JP5078086B2

JP5078086B2 - オリゴヌクレオチド類似体またはその塩

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Publication number: JP5078086B2
Application number: JP2007312713A
Authority: JP
Inventors: 幸夫北出; 義仁上野
Original assignee: Gifu University
Current assignee: Gifu University
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2007-12-03
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2027-12-03
Also published as: JP2009136157A

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド類似体またはその塩に関するものである。

近年、遺伝情報そのものを治療の対象としてとらえるという方法論が普及しつつある。この方法論の一つに、オリゴヌクレオチドを用いたアンチセンス法がある。アンチセンス法とは、化学合成したオリゴヌクレオチド類似体（例えば、１５〜２０の塩基対から成る一本鎖DNA）を細胞に加え、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とＤＮＡ等／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成させることにより、標的遺伝子の発現を塩基配列特異的に抑制し、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程を阻害する方法である。アンチセンス法では、病因となるウイルスまたは遺伝子の塩基配列が既知の場合、アンチセンス分子を理論的に設計し、それを合成するのが可能であることから、これまで治癒が困難と考えられてきた様々なウイルスを原因とする疾患および遺伝子疾患に対する有効な治療方法の一つとして期待されている。

また、ごく最近、オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子発現抑制法として、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ inteference、ＲＮＡ干渉）を利用した方法に、注目が集まっている。このＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡを細胞に導入することにより、同じ塩基配列を有する細胞の染色体由来のＲＮＡが分解され、切断される現象を指す。このＲＮＡｉの機構は、現在のところ、次のように考えられている。先ず、長鎖二本鎖ＲＮＡが、酵素（Ｄｉｃｅｒと呼ばれる）により３’−ＵＵ型のダングリングエンド構造を持つ２１塩基程度の長さの二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）と呼ばれる）に加水分解される。そのｓｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡとＲＮＡ／ｍＲＮＡ二本鎖核酸を形成し、この二本鎖核酸を認識する細胞内タンパク質（ＲＩＳＣ（RNA-induced Silencing Complex）と呼ばれる）と、この二本鎖核酸とが結合し、この結合体により、標的ｍＲＮＡが切断されるというものである。その結果、遺伝子の発現が抑制されるというノックダウン効果が生じる。

アンチセンス法、ＲＮＡｉを利用する方法等に用いるのには、天然型オリゴヌクレオチドに含まれるリボース環を含むオリゴヌクレオチド類似体は、化学的、生物学的に非常に不安定であるという問題があった（例えば、非特許文献１参照）。さらに、オリゴヌクレオチド類似体をアンチセンス法、ＲＮＡｉを利用する方法等で用いるためには、前記ＲＩＳＣとの結合能力が要求されるが、化学的、生物学的に不安定なオリゴヌクレオチド類似体は、通常、この結合能力が低いという問題があった。このように、化学的、生物学的に安定という特性と、優れたノックダウン効果という特性は、両立するのが困難であるという問題があった。しかし、遺伝子治療薬、ＤＮＡチップ、遺伝子診断薬等にオリゴヌクレオチド類似体を用いる場合、安定した診断結果を得るためにも、これらの特性が優れたオリゴヌクレオチド類似体の提供が望まれていた。
Eugen Uhlmann and Anusch Peyman, "Antisense oligonucleotides: a new therapeutic principle", Chemical Reviews, １９９０年、第９０巻、p.543.

そこで、本発明は、化学的、生物的安定性およびノックダウン効果の２つの特性が優れたオリゴヌクレオチド類似体の提供を目的とする。

本発明は、オリゴヌクレオチドを構成する３’末端のヌクレオシドが、式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体またはその塩である。

式（Ｉ）中、Ｒ¹は、式（１）の基、式（２）の基、式（３）の基、式（４）の基、式（５）の基、式（６）の基、式（７）の基および式（８）の基からなる群から選択されるいずれかの基であり、Ｒ²は脂溶性残基であり、ｋ１、ｌ１、ｍ１およびｎ１は、互いに独立して、１〜１０の整数である。

本発明は、このオリゴヌクレオチド類似体により、ヌクレアーゼ耐性およびノックダウン効果の２つの特性が優れたオリゴヌクレオチド類似体を提供することができる。

本発明において、「オリゴヌクレオチド」は、例えばヌクレオシドサブユニットのポリマーをいい、そのサブユニット数は特に限定されないが、例えば、２から１００個である。中でも、本発明のオリゴヌクレオチド類似体がＤＮＡである場合には、それらのサブユニット数は、３〜１００個が好ましく、３〜３０個がより好ましく、ＲＮＡである場合には、３〜５０個が好ましく、３〜３０個がより好ましい。なお、本発明における「オリゴヌクレオチド類似体」は、３’末端のヌクレオシドが式（Ｉ）のヌクレオシド類似体で置き換えられていること以外は、特に限定されない。例えば、３’末端以外のヌクレオシドについては、糖部および塩基部分は、当業者に公知な類似体であってもよい。例えば、３’末端のヌクレオシドを除くヌクレオシドの１以上は、国際公開公報ＷＯ２００６／０３０９０６号において記載の式（ＩＩ）で表わすヌクレオシド類似体でそれぞれ置き換えられていてもよい。

式（ＩＩ）中、Ｒ¹は、式（１）の基、式（２）の基、式（３）の基、式（４）の基、式（５）の基、式（６）の基、式（７）の基および式（８）の基からなる群から選択されるいずれかの基であり、ｋ２、ｌ２、ｍ２およびｎ２は、互いに独立して、１〜１０の整数である。

本発明において、Ｒ¹について、前記脂溶性残基は、式−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ²¹、−Ｏ−（ＣＨ₂）_X−Ｒ²²、−Ｏ−Ｒ²³および−ＮＨ−Ｒ²⁴からなる群から選択されるのが好ましい。前記式中、Ｒ²¹は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであり、Ｒ²²は、アリールまたは置換されたアリールであり、Ｒ²³は、アルキルまたは置換されたアルキルであり、Ｒ²⁴は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであり、ｘは１〜３の整数である。

本発明において、前記アリールとは、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素から誘導された基を意味し、例えばフェニル基、ナフチル基（１−ナフチル基、２−ナフチル基等）等が挙げられる。

本発明において、前記アルキルとは、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６の炭化水素から誘導された基を意味する。前記アルキルは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチル−１−メチルプロピル、ｎ−ヘプチル、１−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、３−メチルヘキシル、４−メチルヘキシル、５−メチルヘキシル、１−エチルペンチル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、４−エチルペンチル、１，１−ジメチルペンチル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、１−プロピルブチル、ｎ−オクチル、１−メチルヘプチル、２−メチルヘプチル、３−メチルヘプチル、４−メチルヘプチル、５−メチルヘプチル、６−メチルヘプチル、１−エチルヘキシル、２−エチルヘキシル、３−エチルヘキシル、４−エチルヘキシル、５−エチルヘキシル、１，１−ジメチルヘキシル、２，２−ジメチルヘキシル、３，３−ジメチルヘキシル、４，４−ジメチルヘキシル、５，５−ジメチルヘキシル、１−プロピルペンチル、および２−プロピルペンチルなどの直鎖状または分岐状のアルキルが挙げられる。

本発明において、前記置換されたアリールとは、前記アリールのベンゼン環上に１以上の置換基を有するものを意味する。前記置換基としては、例えば低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、ハロ低級アルキル、低級シクロアルキル、アリールオキシ、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ等が挙げられる。

また、前記置換されたアルキルとは、前記アルキルに１以上の置換基を有するものを意味する。前記置換基としては、例えばアリール、アリールオキシ、置換されたアリール、置換されたアリールオキシ、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、ハロ低級アルキル、低級シクロアルキル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ等が挙げられる。

本発明において、前記低級アルキルとしては、前記アルキルのうち、例えば炭素数１〜６、好ましくは１〜３のものである。前記低級アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、および１−エチル−１−メチルプロピル等の直鎖状または分岐状のアルキルが挙げられる。

本発明において、前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、およびヨウ素原子であり、好ましくはフッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。

本発明において、前記低級アルコキシとしては、炭素数１〜６、好ましくは１〜３の低級アルキルオキシである。前記低級アルコキシとしては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｉ−ペンチルオキシ、ｓｅｃ−ペンチルオキシ、ｔ−ペンチルオキシ、２−メチルブトキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｉ−ヘキシルオキシ、ｔ−ヘキシルオキシ、ｓｅｃ−ヘキシルオキシ、２−メチルペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、１−エチルブチルオキシ、２−エチルブチルオキシ、１，１−ジメチルブチルオキシ、２，２−ジメチルブチルオキシ、３，３−ジメチルブチルオキシ、および１−エチル−１−メチルプロピルオキシ等が挙げられる。

