JP2021098725A - ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法 - Google Patents

ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2021098725A
JP2021098725A JP2021036134A JP2021036134A JP2021098725A JP 2021098725 A JP2021098725 A JP 2021098725A JP 2021036134 A JP2021036134 A JP 2021036134A JP 2021036134 A JP2021036134 A JP 2021036134A JP 2021098725 A JP2021098725 A JP 2021098725A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
cargo
peptides
carrier
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021036134A
Other languages
English (en)
Inventor
デレク マクレーン
Maclean Derek
デレク マクレーン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kai Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Kai Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kai Pharmaceuticals Inc filed Critical Kai Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2021098725A publication Critical patent/JP2021098725A/ja
Priority to JP2023049966A priority Critical patent/JP2023078424A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11013—Protein kinase C (2.7.11.13)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

【課題】安定性および送達効率を上昇させるためにペプチド組成物を修飾する方法の提供。【解決手段】タンパク質キナーゼC（PKC）調節ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための方法。キャリアペプチドとカーゴペプチドとが、第1のシステイン残基と第2のシステイン残基との間のシステイン・システインジスルフィド結合によって連結している、第1のシステイン残基を含むキャリアペプチドと、第2のシステイン残基を含むPKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階；および第1のシステイン残基もしくは第2のシステイン残基に、または両残基に直接隣接した少なくとも1つの脂肪族残基を導入し、これによりジスルフィド結合の交換速度を、非修飾治療ペプチド組成物と比べて減少させる段階を含む、治療ペプチド組成物においてジスルフィド結合の交換を減少させる方法。【選択図】図１６

Description

本出願は、生物活性のある作用物質を生きた組織の細胞内へ運ぶキャリアを改良するための組成物および方法に関する。組成物および方法は、複合体に血漿安定性を与え、細胞にPKC調節ペプチドがより効率良く取り込まれることを可能にする、修飾tatペプチドに結合したPKC調節ペプチドを含む。
研究によって治療のための組成物としての可能性を持つペプチドが多く生産されてきた。それでも、様々な理由のために、細胞内標的に対するペプチドの治療可能性を十分に実現および活用することは、まだ実現していない。最も重要な理由の1つは、大部分のペプチドが、細胞膜を通過し、治療標的に到達する能力を持っていないことにある。この問題に対する1つの解決法は、標的細胞内へカーゴペプチドを輸送するキャリアペプチドを使用することである。
カーゴペプチドによる標的細胞の膜の通過を促進するために有効なキャリアペプチドの注目すべき例がいくつかある。1つの例は、HIVウイルスのTATタンパク質に由来するペプチド配列である。その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,316,003号（特許文献1）を参照されたい。別の周知のキャリアペプチド配列は、「ポリArg」配列である。たとえば米国特許第6,306,993号（特許文献2）を参照されたい。
多くの場合、キャリアペプチドとカーゴペプチドを連結するために、ジスルフィド結合を用いて治療ペプチド構築物を作製することは、可溶性ペプチドを細胞内標的にターゲティングする問題を解決するために、有効な戦略である。ジスルフィド結合の有用性を説明する1つの理論は、キャリア・カーゴ構築物が標的細胞に入ると、2つのペプチドは、ジスルフィド結合の還元によって分離できるというものである。細胞内環境におけるこの分離によって、キャリア・カーゴの連結が保持される他の連結機序よりも、カーゴペプチドが細胞内でより広く拡散できる可能性がある。しかしながら、とは言うものの、治療ペプチドの投与には、まだ、ジスルフィド結合の交換、タンパク質分解、および細胞内取り込み効率のような数多くの課題がある。これらの問題を制御するための方法は、治療ペプチドの安定性および効力を上昇させると考えられる。
カーゴペプチドにジスルフィド結合したキャリアペプチドを含む治療ペプチドの効力を上昇させるための1つの方法は、ジスルフィド結合の交換を減少させることである。ジスルフィド結合の交換により、キャリアペプチドがカーゴペプチドを別のキャリアペプチドと交換することが可能になり、キャリア・キャリア構築物およびカーゴ・カーゴ構築物が生じるため、試料中のキャリア・カーゴペプチド構築物の量が減少する。キャリアのみの構築物には治療効果はない。キャリアペプチドが細胞内標的へのカーゴの送達を可能にしているので、カーゴ・カーゴ構築物は、効果がたとえ完全になくなっていないとしても途方もなく低下している。ジスルフィド結合の交換のコントロールという問題は、それ自体として、キャリア・カーゴペプチド構築物の治療可能性を最大化するために、重要である。
