libre. Le complexe d'ARN déplacé a été ensuite détecté en-gel, ou transféré vers une membrane chargée positivement et détecté en utilisant des réactifs de détection secondaires (c'est-à-dire, avec un chromogène, ou par chimiluminescence). Pour le transfert de Northern, l'ARN marqué a été utilisé pour la détection de l'ARN qui avait été séparé par électrophorèse et transféré sur une membrane. L'ARN marqué a été dénaturé pendant 5 à 10 minutes à 95 °C et refroidi rapidement sur de la glace jusqu'à moins de 10 °C. La sonde dénaturée a été ensuite ajoutée à une solution d'hybridation optimisée et incubée avec la membrane à une température déterminée de façon empirique pendant au moins 1 heure, mais jusqu'à toute une nuit. La membrane a été ensuite lavée et l'ARN a été détecté en utilisant des réactifs de détection secondaires (c'est-à-dire, chromogène, par chimiluminescence). Pour une analyse en utilisant un ARN marqué pour enrichir en un composant, que la substance contenant le composant ait été liée à une puce, une résine, etc. (par exemple, une analyse « pulldown »), l'ARN marqué a été incubé dans une réaction de liaison contenant la protéine, l'ARN ou l'ADN d'intérêt, un tampon de liaison optimisé, et une résine d'affinité. La résine a été ensuite lavée, le complexe d'ARN a été élué, et la protéine, l'ADN ou l'ARN d'intérêt a été détecté en utilisant des techniques comprenant, mais sans s'y limiter PCR, RT-PCR, buvardage de Western, ou micromatrice. Pour l'hybridation in situ, l'ARN marqué est utilisé en tant que sonde pour la détection de l'ARN ou du complexe d'ARN d'intérêt dans des cellules. L'ARN marqué peut être utilisé après que les cellules aient été fixées sur un support (c'est-à-dire une lame de microscope, une lamelle, un plateau en tissu, un micro-puits, etc.), ou en suspension pour une analyse de cytométrie en flux. De manière similaire, l'ARN marqué peut être transfecté dans des cellules vivantes, et détecté directement ou en utilisant des réactifs secondaires. L'ARN ou le complexe d'ARN est visualisé en utilisant des techniques comprenant, mais sans s'y limiter la microscopie optique ou fluorescente, une analyse de cytométrie en flux, ou une micromatrice. Dans les expériences décrites par la suite, on a utilisé l'ARN ligase T4 pour marquer l'ARN avec du cytidine 3',5' biphosphate biotinylé. Plusieurs molécules ont été synthétisées pour optimiser le nucléotide pour une efficacité de ligature et une fonctionnalité optimales, par exemple, la conservation de l'interaction de l'ARN marqué avec d'autres ARN ou protéines cellulaires. Trois liaisons alkyle différentes ont été testées, y compris alcyne, alcène, et alcane, en combinaison à la fois avec des segments espaceurs LC (chaîne longue), SC (chaîne courte), et PEG, comme illustré sur les figures 1 à 3. Les molécules ont été testées pour l'efficacité de ligature et la fonctionnalité en utilisant des témoins de mobilité électrophorétique (EMSA) établis. Dans une analyse de mobilité, une sonde d'ARN marqué est incubée avec un lysat cellulaire contenant la ou les protéine(s) d'intérêt dans une réaction de liaison. La réaction subit ensuite une électrophorèse sur un gel non dénaturant. La sonde non liée 27 migrera vers le bas du gel, alors que la sonde liée à une protéine migrera plus lentement, en entraînant un retardement sur gel. Les nucléotides contenant alcyne-LC et alcyne-SC se sont ligaturés avec une bonne efficacité ; cependant, la liaison alcyne était réactive dans les lysats cellulaires. Dans un système purifié utilisant un modèle d'ARN polymérase et d'ARN polymérase purifiée, les composés alcyne ont produit un retardement sur gel