本発明において、前記低級アルキルチオとしては、炭素数１〜６、好ましくは１〜３の低級アルキルチオである。前記低級アルキルチオとしては、例えばメチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、ｉ−ペンチルチオ、ｓｅｃ−ペンチルチオ、ｔ−ペンチルチオ、２−メチルブチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、ｉ−ヘキシルチオ、ｔ−ヘキシルチオ、ｓｅｃ−ヘキシルチオ、２−メチルペンチルチオ、３−メチルペンチルチオ、１−エチルブチルチオ、２−エチルブチルチオ、１，１−ジメチルブチルチオ、２，２−ジメチルブチルチオ、３，３−ジメチルブチルチオ、および１−エチル−１−メチルプロピルチオ等が挙げられる。

本発明においては、前記ハロ低級アルキルとしては、炭素数１〜６、好ましくは１〜３の低級アルキルの１以上、好ましくは１〜３の水素原子がハロゲン原子で置き換えられたものである。前記ハロ低級アルキルとしては、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ブロモメチル、ジブロモメチル、トリブロモメチル、１−フルオロエチル、１−クロロエチル、１−ブロモエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、１，２−ジフルオロエチル、１，２−ジクロロエチル、１，２−ジブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ヘプタフルオロエチル、１−フルオロプロピル、１−クロロプロピル、１−ブロモプロピル、２−フルオロプロピル、２−クロロプロピル、２−ブロモプロピル、３−フルオロプロピル、３−クロロプロピル、３−ブロモプロピル、１，２−ジフルオロプロピル、１，２−ジクロロプロピル、１，２−ジブロモプロピル、２，３−ジフルオロプロピル、２，３−ジクロロプロピル、２，３−ジブロモプロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル、２−フルオロブチル、２−クロロブチル、２−ブロモブチル、４−フルオロブチル、４−クロロブチル、４−ブロモブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロブチル、パーフルオロブチル、２−フルオロペンチル、２−クロロペンチル、２−ブロモペンチル、５−フルオロペンチル、５−クロロペンチル、５−ブロモペンチル、パーフルオロペンチル、２−フルオロヘキシル、２−クロロヘキシル、２−ブロモヘキシル、６−フルオロヘキシル、６−クロロヘキシル、６−ブロモヘキシル、パーフルオロヘキシル、２−フルオロヘプチル、２−クロロヘプチル、２−ブロモヘプチル、７−フルオロヘプチル、７−クロロヘプチル、７−ブロモヘプチル、およびパーフルオロヘプチル等が挙げられる。

本発明において、前記低級シクロアルキルとしては、炭素数３〜７の脂環式アルキルである。前記低級シクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチル等が挙げられる。

本発明において、前記アリールオキシとしては、アリール部分は前記アリールについて定義したものである。

本発明において、前記置換されたアリールオキシとしては、置換されたアリール部分は前記置換されたアリールについて定義したものである。

本発明において、Ｒ¹について、前記式−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ²¹中、前記のようにＲ²¹は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであるのが好ましい。前記Ｒ²¹中のアリールとしては、フェニルが好ましい。また、前記Ｒ²¹中の置換されたアリールとしては、低級アルキル、ハロゲン原子および／またはニトロで置換されたフェニルが好ましく、メチル；臭素、フッ素；ニトロで置換されたフェニルがより好ましく、ｐ−ニトロフェニルがさらに好ましい。前記Ｒ²¹中のアルキルとしては、炭素数１〜６のアルキルが好ましく、炭素数１〜３のアルキルがさらに好ましく、メチルがより好ましい。前記Ｒ²¹中の置換されたアルキルとしては、低級アルコキシおよび／またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜６のアルキルが好ましく、低級アルコキシおよび／またはハロゲン原子で置換された炭素数１〜３のアルキルがより好ましく、トリフルオロメチルがさらに好ましい。

本発明において、Ｒ¹について、前記式−Ｏ−（ＣＨ₂）_X−Ｒ²²中、前記のようにＲ²²は、アリールまたは置換されたアリールであり、ｘは１〜３の整数であるのが好ましい。前記Ｒ²²中のアリールとしては、フェニルが好ましい。また、前記Ｒ²²中の置換されたアリールとしては、低級アルコキシ、ハロゲン原子、および／またはニトロで置換されたフェニルが好ましく、メトキシおよび／またはニトロで置換されたフェニルがより好ましく、メトキシフェニル、ジメトキシフェニル、ニトロフェニルがさらに好ましい。

本発明において、Ｒ¹について、前記−Ｏ−Ｒ²³中、前記のようにＲ²³は、アルキルまたは置換されたアルキルが好ましい。前記Ｒ²³中のアルキルとしては、炭素数１〜６のアルキルが好ましく、炭素数１〜４のアルキルがより好ましい。前記Ｒ²³中の置換されたアルキルとしては、アリールオキシおよび／または低級アルコキシで置換された炭素数１〜６のアルキルが好ましく、ベンジルオキシ、メトキシおよび／またはｔ−ブトキシで置換された炭素数１〜３のアルキルが好ましく、ベンジルオキシメチル、メトキシメチル、ｔ−ブトキシメチルがさらに好ましい。

本発明において、Ｒ¹について、前記−ＮＨ−Ｒ²⁴中、前記Ｒ²⁴は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルが好ましく、アリールがより好ましく、フェニルがさらに好ましい。

本発明において、その塩とは、例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等などが挙げられる。無機塩基との塩の例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。本発明において、その塩とは、薬理学的に許容される塩が好ましい。

本発明において、ｋ１、ｌ１、ｍ１およびｎ１は、互いに独立して１〜１０の整数であり、好ましくは１〜６の整数である。ｋ１、ｌ１、ｍ１およびｎ１は、同一または異なっていてもよい。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドを構成する３’末端のヌクレオシドが、式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体またはその塩である。例えば、オリゴヌクレオチドを構成する３’末端のヌクレオシドのみが、前記ヌクレオシド類似体で置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体は、以下の式で表される。

前記式中、Ｒ¹¹¹およびＲは、互いに独立して、前記式（１）の基、前記式（２）の基、前記式（３）の基、前記式（４）の基、前記式（５）の基、前記式（６）の基、前記式（７）の基および前記式（８）の基からなる群から選択されるいずれかの基であり、ｋ１、ｌ１、ｍ１およびｎ１は、互いに独立して、１〜１０の整数である。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよい。オリゴヌクレオチド類似体が、二本鎖である場合、前記二本鎖オリゴヌクレオチドの一方または両方の一本鎖オリゴヌクレオチドを構成する３’末端のヌクレオシドが、式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えられていてもよい。

オリゴヌクレオチド類似体が一本鎖である場合、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、二本鎖形成能を有するのが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチド類似体が、天然型オリゴヌクレオチドと二本鎖形成能を有すれば、アンチセンス、遺伝子検出等のため用いることができるからである。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、ヌクレアーゼ耐性であるのが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチド類似体が、細胞内に取り込まれた際、ヌクレアーゼで分解されるのを防ぐことができ、その結果、オリゴヌクレオチド類似体の細胞内での活性を、持続させることが可能だからである。

本発明の遺伝子発現抑制剤は、本発明のオリゴヌクレオチド類似体を含む。このような遺伝子発現抑制剤は、オリゴヌクレオチド類似体が、例えば、ｓｉＲＮＡやアンチセンスとして作用し、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。

本発明の医薬組成物は、遺伝子発現に伴う疾患を治療するためであり、前記遺伝子発現抑制剤を含むものである。遺伝子発現に伴う疾患、例えば、あるタンパク質が発現されることにより疾患が引き起こされる場合、この医薬組成物により、その遺伝子発現を抑制し、その遺伝子発現に伴う疾患を治療するのに用いることが可能である。

本発明の検査キットは、本発明のオリゴヌクレオチド類似体を含み、前記オリゴヌクレオチド類似体が、検体中の遺伝子とハイブリッド形成することにより、前記遺伝子が検査されるキットである。このようなキットとしては、例えば、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられる。このキットには、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の他に、ウエルとオリゴヌクレオチド類似体等とが固定されたプレート、ファイバー、バイオチップ等の固定化担体等が挙げられる。このようなキットには、前記オリゴヌクレオチド類似体等のほかに、例えば、薬物、反応して発色する発色試薬、検出を容易にする検出試薬等を含んでもよい。