治療ペプチドの使用の直面する別の問題は、タンパク質分解である。ペプチドは、不安定で有名な分子であり、対照に投与されるとしばしばタンパク質分解性の攻撃に不安定である。カーゴは、細胞内標的に到達するためにキャリアペプチドに依存しているので、投与すると分解される不安定なキャリアペプチドは、カーゴペプチドの有効性を低下させるかまたは排除することにさえなる。このように、治療ペプチドの不安定な性質をコントロールまたは排除するための方法も、キャリア・カーゴペプチドの治療可能性を最大化するために重要である。
治療ペプチドの細胞内取り込み効率を上昇させることは、治療ペプチドの有効性または効力を低下させ得るもう一つの問題である。キャリアペプチド配列およびカーゴペプチドに対する相対的配置の最適化は、治療ペプチド構築物の安定性および効力を上昇させるための方法を提供する。
米国特許第6,316,003号 米国特許第6,306,993号
発明の開示
開示する本発明は、キャリアペプチドとPKC活性を調節するカーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物の調製方法に関し、これにより得られた治療ペプチド組成物は、非修飾治療ペプチドと比べて安定性および効力が上昇している。本発明の1つの態様は、キャリアペプチドとカーゴペプチドが、第1のシステイン残基と第2のシステイン残基との間のシステイン・システインジスルフィド結合によって連結している、第1のシステイン残基を含むキャリアペプチドと、第2のシステイン残基を含むPKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階；および第1のシステイン残基もしくは第2のシステイン残基、または両残基に直接隣接した少なくとも1つの脂肪族残基を導入し、これによりジスルフィド結合の交換速度を非修飾治療ペプチド組成物と比べて減少させる段階を含む、治療ペプチド組成物においてジスルフィド結合の交換を減少させる方法である。
開示する本発明の別の態様は、カーゴペプチドに連結されたキャリアペプチドと、PKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階；キャリアペプチド上の、カーゴペプチド上の、または両ペプチド上のタンパク質分解に不安定な部位を同定する段階；および該部位におけるタンパク質分解の速度を非修飾治療ペプチド組成物と比べて減少させるように、不安定な部位のアミノ酸配列を修飾する段階を含む、治療ペプチド組成物のタンパク質分解を減少させる方法に関する。
開示する本発明の別の態様は、カーゴペプチドに連結されたキャリアペプチドと、PKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階；治療ペプチド組成物の血漿安定性を非修飾治療ペプチド組成物と比べて上昇させるように、キャリアペプチド、カーゴペプチド、または両方のアミノ末端残基、カルボキシル末端残基、もしくは両残基を修飾する段階を含む、治療ペプチド組成物の血漿安定性を上昇させる方法に関する。
本明細書に開示する組成物も考察されている。開示する組成物の1つの態様には、細胞内キャリアペプチド、調節ペプチド、または両方がN末端において修飾されている、細胞内キャリアペプチドに共有結合で連結されたPKC調節ペプチドを含む、タンパク質キナーゼC（PKC）調節ペプチド組成物が含まれる。
[請求項101]
キャリアペプチドとカーゴペプチドとが、第1のシステイン残基と第2のシステイン残基との間のシステイン・システインジスルフィド結合によって連結している、第1のシステイン残基を含むキャリアペプチドと、第2のシステイン残基を含むPKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階;および
第1のシステイン残基もしくは第2のシステイン残基に、または両残基に直接隣接した少なくとも1つの脂肪族残基を導入し、これによりジスルフィド結合の交換速度を、非修飾治療ペプチド組成物と比べて減少させる段階
を含む、治療ペプチド組成物においてジスルフィド結合の交換を減少させる方法。
[請求項102]
第1のシステインが、キャリアペプチドのアミノ末端に、カルボキシル末端に、または配列内に配置される、請求項101記載の方法。
[請求項103]
第2のシステインが、カーゴペプチドのアミノ末端に、カルボキシル末端に、または配列内に配置される、請求項101記載の方法。
[請求項104]
システイン残基がシステイン類似体である、請求項101記載の方法。
[請求項105]
システイン類似体がホモシステインである、請求項104記載の方法。
[請求項106]
システイン類似体がD-システインである、請求項104記載の方法。
[請求項107]
システイン類似体がαメチルシステインである、請求項104記載の方法。
[請求項108]
カーゴペプチドに連結されたキャリアペプチドと、PKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階;
キャリアペプチド上の、カーゴペプチド上の、または両ペプチド上のタンパク質分解に不安定な部位を同定する段階;および
該部位におけるタンパク質分解の速度を非修飾治療ペプチド組成物と比べて減少させるように、タンパク質分解を阻害するためにアミノ酸配列を修飾する段階
を含む、治療ペプチド組成物のタンパク質分解を減少させる方法。
[請求項109]
修飾段階が、キャリアペプチド、カーゴペプチド、または両方についてのアミノ末端のアシル化を含む、請求項108記載の方法。
[請求項110]
修飾段階が、キャリアペプチド、カーゴペプチド、または両方についてのカルボキシル末端のアミド化を含む、請求項108記載の方法。
[請求項111]
タンパク質分解に不安定な部位がプロテアーゼ認識部位である、請求項108記載の方法。
[請求項112]
修飾段階が、
認識部位配列を変化させるような、プロテアーゼ認識部位内のアミノ酸の付加、欠失、または置換の導入
を含む、請求項111記載の方法。
[請求項113]
