JP2002511885A

JP2002511885A - 脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物

Info

Publication number: JP2002511885A
Application number: JP50991099A
Authority: JP
Inventors: ランゲル，ウロ; バートファイ，タマス; プーガ，マルグス; バルクナ，アンドレス; ソール，クリッキ; ハルブリンク，マティーアス
Original assignee: ザパーキン―エルマーコーポレーション
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 2002-04-16
Also published as: EP0998577B1; DE69827260T2; AU8408098A; US6025140A; EP0998577A1; CA2298067A1; WO1999005302A1; AU741546B2; DE69827260D1

Abstract

(57)【要約】脂質膜を横切る輸送のため、および細胞内ポリヌクレオチドと相互作用的に接触して送達するために共に結合されたペプチドおよび核酸アナログの構築物が開示される。輸送は、少なくとも細胞の外膜を介して、そしておそらく脂質膜（核、ミトコンドリア、リボゾームなどを含む）によるサイトゾルから分離された細胞成分構造の壁を介してもまた達成される。輸送するペプチドに易動性ジスルフィド結合を介して連結されたペプチド核酸（PNA）アナログ配列は、細胞内で切断され、そしてmRNA（抗遺伝子）またはdsDNA（アンチセンス）を標的化する。

Description

【発明の詳細な説明】脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物発明の分野本発明は、一般的に分子生物学および細胞生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、標的化細胞内DNA配列およびRNA配列と接触する細胞の脂質膜を横切る膜透過性分子の輸送に関する。背景オリゴヌクレオチド、核酸および核酸類似体の細胞内への送達は、アンチセンス剤としての治療有用性における基本的な必要条件である(Yakubov、1989)。入手可能なアンチセンス試薬の主な問題点は、細胞内安定性が低いこと、および細胞取り込み効率が悪いことである(Stein、1993)。さらに、治療効果に必要とされるアンチセンス試薬の用量が高いために、毒性副作用をおこすことが多い。修飾ヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドを適用するか（Bennet、1998）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞内送達を増強することにより、これらの欠点を回避し得る。原形質膜の脂質二重層は、その内部が疎水性のため、大部分の極性分子および電荷分子にとって高度な不透過性バリアとなる（Albert s、1989）。多くのアンチセンス核酸は、有効な薬物速度が得られないため、例えば、有効な細胞内濃度に到達できない理由から、強力な薬剤候補にはなり難い。アンチセンスの研究は、特異的核酸または核酸類似体配列の送達に依存して、転写レベル（「アンチ遺伝子」）でDNAの発現または複製を阻害し、翻訳レベル（「アンチセンス」）でmRNAを阻害するものである。アンチ遺伝子およびアンチセンスの作用メカニズムに関する多くの研究から、細胞に取り込まれ、分布することが治療効果を示す重要因子であることがわかる（Helene、1990；Akhtar、19 92；Stein、1993）。この発明は、これらの重要なパラメーターについて改良するものである。ペプチドおよび核酸類似体の在来型構築物の限定性および欠如性、さらに不充分な経膜細胞内送達方法を考慮して、膜透過性をもつ新規な構築物を開発することが重要である。脂質膜を速やかに、かつ高濃度で輸送されるペプチドおよびペプチド類似体配列を含有する構築物が望ましい。構築物の核酸類似体部分は、輸送後に放出され、標的分子と相互に作用し得るのが、非常に望ましい。さらに、構築物のペプチドおよび核酸類似体部分間を分解するリンカーの供給が望ましい。標的ポリヌクレオチドにハイブリッドを形成し得る核酸類似体は、特に望ましい。疎水性非電荷核酸類似体は、核酸類似体部分として好ましい。効果的な構築物の合成および精製法が望ましい。本明細書における発明は、輸送制限性および欠如性について若干の解答を提供し、最適化構築物を介する細胞内への分子の標的化および方法を提供するものである。要旨本発明は、脂質膜を横切る輸送のため、および相互作用的に接触したRNA、DNA のような細胞内ポリヌクレオチド、酵素、レセプター、調節エレメントへ送達するために共に結合されたペプチドおよび核酸アナログの新規構築物に関する。輸送は、細胞の膜、および特定の細胞下の構造の壁（核、ミトコンドリア、リボゾームなど）を介して達成される。本発明は、核酸アナログ（例えば、PNA：(i)トランスポータン（transportan ）、ガラニン(1-12)-Lys-マストパラン(1-14)アミド(Pooga、1998)、および(ii) pAntennapedia、pAnto(43-58)(Allinquant，1994;Troy，1996;Derossi，1996)）の細胞内分布を増加する２つのペプチドを含む。両ペプチドは、エネルギーおよびレセプターに依存しない様式で細胞内へ侵入することが知られている。多くの他のタンパク質は、核酸アナログと結合され得、そしてその膜透過性特性(Alber ts，1989)（例えば、緑色蛍光タンパク質(Chalfie，1995)およびその保存的改変体）を用いられる。一般的に、本発明の構築物のペプチド部分は、以下のアミノ酸の配列を含む：１文字記号アミノ酸コードに従い（表１）、そしてここでＣ末端は官能化されて、配列の膜透過性特性を保持するアミド基、そのホモログ、その保存的変異体、またはそのペプチドアナログを形成する。好ましくは、ペプチドは、以下のアミノ酸配列をさらに含む： GWT そして、より好ましくは、配列は、以下のアミノ酸配列をさらに含む：この細胞膜透過性特性を与えられるための現在最も好ましいペプチドは、トランスポータンまたはガルパラン(galparan)としていわれる(Pooga，1998)ペプチドであるアミノ酸配列を有する：好ましくは、このペプチドと結合される核酸アナログ分子は、第１に（NからC へ、すなわち左から右へ）、一対のシステイン残基のジスルフィド結合のような易動性結合を介して、リジン残基Ｋと結合される。安定性、合成、および生成の容易さについて、Ｃ末端カルボキシル基は、代表的に、適切な合成支持体リンカーを介して、アミドへ変換される。本発明の第１の局面は、細胞内の相補的標的配列とハイブリダイズする核酸アナログ部分を含む構築物である。核酸アナログは、使用のために提唱された任意の型であり得るか、またはアンチセンス技術(例えば、ペプチド核酸(PNA))において使用され得る。好ましい実施態様において、核酸アナログは、相補的な細胞内ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを受ける。本発明は、細胞内ポリヌクレオチドの相補的配列とハイブリダイズし得るPNA、PNA-DNAキメラ、またはPNA核酸アナログキメラのような核酸アナログ成分とハイブリダイズする工程を包含する構築物を提供する。最も好ましい核酸アナログは、2-アミノエチルグリシン中心を有するペプチド核酸(PNA)である(Nielsenら，1991)。本発明の第２の局面において、核酸アナログは、ヌクレオチド内連結、糖、または核酸の核酸塩基部分への改変からなり得る。適切な改変核酸アナログの例は、2'-O-メチルおよび他の2'-O-アルキルオリゴリボヌクレオチド；ホスホロチオエート、および他のリン酸アナログなどである。核酸アナログは、いくつかの特性によって選択され、それには(i)高い特異性、(ii)高い親和性、(iii)ポリメラーゼによる非伸長性、(iv)化学的安定性、および(v)ヌクレアーゼ耐性が含まれる。好ましい実施態様において、核酸アナログは、PNA（ペプチド核酸）オリゴマーである(Nielsen，1991)。可溶性を改善し、そして凝集作用を減少するために、PNA核酸アナログは、ポリエチレンオキシ、ペプチド、核酸、核酸アナログ等のような親水性修飾因子と結合され得る。第３の局面において、本発明の核酸アナログは、脂質膜を横切る輸送を達成するペプチドに結合され、次いで核酸アナログの細胞内ポリヌクレオチドへの提示を可能にし、それによって二次または三次構造が形成される。本発明のこの局面の好ましい実施態様において、ハイブリダイズされる核酸アナログおよび輸送作用ペプチドは、細胞内環境において易動性結合によって付着され、その結果、ハイブリダイズした核酸アナログが切断されて遊離し、それによって核酸アナログまたはペプチド部分を物理的に分離する。易動性結合の例は、その上ジスルフィド結合が破壊されるか切断され、それによってペプチドおよび核酸アナログ成分を分離する、内在性細胞内酵素または還元剤(例えば、グルタチオンまたはNADPH )に曝露するジスルフィド結合である(Stryer，1981)。核酸アナログへ結合されたシステインアミノ酸残基とペプチド間のジスルフィド基を有する構築物が、好ましい実施態様であり、そして都合良く調製され、そして標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするための核酸アナログを遊離するためにそして適度に易動性である。