ＤＮＡチップとしては、一般に、ガラス基板上に既知遺伝子配列を用いた本発明のオリゴヌクレオチド類似体を含む溶液をスポットして固定化したものや、ガラス基板上で本発明のオリゴヌクレオチド類似体を合成することによって固定化したもの等がある。前記ＤＮＡチップは、例えば、検体中の遺伝子を、前記オリゴヌクレオチド類似体を固定化した分析部にアプライし、前記遺伝子と基板上のオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリッド形成を、例えば、蛍光色素等により検出することによって、目的遺伝子の発現の有無を検出できる。このようなＤＮＡチップによれば、例えば、少量の試料でも有効に分析が可能であり、また、多種のＤＮＡプローブを一つの基板に固定化できるため、一つのＤＮＡチップにおいて同一検体につき、多項目の分析を行うことができる。

本発明の遺伝子発現抑制方法は、オリゴヌクレオチド類似体を用いて、遺伝子の発現を抑制する方法である。この方法では、オリゴヌクレオチド類似体が、例えば、ｓｉＲＮＡやアンチセンスとして作用し、標的遺伝子のｍＲＮＡを切断したり、標的遺伝子のｍＲＮＡと二本鎖を形成等して、その結果、遺伝子発現を抑制することができる。

次に、本発明のヌクレオシド類似体を製造するための製造方法について、例を挙げて説明する。このような製造方法により、従来にはない化学構造を有する、本発明のヌクレオシド類似体の製造が可能になった。以下の製造方法は、本発明のヌクレオシド類似体を製造するための製造方法の一例であって、この製造方法に限定されるものではない。

まずオリゴヌクレオチド類似体が一本鎖である場合、その製造方法は、例えば、式（ＩＩＩ）で表わされる固相合成用ユニット化合物のＲ¹⁴を除去して式（ＩＶ）で表わされる固相合成用ユニット化合物を得、その式（ＩＶ）の化合物の遊離の水酸基にヌクレオチドを伸長させ、その後、固相担体から切り出して本発明のヌクレオシド類似体を得る工程を含む。

前記式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）中、
Ｒ³は、前記式（１）の基、前記式（１）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（２）の基、前記式（２）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（３）の基、前記式（３）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（４）の基、前記式（４）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（５）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（６）の基、前記式（６）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（７）の基、前記式（７）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（８）の基、および前記式（８）の基において、その官能基が保護基で保護された基からなる群から選択されるいずれかの基であり、
Ｒ²は脂溶性残基であり、
Ａは、式−（ＣＨ₂）_n−で表わされる基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｍは、固相担体であり、
前記式（ＩＩＩ）中、Ｒ¹⁴は、保護基である。

前記固相担体とは、固相合成でＤＮＡ、ＲＮＡ等を合成するのに適した固相担体であれば限定されず、たとえば、ＣＰＧ（コントロール細孔ガラス）、ＨＣＰ（High cross-linked polystyrene）等である。

Ｒ¹⁴について前記保護基とは、従来公知の１級アルコ−ルの保護基を用いることができる。そのような保護基としては、例えば、tert−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、tert-ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、（９−フェニル）キサンテン−９−イル［ピキシル（pixyl）］、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、メトキシメチル（ＭＯＭ）等が、挙げられる。

Ｒ³について、官能基が保護されている保護基は、核酸化学において公知な保護基から選択される。例えば、ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリル（ｉＢｕ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）、アリルオキシカルボニル（ＡＯＣ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチレン等が、そのような保護基として用いられうる。

Ｒ³について、式（１）で表された基の官能基が保護基で保護された基、式（２）で表された基の官能基が保護基で保護された基、式（３）で表された基の官能基が保護基で保護された基、式（４）で表された基の官能基が保護基で保護された基および（５）で表された基の官能基が保護基で保護された基としては、例えば、下記式

で表される基等が挙げられる。

前記固相合成用ユニット化合物の遊離の水酸基にヌクレオチドを伸長させるには、オリゴヌクレオチド合成分野で従来公知の技術を用いて、オリゴヌクレオチド類似体の配列に従い、ヌクレオシドを順次カップリングさせて行うことができる。

なお、ヌクレオシド、カップリング試薬、脱保護試薬、洗浄試薬等は、通常核酸固相合成に用いられるものを用いる。得られた固相担体上のオリゴヌクレオチド類似体は、固相担体から切り出して、粗オリゴヌクレオチド類似体を得ることができる。オリゴヌクレオチド側鎖の脱保護は、必要であれば、固相担体の切り出しの前、同時および／または後に行ってもよい。切り出しに用いる試薬は、固相担体およびリンカー（固相担体とオリゴヌクレオチド類似体を接続する部分）構造等に応じて、従来公知の試薬から、適宜選択することができる。この粗オリゴヌクレオチド類似体は、必要であれば、ＨＰＬＣ等で精製してもよい。

次に、オリゴヌクレオチド類似体が二本鎖である場合の製造について例を挙げて説明する。例えば前記のような方法に従い、一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体をまず製造する。そのオリゴヌクレオチド類似体と相補的な配列を有する、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドも別途、従来公知の方法に従い、製造する。次いで、得られた一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体をアニーリング用緩衝液（例えば、１００ｍＭのＫＯＡｃ水溶液、２ｍＭのＭｇＯＡｃ溶液、および３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）を含む緩衝液）中に溶解させたものと、一本鎖の天然オリゴヌクレオチドをアニーリング用緩衝液中に溶解させたものとを、例えば混合し、９５℃で５分間処理し、その後、徐々に２５℃まで冷却させて、二本鎖のオリゴヌクレオチド類似体を得ることができる。この二本鎖のオリゴヌクレオチド類似体は、必要に応じて、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿等をさらに行って、単離精製することができる。なお、前記一本鎖の天然オリゴヌクレオチドの代わりに、前記のような方法に従い、一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体を用いてもよい。そのような方法により、二本鎖のオリゴヌクレオチド類似体を得てもよい。

なお、ヌクレオシド、カップリング試薬、脱保護試薬、洗浄試薬等は、通常核酸固相合成に用いられるものを用いる。得られた固相担体上のオリゴヌクレオチド類似体は、必要であればオリゴヌクレオチド側鎖の脱保護を行った後、固相担体から切り出して、粗オリゴヌクレオチド類似体を得る。切り出しに用いる試薬は、固相担体およびリンカー（固相担体とオリゴヌクレオチド類似体を接続する部分）構造等に応じて、従来公知の試薬から、適宜選択することができる。この粗オリゴヌクレオチド類似体は、必要であれば、ＨＰＬＣ等で精製してもよい。

前記製造方法で用いる固相合成用ユニット化合物（ＩＩＩ）は、例えば、式（ＩＩＩ−１）で表わされる化合物は、以下のような方法で製造することができる。これを、スキーム２を参照しながら説明する。

前記式中、Ｒ³は、前記式（１）の基、前記式（１）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（２）の基、前記式（２）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（３）の基、前記式（３）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（４）の基、前記式（４）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（５）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（６）の基、前記式（６）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（７）の基、前記式（７）の基において、その官能基が保護基で保護された基、前記式（８）の基、および前記式（８）の基において、その官能基が保護基で保護された基からなる群から選択されるいずれかの基である。

前記式中、Ｒ⁴は、式−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ²¹、−Ｏ−（ＣＨ₂）_X−Ｒ²²、または−Ｏ−Ｒ²³である。前記式中、Ｒ²¹は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであり、Ｒ²²は、アリールまたは置換されたアリールであり、Ｒ²³は、アルキルまたは置換されたアルキルであり、ｘは１〜３の整数である。

前記式中、ｋ１、ｌ１、ｍ１およびｎ１は、互いに独立して、１〜１０の整数である。

前記式中、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、一緒になって、式−ＣＲ¹⁶Ｒ¹⁷−で表される基であり、
Ｒ¹³およびＲ¹⁴は保護基であり、
前記Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アルコキシル基からなる群から選択されるいずれかであり、
Ｒ¹⁵は、式−ＳＯ₂−Ｒ¹⁸で表される基であり、前記Ｒ¹⁸は、低級アルキルで置換されていてもよいアリール基であり、
Ｘは、ハロゲン原子であり、
Ａは、式−（ＣＨ₂）_n−で表わされる基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｍは、固相担体である。

例えば、式（ＸＩ）で表される化合物と、式（ＸＩＩ）で表される化合物とを、任意に塩基（例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＤＡＢＣＯ等）存在下に反応させ、前記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物を得ることができる。なお、前記式（ＸＩ）で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