fonctionnel (figure 4 A), alors que le composé alcyne n'a pas produit de retardement sur gel fonctionnel avec le témoin élément réactif au fer (IRE)ûprotéine réactive au fer (IRP) en utilisant un extrait cytosolique de foie (figure 4B). Lorsque l'extrait de foie a été mélangé avec l'ARN polymérase purifiée, le retardement sur gel a été affecté, ce qui suggère que le composé alcyne est réactif avec l'extrait de foie (figure 4C). Des résultats similaires ont été obtenus avec les composés alcène, où le témoin IRE-IRP s'est ligaturé, mais n'a pas produit un retardement sur gel fonctionnel (figure 5). Le nucléotide contenant la liaison alcane et le segment espaceur PEG a été le composé le plus optimal à la fois pour l'efficacité de ligature et pour la fonctionnalité (figure 6). En utilisant la molécule de biotine-PEG4-alcane 3,5 cytidine bisphosphate, des conditions optimales de ligature ont été déterminées. Les conditions décrites ont donné des efficacités de ligature supérieures à 70 % et, dans certains cas, supérieures à 90 %, en fonction de la structure secondaire de l'ARN et des conditions de ligature. Une réaction standard avait un rapport de ligature de donneur sur accepteur supérieur à 20:1. Le tampon de réaction contenait 20 U à 40 U d'ARN ligase T4, 40 U d'inhibiteur d'ARNase, 50 mM de Tris-HG!, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 1 mM d'ATP (pH 7,8 à 25 °C), et 15 % de polyéthylène glycol (PEG, Mr 20 000). Pour obtenir des efficacités de ligature supérieures à 70 %, les réactions ont été incubées à 37 °C pendant 30 minutes, ou à 16 °C de 30 minutes à 24 heures, en fonction de la longueur de l'ARN et de la structure secondaire. Dans un mode de réalisation, les réactions contenaient 25 pmol à 50 pmol d'ARN, 1 nmol de nucléotide biotinylé, et 20 U à 40 unités d'ARN ligase T4 dans un volume de réaction de 30 pL. Un excès de nucléotide biotinylé n'a pas affecté les efficacités de ligature, et une plage de 1 pmol d'ARN à 200 pmol d'ARN a été testée dans la réaction de ligature. La concentration de PEG allait de 5 % à 20 %. Comme illustré dans le tableau ci-dessous, les conditions de ligature ont été évaluées en utilisant plusieurs espèces d'ARN, variant en longueur, complexité, et fonction pour démontrer l'efficacité de la réaction de ligature réaction en utilisant un ARN de complexité et longueur variables. L'ARN a été dérivé des régions non traduites 3' (UTR) d'ARNm (28 à 42 nucléotides), de miARN (22 à 80 nucléotides), et d'ARN catalytique (451 nucléotides). L'ARN a été dérivé par voie synthétique, ou à partir de réactions de transcription in vitro. Description Source d'ARN Longueur Conditions (bases) optimales de réaction IRE (élément réactif Élément UTR synthétique 28 2 h à 16 °C au fer) 5' ou 3' ARN de modèle ARN synthétique 42 30 minutes, 37 °C d'ARN polymérase >1 h 16 °C mir-16-1 micro ARN synthétique 22 toute une nuit 16 °C 28 mature TNF ARE Élément UTR synthétique 37 2 h à 16 °C. 3' Let-7 pré-miARN transcription in -70 toute une nuit à 16 °C vitro hTR ARN transcription in 451 toute une nuit à 16 °C catalytique vitro COX-76 ARE Élément UTR transcription in -70 toute une nuit à 16 °C 3' vitro mir-16-1 pré-miARN transcription in -70 toute une nuit à 16 °C vitro Les efficacités de ligature ont été supérieures à 70 % avec des réactions utilisant 25 à 50 pmol d'ARN, 1 nmol de nucléotide biotinylé, 20 à 40 U d'ARN ligase T4, 40 U d'inhibiteur d'ARNase, 50 mM de Tris-HCI, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 1 mM d'ATP (pH 7,8 à 25 °C), et 15 % de PEG (Mr 20 000). Les efficacités de ligature ont été améliorées pour les ARN avec une structure secondaire ou longueur