核酸アナログおよびペプチド成分に連結するための他の易動性結合は、エステル(-CO₂-)、カルバメート(-NHCO₂-)、およびスルホン酸(-SO₃-)（これらｈ酵素的触媒作用によるかまたは加水分解によって核酸アナログを遊離し得る(M eyer，1994)）を含む。本発明の第４の局面において、DNA転写、RNA翻訳、RNAもしくはDNAの発現、DN A複製、RNA逆転写、または細胞内ポリヌクレオチドのDNAもしくはRNA調節機能（例えば、分子レベルでか、または治療目的での構造／機能の関連を識別することを助けるような研究目的のため）を選択的にブロックするために使用され得る方法および構築物の特定のセットが提供される。一般的に、この方法は細胞内ポリヌクレオチド配列の１つまたはサブセットとハイブリダイズする核酸アナログの１つまたは１つのセットを提供する工程を包含する。これらの構築物は、細胞に曝露され、そして10nMと同じくらい低いか、それより低い濃度で有効であり得る。なぜならそれらは細胞膜を横切って輸送され、サイトゾルおよび種々の細胞成分区画中の細胞内分子とのハイブリダイズまたは他の相互作用的に接触のために直接曝露されるようになり、そして標的DNAまたはRNAとハイブリダイズする（代表的には、少なくとも細胞内ポリヌクレオチドの正常な機能の一時的な阻害またはブロック）からである。第５の局面において、本発明は、細胞内二本鎖安定性を増加し、増強された検出性、および／または捕捉能力を提供するのに役立つ安定化部分と結合されたキメラを含む。分子間二本鎖安定性を増大するための好ましい部分は、副溝結合剤 (minor groove binder)(例えば、Hoechst 33258(Wiederholt，1996)、CC-1065(H anka，1978)、CDPI3(Kumar，1998)、およびインターカレーター（例えば、アクリジン、エチジウムブロミド、スペルミン、ポリカチオンなどが含まれる(Black burn，1996)。構築物または核酸アナログの検出能力を増大するために、核酸アナログは、標識（例えば、フルオレッセイン、ローダミン、シアニンなどを含む蛍光色素）に結合され得る。検出、捕捉、および固定化を容易にするために、構築物は、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはペプチドに結合され得る。標識は、多数の公知の結合方法(Andrus，1995;Hermanson，1996)を用いてキメラへ付着され得る。本発明の第６の局面は、転写阻害または翻訳阻害の量に比例して安定な蛍光シグナルを生成するための蛍光剤を特定することによって、標的化された細胞内分子と相互作用する蛍光標識構築物のインサイチュ検出による正確な実時間のモニタリングのための方法を提供する(Houseal，1993)。送達された構築物の細胞内位置は、特定の細胞小器官および特徴（例えば、核、ミトコンドリア、膜など）の範囲内で局在化および映像化され得る。同様に、化学発光標識構築物は、励起光によって誘引され得、そして類似の検出シグナルを提供する。エナメル質(ada mantyl)1,2-ジオキセタン標識構築物は、アルカリホスファターゼによる脱リン酸化の際に開環され得、それによって照度計、または他の集光装置または感光装置による測定可能な光を生成する(Bronstein，1990;Bronstein，1994)。蛍光剤および消光剤で標識された構築物のハイブリダイゼーションは、蛍光共鳴エネルギー遷移(FRET)効果を与え得、それによって特定の遺伝子および配列のコピー数ならびに発現レベルについての定量的を生じる(Clegg，1992;Cardullo ，1988;Livak，1995)。本明細書で示した本発明が、膜輸送を誘導するために有効である発見されたアミノ酸の特定の配列として具体化されるが、特定のホモログ、短縮化タンパク質、融合タンパク質、保存的変異体、種変異体、および異なるアミノ酸配列で特徴づけられるが、本明細書中で開示される配列の膜透過性活性を保持する他の関連する構築物が、発明を実行することなく作製され得、そして本明細書で開示される本発明の実施態様の１つとして含まれると当然考えられるべきであることが当業者に明らかである。定義他に明記しない限り、本明細書において使用する以下の用語および表現は、次ぎの意味をもつ。「ヌクレオチド」は、DNAまたはRNAなどのポリマー核酸のモノマー単位であり、糖、リン酸塩、および核塩基の三種の異なるサブ単位または部分からなる（Bl ackburn、M.、1996）。二本鎖体部分の場合、ヌクレオチドを「塩基」または「塩基対」とも言う。最も一般的な天然の核塩基であるアデニン（A）、グアニン（G）、ウラシル（U）、シトシン（C）およびチミン（T）は、水素結合機能をもち、配列特異的方法により、核酸ストランドの一方が他方のストランドと結合する。「ヌクレオシド」とは、リン酸塩の欠如したヌクレオチドを言う。DNAおよびRNAにおいては、ヌクレオシドモノマーがホスホジエステル結合で結合されており、本明細書において使用する場合、例えば、H+、NH4+、Na+その他の関連するカウンターイオンを含めて、ホスホジエステル結合またはそのリン酸塩類似体などの結合を用語「ホスホジエステル結合」と言う。「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、二本鎖および一本鎖デオキシリボヌクレオチド「DNA」、リボヌクレオチド「RNA」などを含む、天然ヌクレオチドモノマーの線状ポリマーまたは、その類似体を言う。他の用語では、「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの鎖で、これらは、それぞれデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA ）を構成する構造単位である。ポリヌクレオチドの大きさは、一般的に、数個、例えば、8〜40個のモノマー単位から数千個のモノマー単位に及ぶ。DNAポリヌクレオチドが「ATGCCTG」などのアルファベット配列で表示される場合、ヌクレオチドは、左から右に5'→3'順で、別に明記しない限り、「A」は、デオキシアデノシン、「C」はデオキシシチジン、「G」はデオキシグアノシン、および「T」はチミジンを示す。「核酸類似体」は、構造的に修飾されたDNAおよびRNAのポリマー類似体で、モノマーヌクレオチド類似体単位から化学的に合成され、核酸に関連した特性を幾つか所有する。PNAおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、当該分野において公知の多くの核酸類似体の二例である。「Watson/Crick塩基対合」および「Watson/Crick相補性」は、ヌクレオチドおよびその類似体の特定対型を示し、水素結合により、例えば、Aは、TおよびUと対合し、GはCと対合して共に結合する。特異的塩基対合の動作は、「ハイブリッド形成」または「ハイブリッド化」である。核酸または核酸類似体の二種以上の相補性ストランドが塩基対合すると、ハイブリッドが形成する。「抱合体」または「抱合性」とは、共有結合性、イオン性または疎水性の相互作用を示し、分子部分が共に保持され、近位に保たれる。「リンカー」とは、ペプチド、標識、修飾物質、安定化基などの部分に核酸を連結する鎖を含む一種以上の分子を言う。本明細書において使用する「キメラ」とは、一種以上のヌクレオチドまたは一種以上のヌクレオチド類似体単位を含めたオリゴヌクレオチドを言う。モノマー単位は、ホスホジエステルおよびホスホジエステル類似体結合により結合される。「ホスホジエステル類似体」または「インターヌクレオチド類似体」とは、2' 、5'-結合に限らず、3'、3'-結合、5'、5'-結合、メチルホスホネート、アルキル化ホスホトリエステル、3'-N-ホスホールアミデートおよび非架橋状N-置換ホスホールアミデートなどの組成物および／またはヌクレオチドに付着する部位が異なる天然ホスホジエステル3'、5'-インタイヌクレオチド結合の類似物を言う。用語「2'-修飾RNA」は、糖の2'位にヒドロキシルの置換基をもつ、一種以上のリボヌクレオチドを含む核酸類似体を意味する。例として、2'-O-アルキルRNAは、糖の2'位が-OR部分（Rは低級アルキル）の一種以上のリボヌクレオチドを含む核酸類似体である（Sproat、1994）。用語「透過」および「透過性」とは、細胞膜を通過する、この発明の構築物の細胞膜透過性、すなわち、構築物を通過させる細胞膜感受特性を言う（Alberts 、1989）。「標識」とは、一方または両方の核塩基オリゴマーの末端に共有結合された基を言う。この標識は、蛍光、ケミルミネセンスおよび電子化学的ルミネセンスなどの手段により、分子を検出する信号を出すなどの機能を実行できる。択一的に、標識を用いて、特異的または非特異的捕獲法により、分子を分離または固定化する（Andrus、1995）。標識には、フルオレセインおよびローダミン誘導体（Menc hen，1993；Bergot、1994）などの蛍光色素だけでなく、シアニン色素およびエネルギー転移色素（Clegg、1992；Cardullo、1988）がある。「検出」とは、検出標識の特性に基づく構築物の検出、観察または測定を言う。用語「不安定性」とは、試薬、酵素または細胞構成要素によって分解され得る分子中の一種以上の結合を言う。用語「核塩基修飾」とは、DNAおよびRNAで認められる天然核塩基のA、G、C、T 、Uの塩基対合誘導体を言う。