次に、前記式（ＸＩＩＩ）で表される化合物と、前記式（ＸＩＶ）で表される化合物とを、塩基（例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸ルビジウム、炭酸リチウム、炭酸セシウム等）および任意にクラウンエーテル（１８−クラウン−６−エーテル、２１−クラウン−７−エーテル、１５−クラウン−５−エーテル、１２−クラウン−４−エーテル等）存在下に縮合させ、下記式（ＸＶ）で表される化合物を得ることができる。なお、前記式（ＸＩＶ）で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

次に、前記式（ＸＶ）で表される化合物のＲ¹³の性質に応じた条件下（例えば、Ｒ¹³がシリル基であればテトラフルオロボランで処理）で処理してＲ¹³を除去し、その後、前記式（ＸＶＩ）で表わされる化合物と、任意に塩基（例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＤＡＢＣＯ、ピリジン等）存在下に反応させ、前記式（ＸＶＩＩ）で表される化合物を得ることができる。なお、前記式（ＸＶＩ）で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

次に、前記式（ＸＶＩＩ）で表される化合物のＲ¹¹およびＲ¹²の性質に応じた条件下で処理してＲ¹¹およびＲ¹²を除去し、その後、前記式（ＸＶＩＩＩ）で表わされる化合物と、任意に塩基（例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＤＡＢＣＯ、ピリジン等）存在下に反応させ、前記式（ＸＩＸ）で表される化合物を得ることができる。なお、Ｒ¹¹およびＲ¹²それぞれの基に応じて、公知の除去方法を選択することができる。例えば、Ｒ¹¹またはＲ¹²がtert−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、tert-ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）等のシリル基である場合、トリブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）、塩化アンモニウム等で処理することにより、Ｒ¹¹またはＲ¹²を除去することが可能である。また、例えば、Ｒ¹²およびＲ¹³が、一緒になって、式−Ｃ（ＣＨ₃）₂−で表される基である場合、酸（例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸、酢酸等）で処理することにより、Ｒ¹²およびＲ¹³を同時に除去することが可能である。

次に、前記式（ＸＩＸ）で表わされる化合物と、式（ＸＸ）で表わされる無水物とを、任意に塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−メチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に縮合させ、式（ＸＸＩ）で表わされる化合物を得ることができる。なお、式（ＸＸ）で表わされる無水物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

次に、前記式（ＸＸＩ）で表わされる化合物と、式（ＸＸＩＩ）で表わされるアミノ基を有する固相担体とを、カップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＩＩＩ−１）を得ることができる。

また、例えば、式（ＩＩＩ−２）で表わされる化合物は、前記スキーム２中の化合物（ＸＶ）で表わされる化合物から、以下のような方法で製造することができる。これを、スキーム３を参照しながら説明する。

前記式中、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、一緒になって、式−ＣＲ¹⁶Ｒ¹⁷−で表される基であり、
前記Ｒ¹⁶およびＲ¹⁷は、互いに独立して、水素原子、低級アルキル基および低級アルコキシル基からなる群から選択されるいずれかであり、
Ｒ¹³およびＲ¹⁴は保護基であり、
Ａは、式−（ＣＨ₂）_n−で表わされる基であり、前記式においてｎは１〜６の整数であり、
Ｒ²⁴は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｍは、固相担体である。

例えば、前記式（ＸＶ）で表わされる化合物のＲ¹³の性質に応じた条件下で処理してＲ¹³を除去して１級アルコールを得、それをアルデヒドまで酸化して前記式（ＸＸＩＩＩ）で表わされる化合物を得ることができる。前記酸化としては、ＰＣＣ（クロロクロム酸ピリジニウム）酸化、ＰＤＣ（二クロム酸ピリジニウム）酸化、スワーン（Swern）酸化、ＴＲＡＰ（過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム）酸化、デス・マーチン（Dess-Martin）酸化等を用いることができる。

次に、前記式（ＸＸＩＩＩ）で表わされた化合物と、式（ＸＸＩＶ）で表わされるアミンとを、任意に酸（例えば、塩化水素、パラトルエンスルホン酸等）存在下に縮合させ、シッフ塩基を得る。そのシッフ塩基を還元して、前記式（ＸＸＶ）で表わされる化合物を得ることができる。前記還元は、ＮａＣＮＢＨ₃、ＮａＢＨ₄、ＬｉＢＨ₄等を用いて行うことができる。なお、前記式（ＸＸＩＶ）で表される化合物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

次に、前記式（ＸＸＶ）で表わされる化合物のＲ¹¹およびＲ¹²の性質に応じた条件下で処理してＲ¹¹およびＲ¹²を除去し、その後、前記式（ＸＶＩＩＩ）で表わされる化合物と、任意に塩基（例えば、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ＤＡＢＣＯ、ピリジン等）存在下に反応させ、前記式（ＸＸＶＩ）で表される化合物を得ることができる。なお、Ｒ¹¹およびＲ¹²それぞれの基に応じて、公知の除去方法を選択することができる。例えば、Ｒ¹¹またはＲ¹²がtert−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、tert-ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）等のシリル基である場合、トリブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）、塩化アンモニウム等で処理することにより、Ｒ¹¹またはＲ¹²を除去することが可能である。また、例えば、Ｒ¹²およびＲ¹³が、一緒になって、式−Ｃ（ＣＨ₃）₂−で表される基である場合、酸（例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸、酢酸等）で処理することにより、Ｒ¹²およびＲ¹³を同時に除去することが可能である。

次に、前記式（ＸＸＶＩ）で表わされる化合物と、式（ＸＸ）で表わされる無水物とを、任意に塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、触媒（例えば４−メチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等）等の存在下に縮合させ、式（ＸＸＶＩＩ）で表わされる化合物を得ることができる。なお、式（ＸＸ）で表わされる無水物は、公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。

次に、前記式（ＸＸＶＩＩ）で表わされる化合物と、式（ＸＸＩＩ）で表わされるアミノ基を有する固相担体とを、カップリング試薬（例えば、ＷＳＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩））存在下に縮合させ、ユニット化合物（ＩＩＩ−２）を得ることができる。

なお、スキーム１〜３の各工程において、必要であれば、各官能基に保護基を導入したり、保護基を脱保護したり、保護基を変更してもよい。なお、官能基の種類に応じた保護基の選択、保護基の導入および保護基の除去は、当該分野で公知の方法に従い、行うことができ、例えば、「有機合成における保護基（"Protective Groups in Organic Synthesis"）, T. Greeneら著、John Wiley & Sons, Inc.出版」等を参照することができる。

本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
Ａｒ：アルゴン（Argon）
ＣＰＧ：コントロール細孔ガラス（controlled pore glass）
ＤＭＡＰ：4-ジメチルアミノピリジン（4-dimethylaminopyridine ）
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド（dimethylformamide）
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸・ジナトリウム塩・de
hydrate （ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dehydrate ）
ＨＲＭＳ：高分解能質量分析（high-resolution mass spectrometry ）
ＴＢＡＦ：トリブチルアンモニウムフルオライド（tributylammoniumfluoride）
ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ： tert−ブチルジフェニルシリルクロライド（tert-butyldiphenylsilylchloride）
ＴＢＥ：トリスホウ酸-EDTA（Tris-boric acid-EDTA）
ＴＥＡＡ：トリエチルアミン-酢酸（triethylamine-acetic acid）
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン（tetrahydrofuran）
ＴＥＭＥＤ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（N,N,N',N'-tetramethyl-ethylenediamine）
ＷＳＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・塩酸塩（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, hydrochloride）

ＣＰＧ上の化合物の活性は、以下のようにして算出した。
乾燥させたＣＰＧ６ｍｇをガラスフィルターにのせ、そこへＨＣｌＯ₄およびエタノールの混合物（ＨＣｌＯ₄：ＥｔＯＨ＝３：２）を流し込んだ。得られたろ液の吸光度（波長４９８ｎｍ（ＤＭＴｒ基の吸収波長））を測定し、その値を以下の式に代入して算出した。