アミノ酸付加またはアミノ酸置換がD-アミノ酸の導入を含む、請求項112記載の方法。
[請求項114]
修飾段階が、タンパク質分解に不安定な部位の化学修飾の導入を含む、請求項111記載の方法。
[請求項115]
化学修飾がα-メチル化、またはN-メチル化である、請求項114記載の方法。
[請求項116]
カーゴペプチドに連結されたキャリアペプチドと、PKC活性調節カーゴペプチドとを含む、治療ペプチド組成物を提供する段階;
治療ペプチド組成物の血漿安定性を非修飾治療ペプチド組成物と比べて上昇させるように、キャリアペプチド、カーゴペプチド、または両方のアミノ末端残基、カルボキシル末端残基、もしくは両残基を修飾する段階
を含む、治療ペプチド組成物の血漿安定性を上昇させる方法。
[請求項117]
キャリアペプチドが修飾tatペプチドである、請求項113記載の方法。
[請求項118]
修飾tatペプチドが、そのN末端アミノ酸のアミン基におけるアシル化もしくはそのC末端アミノ酸のカルボキシル基におけるアミド化によって、またはその両方によって修飾されている、請求項114記載の方法。
[請求項119]
細胞内キャリアペプチド、調節ペプチド、または両方がN末端において修飾されている、細胞内キャリアペプチドに共有結合で連結しているPKC調節ペプチド
を含む、タンパク質キナーゼC(PKC)調節ペプチド組成物。
[請求項120]
PKC調節ペプチドが、ジスルフィド結合によって細胞内キャリアペプチドに連結している、請求項119記載の組成物。
[請求項121]
PKC調節ペプチドが、PKCアイソザイムの活性を阻害する阻害ペプチドである、請求項119記載の組成物。
[請求項122]
PKC調節ペプチドが、PKCアイソザイムの活性を促進する活性化ペプチドである、請求項119記載の組成物。
[請求項123]
細胞内キャリアペプチドが、
Figure 2021098725
を含む修飾tatペプチドである、請求項119記載の組成物。
[請求項124]
細胞内キャリアペプチドが、
Figure 2021098725
を含む修飾tatペプチドである、請求項119記載の組成物。
[請求項125]
修飾tatペプチドが、そのN末端においてアシル基、アルキル基、またはスルホニル基で置換されている、請求項123または124記載の組成物。
[請求項126]
修飾tatペプチドが、そのN末端においてアシル化されている、請求項125記載の組成物。
[請求項127]
tatペプチドが、そのC末端においてさらに修飾されている、請求項119記載の組成物。
[請求項128]
tatペプチドが、そのC末端におけるアミド形成によってさらに修飾されている、請求項119記載の組成物。
[請求項129]
PKC調節ペプチドが、修飾tatペプチドのアミノ酸の側鎖に共有結合で連結されている、請求項119記載の組成物。
[請求項130]
PKC調節ペプチドが、システイン、リジン、およびチロシンより選択される残基の側鎖に共有結合で連結されている、請求項129記載の組成物。
[請求項131]
PKC調節ペプチドが、N末端のシステイン残基の側鎖に共有結合で連結されている、請求項124記載の組成物。
[請求項132]
tatペプチドのN末端のシステインがアシル化されている、請求項131記載の組成物。
[請求項133]
tatペプチドのC末端のアルギニンが第一級カルボキサミドである、請求項131記載の組成物。
[請求項134]
PKC調節ペプチドが、そのN末端におけるアシル化もしくはそのC末端におけるアミド化のいずれかにより、またはそのN末端におけるアシル化およびそのC末端におけるアミド化の両方により修飾されている、請求項131記載の組成物。
[請求項135]
修飾tatペプチドが、
Figure 2021098725
である、請求項119記載の組成物。
[請求項136]
PKC調節ペプチドが、tatペプチドのシステイン残基のスルフヒドリル基を介して、tatペプチドに共有結合で連結されている、請求項135記載の組成物。
[請求項137]
第2の膜輸送ペプチドをさらに含む、請求項119記載の組成物。
[請求項138]
キャリアペプチドとカーゴペプチドとがペプチド結合で連結している、キャリアペプチドおよびPKC活性調節カーゴペプチド
を含む、線状の治療ペプチド。
[請求項139]
キャリアペプチドとカーゴペプチドとがペプチド結合でリンカーペプチドに連結されている、キャリアペプチドとカーゴペプチドとの間に位置付けられたリンカーペプチド
をさらに含む、請求項138記載の線状の治療ペプチド。
[請求項140]
治療ペプチドのアミノ末端、カルボキシル末端、または両末端が、アミノ末端アミノ酸のアミン基においてアシル化されているか、もしくはカルボキシル末端アミノ酸のカルボキシル基においてアミド化されているか、またはその両方である、請求項138記載の線状の治療ペプチド。
[請求項141]
複数のPKC活性調節カーゴペプチドに結合した少なくとも1つのキャリアペプチドを含む、治療ペプチド多量体。
[請求項142]
少なくとも1つのキャリアタンパク質が、第1および第2のシステイン残基を含む、請求項141記載の治療ペプチド多量体。
[請求項143]
第1のカーゴペプチドが、ジスルフィド結合によって第1のシステイン残基に連結され、かつ
第2のカーゴタンパク質が、ジスルフィド結合によって第2のシステイン残基に連結されている、
請求項142記載の治療ペプチド多量体。
治療ペプチドKAI-9706およびKAI-1455の濃度に対するCK放出をプロットしたグラフである。 治療ペプチドKAI-9706およびKAI-1455の濃度上昇に対する梗塞パーセントをプロットしたグラフである。 ヒト血清（3A）、ブタ血清（3B）、およびラット血清（3C）中で、時間の経過とともに残っている完全な治療ペプチドKAI-9803、KAI-9706、およびKAI-1455の割合（パーセント）をプロットしたグラフである。 ジスルフィド結合を介して連結しているキャリアペプチドとカーゴペプチドとを含む治療ペプチドの、線状の治療ペプチドへの変換を図示する。この線状ペプチド（KP-01547）は、アミノ末端およびカルボキシル末端にキャップが付いており、短いアミノ酸配列のリンカーを含む。 時間（日数）の経過とともに、完全な治療ペプチド（線状および非線状）の割合（パーセント）をプロットしたグラフである。 時間（日数）の経過とともに、治療ペプチドの安定性を比較したグラフである。 