「ペプチド」は、アミノ酸のポリマーで、左側の末端は、表記上のNまたはアミノで、右側の末端は、Cまたはカルボキシルである。最も一般的な天然アミノ酸は、三つのアルファベット文字または一つのアルファベット文字コードにより、択一的に示される（第１表）。本明細書において使用するペプチドは、「ペプチド類似体」、L-アミノ酸側鎖またはα―アミノ酸のバックボーンを一種以上修飾した構造修飾体を含むものとする。バックボーン修飾ペプチド類似体の一例として、N-メチルグリシン「ペプトイド」（Zuckermann、1992）が挙げられる。参照配列の対応残基の「保存的変種」または「保存的置換」であるアミノ酸残基は、例えば、類似した、サイズ、形状、電荷、疎水性、親水性、極性、および共有結合または水素結合の形成性などの反応的化学特性や他の特性をもち、対応する参照残基と生理的または機能的に類似したものである。「容認点突然変異」（Dayhoff、1978）に対して定義された基準を完全に満たす保存的変種が特に好ましい。アミノ酸の保存的変種は、一般に、以下の基内の置換がある。 I．グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン II．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン III．セリン、スレオニン IV．リジン、アルギニン V．フェニルアラニン、チロシン「相同体」は、脂質膜透過性機能を保持する本質的に同一のアミノ酸配列をもつペプチドであり、このアミノ酸配列は、例えば、上記の同じクラス内の他のものと一個のアミノ酸が置換する（例えば、I．のグリシンに対してバリン、IV．のリジンに対してアルギニン）保存的アミノ酸置換、または、タンパク質機能を破壊しないアミノ酸配列部位に位置する一種以上の非保存的置換、欠失または挿入が、主として、または唯一好ましい配列と異なる。このような配列は、比較を行うペプチドの配列と、アミノ酸レベルが少なくとも85％、さらに好ましくは90％、最も好ましくは95％同一であることが好ましい。図面の簡単な説明第１図は、DNAおよびPNA構造部分を示す。第２図は、DNA/PNA二本鎖体部分の塩基対合を示す。PNAは、より安定な逆行性構造を指向し、PNAのN末端は、DNAの5'末端と、PNAのC末端は、DNAの3'末端と整列する。第３図により、核酸類似体のヒトガラニン受容体ビオチン-Cys-cPNA 15mer 1がペプチド、Cys(Npys)-pAntp(43-58)2に抱合し、構築物のcPNA(18-32)-S-S-pAntp (43-58)を形成する例を説明する。第４図は、二つの構築物：pAntp(43-58)-S-S-(ビオチニルPNA21)Aおよびトランスポルタン-S-S-(ビオチニルPNA21)Bの構造を示す。第５図は、さらに、pAntp(43-58)-S-S-(ビオチニルPNA21)Aの詳細な構造を示す。第６図は、CPNAオリゴマー、cPNA-ペプチド構築物、ホスホロチオエート、ヒトおよび／またはGalR1 mRNAに相補的オリゴヌクレオチドおよび輸送ペプチドによるBowes細胞膜のヒトガラニン受容体への125K-ガラニン結合のダウンレギュレーションデータを示す。μMで示した半値最大阻害作用を記載する。CPNArおよびcP NAhは、それぞれ、ラットのコード化領域およびヒトGalR1 mRNAの相補的PNA配列を示す。PNAオリゴマーの配列は、左側にN-末端および右側にC-末端のペプチド命名法に従って示す。C-末端は、全例でアミド化されている。第７図は、アンチセンスPNAの構築物と担体ペプチドのトランスポルタンやpAntp によるGalR1ダウンレギュレーションの濃度依存性を示す。Bowes細胞を構築物の存在下、37℃で36時間増殖させ、細胞膜への¹²⁵I-ガラニンの特異的結合およびウエスターンブロット法により受容体量を推定する。細胞を以下の通り処理する。 ○cPNA h(18-38)-S-S-pAntp A ●cPNA h(18-38)-S-S-トランスポルタンB ■cPNA h(1-21)-S-S-pAntp ▲ホスホロチオエート h(18-38) △共倒れ型cPNA h(18-38)-S-S-pAntp ▽cPNA h(18-38) 第８図は、未処理ラット７匹（□）、共倒れ型PNA r(18-38)-S-S-pAntp構築物の投与ラット３匹（△）およびPNA r(18-38)-S-S-pAntp構築物の投与ラット５匹（ ▲）におけるC-繊維条件付け刺激（CS）の反射促進効果に及ぼす種々用量のくも膜下ガラニンの作用を示す。データは、ガラニン処理せずに、CS後の促進対照値の％で示す。好ましい実施態様の詳細な説明次ぎに、この発明の好ましい実施態様の付随図面で説明する発明の実施例について、詳細に言及する。この発明を好ましい実施熊様と関連付けて述べるが、発明は、これらの実施態様に制限するものでない。逆に、この発明は、この特許請求の範囲で定義される発明の範囲内に含められる、択一性、修正および等価物を保護しようとするものである。 I．核酸類似体の構造および合成一般には、慣習的な説明により、この発明の核酸類似体の設計および合成を行う。核酸類似体については、ホスホルアミダイト化学（Beaucageら、1992；Caruth ers、1983）を使用する自動固相DNA合成装置、例えば、ABI392または394DNA合成装置（PE Applied Biosystems、Foster City、CA）または、自動固相ペプチド合成装置、例えば、ABI433ペプチド合成装置（PE Applied Biosystems、Foster Ci ty、CA）で合成するのが好ましい。 PNA この発明の好ましい核酸類似体は、ペプチド核酸（PNA）の次世代アンチセンス試薬（Nielsen、1991：Bennet、1998）として、潜在的有用性をもつ、特に有望なクラスの核酸類似体である。PNAは、Watson/Crick塩基対合を起こす天然核塩基を利用し、中性アキラル性ポリ-[2-アミノエチルグリシン]アミドバックボーンで結合することにより、例えば、極めて高特異性および親和性の優れたハイブリッド形成特性が生じる（Egholm、1993；Peffer、1993）。PNAは、よく知られたヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼまたは他の修飾酵素の基質ではなく、天然の核酸、DNAおよびRNAがヌクレアーゼによって速やかに分解し、そのためin vivoで好都合なアンチ遺伝子またはアンチセンス結果が得られなくなることから、重要な特性をもつ（Akhtar、1991）。標識ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成により、形成されたハイブリッド二本鎖体のPNA/DNAおよびPNA/RNAは、転写レベルで細胞内DNAの正常な機能化を効率的に阻害し、翻訳レベルではRNA の正常な機能化を効率的に阻害し得る。PNAを適用して、転写および翻訳レベル上でのタンパク質発現を遮断し、微量注入されたPNAは、無傷の細胞において強力なアンチセンス効果を示す（Knudsen、1996；Knudsen、1997）。また、PNAオリゴマーには、遺伝分析および診断試験における増強プローブとしての有用性、また分子生物学におけるPCRのポリメラーゼ活性適合度の増強（Demers、1997）などの手段としての有用性が認められている。さらに、PNAは、単一塩基対突然変異分析（Orum、1993）の「クランピング素子」としてPCRで使用されており、それによってPNAは、相補的標的配列、典型的には野生型の増殖を抑制し、匹敵するDNAプライマーをもつ低コピー数または突然変異体標的配列を選択的に増殖し得る。PNAオリゴマー自体を効率的に細胞内部に送達または輸送できないため、現在まで、アンチセンス試薬としてPNAをin vivoに適用出来なかった（Nielsw n、1993；Hanvey、1992；Knudsen、1997）。第１図は、DNAおよびRNAの構造の比較を示す。図のように、天然DNAの糖―リン酸塩バックボーンは、核塩基を保持するPNAの2-アミノエチルヒリシンペプチドバックボーンで置換される。第２図のPNAとDNA間のハイブリッド二本鎖体は、 DNA/PNA二本鎖体のWatson-Crick塩基対合（Egholm、1993）を説明するものである。PNAおよび核酸の二本鎖体の高熱融解値（T_m）で例示されるように、DNA標的に対するPNAの著しく高い親和性は、主としてPNAの非イオン性によるものであり、DNA/DNAおよびDNA/PNA二本鎖体のストランド間の電気斥力を除去する。PNAオリゴマーは、加水分解や、細胞内の酵素分解に対して安定である。PNAオリゴマーは、良く知られるヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ペプチダーゼまたは、分解やプロセシングで他の核酸または核酸類似体を不活性にし得る他の酵素の基質ではない。市販の自動合成装置、例えば、Model394 DNA/RNA合成装置またはModel433ペプチド合成装置（PE Applied Biosystems、Foster City、CA）を市販の試薬（Vi nyak、1997；Van der Laan、1997）と共に使用して、通常の方法により、PNAオリゴマーを合成し得る。修飾糖類似体最初の実施態様において、核酸類似体の核酸分画の糖部分を修飾する。特に好ましい実施態様では、ヌクレオシドの2'-位を修飾する。