d'ARN étendue en chauffant brièvement avant la réaction de ligature ; les températures de chauffage allaient de 80 à 90 °C pendant 1 à 5 minutes, ce qui a été suivi par un refroidissement rapide sur de la glace pendant au moins 1 minute et jusqu'à plusieurs heures. Dans certains cas, l'ajout de DMSO à 25 % avant le chauffage a amélioré l'efficacité de ligature. L'ordre d'addition des composants réactionnels n'avait pas d'importance, à l'exception du PEG, qui a été ajouté en dernier. Plusieurs variétés de PEG ont été testées, y compris des masses moléculaires de 1500, 6000, 8500, et 20 000. Bien que le PEG (Mr 20 000) ait le mieux amélioré l'efficacité de ligature, les autres molécules de PEG étaient acceptables, et d'autres molécules d'exclusion stérique seraient également acceptables. Une concentration en PEG de 15 % était optimale. D'autres concentrations en PEG pourraient également être utilisées, allant de 5 à 20 %. Les efficacités de ligature ont été évaluées en utilisant l'hybridation sur tache et la densitométrie de points quantitative. Un ARN biotinylé par voie synthétique a été utilisé en tant que témoin où l'on a supposé 100 % de biotinylation. L'ARN marqué provenant de la réaction de ligature et l'ARN marqué par voie synthétique ont été d'abord normalisés à la concentration, puis dilués en séries pour déterminer l'efficacité. Un petit volume a été appliqué (tacheté) sur une membrane en nylon chargée positivement. La membrane a été réticulée en utilisant un rayonnement ultraviolet (UV). L'ARN biotinylé a été détecté en utilisant un substrat de streptavidine peroxydase du raifort (HRP) et une détection chimiluminescente. Les points non saturants, qui sont des points où la valeur d'intensité de densitométrie n'a pas été saturée, ont été quantifiés en utilisant une densitométrie. Pour déterminer l'efficacité de ligature, l'ARN marqué a été comparé à l'étalon témoin pour déterminer l'efficacité. Pour déterminer la reproductibilité du marquage, les échantillons ont été appliqués (tachetés) en triple pour deux des échantillons d'ARN pour la variabilité intra-analyse, et chaque ligature avec les conditions optimisées a été répétée au moins trois fois indépendantes pour la variabilité inter-analyse. Pour déterminer l'intégrité du marquage, l'ARN marqué a été séparé par électrophorèse sur un gel contenant 5 % d'acrylamide/8 M d'urée (gel dénaturant), l'ARN a été transféré sur une membrane de nylon et a 29 été détecté par chimiluminescence. Les résultats ont indiqué que les sondes marquées étaient de grande qualité, de la bonne taille, et présentaient ou une dégradation minimale ou ne présentaient aucune dégradation. L'ARN transcrit in vitro a été dérivé par transcription à partir d'un plasmide digéré contenant la séquence d'intérêt encadrée par un site de liaison de polymérase T7 et site d'enzyme de restriction de telle sorte que seul l'ARN d'intérêt est transcrit. L'ARN transcrit in vitro a été également dérivé par transcription des amorces complémentaires contenant un élément de séquence de liaison d'ARN polymérase T7. Le plasmide digéré a été purifié par extraction avec du phénol:chloroforme et une précipitation à l'éthanol. Les amorces complémentaires ont été annelées dans une réaction contenant 25 pM de chaque amorce dans 10 mM de tampon Hepes (pH 7,3). Les réactions ont été incubées à 95 °C pendant dix minutes, ce qui a été suivi d'un refroidissement lent à température ambiante pendant au moins dix minutes, suivi par une incubation sur de la glace. Les réactions de transcription contenaient typiquement 500 ng à 1 pg d'ADN, 0,5 mM de chacun parmi ATP, CTP, UTP, et GTP, 1X tampon de