2つの線状ペプチドを図示する。 時間の経過とともに様々なPKC-βI治療ペプチドの安定性を比較したグラフである。 時間の経過とともに様々なPKC-βII治療ペプチドの安定性を比較したグラフである。 26℃（10A）および37℃（10B）でのKAI-9706、ならびに26℃（10C）および37℃（10D）でのKAI-1455の安定性に対する温度の影響を図示するグラフである。 10分間の灌流によるランゲンドルフのインビトロ虚血後アッセイ法において、KAI-9803またはKAI-1355ペプチドの濃度を上昇させた際のクレアチニンキナーゼ放出をプロットしたグラフである。 KAI-1479の作製を示す図である。 再灌流試験の結果を示す棒グラフである。図13Aは実験中の事象の時系列を示し、図13Bは様々な治療ペプチド（KAI-9803、KAI-1479、およびKAI-1482）の保護的な性質を示す棒グラフである。 ペプチドのアミノ末端にシステイン残基を持つSEQ ID NO: 33のカーゴペプチドを示す。 治療ペプチドの多量体の4つの可能な立体配置を示す。 線状ペプチドKP-1680、KP-1681、KP-1633、およびKP-1678を示す。 時間の経過とともに試験溶液中に残存するペプチドの割合（％）を示すグラフである。 時間の経過とともに試験溶液中に残存するペプチドの割合（％）を示すグラフである。 時間の経過とともに試験溶液中に残存するペプチドの割合（％）を示すグラフである。 時間の経過とともに試験溶液中に残存するペプチドの割合（％）を示すグラフである。
開示する本発明は、安定性および送達効率を上昇させるためにペプチド組成物を修飾する方法に関する。具体的には、開示する発明は、タンパク質キナーゼC（PKC）調節ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための方法に関する。「治療ペプチド組成物」は、「キャリアペプチド」と「カーゴペプチド」とを含む。「キャリアペプチド」は、治療ペプチド組成物の細胞内取り込みを促進する、ペプチドまたはペプチド内のアミノ酸配列である。「カーゴペプチド」は、PKC調節ペプチドである。本明細書に記載されるキャリアペプチド、カーゴペプチドのいずれか、またはその両方に対するペプチド修飾は、ジスルフィド結合の交換の減少、物理的安定性、タンパク質分解の減少、および細胞内取り込み効率の上昇により、治療ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させる。
ジスルフィド結合の交換
開示する治療ペプチド組成物の好ましい態様は、各ペプチドに1つずつの、2つの硫黄含有残基を結合させるジスルフィド結合を介して、キャリアペプチドに結合されたカーゴペプチドを提供する。本態様のジスルフィド結合は、治療ペプチド組成物が、溶液中であっても、凍結乾燥されていても、沈殿していても、結晶化していても、または噴霧乾燥されていても、不安定である場合があり、その結果、キャリア・カーゴの組み合せが、不活性なキャリア・キャリア組成物に、および同様に不活性でしばしば不溶性のカーゴ・カーゴ組成物に分解するということになる。開示する治療ペプチド組成物の安定性は、化学修飾の利用によって、および使用前のペプチド組成物の物理的環境の制御によって、改善される。
化学修飾
結合用硫黄含有残基は、キャリアペプチドまたはカーゴペプチドの配列のどこにでも配置することができる。たとえば、開示する治療ペプチド組成物の好ましい態様は、典型的には、結合用硫黄含有残基をキャリアペプチドおよびカーゴペプチドのアミノ末端に持つ。結合用硫黄含有残基は、両ペプチドのカルボキシル末端に、またはその代わりとして、一方のペプチドのアミノ末端および他方のペプチドのカルボキシル末端に配置することもできる。さらに、結合用硫黄含有残基は、どちらかのまたは両方のペプチドの配列内のどこにでも存在することができる。キャリアペプチド内に、カーゴペプチド内に、または両ペプチド内に結合用硫黄含有残基を配置すると、ジスルフィド結合の交換の速度が低下することが観察された。
治療ペプチド組成物のジスルフィド結合を安定化させるために有用な化学修飾の例は、キャリアペプチドとカーゴペプチドを結合させるために使用する硫黄含有残基に直接隣接した、アミノ酸残基の最適化を含む。ジスルフィド結合を安定化させるための好ましい方法は、キャリアおよび/またはカーゴペプチドの硫黄含有残基に直接隣接するように脂肪族残基を配置する段階を含む。脂肪族残基は、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。したがって、結合用硫黄含有残基をペプチドのアミノ末端に配置する場合には、ジスルフィド結合の交換速度を低下させるために、脂肪族残基をアミノ末端から2番目の位置に配置する。結合用硫黄含有残基をペプチドのカルボキシル末端に配置する場合には、ジスルフィド結合の交換速度を低下させるために、脂肪族残基をペプチドのカルボキシル末端から2番目の位置に配置する。結合用硫黄含有残基をペプチドの配列内に配置する場合には、脂肪族残基を、その残基のアミノ末端側もしくはカルボキシル末端側に、または両側に配置することができる。
本明細書に開示する本発明では、様々な硫黄含有残基の使用が考えられる。ペプチド組成物における結合システイン残基として、システインおよびシステイン類似体も使用できる。特定のシステイン類似体には、D-システイン、ホモシステイン、αメチルシステイン、メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、ペニシラミン、アシル基を受け入れる能力のある類似体のアセチル化型、および他のブロッキング基で修飾されたシステイン類似体が含まれる。たとえば、カーゴペプチド、キャリアペプチド、または両ペプチドにおいてホモシステイン、アセチル化ホモシステイン、ペニシラミン、およびアセチル化ペニシラミンを使用すると、ペプチド組成物が安定化し、ジスルフィド結合の交換が減少することが示されている。1つのシステインからの塩基を介したα水素の引き抜きが、硫黄原子の存在により防止されるため、αメチルシステインはジスルフィド分解を阻害する。ジスルフィド結合で結合したカーゴ/キャリアペプチド複合体は、非修飾ペプチドよりも、グルタチオン還元に対して抵抗性が高いことが示された。他のシステイン類似体も、結合システインとして有用である。同様に、システインの立体異性体もジスルフィド結合の交換を阻害する。