前記式中、Abs.は、波長４９８ｎｍにおけるＣＰＧの吸光度であり、
Vol.は、測定したろ液の容量であり、
weightは、測定したCPGの重量である。

［機器］
ＮＭＲスペクトルは日本電子株式会社製ＪＭＲ−α４００を用いて測定した。質量分析（ＥＩ）は株式会社島津製作所製ＱＰ１０００Ａを、質量分析（ＦＡＢ、ＨＲＭＳ）は日本電子株式会社製ＪＭＳ−Ｄ３００を用いて測定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳは株式会社島津製作所製ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲｐｌｕｓを用いて測定した。吸光度は日立ハイテクノロジーズ製分光光度計Ｕ２００１スペクトロフォトメーターを用い測定した。オリゴヌクレオチド類似体の融解温度は株式会社島津製作所製ＵＶ２４５０ＵＶビジブル・スペクトロフォトメーターを用いて測定した。核酸自動合成機はアプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ジャパン株式会社製ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍＥｘｐｅｄｉｔｅ８９０９ｓｙｓｔｅｍを使用した。放射活性の測定には富士フィルム株式会社製ＦＵＪＩＸＢＡＳＳ２５００ＴＲを使用した。測定の際使用するイメージングプレートは富士フィルム株式会社製ＢＡＳ−ＩＰＭＳ２０４０を使用した。ＬｕｃＡｓｓａｙにはアトー株式会社製マイクロプレート用ルミノメータルミネッセンサーＪＮＲIIを使用した。

［実験材料］
反応溶媒として使用したＤＭＦは購入後、モレキュラーシーブス３Åまたは４Å存在下、保存したものを使用した。ピリジンは水酸化カルシウムにより脱水し蒸留、モレキュラーシーブス３Åまたは４Å存在下、保存したものを使用した。その他の試薬、及び溶媒については市販のものをそのまま用いた。ＴＬＣプレートはメルク株式会社製シリカゲル６０Ｆ₂₅₄を用いた。順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーの充填剤には和光純薬株式会社製ワコーゲルＣ−３００、関東化学株式会社製シリカゲル６０Ｎ（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ，ｎｅｕｔｒａｌ）６３〜２１０μｍを用いた。オリゴヌクレオチドの精製には日本ウォーターズ株式会社製セップパック（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８を使用した。

（製造例１）
ＣＰＧ樹脂と結合した３−（チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−（４，４’−ジメトキシトリチル）−プロパノン−１−オールの製造

（１）１−ｔ−ブチル−ジフェニルシリルオキシ−２，２−ジヒドロキシメチル−３−プロパノール（1-t-butyl-diphenylsilyloxy-2,2-dihydroxymethyl-3-propanol）の製造
ペンタエリスリトール（６．００ｇ、４４．０４ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．６０ｇ、８８．０８ｍｍｏｌ）を乾燥させ、アルゴン雰囲気下においてＤＭＦ（４００ｍｌ）に溶解させた。その溶液に、ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（１２，Ｌ、４５．９ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下して加え、その混合物を室温にて５時間撹拌した。混合物から溶媒を留去後、得られた残渣を、酢酸エチルと水から抽出した。抽出した酢酸エチル溶液を、飽和ＮａＣｌａｑで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。その酢酸エチル溶液から溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１：０〜２０：１）で精製して、無色透明オイル状の表題化合物を得た。（収量８．２８ｇ、２２．１ｍｍｏｌ、収率５０％）

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：７．５６（４Ｈ，ｓ，フェニル），７．３２（６Ｈ，ｓ，フェニル），３．５７（８Ｈ，ｄ，Ｊ＝３０．８，４−ＣＨ₂−），２．９０（３Ｈ，ｍ，３−ＯＨ），０．９８（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル）．
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：９９．１６，９７．１６，９３．５９，９１．４７，２８．９０，２８．３３，９．１６，−９．５５，−１７．２３。

（２）２，２−ジメチル−５−ｔ−ブチル−ジフェニルシリルオキシルメチル−５−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキサン（2,2-dimethyl-5-t-butyl-diphenylsilyloxylmethyl-5-hydroxymethyl-1,3-dioxan）の製造
１−ｔ−ブチル−ジフェニルシリルオキシ−２，２−ジヒドロキシメチル−３−プロパノール（７．９６ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエン安息香酸・一水和物（３．００ｇ、１５．４４ｍｍｏｌ）とを、アセトン（２５０ｍｌ）中で溶解した。その溶液に、ｏ−ギ酸エチル（２５ｍｌ）を加え、その混合物を室温で６時間攪拌した。その混合物を希アンモニア水で中和して反応を停止した後、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ＝２０：１〜５：１）で精製して、表題化合物を得た。（収量７．５７ｇ、８．９８ｍｍｏｌ、収率８６％）

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：７．６７（５Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，フェニル），７．４０（５Ｈ，ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，フェニル），３．７４（８Ｈ，ｍ，４−ＣＨ₂−），１．４０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２−ＣＨ₃），１．０６２（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル）．
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：１３５．５８，１３２．３２，１２９．８５，１２７．７７，６５．０１，６４．４５，６２．４８，６０．３６，３９．５０，２６．８０，２４．２０，２３．１０，１９．１９。

（３）２，２−ジメチル−５−ｔ−ブチル−ジフェニルシリルオキシルメチル−５−トルエンスルホニルメチル−１，３−ジオキサン（2,2-dimethyl-5-t-butyl-diphenylsilyloxylmethyl-5-tolueneslufonylmethyl-1,3-dioxan）の製造
２，２−ジメチル−５−ｔ−ブチル−ジフェニルシリルオキシルメチル−５−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキサン（６．３３ｇ、１５．２７ｍｍｏｌ）のＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍｌ）中溶液に、ＤＭＡＰ（５．６２ｇ、４５．８１ｍｍｏｌ）を加え、さらに氷冷下にて５−トルエンスルホニルメチルクロライド（５．８２ｇ、３０．５４ｍｍｏｌ）を加えて、その混合物を約５時間攪拌した。その混合物を、ＣＨ₃Ｃｌおよび飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液で抽出および洗浄した。得られた有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥し、有機溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１００：１〜２０：１）で精製して、表題化合物を得た。（収量７．８６ｇ、１３．８１ｍｍｏｌ、収率９０％）

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：７．６６（５Ｈ，ｍ，フェニル），７．３５（９Ｈ，ｍ，フェニル），３．８２（４Ｈ，ｓ，２−ＣＨ₂），３．７４（４Ｈ，ｓ，２−ＣＨ₂），１．３８（６Ｈ，ｓ，２−ＣＨ₃），１．０５（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．０５（３Ｈ，ｓ，Ｔｓ−Ｍｅ）．
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：９９．１３，９６．２６，９５．９７，９３．４２，９１．６１，９１．３３，６１．９０，３２．５７，２５．８３，２５．４２，２．９１，−９．７２，−１２．０３，−１３．８１，−１４．８１，−１７．２１。

（４）２，２−ジメチル−５−（チミン−９−イルメチル）−５−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキサン（2,2-dimethyl-5-(thymine-9-yl-methyl)-5-hydroxymethyl-1,3-dioxann）の製造
２，２−ジメチル−５−ｔ−ブチル−ジフェニルシリルオキシルメチル−５−トルエンスルホニルメチル−１，３−ジオキサン（９．９０ｇ、１７．４０ｍｍｏｌ）に、チミン（４．３９ｇ、３４．８０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．６１ｇ、２６．１０ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６−エーテル（４．２０ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を加え、一晩乾燥させた。その混合物にＤＭＦ（１５０ｍｌ）およびＤＭＳＯ（５０ｍＬ）を加え、得られた混合物を７０℃オイルバスで４８時間加熱した。その混合物から溶媒を減圧留去し、得られた残渣に、ｎ−ヘキサンおよび酢酸エチルの混合物（ｎ−Ｈｅｘ：ＥｔｏＡｃ＝１：１）および水を加えて、抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１００：１〜２０：１）で精製して白色結晶の混合物を得た（６．８８ｇ）。この混合物（６．８８ｇ）にＡｒ置換下にＴＨＦ（１２０ｍＬ）を加えて溶解させ、その溶液にＴＢＡＦ（２８ｍＬ）を加えて得られた混合物を一晩混合した。その混合物から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１００：１〜２０：１）で精製して標題化合物を得た（１．６３３ｇ、５．７４ｏｏｌ、収率３３％）。

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：８．４５（１Ｈ，ｓ，−ＮＨ−），７．１６（１Ｈ，ｓ，−ＣＨ−），４．０７（２Ｈ，ｓ，−ＣＨ₂），３．７４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２−ＣＨ₂），），３．６０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，−ＯＨ，−ＣＨ₂），３．２２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，−ＣＨ₂）１．３８（６Ｈ，ｓ，２−ＣＨ₃），１．９５（３Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃），１．０５（９Ｈ，ｓ，ｔ−ブチル），１．０５（３Ｈ，ｓ，Ｔｓ−Ｍｅ）．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）ｍ／ｚ：２８４．１３７２（Ｍ⁺）２６９，２３３，２０８，１９５，１８０．
元素分析。Ｃ₁₃Ｈ₂０Ｎ₂Ｏ₅・１／５Ｈ₂Ｏについて計算。計算値：Ｃ，５４．２３；Ｈ，７．１４；Ｎ，９．７３．測定値：Ｃ，５４．３０；Ｈ，６．９０；Ｎ，９．６５。