2'-修飾ヌクレオシドをもつオリゴヌクレオチドは、リボチーム、ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンス類似体および他の細胞メカニズムプローブ（Lamond、1989；Goodchild、1992）として研究されてきた。2'-O-アルキル-オリゴリボヌクレオシドの望ましい特徴として、高い化学的安定性、相当なRNA-ヌクレアーゼおよびDNA-ヌクレアーゼ抵抗性（RnaseHを含めて）、および二本鎖体熱安定性の増大がある（Ohtsuka、1991）。好ましい実施態様において、そのリボヌクレオチド分画は、2'-O-アルキル-リボヌクレオチドで、2'-O-メチル-リボヌクレオチドが好ましい。さらに好ましい修飾リボヌクレオチドには、2'-O-アリル-リボヌクレオチド、2'-アリルリボヌクレオチド、2'-ハロ-リボヌクレオチド、2'-O-メトキシエチル-リボヌクレオチド、2'-分枝基-リボヌクレオチドおよび2'-O-分枝基-リボヌクレオチドがある。下記の構造は、幾つかの好ましい糖修飾を説明するものである。この発明のもう一つの実施態様において、一種以上のヌクレオチドの1'-位を修飾する。好ましい修飾では、1'-位はα-アノマーヌクレオチド塩基で、糖の1' -位の天然立体化学的構造が転化する。例えば、複素環および5'-原子が、cis方位にかわって、trans方位にある（Morvan、1986）。また、1'-位は分枝基をもつ（Azhayeva、1995）。択一的に、修飾糖類似体は炭素環式ヌクレオチドで、糖の 4'-酸素原子が炭素原子、イオウ原子または窒素原子と置換される（Perbost、19 89）。修飾インターヌクレオチド類似体もう一つの好ましい実施態様においては、核酸類似体部分を構成する若干または全ヌクレオチドを非標準インターヌクレオチド結合により連結する。好ましい非標準インターヌクレオチド結合には、2'-5'-結合、転化3'-3'および5'-5'結合、メチルホスホネート、非架橋性N-置換ホスホルアミデート、アルキル化ホスホトリエステル分枝構造、3'-N-ホスホルアミデート、ペプチド核酸（PNA）および非ヌクレオシドポリマーがある。用語「非ヌクレオシドポリマー」とは、ポリヌクレオチドではないポリマー、例えば、ポリエチレンオキサイド、ポリペプチド、ポリアクリルアミドおよびポリ炭化水素を言う。さらに、PNAまたは3'-N-ホスホルアミデートの結合が好ましく、このような結合を含む核酸類似体に高い親和性がある。核塩基類似体この発明の好ましいもう一つの実施熊様では、核酸類似体の若干、または全ヌクレオチドは修飾核塩基である。好ましい核塩基の修飾として、C-5-アルキルピリミジン、2,6-ジアミノプリン、2-チオピリミジン、C-5-プロピンピリミジン、 7-デアザプリン、イソシトシン、イソグアニンおよび万能塩基があり、Watson/C rickの塩基特異性識別の低下、塩基対合ハイブリッド形成相互作用の減少を示す。例えば、3-ニトロピロール(Nichols、1994)および5-ニトロインドール（Loake s、1994）がある。 5'-および3'-末端修飾この発明の第三の局面において、キメラの5'-および3'-末端を修飾することにより、物理化学的特性および生物学的特性を改善したキメラベクターを得る。特に、このような修飾により、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増加させる。この局面の好ましい実施態様において、3'-末端ヌクレオチドとして、2'、3'-ジデオキシヌクレオチドを包含させることにより、キメラの3'-末端を修飾する。もう一つの好ましい実施態様において、5'-5'結合、2'-5'結合または標識、好ましくは蛍光色素またはビオチンを包含させることにより、キメラの5'-末端を修飾する。一般的には、公知の合成技術を使用して核酸類似体を合成する。ポリヌクレオチドの形成に使用する化学的作用はBeaucage、1992によって詳細に解説されている。この発明のキメラの作製に使用するホスホルアミデートによるポリヌクレオチド合成法は、出発ヌクレオシドモノマーの効率的かつ迅速なカップリングおよび安定性のため、好ましい合成法である。一般的には、固体支持体に付着させたポリマー鎖を増殖させて合成を行い、その結果、液相中の過剰試薬をろ過により容易に除去でき、それによってサイクル間の必要な精製段階が減少する（Caruth ers、1984）。分析および精製方法核酸類似体、ペプチドおよび構築物などの高分子量分子の分析および精製では、高分解能および高分離効率が要求されている。これらは、電荷および分子内水素結合のため、安定な複合構造をとることがよくある。例えば、従来型のHPLC分離で使用する非変性逆相条件下では複数のピークが存在する可能性があり、生成物の単離および収集が煩雑になる。変性剤の7M尿素によるスラブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）は、構築物の分析および精製に使用し得る。厚さ3mm のゲルに10〜20の粗oduを負荷して電気泳動を行い、蛍光TLCプレート（EMS cien ce、part#5735）にUV光を照射してバンドを切り取り、室温下、水中で一晩すすぎ、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（PE Applied Biosystems、part#4007 71）で脱塩／濃縮して若干のodu（A２６０ｎｍ、約100μg）を単離し得る。ポリマー吸着剤（Dionex NucleoPac PA-100；4×250mm、Dionex Co.）の陰イオン交換HPLCにより、良好な分解能、予想可能な溶出パターンおよび再現性のある保持時間が得られる。構築物に有用なプロトコールは、以下のものを必要とする。移動相−溶媒Ａ：100mM NaCl、10mM NaOHの10％アセトニトリル溶液（pH12）；溶媒Ｂ：800mM NaCl、10mM NaOHの10％アセトニトリル溶液（pH12）；溶出速度＝1 .0ml/分；０分から25分にかけて、Ｂ溶媒を0％から80％へ直線的に勾配させる（ Andrus、1998）。 II．ペプチドの構造および合成この発明の細胞を通過する構築物中のペプチドは、Derossi、1994により述べられた第三螺旋構造のAntennapediaホメオドメインおよびPooga、（FASEB）1998 により述べられたトランスポルタンを含む。実施例４の方法により両ペプチドを合成し、実施例６の方法によりPNAおよび他の核酸類似体に抱合し得る。両ペプチドと、その相同体および構成変種は、数種の細胞株によって効率的に取り込まれ、その細胞内分布が確認されてきた。このペプチドと、その保存的変種を選び、下記に示す。トランスポルタン（ガルパラン）は、N-末端が神経ペプチドガラニン（Bartfa i、1993；Habert-Ortoli、1994）およびC-末端がマストパランで、両断片がリジンを介して結合した27アミノ酸ペプチドである。トランスポルタンは、細胞透過性ペプチドであり、ビオチニル化類似体のNε13-ビオチニル-トランスポルタンを使用する間接免疫蛍光法により鑑定される。トランスポルタンの取り込みは、試験を行った全細胞株において迅速かつ効率的である。ビオチニルートランスポルタンの内在化は、エネルギーに依存し、０〜37℃で効率的に起こり、37℃で約 20分後、細胞内最大収縮に達する。トランスポルタンの細胞透過性は、細胞型によっては限定されないが、ペプチド配列の一般的特徴をもつ。 Antennapedia断片において、一種以上のトリプトファン残基の存在が内在化を促進するのに好ましい。トランスポルタンは、二つの残基、Trp²およびTyr⁹を含有し、これらの残基は、転位ミセル形成を誘発し得る。トランスポルタンは、疎水性または親水性核酸類似体などの異なった巨大分子の導入に有用なペプチドベクターである。トランスポルタンの内在化は、受容体／タンパク質に依存し、中等度の温度では、培養中の細胞の成長に影響を及ぼさない。トランスポルタンのエネルギー依存性細胞透過性は、核DNAまたはmRNAなどのように、細胞内ポリヌクレオチドに配列特異的にハイブリッドを形成させるため、核酸類似体に抱合されると、重要な結果および予期しない結果をもたらす。 III．ペプチドおよび核酸類似体の抱合構築物を調製する一般的な抱合戦略は、核酸類似体とペプチド部分を別々に合成することである。試薬および自動合成装置は、ペプチドや、多くの核酸類似体の合成用に市販されている。さらに、各部分を誘導体化し、結合を形成するための反応機能性をもたせ得る。核酸類似体を適当な結合によりペプチドに共有結合させ得る。好ましい結合は、ジスルフィドなどの不安定性結合である。構築物の核酸類似体とペプチド間をジスルフィド結合させるため、二つの部分を誘導体化して、チオール基にし、他方にleaving基をもたせ得る。下記および実施例５に示す核酸類似体およびペプチド部分の抱合またはカップリング図において、ペプチドをシステインアミノ酸上のニトロピリジルleaving 基（Npys）により誘導体化する。核酸類似体は、非保護システインチオールをもち、さらに、蛍光色素またはビオチンなどの標識により誘導体化し得る。ペプチドのNpys基を核酸類似体チオールで求核置換して、ジスルフィド結合構築物を得る。 IV.構築物の細胞内送達この発明の有用性は、親水性物質、例えば、細胞内標識対向性ペプチドライブラリー、細胞毒素、細胞増殖抑制物質、抗細菌性物質、抗ウイルス性物質、プラスミドおよびタンパク質の細胞内送達にある。