ジスルフィド結合の交換は、キャリアペプチドとカーゴペプチドを連結させて単一の線状ペプチドを形成させることにより、完全に排除できる。この方法は、以下に議論される。
物理的安定性
ジスルフィドの物理的環境は、安定性に影響がある。図10で（部分的に）示されるように、溶液のpHが低下し（塩基性よりも酸性の環境の方が良い）、溶液の温度が低下し、および溶液中のペプチド組成物の濃度が低下すると、溶液中の安定性は上昇する。凍結乾燥した形態の場合は、pHが低下、温度が低下、および賦形剤に対するペプチド組成物の比率が上昇すると、安定性は上昇する。好ましい賦形剤は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2005年9月30日付の米国特許出願第 11/240,962号に議論されている。
予想外の「賦形剤効果」は、極めて結晶性の賦形剤であるマンニトールで最も顕著だった。より結晶性の低い賦形剤（スクロースのような）の使用、または賦形剤の不使用により、ペプチド組成物量への依存がはるかに少ないことが示された。理論に縛られることまたは理論によって限定されることは望まないが、非結晶性の賦形剤を使用すると、無定型基質が生成し、これが分子間会合を防止すると考えられる。理論的には、結晶性の基質内ではペプチド組成物は、排除され、バイアル壁に押し付けられ、おそらく局所濃度が高まる。API濃度が低いと、結果として生じる薄膜は、ペプチド-ガラス接触面積が高くなり、シリカは不安定である。
いくつかの要因は、治療ペプチド組成物が標的細胞に取り込まれる効率に影響を与える。たとえば、治療ペプチドの溶解性は、標的細胞によってペプチドが取り込まれる効率に影響する。同様に、キャリアペプチドまたはカーゴペプチドのアミノ酸配列は、それらを用いるペプチド組成物の溶解性を大部分決定する。いくつかのペプチド、特にカーゴペプチドは、疎水性残基（例、Phe、Tyr、Leu）を含み、凝集につながる「ジッパー」機序によって分子内相互作用が可能になる、規則的な間隔を有すると考えられる。潜在的にそのような問題のあるペプチドの例は、図14に示されている。図示された配列は、δPKCのV1ドメインにおいてβ鎖を形成すると考えられている。そのようなペプチドは、不溶性の沈着物を形成する傾向がある。
そのようなペプチドの溶解性は、カーゴペプチド配列に特定の修飾をすることにより、改善できる。たとえば、アミノ末端に、およびまたはカルボキシル末端に、または内部の残基に、ポリエチレングリコール（PEG）のような水和基、四級アンモニウム塩のような高度荷電基、または特定のアミノ酸残基のかさ高の分岐鎖のような可溶化基を導入すると、図14に図示されているようなペプチドの溶解性を改善する。さらに、活性には不要であることが示されている疎水性側鎖は、欠失によって、またはアラニン、グリシン、またはセリンのような保存的または非干渉性残基との置換によって除去し、このようにペプチドの溶解性を改善することができる。
タンパク質分解：血漿安定性
血液および血漿は、本明細書で開示するタンパク質キナーゼC調節ペプチドもしくはペプチド組成物の細胞内取り込みを促進するキャリアペプチド、またはその両方を分解することのできるプロテアーゼを含む。キャリアペプチドまたはカーゴペプチドのタンパク質分解を減少させる1つの方法は、治療ペプチド組成物によって提示されるプロテアーゼの標的を覆うことである。
治療ペプチドは、対象の血漿に入ると、ペプチダーゼの攻撃を受けやすくなる。エキソペプチダーゼ（ペプチド鎖の末端のアミノ酸によって形成されたペプチド結合を加水分解する酵素群の任意のもの）、またはエンドペプチダーゼ（タンパク質分子の長い鎖の内部のペプチド結合を加水分解する酵素群の任意のもの）によっておきるペプチド分解に対処するための戦略が、提供される。エキソペプチダーゼは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端からアミノ酸残基を切断する酵素であり、特異的部位または非特異的部位で切断できる。エンドペプチダーゼは、アミノ酸配列内で切断し、同様に非特異的であり得るが、エンドペプチダーゼは、しばしば特定のアミノ酸配列（認識部位）を認識し、それらの部位またはその近くでペプチドを切断する。
タンパク質分解からペプチド組成物を保護する1つの方法は、ペプチドのアミノおよび/またはカルボキシル末端の「キャッピング」を含む。「キャッピング（キャップ付け）」という用語は、共有結合の修飾を介して、ペプチドの末端にブロッキング基を導入することを指す。適当なブロッキング基は、ペプチドの生物学的活性を低下させることなく、ペプチドの末端にキャップを付ける。記載されたペプチドのアミノ末端のアセチル化は、ペプチドをタンパク質分解から保護する好ましい方法である。他のキャッピング部分も可能である。アシル化部分の選択により、ペプチドに「キャップ」を付け、また化合物の疎水性を調節する機会が提供される。たとえば、以下の一連のアシル基は、疎水性を上昇させ、さらにキャッピング部分としても考えられる：ホルミル、アセチル、プロパノイル、ヘキサノイル、ミリストイル。記載されたペプチドのカルボキシル末端のアミド化も、タンパク質分解からペプチドを保護するための好ましい方法である。
エンドペプチダーゼからのペプチドの保護は、典型的には、ペプチドからのエンドペプチダーゼ認識部位の同定および除去を含む。プロテアーゼ認識部位は、当業者に周知である。したがって、潜在的なエンドペプチダーゼ認識部位を同定し、認識部位内のアミノ酸配列を変化させることによって、その部位を除去することが可能である。認識部位を破壊するために、認識配列内の残基を移動させるかまたは削除することができる。好ましくは、同定されたプロテアーゼ認識部位を含むアミノ酸の1つまたは複数に保存的置換を行う。これらのアミノ酸の側鎖は、様々な化学的性質を持っている。本議論のために、最も一般的なアミノ酸は、以下に列挙する9つのグループに分類される。これらのグループ内での置換は、保存的置換と見なされる。
保存的アミノ酸置換
Figure 2021098725
細胞内取り込み効率