（５）２，２−ジメチル−５−（チミン−１−イルメチル）−５−ベンジルオキシメチル−１，３−ジオキサン（2,2-dimethyl-5-(thymine-1-yl-methyl)-5-benzyloxymethyl-1,3-dioxan）の製造
予め真空乾燥させておいた２，２−ジメチル−５−（チミン−９−イルメチル）−５−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキサン（５８０ｍｇ、２．０４ｍｍｏｌ）のピリジン（１８ｍｌ）溶液に、ベンジルクロライド（１ｍｌ、８．６７ｍｍｏｌ）のピリジン（９ｍｌ）溶液を滴下した。Ａｒ雰囲気下で８時間攪拌した後、反応混合物に炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を止めた。その混合物を酢酸エチルおよび飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液で抽出した。得られた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄後、無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。その酢酸エチル溶液から溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１００：１〜１５：１）で精製して標題化合物（５６２ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ、収率７１％）を得た。

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：８．４９（１Ｈ，ｓ−ＮＨ−），７．９８−７．４３（５Ｈ，ｍ，フェニル），７．１５（１Ｈ，ｓ，−ＣＨ−），４．２７−３．７５（８Ｈ，ｍ，４−ＣＨ₂−），１．８８（３Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃），１．４８（６Ｈ，ｓ，２−ＣＨ₃）．
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：１６５．９１，１５１．４７，１４１．４９，１３３．４０，１２９．４８，１２９．４５，１２８．６０，１１０．５８，９８．９３，６４．６７，６３．０７，４８．６７，３８．９０，２６．５３，２１．０３，１２．３５．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）ｍ／ｚ：３８８（Ｍ⁺），３７３，２０８，１９５，１８０，１３７，１０５，７７，６６．
ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ₂₀Ｈ₂₄Ｎ₂Ｏ₆ について計算した値３８８．１６３４４、測定値３８８．１６４４２。

（６）３−チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−ヒドロキシメチルプロパン−１−オール（3-(thymine-1-yl-methyl)-2-O-Benzoyl-2-hydroxymethyl-propane-1-ol）の製造
２，２−ジメチル−５−（チミン−１−イルメチル）−５−ベンジルオキシメチル−１，３−ジオキサン（５６４ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）の水およびＴＨＦ混合溶媒（水：ＴＨＦ＝１：１）中溶液（１５ｍＬ）に、酢酸（７ｍｌ）を加えて２４時間攪拌した。前記混合物から溶媒を減圧留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１００：１〜１０：１）で精製し、標題化合物（４７０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ、収率９３％）を得た。

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：９．０４（１Ｈ，ｓ−ＮＨ−），８．０７−７．４６（５Ｈ，ｍ，フェニル），７．２６（１Ｈ，ｓ，−ＣＨ−），４．３８−３．４３（８Ｈ，ｍ，４−ＣＨ₂−），３．２８（２Ｈ，ｍ，２−ＯＨ−），１．９０（３Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃）．
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：１５３．０１，１４１．７５，１３３．６９，１２９．７２，１２９．０９，１２８．６０，１１１．６９，９２．６８，６２．３５，５９．８５，４７．０３，４６．３４，１２．２８．
Ｍａｓｓ（ＥＩ）ｍ／ｚ：３４８（Ｍ⁺），２９９，２２６，１９５，１８０，１５５，１３９，１２６，１０５，７７，６６．
ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ₁₇Ｈ₂₀Ｎ₂Ｏ₆について計算した値３４８．１３２１４、測定値ｒ３４８．１３１３４。

（７）３−（チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−（４，４−ジメトキシトリチル）プロパン−１−オール（3-(thymine-1-yl-methyl)-2-O-Benzoyl-2-(4,4’-dimethoxytrityl)-propane-1-ol）の製造
予め真空下に乾燥させておいた３−チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−ヒドロキシメチルプロパン−１−オール（４７０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）のピリジン（１７ｍｌ）溶液に、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（５４８ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１０ｍＬ）を加え、得られた混合物をＡｒ雰囲気下で４８時間攪拌した。前記混合物を酢酸エチルおよび飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液で抽出した。得られた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。得られた有機層から溶媒を減圧留去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ₃：ＭｅＯＨ＝１００：１〜１５：１）で精製し、標題化合物（２８０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、収率３２％）を得た。

¹ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：８．３６（１Ｈ，ｓ−ＮＨ−），７．８８−７．３９（５Ｈ，ｍ，フェニル），７．３６−６．７１（１５Ｈ，ｍ，ＤＭＴｒおよび芳香族プロトン），３．６７（６Ｈ，ｄ，２−ＣＨ₃），４．４７−３．３７（８Ｈ，ｍ，４−ＣＨ₂−），３．０５（２Ｈ，ｄ，２−ＯＨ−），１．７０（３Ｈ，ｓ，−ＣＨ₃）．
¹³ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ：１６６．０３，１５８．５７，１５８．５１，１５２．５４，１４１．３３，１３５．１０，１３５．０１，１３３．２４，１３０．１０，１２９．９５，１２９．６１，１２９．５７，１２８．４１，１２７．９５，１２７．９４，１２７．０１，１１３．２０，１１３．１７，１１１．３４，８６．６１，６３．４８，６１．３１，６０．４５，５５．１１，５５．１０，４７．８１，４５．９７，１２．３１．
Ｍａｓｓ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ：６５１（［Ｍ⁺＋Ｈ］），３０３，２７７，１８５，１０５，９３，７５，５７．
ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ₃₈Ｈ₃₉Ｎ₂Ｏ₈について計算した値６５１．２７０６３、測定値６５１．２６９１７。

（８）ＣＰＧ樹脂と結合した３−（チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−（４，４’−ジメトキシトリチル）−プロパノン−１−オールの製造
予め真空下に乾燥させておいた３−（チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−（４，４−ジメトキシトリチル）プロパン−１−オール（３１８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１１９ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）にピリジン（５ｍｌ）を加えた。その溶液に、無水コハク酸（１４７ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物をＡｒ雰囲気下で２４時間攪拌した。その混合物を酢酸エチルおよび飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液で抽出した。得られた有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。得られた有機層から溶媒を減圧留去後、残渣にＤＭＦ（１２ｍｌ）を加えた。そのＤＭＦ混合物に、ＣＰＧ（６２８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）とＷＳＣ（９３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を加え、Ａｒ雰囲気下で７２時間振とうさせた。前記混合物をピリジンで洗浄した後、０．１ＭＤＭＡＰのピリジンおよび無水酢酸混合溶液（ピリジン：無水酢酸＝９：１、１０ｍＬ）を加え、さらに１２時間振とうさせた。得られた混合物のＣＰＧをフィルター上でメタノール、次いでアセトンで洗浄し、乾燥させた（得られたＣＰＧ樹脂と結合した３−（チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−（４，４’−ジメトキシトリチル）−プロパノン−１−オールの活性は２２．４μｍｏｌ／ｇ）。

塩基配列の３’末端に、式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体を導入した配列番号１（下記に示す塩基配列参照）からなる一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体の製造

Renilla（ルシフェラーゼ）の１９塩基配列の３’末端にＴＴを付加したものをｓｉＲＮＡとした。そのｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端のＴを式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えたものを配列番号１とする。また、そのｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端のＴを式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えたものを配列番号２とする。配列番号１の塩基配列に従い、核酸自動合成機およびＣＰＧ樹脂を用いるホスホロアミダイト法によりオリゴヌクレオチド類似体（ＲＮＡタイプ）を製造した。塩基配列中、Ｙで示す配列には、製造例１で製造したＣＰＧ樹脂と結合した３−（チミン−１−イルメチル）−２−Ｏ−ベンゾイル−２−（４，４’−ジメトキシトリチル）−プロパノン−１−オールをＣＰＧ樹脂として用いて導入した。他の配列には、リボースタイプのヌクレオシドのアミダイト誘導体を用いて導入した。ＣＰＧ樹脂は、０．５μｍｏｌに相当する量をカラムに入れ、核酸自動合成機にセットした。前記アミダイト誘導体はアセトニトリルに溶解させ、０．１Ｍ溶液に調製した。各縮合時間は、１５分とした。