transcription, 30 U d'ARN polymérase T7, et 40 unités d'inhibiteur d'ARNase. Les réactions ont été incubées pendant 30 minutes à 1 heure à 37 °C. L'ADN a été digéré pendant dix minutes avec de l'ADNase I dépourvue d'ARNAse à 37 °C, ce qui a été suivi par une inactivation avec de I'EDTA. L'ARN a été ensuite précipité de façon sélective avec de l'éthanol, et la pureté de la transcription a été déterminée par électrophorèse ou sur gel d'agarose ou sur gel de polyacrylamide non dénaturant. L'ARN précipité a été ensuite quantifié par spectroscopie UV (absorbance à 260 nm/280 nm), et on a utilisé 25 pmol à 50 pmol d'ARN dans chaque réaction de ligature. La fonctionnalité de l'ARN marqué a été déterminée en analysant une interaction connue de l'ARN pour s'assurer que le marqueur d'extrémité 3' a perturbé de façon minimale la structure secondaire. La fonctionnalité de l'élément réactif au fer (IRE) marqué, au modèle d'ARN polymérase, et au micro-ARN let-7 a été déterminée par analyse de mobilité électrophorétique (EMSA) d'ARN. La source de protéines comprenait de l'extrait de foie cytosolique contenant un élément réactif au fer-protéine réactive au fer (IRE-IRP), un lysat de surexpression de lin-28 (let-7-lin28), et de l'ARN polymérase de noyau purifiée (Epicentre). Des dilutions de chaque ARN (nM) ont été incubées avec la protéine d'intérêt dans une réaction de liaison 1X contenant 10 mM d'HEPES (pH 7,3), 20 mM de KCI, 1 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 2,5 à 10 pg d'ARNt, et 5 % de glycérol pendant 15 à 30 minutes à température ambiante (environ 20 à 22 °C). Les conditions optimales de liaison ont été obtenues pour le modèle d'ARN polymérase en remplaçant l'ARNt par de l'albumine de sérum bovin (BSA), et en augmentant la concentration en DTT à 3 mM et la concentration en KCI à 40 mM pour l'interaction let-7-Iin28. Les compositions de réaction de liaison ont été séparées par électrophorèse sur gels de retardement d'ADN natifs à 6 % d'acrylamide pendant une heure, 100 V, ou à température ambiante ou à 4 °C. L'ARN a été ensuite transféré vers une membrane de nylon chargée positivement, réticulé (rayonnement UV), puis détecté par chimiluminescence. Trois réactions de liaison ont été évaluées pour chaque ARN marqué : 1) la migration et l'intensité de la sonde libre qui a migré vers le bas du gel ; 30 ) l'intensité de l'ARN marqué avec la protéine, entraînant un retardement sur gel du complexe ARN-protéine ; et 3) la réaction de compétition de l'ARN marqué et de l'ARN non marqué avec la protéine (figure 6). Chaque réaction de retardement sur gel a été répétée trois fois avec trois ARN marqués indépendamment. Chacune des 3 sondes marquées à l'extrémité a pu se lier fonctionnellement à ses protéines respectives et produire un retardement sur gel solide, comme illustré pour l'interaction modèle d'ARN-ARN polymérase (figure 6A), l'interaction IRE-IRP (figure 6B), et l'interaction let-7-lin28 (figure 6C). Chaque sonde a été également fonctionnelle au niveau nanomolaire, indiquant que la réaction de marquage à 50 pmol était suffisante pour les études EMSA. Dans un mode de réalisation, la biotine ou un autre fragment approprié, connu du spécialiste de la technique, sur le nucléotide marqué sert de poignée d'affinité pour isoler les complexes ARN:protéine. La fonctionnalité d'un ARN marqué à la biotine décrit pour servir de poignée d'affinité pour isoler des complexes d'ARN (contenant de l'ARN, de l'ADN, de l'ARN et de l'ADN, ou une protéine) en utilisant une résine d'affinité, une perle, ou une puce de détection (par exemple, pull-down) a été déterminée en utilisant une résine de streptavidine agarose