上記の修飾に加えて、キャリアペプチドとカーゴペプチドの連結を変化させることによって、開示する治療ペプチド組成物の有用性を改善することができる。たとえば、1つの態様では、キャリアペプチドとカーゴペプチドとが、ペプチド結合によって連結され、線状ペプチドを形成している。治療ペプチドの安定性および効力は、複数のカーゴペプチドが1つまたは複数のキャリアペプチドに連結している、ペプチド多量体を作製することによっても上昇できる。切断可能リンカー配列を含む本発明の別の態様も議論される。
線状ペプチド
ペプチド組成物の安定性を改善するための別の戦略は、ジスルフィド結合を介してペプチドを結合する段階とは対照的に、カーゴペプチドとキャリアペプチドを結合して単一のペプチドにする段階を含む。たとえば、図4Aに示される態様では、カーゴペプチド（SEQ ID NO: 13）は、アミノ末端のシステインを介して連結している。カーゴペプチドおよびキャリアペプチドの線状の型は図4Bに示されており、カーゴペプチドとキャリアペプチドは、短いジペプチドリンカー（例、Ser-Gly）を介して連結している。このリンカーは例示である。
図示された例では、カーゴのC末端は、リンカーを介してキャリアのN末端に連結している。しかし、それらのC末端を介して、それらのN末端を介して、およびキャリアペプチドをペプチド組成物のN末端部分に配置する場合に、ペプチドを連結する段階を含む、他の可能な順列も考えられる。
さらに、ジスルフィド結合されたペプチド組成物を安定化するための上記の段階は、適切な場合には、線状でも使用できる。たとえば、図4Bに示された線状ペプチド組成物は、そのアミノ末端およびカルボキシル末端の両方にキャップが付いている。さらに、ペプチド内の配列は、ごちゃ混ぜにされる（scrambled）か、またはDアミノ酸で置換されていても良い。
図7に示されるように、β-Iの7位のAsnの脱アミノ化は、Asn-Glyにより連結されたペプチド組成物の線状化型を有意に不安定にすることが観察された。GlyをLeuに変更すると、この線状ペプチド組成物は安定化する。同様に、線状β-II組成物の2位のGln残基の脱アミノ化は、有意に不安定にすることが観察された。Gluで置換すると線状組成物の安定性が改善した。これらのペプチドの修飾型を比較するデータは、図8および9に示されている。
特定の理論に限定されることなく、脱アミノ化が、Asnの側鎖アミドのAsn残基に対するα鎖または主鎖のアミドHN-C末端の攻撃に起因し、アスパラギン酸部分に加水分解できる環状アスパルトアミド中間体を生成すると考えられる。C末端残基のサイズをAsnまで増加させることは、主鎖アミドの立体障害を増加させ、有意に脱アミド化を遅くすると考えられる。
ペプチド多量体
安定性および効力を改善するための別の方法は、1つまたは複数のキャリアペプチドに会合した複数のカーゴペプチドで多量体を形成することによって使用可能である。そのような製剤の例は、図15に示されている。分岐した多価のペプチド組成物は、組成物の親和力、効力および安定性を上昇させる。切断部位を設計することによりまたは多量体組成物中への他の放出機序を設計することにより、複数の複合体が、標的細胞中にPKC調節カーゴペプチドをほぼ同時に放出することができる。多量体ペプチドの例は、Yu et al. JBC 275(6):3943-9 (2000)に議論されている。
切断可能配列
典型的には、キャリアとカーゴは、エステラーゼ、アミダーゼ、および同様なもののような、遍在性酵素によって切断できる結合によって、連結されている。そのような酵素の濃度は、細胞外の環境よりも細胞内の方が高いと考えられている。したがって、一旦複合体が細胞内に入ると、カーゴとキャリアとの間の連結を切断できる酵素に出会う可能性がより高くなる。したがって、酵素は、最も有用だと考えられる細胞内で、生物学的活性のあるカーゴを放出できる。
タンパク質キナーゼC調節ペプチド
タンパク質キナーゼC調節ペプチドという用語は、PKCアイソザイムおよび/または可変領域に由来する。様々なPKCアイソザイム特異的なペプチドおよび可変領域特異的なペプチドが記載されており、ここに開示する本発明を用いて使用できる。好ましくは、PKC調節ペプチドは、V1、V3、またはV5由来のペプチドである。（「V1」と「C2」という用語は同義である。）全体が参照により本明細書に組み入れられる以下の米国特許または米国特許出願は、本明細書に開示する本発明を用いて使用できる様々な適切なペプチドを記載している：5,783,405、6,165,977、6,855,693、US2004/0204364、US2002/0150984、US2002/0168354、US2002/057413、US2003/0223981、US2004/0009922、および10/428,280。表1は、本発明とともに使用する好ましいPKC調節ペプチドを列挙している。
（表１）PKCアイソザイム由来のカーゴペプチド
Figure 2021098725
Figure 2021098725
Figure 2021098725
Figure 2021098725
Figure 2021098725
（表２）キャリアペプチド
Figure 2021098725
キャリアの他の例には、当技術分野で公知である、オクタ-Arg、オクタ-D-Arg、およびアンテナペディア（Antennapedia）由来ペプチドが含まれる。
以下の実施例は、説明のためのもので、本発明を限定するものではない。
実施例1
エキソペプチダーゼ保護：キャップ付きペプチドの血漿安定性
キャップ付きペプチドの血漿安定性を比較した。KAI-9706のアミノ末端およびカルボキシル末端を段階的に修飾した。血漿安定性は、15分後に残存するペプチド組成物の割合によって測定された。結果を表2に提供する。
（表２）KAI-9706の血漿安定性
Figure 2021098725
15分の時点において残存する親化合物（%）
ラット血漿中のt1/2=最長寿命の誘導体については40〜45分
上記に提供されたデータは、非修飾のカーゴペプチドとキャリアペプチドとを含むペプチド組成物が最も不安定であることを示す。さらに、キャリアペプチドのみを保護しても、血漿中のペプチド組成物の半減期を延長できなかった。さらに、キャリアペプチドを修飾せずにカーゴペプチドを修飾しても、血漿中の半減期の安定性には明らかな影響はなかった。しかし、キャリアペプチドに保護基を付加することが、それがアミノ末端でもカルボキシル末端でも、ペプチド組成物の血漿安定性における著しくかつほぼ同等の増加につながった。キャリアペプチドの両方の基の保護により、さらに保護が提供された。興味深いことに、カーゴペプチドの保護は、組成物の安定性にほとんどまたは全く影響がなかった。