前記ＣＰＧ樹脂に結合した配列番号１のオリゴヌクレオチド類似体は、ＤＭＴｒ基が除去され、ベンゾイル基、アセチル基、フェノキシアセチル基およびシアノエチル基で保護された状態で核酸自動合成機による合成を終了した。

合成終了後、ＣＰＧ樹脂に結合したオリゴヌクレオチドをエタノールとアンモニア水の混合液（ＥｔＯＨ：ＮＨ₃＝３：１、１ｍＬ）中で室温で１２時間振とうして樹脂からの切り出し及び脱保護を行なった。反応混合物をエッペンドルフチューブに移し、減圧下乾固した。得られた残渣にＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（１Ｍ、１ｍＬ）を加え、その混合物を室温で１２時間振とうした。この反応混合物をＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ）で３０ｍＬまで希釈した。この混合物をＣ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（溶出液：水中、５０％ＣＨ₃ＣＮ（３ｍＬ））により精製して、目的とする一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体を含む残渣を得た。この残渣にローディングバッファー（９０％ホルムアミド中１×ＴＢＥ、１００μＬ）を加え、２０％ＰＡＧＥにより（５００Ｖ，２０ｍＡ）、目的とする一本鎖のオリゴヌクレオチド類似体を単離した。ＰＡＧＥから目的のオリゴヌクレオチドを切り出し、そこへＴＥＡＡ緩衝液（０．１Ｍ（２０ｍＬ）（ＥＤＴＡ水溶液（１ｍＭ）を含む）を加え、１２時間振とうした。ろ液を、平衡化させたＣ−１８逆相カラムクロマトグラフィー（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（溶出液：水中、５０％ＣＨ₃ＣＮ（３ｍＬ））により精製した。配列番号１で表わされるオリゴヌクレオチド類似体の収量は、０．３８ｍｇ、５．８％であった。この終了は、水（１ｍＬ）中の２６０ｎｍにおける吸光度を測定して算出した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ計算値：６６１２、実測値：６６１３。

前記溶液の調製方法について説明する。
０．１ＭのＴＥＡＡ緩衝液は、以下のようにして調製した。酢酸（１１４．３８ｍＬ）およびトリエチルアミン（２７７．６ｍＬ）の混合物に、水を加えて１Ｌにした。その溶液に酢酸を加えてｐＨを７．０に調整し、次いでその溶液を２０倍に希釈することにより調製した。

２０％ＰＡＧＥは、以下のようにして調製した。４０％アクリルアミド溶液（４５ｍＬ）、尿素（３７．８ｇ）および１０×ＴＢＥ緩衝液（９ｍＬ）を混合して溶解させ、その後水を加えて９０ｍＬとした。その溶液に、ＡＰＳ（６２ｍｇ）を加えて溶解させた後、ＴＥＭＥＤ（４５μＬ）を加えて振り混ぜた。その溶液を、１．５ｍｍスペーサーを挟んで固定した２枚ガラス板の間に流し込み、１時間以上静置して固化させて、２０％ＰＡＧＥを得た。

ＥＤＴＡ水溶液は、ＥＤＴＡ・４Ｎａ（１．８０ｇ）を水（４０ｍＬ）に溶解させることにより調製した。

４０％アクリルアミド溶液は、アクリルアミド１９０ｇとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド１０ｇを水に溶解させて５００ｍＬにして調製した。アクリルアミド：Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド＝１９：１。

１０×ＴＢＥ緩衝液は、トリス（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）を１０９ｇ、ホウ酸５５ｇおよびＥＤＴＡ・２Ｎａ（７．４３ｇ）を水に溶かして１Ｌとした。

前記オリゴヌクレオチド類体の吸光度および収量は、以下のようにして測定した。
前記オリゴヌクレオチド類似体を水に溶解させて、水溶液を調製し、その水溶液を、波長２６０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ₂₆₀）が、吸光度計の有効範囲になるように希釈した。光路長（ｌ）１ｃｍの吸光度測定用石英セルを用い、室温にてＡｂｓ₂₆₀を測定した。ＯＤ₂₆₀値の計算には以下の式（１）を用いて算出した。

ＯＤ₂₆₀（ε・Ｍ・ｍＬ^-1）＝Ａｂｓ₂₆₀（ε・ｃｍ・Ｍ）×Ｖ^-1（ｍＬ）×ｌ^-1（ｃｍ）（１）

前記式（１）中、Ａｂｓ₂₆₀は、前記オリゴヌクレオチド類似体溶液の波長２６０ｎｍにおける吸光度を示し、Ｖは溶液の全量を示し、ｌは光路長を示し、Ｍはモル濃度を示す。
前記式（１）中、前記オリゴヌクレオチド類似体のモル吸光係数ε２６０は、以下の式（２）を用いて算出した。

ε＝２｛ε（Ｎ_1pＮ₂）＋ε（Ｎ_2pＮ₃）＋・・・＋ε（Ｎ_n-1pＮ_n）｝−｛ε（Ｎ₂）＋ε（Ｎ₃）＋・・・＋ε（Ｎ_n-1）｝（２）

前記式（２）中、ε（Ｎ_n）はある核酸Ｎ_nのε₂₆₀を示し、ε（Ｎ_n-1pＮ_n）はある核酸二量体Ｎ_n-1pＮ_nのε₂₆₀を示す。

濃度Ｃ（ｍｏｌ／Ｌ）は、以下の式（３）を用いて算出した。

Ｃ＝Ａｂｓ₂₆₀×ε₂₆₀ ^-1×ｌ^-1 （３）

前記式（３）中、Ａｂｓ₂₆₀、ε₂₆₀、およびｌは、前記のとおりである。

得られたオリゴヌクレオチド類似体の吸光度のε値、２６０ｎｍにおける吸光度および収率を、表１に示す。また、得られたオリゴヌクレオチド類似体の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにより確認した。その結果は、表２に示す。

配列番号１の代わりに配列番号２（下記に示す塩基配列参照）の塩基配列に従い、実施例１と同様にして一本鎖オリゴヌクレオチドを得た。

Renilla（ルシフェラーゼ)の１９塩基配列の３’末端にＴを付加したものをｓｉＲＮＡとした。そのｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端のＴを式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えたものを配列番号３とする。また、そのｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端のＴを式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えたものを配列番号４とする。配列番号１の代わりに配列番号３（下記に示す塩基配列参照）の塩基配列に従い、実施例１と同様にして一本鎖オリゴヌクレオチドを得た。

配列番号１の代わりに配列番号４（下記に示す塩基配列参照）の塩基配列に従い、実施例１と同様にして一本鎖オリゴヌクレオチドを得た。

実施例１で製造した配列番号１からなるオリゴヌクレオチド類似体（０．６ｎｍｍｏｌ）および実施例２製造した配列番号２からなるオリゴヌクレオチド類似体（０．６ｎｍｍｏｌ）を、アニーリングバッファー（１０ｍＭのリン酸ナトリウム塩（ｐＨ７．０）および１ＭのＮａＣｌ）中に溶解させた。その溶液を９０℃で５分間、次いで室温で１時間の間、インキュベートして、下記に示す塩基配列のような、配列番号１からなるオリゴヌクレオチド類似体と配列番号２からなるオリゴヌクレオチド類似体とからなる、二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を得た。

実施例１で製造した配列番号１からなるオリゴヌクレオチド類似体の代わりに、実施例３で製造した配列番号３からなるオリゴヌクレオチド類似体を、実施例２で製造した配列番号２からなるオリゴヌクレオチド類似体の代わりに、実施例４で製造した配列番号４からなるオリゴヌクレオチド類似体を用いた以外は実施例５と同様にして、下記に示す塩基配列のような、配列番号３からなるオリゴヌクレオチド類似体と配列番号４からなるオリゴヌクレオチド類似体とからなる、二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を得た。

実施例２で製造した配列番号２からなるオリゴヌクレオチド類似体（５０ｐｍｏｌ）を、１０×ＰＮＫ緩衝液（２μＬ）、６ｕｎｉｔ／μＬのＬＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ．ＣｏｌｉＡ１９）（１μＬ）、γ−³²ＰＡＴＰ（１μＬ）および滅菌水（１６μＬ）の混合液中で、氷冷下に、混合し、その後、３７℃で３０分間攪拌した。その後、スピンカラムを用いて前記混合物から夾雑物を除去して、５’末端が³²Ｐ同位体で標識された、配列番号２からなるオリゴヌクレオチド類似体を得た。