et la résonance de plasmon de surface. IRE-ARN (SEQ ID No.: 1) a été marqué en utilisant du biphosphate de cytidine biotinylé, et de l'ARN ligase T4. La protéine IRP, qui lie les séquences d'ARN IRE, a été clonée en un vecteur contenant un marqueur HA et traduite in vitro en utilisant un système de transcription/traduction in vitro humain dépourvu de cellules humaines. Avant incubation avec l'ARN biotinylé, le lysat d'IRP a été incubé avec une résine streptavidine agarose pour réduire la liaison non spécifique, et pour éliminer la biotine endogène. Le lysat d'IRP a été ensuite incubé avec l'IRE marqué, ou avec un ARN témoin non spécifique (SEQ ID No. : 2) qui a été marqué en 3' avec de la biotine, dans un tampon de liaison (10 mM HEPES, pH 7,3, 20 mM de KCI, 1 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 10 % de glycérol, 40U d'inhibiteur d'ARNase (RNasin®)) pendant 30 minutes à la température ambiante, et a été ensuite réticulé à la lumière UV (254 nm) pendant 10 minutes sur de la glace. Les réactions de liaison ont été ensuite lavées avec PBS et le complexe IRE-IRP a été élué de la résine. Après séparation par électrophorèse et transfert sur une membrane, l'IRP a été détecté en utilisant un anticorps anti-HA de souris. Les résultats sont montrés sur la figure 7. La voie 1 est 5 µL de lysat HA-IRP IVT, la voie 2 est 25 .tL de fraction en flux direct, la voie 3 est 50 µL de fraction de lavage, et la voie 4 est 25 µL de fraction éluée. La capacité de l'ARN marqué à la biotine à produire un enrichissement en complexes ARN:protéine en utilisant une puce de détection à la streptavidine immobilisée a été examinée en utilisant la résonance de plasmon de surface BiacoreTM (SPR). Les résultats apparaissent sur la figure 8 où la ligne pleine est l'ARNm témoin et la ligne discontinue est une référence (cuve à circulation 1) ; et où A = chargement témoin du modèle d'ARN biotinylé ; B = injection d'ARN Pol II ; C = ARN Pol II lié à l'ARN témoin ; et D = injection d'ARN témoin non marqué. L'ARN témoin marqué à la biotine a été capturé sur une puce de détection revêtue de streptavidine, ce qui a été suivi par une injection d'ARN 31 polymérase bactérienne. Une réponse de liaison d'ARN polymérase Il a été détectée sur la surface active d'ARN et la spécificité a été confirmée par la perte de liaison après injection de l'ARN témoin non marqué. Vingt pmol d'ARN marqué ont été diluées dans un tampon Hepes sans nucléase (pH 7,3), injectées à raison de 51,tL/min pendant quatre minutes, et capturées sur une puce de détection revêtue de streptavidine achetée dans le commerce pour le Biacore 3000®. L'ARN polymérase bactérienne (0,1 U/µL) a été ensuite injecté pendant deux minutes. Comme illustré sur la Figure 8, une réponse de liaison d'ARN polymérase Il a été détectée sur la surface active d'ARN et la spécificité a été confirmée par la perte de liaison après injection de l'ARN témoin non marqué. La spécificité a été déterminée via une compétition d'ARN polymérase de liaison avec un excès de 50 à 100 fois d'ARN modèle d'ARN polymérase non marqué qui a été injecté pendant quatre minutes. Un mode de réalisation est un procédé pour analyser de l'ARN en utilisant une sonde d'ARN marquée avec le composé décrit précédemment et en utilisant le procédé décrit précédemment. L'ARN marqué peut être synthétisé comme décrit précédemment. La sonde d'ARN marqué est mise en contact avec l'échantillon à analyser dans des conditions permettant à l'ARN marqué de s'hybrider avec l'ARN dans l'échantillon et de détecter l'hybridation dans une analyse, par exemple, de mobilité, de transfert de Northern, d'hybridation in situ, un pull-down