実施例2
血漿安定性に対するD-ペプチドの効果
KAI-9706は、ペプチド組成物の安定性に対する影響を決定するために、D-ペプチドを用いて操作された。非修飾KAI-9706は、同じアミノ酸配列を持つペプチド組成物と比較したが、用いたアミノ酸は、l-アミノ酸ではなくd-エナンチオマーであった。ペプチド組成物のレトロインベルソ型、およびごちゃ混ぜ型も調製された。実験データを表3に示す。
（表３）KAI-9706の血漿安定性
Figure 2021098725
15分の時点で残存する親化合物（％）
キャリアの修飾は、組成物の半減期を改善する傾向が強かったが、カーゴの修飾はほとんど効果がなかった。
実施例3
キャップ付きのKAI-9706はインビトロの効力を保持する
キャリアペプチド部分KAI-9706（KAI-1455）のキャッピングは、ペプチド組成物の血漿半減期を増やすことが示された。ラット心臓モデル（ランゲンドルフアッセイ法）において、キャップ付き組成物が虚血障害を阻害する能力を、キャップなしの形態と比較して評価した。結果を図1に示す。
実施例4
キャップ付きKAI-9706は効力の上昇を示す
KAI-1455は、脳卒中モデルで試験した。図2に示されるように、キャップ付きのペプチド組成物は、梗塞パーセントによる判断では、脳組織の増強した保護を提供した。このデータは、より低い用量で脳組織の有意な保護が得られることを示す。
実施例5
種に関係なくペプチドの安定性は上昇している
修飾KAI-9706ペプチド（KAI-1455）の安定性は、ヒト（図3A）、ブタ（図3B）、およびラット（図3C）の血清中で、KAI-9706およびKAI-9803と比較した。キャップ付きのKAI-1455は、3つの種の全てにおいて血漿安定性が上昇していた。
実施例6
キャップ付きKAI-9706は効力の上昇を示す
KAI-1455は、脳卒中モデルで試験した。図2に示されるように、ペプチド組成物のキャップ付き型は、梗塞パーセントによる判断では、脳組織の増強した保護を提供した。このデータは、より低い用量で脳組織の有意な保護が得られることを示す。
実施例7
種に関係なくペプチドの安定性は上昇している
修飾KAI-9706ペプチド（KAI-1455）の安定性は、ヒト（図3A）、ブタ（図3B）、およびラット（図3C）の血清中で、KAI-9706およびKAI-9803と比較した。キャップ付きのKAI-1455は、3つの種の全てにおいて血漿安定性が上昇していた。
実施例8
線状ペプチドの安定性
KAI-9803およびBC2-4の線状型が構築され、これらのペプチド組成物および他のペプチド組成物のジスルフィド結合で連結した型と比較して安定性が評価された。ペプチドを37℃でPBS（pH 7.4）中に0.1 mg/mlで溶液中に入れた。図5に示されるように、KAI-9803およびBV2-4の線状型は、安定性が上昇していた。
実施例9
線状PKC-β I およびPKC-β II ペプチド組成物は、ジスルフィド結合した組成物よりも高い安定性を示す
PKC-βIおよびPKC-βIIペプチド組成物の線状型およびジスルフィド結合で連結した型を、実施例8に記載された条件下でインキュベーションした。図6に示されるように、PKC-βIおよびPKC-βIIペプチドの線状形態は、非線状対応物よりも安定性が上昇していた。
実施例10
線状PKC-β I およびPKC-β II ペプチド組成物の改善した安定性
PKC-βIおよびPKC-βIIペプチド組成物の線状型は、安定性が改善されていたが、脱アミノ化反応の対象でもあった。特に、β-Iおよびβ-IIペプチドの7位のAsn残基、およびβ-IIペプチドの2位のGln。これらの線状ペプチド組成物は、β-Iペプチド組成物中のAsnのすぐC末端側のGlyをLeuで置換すること、またはβ-IIペプチド組成物中のGlyをIleで置換することのいずれかにより修飾した。β-IIペプチド組成物の2位のGlnも、Glu残基で置換した。ペプチドの安定性は、実施例8に記載された条件下で検討された。図8および9に示されるように、上記のアミノ酸置換は、これらの線状ペプチド組成物を安定化させた。
実施例11
KAI-9803誘導体（KAI-1355）は効力を保持した
カルボキシル末端のロイシンが除去されたKAI-9803の切断型である、KAI-1355の効力が試験された。KAI-1355の安定性試験は、C末端のLeu残基の欠失によりこのカーゴペプチドの安定性が増加したことを示した。誘導体ペプチド組成物の効力は、ランゲンドルフのインビトロ虚血後モデルにおいて、全長型のKAI-9803と比較された。実験結果は図11に示す。示されたように、KAI-1355（KAI-9803の修飾型）はまだ虚血から心筋を保護する能力を持っており、効力は全長KAI-9803と同等であった。
実施例12
KAI-1479を生産するためのKAI-9803の最適化
カーゴペプチドKAI-9803の切断は、ペプチド組成物を安定化する一方で、効力にほとんどまたは全く影響がないことが示された。図12に図示されるように、TATキャリアペプチドのキャップ付き型は、切断カーゴペプチドKAI-1355に結合され、切断された9803カーゴペプチドと全長のキャップ付きTATキャリアペプチドとを含むKAI-1479が作製された。
修飾されたKAI-1479、KAI-9803、およびKAI-1482ペプチド組成物は、ラットの中大脳動脈閉塞（MCAO）脳卒中モデルにおいてアッセイされ、ペプチド組成物が梗塞サイズを阻害する能力を決定した。ラットに2時間の大脳動脈閉塞が施された。各々のペプチド組成物または生理食塩水は、22時間の再灌流期間の直前に、試験動物に投与され、再灌流後に動物を屠殺して梗塞サイズを測定した。図13に示されるように、修飾KAI-1479ペプチド組成物は、梗塞サイズを妨害する能力がKAI-9803と比べて増加していた。KP-01482は、両端にキャップが付きかつカーゴにジスルフィド結合で結合したTATペプチドに、N末端のCysにより連結されたカーゴ配列
Figure 2021098725
を持つ。
実施例13
一連の線状εPKC阻害物質のインビトロの生物学的安定性