［二本鎖の安定性］
実施例６で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体および天然型の二本鎖オリゴヌクレオチドについて、測定したそれぞれのＴｍ値を、以下の表３および図１に示す。それぞれの二本鎖の濃度は３μＭになるように調整し，測定用緩衝液（１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄，１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）、（２００μＬ）に溶解させ、９５℃で３分間加熱した。その後，１時間放置し混合物を常温に戻した。その混合物のうち１５０μＬを専用セルに入れ測定した。なお、天然型の二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は、以下の式に示すとおりである（配列番号５および６）。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、Renilla（ルシフェラーゼ)の１９塩基配列の３’末端にＴＴを付加したものであり、ｓｉＲＮＡである。

前記表３および図１に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、天然型のものと比較して同等の熱的安定性を有することを、確認できた。

［デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ］
ＨｅＬａ細胞（４０００セル／ｍＬ）を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ入れ、２４時間培養した。実施例５で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を、培地（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ）各量、０．２μｇ／μＬｐｓｉ−ＣＨＥＣＫ（ホタル、Ｒｅｎｉｌｌａ各々の配列を持つベクター）１μＬ、ｔｒａｎｓｆａｓｔ（トランスフェクション試薬）３μＬを総量３５０μＬになるように混合した。培地を吸い出した９６ウェルプレートの各ウェルに前記二本鎖オリゴヌクレオチドの混合液（３５μＬ）を入れ、１時間後培地を１００μＬ加えて２４時間培養した。前記ウェル中にデュアル−グロ(Ｄｕａｌｇｌｏ）基質（ホタルルシフェラーゼの基質）２４μＬを加え、発光測定用の９６ウェルプレートにサンプルを移した。プレートを１０分放置後、ホタル・ルシフェラーゼを測定した。その後、ウェルにストップ・アンド・グロ（Ｓｔｏｐａｎｄｇｌｏ）基質（２４μＬ）を加え、１０分放置た。その後、ウェルのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを測定した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの値は、ホタル・ルシフェラーゼの値で割り、コントロールに対する％を用いて比較した。なお、ルシフェラーゼの測定には、ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｅｒＪＮＲIIを使用した。実施例５で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド
類似体の代わりに、天然型の二本鎖オリゴヌクレオチド類似体をコントロールとして用いて同様にアッセイした。その結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）中、２本のバーのうち左が天然型の二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を用いた場合、右が実施例５で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を用いた場合の結果である。なお、天然型の二本鎖オリゴヌクレオチド類似体の配列は、以下の式に示すとおりである（配列番号７および８）。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、Renilla（ルシフェラーゼ）の１９塩基配列の３’末端にＴを付加したものであり、ｓｉＲＮＡである。

また、実施例５で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体の代わりに実施例６で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を用いたアッセイの結果を図２（ｂ）に示す。図２（ｂ）中、２本のバーのうち左が天然型の二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を用いた場合、右が実施例６で製造した二本鎖オリゴヌクレオチド類似体を用いた場合の結果である。なお、その際に用いた天然型の二本鎖オリゴヌクレオチド類似体の配列は、以下の式に示すとおりである（配列番号５および６）。

図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、天然型のものと同等のタンパク発現抑制作用を有することが確認できた。従って、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、ノックダウン効果に優れることが確認できた。

［ヌクレーゼ耐性］
一本鎖オリゴヌクレオチド類似体のエキソヌクレアーゼ耐性の評価
実施例７で得られた配列番号２からなる一本鎖オリゴヌクレオチド類似体、その天然型の一本鎖オリゴヌクレオチドの、エキソヌクレアーゼ耐性を評価した。エキソヌクレアーゼとしては、ヘビ毒ホスホロジエステラーゼ（ＳＶＰ）を使用した。ＳＶＰは、リン酸ジエステル結合を選択的に切断しオリゴヌクレオチドを５’−モノリン酸ヌクレオチドに分解する。

以下に示す組成の反応溶液から、１、３、５、１０、３０、６０分後に、ローディング溶液（７Ｍ urea ＸＣＢＰＢ；５μＬ）を含む各エッペンドルフチューブに、反応液（５μｌ）をサンプリングして反応を停止させた。なお、０分後のサンプルは、ＳＶＰ水溶液を加えていないものである。得られた各時間におけるサンプルを、２０％ウレア入りＰＡＧＥにより電気泳動させて、ゲル中で分離した。前記ゲルを、イメージングプレートと接触させて、前記ゲル中の分離されたイメージを転写した。このイメージをバイオイメージングアナライザー（商品名：ＢＡＳ２０００、富士写真フィルム株式会社製）を用いて取り込み、ＲＩイメージ解析ソフトにより画像処理した。その結果を図３に示す。

一本鎖オリゴヌクレオチド類似体（実施例７）の反応溶液の組成
一本鎖オリゴヌクレオチド類似体４μＬ
（最終濃度10μM）
緩衝液（250mM Tris-HCl、50mM MgCl₂(pH7.0)) ６μＬ
１units／ｍＬＳＶＰ水溶液４μＬ
滅菌水２６μL
計４０μＬ

天然型一本鎖オリゴヌクレオチドの反応溶液の組成
一本鎖オリゴヌクレオチド４μL
（最終濃度10μM）
緩衝液（250mM Tris-HCl、50mM MgCl₂(pH7.0)) ６μＬ
１units／ｍＬＳＶＰ水溶液４μＬ
滅菌水２６μL
計４０μＬ

前記図３に示すように、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチド類似体は、天然型一本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、エキソヌクレアーゼ耐性が向上していることが確認された。

本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、例えば、検査キット用オリゴヌクレオチドとして有用である。

図１は、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の一例と、天然型のオリゴヌクレオチドの一例のＴｍ値を示す図である。図２（ａ）は、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の一例と、天然型のオリゴヌクレオチドの一例のｓｉＲＮＡのタンパク発現抑制効果を示す図である。図２（ｂ）は、本発明のオリゴヌクレオチド類似体の一例と、天然型のオリゴヌクレオチドの一例のｓｉＲＮＡのタンパク発現抑制効果を示す図である。図３は、本発明のオリゴヌクレオチド類似体のエキソヌクレアーゼに対する耐性を示す図である。

配列番号１オリゴヌクレオチド類似体
配列番号２オリゴヌクレオチド類似体
配列番号３オリゴヌクレオチド類似体
配列番号４オリゴヌクレオチド類似体
配列番号５オリゴヌクレオチド類似体
配列番号６オリゴヌクレオチド類似体
配列番号７オリゴヌクレオチド類似体
配列番号８オリゴヌクレオチド類似体

Claims

オリゴヌクレオチドを構成する３’末端のヌクレオシドが、式（Ｉ）で表わされるヌクレオシド類似体で置き換えられているオリゴヌクレオチド類似体またはその塩。

式（Ｉ）中、Ｒ¹は、式（１）の基、式（２）の基、式（３）の基、式（４）の基、式（５）の基、式（６）の基、式（７）の基および式（８）の基からなる群から選択されるいずれかの基であり、Ｒ²は脂溶性残基であり、ｋ１、ｌ１、ｍ１およびｎ１は、互いに独立して、１〜１０の整数である。
前記式（Ｉ）中、前記脂溶性残基が、式−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ²¹、−Ｏ−（ＣＨ₂）_X−Ｒ²²、−Ｏ−Ｒ²³および−ＮＨ−Ｒ²⁴からなる群から選択される請求項１に記載のオリゴヌクレオチド類似体またはその塩。
前記式中、Ｒ²¹は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであり、
Ｒ²²は、アリールまたは置換されたアリールであり、
Ｒ²³は、アルキルまたは置換されたアルキルであり、
Ｒ²⁴は、アリール、置換されたアリール、アルキル、または置換されたアルキルであり、
ｘは１〜３の整数である。
前記オリゴヌクレオチド類似体が、二本鎖形成能を有する請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド類似体またはその塩。
前記オリゴヌクレオチド類似体が、ヌクレアーゼ耐性である請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類似体またはその塩。
オリゴヌクレオチドを含む遺伝子発現抑制剤であって、前記オリゴヌクレオチドが、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類似体またはその塩である遺伝子発現抑制剤。
遺伝子発現に伴う疾患を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、請求項５に記載の遺伝子発現抑制剤を含む医薬組成物。
請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド類似体を含む検査キットであって、
前記オリゴヌクレオチド類似体が、検体中の遺伝子とハイブリッド形成することにより、前記遺伝子が検査される検査キット。
請求項７に記載の検査キットであり、前記検査キットが、DNAチップであるキット。