assay, etc. en utilisant, par exemple, une molécule reporter conjuguée à la streptavidine telle qu'une enzyme, un composé fluorescent, un isotope, une particule d'or, etc. Les modes de réalisation montrés et décrits dans la description sont seulement des modes de réalisation spécifiques des inventeurs qui sont des spécialistes de la technique et ne sont en aucune façon limitants. Pour cette raison, divers changements, modifications, ou variations à ces modes de réalisation peuvent être apportés sans dévier de l'esprit de l'invention dans le champ d'application des revendications suivantes. 32

Claims (13)

  1. Revendications1. Composé de structure (I) : P1-P2-Nus-Alk-Lnk-Obs(I) ou un sel, base conjuguée, tautomère, ou forme ionisée de celui-ci, dans lequel P1 est un groupe phosphate ; P2 est un groupe phosphate ; Nus est un fragment nucléoside comprenant un sucre lié à une base purine ou pyrimidine ; Alk est un groupe de raccordement ayant la structure -//-(CH2),,-Y-//- où Y est une liaison ou un groupe formant liaison choisi parmi O O H R II II ùNù7ùNù7 -0ù,ùCù7 ùSù7ùSù7ùSi 0 1 m est un nombre entier allant de 3 à 6 inclus, et où la liaison la plus à gauche est et la liaison la plus à droite est à Lnk ; Lnk est un groupe de liaison ayant la structure et à Nus -/-Ai-CH2.-(- CH2OCH2-kH2-A2 I n Ai-X-A3-CH2--CH2OCH2*CH2-A2 I n ou où n est un nombre entier allant de 2 à 48 inclus ; AI est un groupe formant liaison choisi parmi O O O O S NR ùCH2ù , ùCù CùNHù CùOù+ùSù CùNHù CùNH O H R ùN-- 7-N ùO A2 est un groupe formant liaison choisi parmi O O S NR H R H II H Il H II H H Il H ùN ùN ùN--Cù7 ùNùSù NùCùNù NùCùN O H O H O O O O O ùNùCùN ùOùC ùSùC ùC CùNH ùCùOA3, lorsqu'il est présent, est un groupe formant liaison choisi parmi 33R H R H IIll H III H S H H II H ùN--' ùNù' ùNùCù'ùNùSù'ùNùCùNù'ùNùCùNù' Il O H O H O O O O O ùNùC--Nù'ùOùCù'ùSùCù'ùCù'ùCùNHù'ùCùO et X est un groupe clivable qui peut subir un clivage silicium-carbone, un clivage nucléophile, un clivage redox, un clivage photochimique, un clivage enzymatique, ou un clivage basé sur un échange, et la liaison la plus à gauche est à Alk et la liaison la plus à droite est à Obs ; et Obs est un marqueur observable.
  2. 2. Composé selon la revendication 1, dans lequel le sucre est un ribose ayant un site 5', un site 3', et un site 1', P1 est fixé au ribose au niveau du site 5', P2 est fixé au ribose au niveau du site 3', et la base purine ou pyrimidine est choisie parmi cytosine (C), uracile (U), adénine (A), guanine (G), or inosine (I) et est fixée au ribose au niveau du site 1'.
  3. 3. Composé selon la revendication 1, dans lequel la base purine ou pyrimidine est choisie parmi 1-méthyladénine, N6-méthyladénine, N6-isopentyladénine, N,N-diméthyladénine, 7-déaza-adénine, 2-thiocytosine, 3-méthylcytosine, N4-acétylcytosine, 2-thiocytosine, 1-méthylguanine, 2-méthylguanine, 7-méthylguanine, N2,N2-diméthylguanine, 7-déazaguanine, 2-thio-uracile, 6-thiopurine, ou 2,6-diaminopurine.
  4. 4. Composé selon la revendication 1, dans lequel le marqueur observable est un chromogène, un fluorophore, un marqueur de masse, un marqueur de spin, un marqueur de liaison de streptavidine, ou un marqueur de détection secondaire.
  5. 5. Composé selon la revendication 1, dans lequel n est un nombre entier allant de 2 à 24 inclus.
  6. 6. Composé selon la revendication 1, dans lequel le sucre est le ribose, la base purine ou pyrimidine est choisie parmi adénine (A), cytosine (C), guanine (G), uracile (U), ou inosine (I), m est 3, n est 4, et le marqueur observable est un composé de liaison de streptavidine choisi parmi la biotine, la desthiobiotine, ou l'iminobiotine.