可能性のある適用として、癌療法、信号形質導入研究（公知のＧタンパク質のペプチド性阻害剤、タンパク質キナーゼ／ホスファターゼなどがある）、新規な細胞内薬物標的の発見（ライブラリーアプローチによる）、形質移入（または遺伝子療法）および細胞内タンパク質レベルの上昇による結果の研究（Alberts、1989）。この発明は、基礎的な分子生物学的研究にとって、新規の有力な手段を提供するものである。本明細書において述べる構築物および方法は、いかなる生物種の細胞にも使用し得る。この発明は、より効果的な薬物を発見し、治療的介入の新規な点を認識する上で助けとなり、この発明のペプチド構築物の膜透過性活性を本質的に必要とする細胞に分子を導入する一般的方法を提供するものである。この発明の構築物は、容易に細胞内に入いる（実施例６および７）。細胞を１ μMの特定の構築物とインキュベート（第４図）すると、速やかにビオチニル-PN Aを示し、核などにほぼ均一に分布したビオチニル-PNAを間接免疫蛍光により検出する。ガラニンは、広範囲に分布する29または30アミノ酸の神経ペプチドで、広域生物作用スペクトルをもつ（Pooga（FASEB）、1998；Bartfai、1995）。１型ガラニン受容体GalR1は、ヒトBowes黒色腫から最初にクローン化され、次いで、ラット脳からクローン化された（Habert-Ortoli、1994）。GalR1は、種間で高度に保存され、視床下部、海馬および脊髄に豊富に存在する。GalR1の発現ダウンレギュレーションによるPNA-S-S-ペプチド構築物（例えば、AおよびB）のアンチセンス作用例を本明細書において示す。また、実施例９において、ラット脊髄におけるガラニン受容体のin vivo抑制を示し、ガラニン受容体発現の減少により、疼痛反応が著明に修飾されることを示す。この疼痛伝搬の減少は、125I-ガラニン結合の減少量と相関する（例えば，機能的ガラニン受容体）。 Cos-7細胞のヒトガラニン受容体の発現をPNA、天然DNAオリゴヌクレオチドおよび構築物ＡとＢ（第４図および第５図）のアンチセンス作用により実験した。 PNA配列をプラスミドと共に細胞内に形質移入すると、Cos-7細胞のガラニン受容体の一過性発現が低下する（実施例７）。プラスミドをPNAと予備インキュベートすることにより、さらに著明なガラニン受容体合成阻害が得られる。構築物ＡおよびＢを細胞内へ導入すると、おそらく、より高い細胞内濃度が得られるため、著明に強力なアンチセンス作用が得られる（第６図）。ガラニン受容体含有量の減少は、用量依存的で、構築物ＡおよびＢの濃度に比例する（第７図）。共倒れ型ナンセンスPNAを使用する対照構築物ＡおよびＢは、特異的¹²⁵I-ガラニン結合に作用を及ぼさなかった。Ｖ．実施例次ぎの実施例を考慮することにより、この発明をさらに明確にする。実施例は、この発明の単なる例示であって、いかなる場合もその範囲を制限しないものである。実施例１ PNAの合成合成装置製造業者の使用説明書およびEgholm、1993の一般的操作方法に従って、 Applied Biosystems Model394 DNA/RNA合成装置または433Aペプチド合成装置（P erkin-Elmer Corporation、PE Applied Biosystems Division）を使用してPNAの自動合成を実施し得る。 PNAの合成を、MBHA（メチルベンズヒドリルアミン）リンカー、高負荷ポリスチレン支持体で、第２表の段階サイクルにより２〜50μMスケールで実施し得る。各Boc-PNAモノマー付加に対してサイクルを実施する（Dueholm、1994）。標準合成技術および核塩基（A^bz、C^bz、Ｇ^ibu、T）および一級アミノ（MMT、F moc またはBoc）保護基により、PNAの合成を実施する。しかし、システインのニトロピリジルスルフィド保護基（Npys）は、ピペリジンで分解するため、NPysが配列内に含まれる場合、MMTまたはBoc法を必要とする。5μMのスケールの場合、全反応容量が440μlの3ml反応容器を使用する。合成終了時に、PNAを室温で１時間TF MSA（トリフルオロメタンスルホン酸）で分解した後、粗PNAをエーテルで沈殿させる。 21mer cPNA（18-32）をアミノ末端がシステインアミノ酸残基で合成した。PNA 配列は、１型ヒトガラニン受容体mRNAのヌクレオチド18-38と相補的な逆平行方向にある。実施例２ PNA/DNAキメラの合成使用説明書およびUhlmann、1996；Van der Laan、1997およびVinayak、1997の一般的操作方法に従い、Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成装置または 433Aペプチド合成装置（The Perkin-Elmer Corporation、PE Applied Biosystem s Division）を使用してPNA/DNAキメラを自動合成し得る。 PNA/DNAキメラ合成に使用する支持体は、非膨潤性の高架橋ポリスチレンビーズで、ヒドロキシメチル安息香酸リンカーをもつ（Vinayak、1997）。キメラ合成のPNAモノマーは、モノメトキシトリチル（MMT）基を使用して、一級アミンを保護する。第一段階で、モノマーのHATUおよびDIPEAをそれぞれDNF/アセトニトリル、1/1に溶解し、同時に反応カートリッジへ送る。16分後に、キャッピング試薬を加える。PNAの一級アミノ基の原子移動性または環化性を最小限に抑えるため、最後のMMT基を除去した後にPNAおよびPNA-DNAキメラの5'（N）末端をアセチル化する。DNAおよびPNA部分の結合に必要な試薬、キメラ合成、分解、脱保護および精製のための操作方法は、Van der Laan、1997によって述べられている。この研究方法において、単一カートリッジおよび単一合成装置でキメラを一つの分子として作製し得る。合成後、水酸化アンモニウム（1.5mM）またはMeOH:t-BuNH₂:H₂O（1:1:2）の混合液を使用して支持体からキメラを分離し、溶液を55〜85℃で1〜16時間加熱して環外アミン保護基を除去する。次に、溶液を最初の容量の1/2に濃縮し、水（1 ml）を加え、ゲルろ過法（SephadexTM、Pharmacia）によりキメラを脱塩する。逆相HPLC、陰イオン交換HPLC,毛管ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および他の通常の方法により、キメラを分析し、精製し得る（Andrus、1992 ）。実施例３ 5'-アミノ、2'-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドの合成 Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成装置（The Perkin-Elmer Corpora tion、PE Applied Biosystems Division）を使用し、使用説明書およびSprat、1 994の一般的操作方法により、5'-アミノ、2'-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドを自動合成し得る。DNA（dA^bz、dG^dmf、dC^bz、T）および2'-O-Me RNA（A^bz、G^dmf 、C^bz、U）ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーでオリゴヌクレオチドを合成する。８個のモノマーは、乾燥アセトニトリル（＜50ppm H₂O）で自動希釈されるが、合成装置で２〜３週間の有用な寿命をもつ。２μMスケールでの各サイクルに対して、0.1Mホスホルアミダイトヌクレオシドのアセトニトリル溶液40μ l（約3.5mg）を0.5M 5-Hテトラゾールのアセトニトリル溶液120μlと同時に添加してカップリングを行う。合成および固体支持体からの分離を中断することなく、自動的に行う。これらは、すべて８モノマー位を用い、カップリング時間は、特異的に、25秒間（DNA）および４分間（2'-Ome RNA）である。最後のモノマーとして、N-トリフルオロアセチル、6-アミノヘキシル、シアノエチルジイソプロピルアミノホスホルアミダイトにより、5'-アミノ基を支持体結合オリゴヌクレオチドに結合する。合成効率をトリチル伝導度モニターにより、リアルタイムで測定し、一般的に、合成効率は、＞98％の段階的平均収量を示す。12μモルの3' -ヌクレオシド/g支持体で負荷した高架橋度の1000Åポア径ポリスチレンを使用して、.2μ モルスケール（約1.6mg）で約40粗oduのオリゴヌクレオチドを生成する。スケールを１μモルに上げると、1000Åの3'-ヌクレオシドCPG支持体で200粗odu（約8m g）が得られる。A,GおよびCの核塩基保護基を、濃水酸化アンモニウム（65℃で１時間）中の匹敵する脱保護速度で選択する。HPLCによる分離、脱保護および精製後、最長50塩基の5'-アミノ、2'-O-メチルRNAオリゴヌクレオチドを高純度および高収量でルーチン的に得ることができる。実施例４ビオチンートランスポルタンペプチドの合成ペプチドおよびPNAオリゴマーをt-BOC試薬を用いる固相合成法（Geiser、1988 ）を使用して、ABI431Aおよび433ペプチド合成装置（PE Applied Biosystems 、Foster City、CA）で構築する。 MBHA-ポリスチレン支持体（1.1mMアミノ/g負荷、Bachem、Switzerland）で0.1 ｍモルスケールの段階的アミノ酸付加方法でペプチドを合成し、C-末端アミドペプチドを得た。ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）／ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）を使用してアミノ酸モノマーを活性化した。側鎖からのホルミルおよびベンジル基の脱保護をTFMSA（トリフルオロメタンスルホン酸）を使用して実施した。ヒスチジンのDNP保護基を20（重量）％チオフェノール／DMFと室温で１時間処理して除去した。ビオチンートランスポルタンの合成には、Ne13 Fmoc-トランスポルタン-MBHA樹脂を用いた。N-Fmoc保護基を20％ピペリジンのDM F溶液で除去した。ペプチドー樹脂に、３×過剰量のHOBTおよびDCC活性化ビオチンのDMF溶液を添加して、用手法によりビオチンをペプチドに結合した。カップリング反応は、室温で１時間後に完了させた。最後に、液体HFと０℃で30分間処理して、ペプチドを樹脂から分離した。逆相HPLC精製、Nucleosil 120-3 C18カラム（0.4×10cm）のHPLC分析による逆相HPLC精製後のペプチドの純度は、＞99 ％と評価された。Plasma Desorption Mass Spectrometer（BioIon20、Applied B iosystems）による分子質量測定により同定した。実施例５ペプチドおよびPNAの抱合 15mer PNAH₂N-CCC TCG CTG AGG TCC-アミド（SEQ.ID NO.9）をヒトガラニン受容体mRNAに対するアンチセンス配列として設計し、合成する。PNAをN-末端でシステインアミノ酸に結合した。細胞における構築物の細胞内局在部位の検出を可能にするため、システインのアミノ部分をビオチニル化してビオチン-cys-CCC T CG CTG AGG TCC-アミドを得た。生体膜を通過すること（Derossi、1996）が知られているAntennapediaヘモドメインの16アミノ酸第三螺旋構造ペプチドpAntp（4 3-58）のトランスポルターペプチドpAntp（43-58）をN末端にニトロピリジルスルフィドシステイン残基を含む２として合成した。精製したCys（NPys）-ペプチド２を脱気した40％ジメチルホルムアミドのDMSO溶液中で、Cys-PNA1と1:1のモル比（または、僅かに過剰量のPNA）により混合した。PNAのシステインとペプチドのシステイン間を架橋して、構築物、cPNA（18-32）-S-S-pAntp（43-58）を得、HPLC精製（第３図）後に純粋状態で単離してジスルフィド架橋構築物、例えば、Aを得た（第３図および第５図）。試薬濃度は、可能な限り高く、例えば、0.0 2〜0.10mMにすべきである。反応は、遮光し、窒素下で、穏やかに振とうしながら18〜24時間反応させた。粗生成物を逆相HPLCにより精製した。実施例４のように、分子質量分光分析法により同定した。実施例６構築物の細胞導入ヒト黒色腫細胞Bowes’(ATCC CRL-9607)を、10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したEagle's Minimal Essential Medikum（MEM）（「Gibco」）中で培養した。細胞をプレパレートガラス上におき、ミクロチャンバー中で約50％の融合性が得られるまで増殖させた。細胞培地に構築物および対照物（PNAおよびペプチド）を直接加え、5 %CO₂下、37℃で特定の期間インキュベートした。ガラス上の細胞を、主にPBSですすぎ、４％パラホルムアルデヒドおよび１％グルタルアルデヒドのPBS混合液で固定した。固定細胞をメタノール中、-20℃で10分間浸透させ、非特異的結合部位を５％BSAのPBS溶液でブロックした。取り込まれたビオチニル化PNAおよびペプチドをストレプトアビジン-FITC（Amersham、1:100希釈）またはアビジン -TRITC（Sigma、1:200希釈）により検出した。ヒトBowes'黒色腫細胞を1μMの構築物AまたはB（第４図）の一方と37℃で４時間インキュベートすると、間接免疫蛍光法により、ビオチニル-PNAをどの細胞でも検出でき、核を含めて、ほぼ均一に分布する。使用する両輸送ペプチドが同一でなくても、その染色パターンは類似し、たとえペプチド自体、pAntp（43-58）およびトランスポルタンが細胞内局在化において異なる偏好性を示すとしてもである。トランスポルタンは、膜構造において優勢的に存在し、一方、pAntp（43- 58）は、核偏好性を示す。構築物とペプチドのみの染色パターンが異なるので、 PNAはペプチドから分解される。細胞内では、ペプチドをPNAに連結する構築物A およびBの不安定性ジスルフィド結合が、迅速に分解して、ペプチドからPNAを解離し、それによって、細胞質ゾル中の標識mRNAと会合または核内へ移行する。６、16および21単位長のPNAを含む三種の構築物は、類似する効率で細胞内に送達される（実施例１）。実施例７ PNA単独によるcos-7細胞のインキュベーション電気穿孔法によりcos-7細胞をガラニン受容体運搬pRK8プラスミド２μgとcPNA 21 ２μgおよび担体としてサケ精子DNA 50μgと共に細胞内に同時形質移入した。比較のため、PNA無添加の担体DNA単独により、同じ形質移入を行った。形質移入細胞を48時間増殖させ、発現ガラニン受容体量を¹²⁵I-ガラニン結合によって推定した。細胞を2.5mM MgCl₂、0.5mM EDTA（pH7.3）を含む低張性氷冷5mM HEPES緩衝液中に懸濁して溶解した後、氷上で10分間インキュベートした。得られたミクロゾーム膜分画を４℃、10,000×gで10分間遠心分離して集め、秤量した。膜を0.05 ％（w/v）ウシ血清アルブミンおよび0.1％（w/v）バシトラシン添加HEPES緩衝化 Krebs-Ringer（HKR）溶液に再懸濁し、ガラス-Teflonホモジェナイザーでホモジネートした。平衡結合実験を、200pM[¹²⁵I]-ガラニン（NEN）、細胞膜およびガラニンを含むHKRの最終容量300μl中で行った。試料を振とう水浴中、37℃で30 分間インキュベートした。氷冷HKR2×10mlを添加してインキュベーションを停止させた後、0.3％（v/v）ポリエチレンイミン溶液中、２〜３時間、予め被覆した Whatman GF/Cガラス繊維ろ紙で急速ろ過した。ろ紙に保持された放射活性をγ計数計（Packard）で測定した。比結合を大過剰量の非標識ガラニン（１μM）と置換し得る全結合に対する割合として測定した。タンパク質濃度をPeterson、1977 により測定した。実施例８ Bowes細胞株における１型ヒトガラニン受容体のダウンレギュレーション様々な構築物および対照核酸類似体をBowes黒色腫細胞（第６図）に送達し、ヒトガラニン受容体翻訳のダウンレギュレーションにおけるPNA構築物のアンチセンス効果を示させた。ヒトcPNA配列が、トランスポルタンおよびpAntpをもつ構築物の核酸類似体部分であるとき、¹²⁵I-ガラニン結合に及ぼす強力な阻害作用が得られる。¹²⁵I-ガラニンの比結合は、１型ガラニン受容体mRNAのコード領域のヌクレオチド18-38を標的とする構築物で最も減少した。CPNAh（18-38）-S- S-pAntp3μMまたはcPNAh（18-38）-S-S-トランスポルタンＢとBowes細胞を処理することにより、結合をそれぞれ91%および83％減少させる（第６図）。ガラニン受容体による¹²⁵I-ガラニン比結合の最大減少率91％（3μM A）または83％（1 .5μMM B）は、細胞を構築物ＡおよびＢと37℃で36時間インキュベーションした後に検出された。ヌクレオチド1-21を標的とするGalR1 mRNAの翻訳出発部位と相補的なPNAだけは効果が弱い。推定RNA二次構造は、１型ガラニン受容体mRNAのコード領域の領域1-21および18-38は、主に、不対環状構造中に存在することから、PNAにより各領域を効率的に標的化し得ることが確認できる。ヒトおよびラットGalR1は、高度に相同するが、mPNAの1-21位および18-38位が、それぞれ６および５ヌクレオチドと異なる。ヒトガラニン受容体に対するラット特異的PNAとmRNAに起こり得る相互作用により、各構築物の低アンチセンス効果をある程度説明し得る。1μM cPNA r（1-21）-S-S-pntpおよびcPNAr（18-38） -S-S-pntp（Ａ）とのインキュベーションにより、36時間後のガラニン受容体への¹²⁵ I-ガラニンの比結合は13%および18％低下する。比較として、領域18-38と相補的な非修飾ホスホジエステルアンチセンス21mer オリゴヌクレオチドの効果を測定した。オリゴヌクレオチド濃度10μMでは、ホスホジエステルDNAの安定性が比較的低いため、¹²⁵I-ガラニン結合の減少は５％しか観察されなかった（第６図）。ヒトGalR1 mRNAのヌクレオチド18-38に相補的なホスホロチオエート21merは、著明なアンチセンス効果を示すが、濃度は、これと対応するPNAよりも著明に高い。12μMホスホロチオエートh（18-38）と36 時間インキュベートすることにより、ガラニン結合が37％減少する。ウエスターンブロット分析によると、PNA-S-S-ペプチド構築物、例えば、ＡおよびＢとの処理後、ガラニン受容体と¹²⁵I-ガラニンの比結合が減少し、細胞膜中のガラニン受容体タンパク質含有量の減少を伴う。この結果は、タンパク質発現の減衰と¹²⁵I-ガラニン結合間の相関関係を示す。実施例９ラット脊髄におけるin vivoラット１型ガラニン受容体のダウンレギュレーション構築物Ａおよび、これと対応する共倒れ型21merPNAを含む構築物150μMを、長期的に埋め込んだカテーテルよりラットのくも膜下に投与した。