  7. 7. Composé selon la revendication 1, dans lequel le sucre est le ribose, la base purine ou pyrimidine est la cytosine (C), m est 3, Lnk est 34Ai-CH2-(ù CH2OCH2--CH2-A2- - - A1-X-A3.CH2-(- CH2OCH2ù)ùCH2-A2ùIùn ou n dans lequel n est 4, O O O AI est ùCùNHù, A2 est ùNHùCù, et lorsqu'il est présent, A3 est ùNHùCù, et Obs est choisi dans le groupe constitué de la biotine, un fluorophore, et un azothydrure.
  8. 8. Procédé de marquage d'un acide ribonucléique (ARN), le procédé comprenant le chauffage de l'ARN dans une solution, la solution contenant éventuellement du sulfoxyde de diméthyle à une concentration allant jusqu'à 25%, à au moins 75 °C jusqu'à 95 °C, puis le refroidissement de l'ARN chauffé pendant au moins une minute à moins de 10 °C, et, la mise en contact de l'ARN chauffé et refroidi avec le composé selon la revendication 1 dans des conditions de réaction utilisant de l'ARN ligase T4 et en incluant du PEG ayant une masse moléculaire comprise entre environ 1500 et 24 000 inclus et à une concentration allant de 5 % de PEG à 20 % de PEG inclus pour ligaturer le composé selon la revendication 1 à l'ARN pour donner un ARN modifié.
  9. 9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la concentration en PEG est environ 15 %.
  10. 10. Procédé selon la revendication 8, dans lequel la masse moléculaire du PEG est 20 000.
  11. 11. Procédé selon la revendication 8, en utilisant le composé selon la revendication 1.
  12. 12. Procédé de synthèse de biotine-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate, le procédé comprenant la réaction de propargyl-trifluoro-acétamide avec de la 5-iodocytidine pour donner de la 5-[3-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine, la conversion de 5-[3-(trifluoro-acétamido)propynyl]cytidine en 5-[3-(trifluoro- acétamido)propyl]cytidine, la conversion de 5-[3-(trifluoro-acétamido)propyl]cytidine en 5-(3-aminopropyl)cytidine, la réaction de 5-(3-aminopropyl)cytidine avec de la NHS-PEG-biotine pour donner de la biotine-PEG-alcane-cytidine, et la réaction de biotine-PEG-alcane-cytidine avec du chlorure de diphosphoryle pour donner du biotine-polyéthylène glycol (PEG)-alcane-3',5'-cytidine-bisphosphate.
  13. 13. Procédé selon la revendication 12, donnant le composé selon la revendication 1. 35.Trousse comprenant le composé selon la revendication 1 et des instructions pour le marquage d'un acide ribonucléique (RNA) avec le composé. 15. Trousse comprenant composé selon la revendication 1, dans lequel Obs est la biotine, et des instructions pour capturer et/ou utiliser un acide ribonucléique (ARN) marqué avec le composé sur une matrice ou une puce. 16.Procédé d'analyse d'un analyte d'acide ribonucléique (RNA), le procédé comprenant le marquage d'un ARN avec le composé selon la revendication 1 pour donner une sonde d'ARN modifié, et la mise en contact de la sonde d'ARN modifié avec un échantillon contenant l'analyte ARN dans des conditions pour hybrider la sonde d'ARN modifié avec l'analyte ARN, et la détection de l'analyte ARN hybridé avec la sonde d'ARN modifié, l'hybridation et la détection de la sonde d'ARN modifié analysant l'analyte ARN. 17. Procédé selon la revendication 16 où l'analyse est au moins une parmi la mobilité, le transfert de Northern, le pull-down assay, ou l'hybridation in situ. 18. Procédé selon la revendication 16, où la détection utilise une molécule reporteur conjuguée à la streptavidine. 19. Procédé selon la revendication 16, où la molécule reporteur est choisie dans le groupe constitué d'enzymes, composés fluorescents, isotopes, particules d'or, et leurs combinaisons. 20. Procédé selon la revendication 16 utilisant le composé selon la revendication 1. 21. Composé ayant la structure O I I HOùPùO 1 OH HOC ~O HOùP I I O NH2 O O N1~~•0•~.0.~0~,O.-/"% N~ H H O~N HN S j NH O OH 36
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