36時間中に３回注入を行い、最後の注射から約12時間後に電気生理学的実験を行った。いかなる場合にも毒性、麻痺または運動障害は認められなかった。侵害受容屈筋反射を高閾値電気刺激に反応する同側性ひかがみ筋のEMGとして記録した。基準屈筋反射および、反復C-繊維刺激による反射促進に及ぼすガラニン投与の効果を評価し、その効果を構築物Ａおよび共倒れ型配列を受容したラット間で比較した（第８図）。C-繊維の条件付け刺激（CS）により、21mer cPNAをもつ構築物または共倒れ型PNA配列をもつ構築物を受容したラットにおいて、同様に、主として屈筋反射促進が誘導される。ガラニン注射により、共倒れ型21mer PNAをもつ構築物で処理したラットおよび未処理のラットにおいて、C-繊維CSによる反射促進は用量依存的に阻害される。このガラニン効果は、構築物Ａを受容したラットでは約100倍低下する（第８図）。これらの結果より、Ａなどの構築物は、脊髄興奮性のC-繊維CS誘発性増加に及ぼすくも膜下ガラニンの遮断効果の用量反応曲線を100倍シフトさせることが明らかである。これは、ガラニンの阻害作用を介在すると思われる１型ガラニン受容体の著明なダウンレギュレーションを意味する。実施例10 DNAホスホジエステルオリゴヌクレオチドRINm5F細胞の制御ダウンレギュレーション比較として、三種の異なるアンチセンスホスホジエステルオリゴヌクレオチドをポリアミン界面活性化剤のLIPOFECTAMINETMにより調製し、ガラニン受容体含有RINm5F細胞に形質移入した。RINm5Fインスリノーマ細胞を、５％（v/v）ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地中、5％CO₂-強化空気下、37℃で増殖させた。オリゴデオキシヌクレオチドの添加時には、血清および抗生物質無添加Optim-ME M(r)1還元血清培地を使用した。全細胞培養培地を、GIBCOから購入した。オリゴヌクレオチド配列は、次のラット１型ガラニン受容体のATGコドン領域と相補的であった。最終濃度範囲0.2〜20μMで、異なる時間（4〜24時間）インキュベーションして試験した後、薬物無添加培地で24時間増殖させて収穫し、¹²⁵I-ガラニン結合実験を行った。これらのオリゴヌクレオチドの受容体タンパク質発現レベルに及ぼす効果は、いかなる条件下においても認められなかった。効果が認められないのは、ヌクレアーゼ分解のため、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの安定性が比較的低いことにより説明し得る。択一的に、RINm5F細胞のガラニン受容体は、異なるサブ型である可能性がある。にもかかわらず、このようなRINm5F細胞での陰性結果は、この発明局面、つまり、細胞内ポリヌクレオチドを標的とする安定な核酸類似体および細胞透過性輸送ペプチドの必要性を明確に示すものである。本明細書において、個々の出版物または特許出願書を参照文献により明確かつ個別に示して、全出版物および特許出願書を参照文献により包含させる。上記に若干の限られた実施態様について詳細に述べてきたが、分子生物学分野の当業者にとって、この好ましい実施態様について数多くの変更を、実施熊様の説明にもとることなく遂行できることは明らかである。このような変更はすべて、以下の特許請求の範囲内に包含されるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１２年１月２４日（２０００．１．２４）【補正内容】５．１請求の範囲を別紙の通り訂正します。５．２明細書を以下の通り訂正します。（１）第９頁８行目の「アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞内送達を増強すること」を「アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内送達を増強すること」に訂正します。（２）第10頁11行目の「pAnto」を「pAntp」に訂正します。（３）第11頁３行目の「易動性」を「不安定性」に訂正します。（４）第11頁３行目の「生成」を「精製」に訂正します。（５）第12頁１行目の「易動性」を「不安定性」に訂正します。（６）第12頁３行目の「易動性」を「不安定性」に訂正します。（７）第12頁９行目の「易動性」を「不安定性」に訂正します。（８）第12頁10行目の「易動性」を「不安定性」に訂正します。（９）第12頁11行目の「これらｈ」を「これらは」に訂正します。（10）第13頁22行目の「定量的」を「定量的情報」に訂正します。（11）第15頁10行目の「核酸」を「核酸アナログ」に訂正します。（12）第15頁11行目の「分子」を「原子」に訂正します。（13）第15頁19行目の「5'-インタイヌクレオチド結合」を「5'-ヌクレオチド間結合」に訂正します。（14）第16頁11〜12行目の「最も一般的な天然アミノ酸」を「20 個の最も一般的な天然Ｌ−アミノ酸」に訂正します。（15）第19頁２行目の「cPNA」を「PNA」に訂正します。（16）第19頁６行目の「PNA」を「cPNA」に訂正します。（17）第19頁26〜28行目の「この発明の好ましい核酸類似体は、ペプチド核酸（PNA）の次世代アンチセンス試薬（Nielsen、1991；Bennet、1998）として、潜在的有用性をもつ、特に有望なクラスの核酸類似体である。」を「この発明の好ましい核酸類似体は、次世代アンチセンス試薬（Nielsen、1991；Bennet、1998 ）として、潜在的有用性をもつ、特に有望なクラスの核酸類似体であるペプチド核酸（PNA）である。」に訂正します。（18）第20頁2〜４行目の「PNAは、よく知られたヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼまたは他の修飾酵素の基質ではなく、」を「PNAは、よく知られた任意のヌクレアーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼまたは他の修飾酵素の基質ではなく（Demidov ら、1994）、」に訂正します。（19）第20頁22〜23行目の「2-アミノエチルヒリシンペプチドバックボーン」を「2-アミノエチルグリシンペプチドバックボーン」に訂正します。（20）第20頁27行目の「DNA/PNA」を「DNA/RNA」に訂正します。（21）第21頁10行目の「リボチーム」を「リボザイム」に訂正します。（22）第23頁24行目の「単離」を「同定」に訂正します。（23）第23頁26行目の「電気泳動を行い」を「標準的条件下で電気泳動を行い」に訂正します。（24）第23頁27行目の「バンドを切り取り」を「可視化した後にバンドを切り取り」に訂正します。（25）第24頁11行目の「第三螺旋構造のAntennapediaホメオドメイン」を「An tennapediaホメオドメインの第三螺旋pAntp(43-58)」に訂正します。（26）第25頁４行目の「受容体／タンパク質に依存し」を「受容体／タンパク質に依存せず」に訂正します。（27）第25頁５行目の「温度」を「濃度」に訂正します。（28）第26頁17行目の「信号形質導入研究」を「シグナル伝達研究」に訂正します。（29）第31頁14行目の「1.1mM」を「1.1mmol」に訂正します。（30）第32頁8行目の「ヘモドメイン」を「ホメオドメイン」に訂正します。（31）第32頁13行目の「架橋」を「ジスルフィド架橋」に訂正します。（32）第33頁13行目の「標識mRNA」を「標的mRNA」に訂正します。（33）第33頁20行目の「細胞内に」を「5 ×10⁶個の細胞内に」に訂正します。（34）第34頁16〜17行目の「CPNAh（18-38）-S-S-pAntp3μMまたはcPNAh（18- 38）-S-S-トランスポルタンＢとBowes細胞を処理すること」を「cPNAh（18-38） -S-S-pAntpＡ3μMまたはcPNAh（18-38）-S-S-トランスポルタンＢ1.5 μMでBowes 細胞を処理すること」に訂正します。（35）第34頁25行目の「mPNA」を「mRNA」に訂正します。（36）第34頁28行目の「cPNA r（1-21）-S-S-pntp」を「cPNA r（1-21）-S-S- pAntp」に訂正します。（37）第34頁28〜29行目の「cPNA r（18-38）-S-S-pntp」を「cPNA r（18-38 ）-S-S-pAntp」に訂正します。（38）第35頁４行目の「安定性」を「ヌクレアーゼ安定性」に訂正します。（39）第35頁19行目の「電気生理学的実験」を「急性の電気生理学的実験」に訂正します。（40）第36頁9〜10行目の「DNAホスホジエステルオリゴヌクレオチドRINm5F細胞の制御ダウンレギュレーション」を「DNAホスホジエステルオリゴヌクレオチドRINm5F細胞でのガラニン受容体の制御ダウンレギュレーション」に訂正します。請求の範囲１．脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物であって、以下：細胞内ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸アナログ；ペプチド；および該核酸アナログと該ペプチドを連結する不安定性結合、を含む、構築物。２．前記ペプチドが、以下の配列を含み、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、請求項１に記載の構築物。３．前記ペプチドが、以下の配列 GWT; を含み、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、請求項ｌに記載の構築物。４．以下の配列を含む、請求項３に記載の構築物であって、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、構築物。５．以下の配列を含む、請求項４に記載の構築物であって、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、構築物。６．前記核酸アナログが、PNAまたはPNA/DNAキメラである、請求項１に記載の構築物。７．前記核酸アナログが、2'-O-アルキルRNAまたは2'-O-アルキルRNA/DNAキメラである、請求項１に記載の構築物。８．前記核酸アナログが核酸塩基改変オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の構築物。９．前記ペプチドおよび前記核酸アナログが、細胞内への輸送後に切断される結合によって結合されている、請求項１に記載の構築物。１０．前記結合がジスルフィド結合である、請求項９に記載の構築物。１１．前記結合がエステル結合である、請求項９に記載の構築物。１２．標識をさらに含む、請求項１に記載の構築物。１３．前記標識が、ビオチン、ジニトロフェニル、アクリジン、フルオレッセイン、ローダミン、シアニン、ジゴキシゲニン、インターカレーター、副溝結合剤、および以下の構造ここで、R₁は水素またはハロゲンであり；R₂はリン酸、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり；そして、R₃はメチル、エチル、および低級アルキルである、を有する化学発光剤前駆体からなる群より選択される、請求項１２に記載の構築物。１４．前記ペプチドが、以下を含み、ここでR₁およびR₂のそれぞれが、ペプチド、アミノ酸、NH₂、H、または OHであり、R₁ およびR₂ のうちの少なくとも１つがペプチドであり、前記核酸アナログが、ペプチドであるR₁およびR₂の１つに結合されている、請求項１に記載の構築物。１５．前記R₁およびR₂の１つがシステインを含み、そして前記核酸アナログが、該システインにジスルフィド結合されている、請求項１４に記載の構築物。１６．以下の構造を含み、ここでR₁がペプチドであり、そしてNAAが前記核酸アナログである、請求項１に記載の構築物。１７．前記NAAが、ジスルフィド結合を介してKに連結されているPNAまたはPNA/D NAキメラである、請求項１６の構築物。１８．前記R₁が、以下を含む、請求項１６に記載の構築物。１９．前記Ｃ末端Ｌがアミド化されている、請求項１６に記載の構築物。２０．前記ジスルフィド結合が、１対のシステイン残基の間で配置される、請求項１６に記載の構築物。２１．DNA転写、RNA翻訳、RNA発現もしくはDNA発現、DNA複製、あるいは生存細胞におけるDNAもしくはRNA配列の予め選択された１つまたはサブセットのDNAまたはRNAの調節機能を選択的に阻害する方法であって、該方法が、以下：脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物を提供する工程であって、以下：細胞内ポリヌクレオチドと相補的な配列を有するPNA；ペプチド；ならびに該P NAおよび該ペプチドを連結する不安定性結合；を含む、工程；および該構築物が、細胞の外膜を横切って輸送され、少なくとも透過し、そして該PN Aが、そこに配置される細胞内ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように該構築物に細胞を曝露する工程；を包含する、方法。２２．前記構築物が標識を含む、請求項２１に記載の方法。２３．前記標識が蛍光標識である、請求項２２に記載の方法。２４．前記構築物が細胞内へ輸送された後、および不安定性結合が切断される前または後で、前記蛍光標識を検出する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。２５．前記標識がビオチン標識である、請求項２２に記載の方法。２６．前記構築物が細胞内へ輸送された後、および不安定性結合が切断される前または後で、前記ビオチン標識を検出する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 31/712 Ａ６１Ｋ 37/02 ＺＮＡ (72)発明者プーガ，マルグスエストニア国タルツイーイー2400，ピック 98―27 (72)発明者バルクナ，アンドレスエストニア国タルツイーイー2400，アルドラ 69 (72)発明者ソール，クリッキスウェーデン国リディンゴ 181 62, サルグスティゲン 37，オルロール内 (72)発明者ハルブリンク，マティーアススウェーデン国ストックホルム 104 05，プロフェッソースリンゲン 23

Claims

【特許請求の範囲】１．脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物であって、以下：細胞内ポリヌクレオチドとハイブリダイズし得る核酸アナログ；ペプチド；および該核酸アナログと該ペプチドを連結する易動性結合、を含む、構築物。２．前記ペプチドが、以下の配列を含み、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、請求項１に記載の構築物。３．前記ペプチドが、以下の配列 GWT; を含み、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、請求項１に記載の構築物。４．以下の前記配列を含む、請求項３に記載の構築物であって、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、構築物。５．以下の前記配列を含む、請求項４に記載の構築物であって、ここでそれらのホモログおよび保存的変異体を含む、構築物。６．前記核酸アナログが、PNAまたはPNA/DNAキメラである、請求項１に記載の構築物。７．前記核酸アナログが、2'-O-アルキルRNAまたは2'-O-アルキルRNA/DNAキメラである、請求項１に記載の構築物。８．前記核酸アナログが核酸塩基である、請求項１に記載の構築物。９．前記ペプチドおよび前記核酸アナログが、細胞内への輸送後に切断される結合によって結合されている、請求項１に記載の構築物。１０．前記結合がジスルフィド結合である、請求項９に記載の構築物。１１．前記結合がエステル結合である、請求項９に記載の構築物。１２．標識をさらに含む、請求項１に記載の構築物。１３．前記標識が、ビオチン、ジニトロフェニル、アクリジン、フルオレッセイン、ローダミン、シアニン、ジゴキシゲニン、インターカレーター、副溝結合剤、および以下の構造ここで、R₁は水素またはハロゲンであり；R₂はリン酸、ガラクトシド、グルコシド、グルクロニド、トリアルキルシリルオキシ、アシルオキシ、または水素であり；そして、R₃はメチル、エチル、および低級アルキルである、を有する化学発光剤前駆体からなる群より選択される、請求項１２に記載の構築物。１４．前記ペプチドが、以下を含み、ここでR₁およびR₂のそれぞれが、ペプチド、アミノ酸、NH₂、H、または OHであり、少なくとも１つのR₁およびR₂がペプチドであり、前記核酸アナログが、ペプチドであるR₁およびR₂の１つに結合されている、請求項１に記載の構築物。１５．前記R₁およびR₂の１つがシステインを含み、そして前記核酸アナログが、該システインにジスルフィド結合されている、請求項１４に記載の構築物。１６．以下の構造を含み、ここでR₁がペプチドであり、そしてNAAが前記核酸アナログである、請求項１に記載の構築物。１７．前記NAAが、ジスルフィド結合を介してKに連結されているPNAまたはPNA/D NAキメラである、請求項１６の構築物。１８．前記R₁が、以下を含む、請求項１６に記載の構築物。１９．前記Ｃ末端Ｌがアミド化されている、請求項１６に記載の構築物。２０．前記ジスルフィド結合が、１対のシステイン残基の間で配置される、請求項１６に記載の構築物。２１．DNA転写、RNA翻訳、RNA発現もしくはDNA発現、DNA複製、あるいは生存細胞におけるDNAもしくはRNA配列の予め選択された１つまたはサブセットのDNAまたはRNAの調節機能を選択的に阻害する方法であって、該方法が、以下：脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物を提供する工程であって、以下：細胞内ポリヌクレオチドと相補的な配列を有するPNA；ペプチド；ならびに該P NAおよび該ペプチドを連結する易動性結合；を含む、工程；および該構築物が、細胞の外膜を横切って輸送され、少なくとも透過し、そして該PN Aが、そこに配置される細胞内ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように該構築物に細胞を曝露する工程；を包含する、方法。２２．前記構築物が標識を含む、請求項２１に記載の方法。２３．前記標識が蛍光標識である、請求項２２に記載の方法。２４．前記構築物が細胞内へ輸送された後、および易動性結合が切断される前または後で、前記蛍光標識を検出する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の方法。２５．前記標識がビオチン標識である、請求項２２に記載の方法。２６．前記構築物が細胞内へ輸送された後、および易動性結合が切断される前または後で、前記ビオチン標識を検出する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。