ラットおよびヒトの血漿中および血清中での化合物の安定性に対する、N末端のアセチル化およびC末端のアミド化の効果を検討した。調べられた線状ペプチドを図16に示す。化合物は、100μg/mlの濃度で血漿/血清中で試験した。溶液は室温でインキュベーションし、5% TCAで沈殿させ、上清を酢酸アンモニウムで中和した。その後ペプチドをLC/MSで分析した。図17A〜17Dに示されたデータから分かるように、試験された化合物は全てヒトの血漿中では比較的安定だったが、C末端のアミドを含むKP-1633およびKP-1678は、ヒト血清中で安定性が上昇していた。N末端のアセチル化単独ではペプチドを安定させなかった。興味深いことに、KP-1680のアミノ酸配列およびその分解産物は、ペプチドの代謝された形態がC末端からのアルギニン残基の連続的切断を表すことを示した。血漿中ではなく血清中のカルボキシペプチダーゼNの活性により、観察された安定性の差異を説明することができた。血漿試料は、この亜鉛メタロプロテイナーゼを阻害することが公知であるEDTAを用いて採取した。

Claims (1)

  1. ペプチド結合によってキャリアペプチドに共有結合で連結しているカーゴペプチドを含む組成物であって、該キャリアペプチド、該カーゴペプチド、または両方がN末端において修飾されている、組成物。
JP2021036134A 2007-01-19 2021-03-08 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法 Pending JP2021098725A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023049966A JP2023078424A (ja) 2007-01-19 2023-03-27 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88141907P 2007-01-19 2007-01-19
US60/881,419 2007-01-19
US94528507P 2007-06-20 2007-06-20
US60/945,285 2007-06-20
JP2018058012A JP2018111717A (ja) 2007-01-19 2018-03-26 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018058012A Division JP2018111717A (ja) 2007-01-19 2018-03-26 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023049966A Division JP2023078424A (ja) 2007-01-19 2023-03-27 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2021098725A true JP2021098725A (ja) 2021-07-01

Family

ID=39636771

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009546577A Ceased JP2010516707A (ja) 2007-01-19 2008-01-22 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2014143781A Active JP5937643B2 (ja) 2007-01-19 2014-07-14 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2016096016A Pending JP2016147905A (ja) 2007-01-19 2016-05-12 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2018058012A Pending JP2018111717A (ja) 2007-01-19 2018-03-26 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2021036134A Pending JP2021098725A (ja) 2007-01-19 2021-03-08 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2023049966A Pending JP2023078424A (ja) 2007-01-19 2023-03-27 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009546577A Ceased JP2010516707A (ja) 2007-01-19 2008-01-22 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2014143781A Active JP5937643B2 (ja) 2007-01-19 2014-07-14 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2016096016A Pending JP2016147905A (ja) 2007-01-19 2016-05-12 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2018058012A Pending JP2018111717A (ja) 2007-01-19 2018-03-26 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023049966A Pending JP2023078424A (ja) 2007-01-19 2023-03-27 ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法

Country Status (8)

Country Link
US (6) US8067532B2 (ja)
EP (2) EP3248985B1 (ja)
JP (6) JP2010516707A (ja)
KR (4) KR20090115852A (ja)
CN (3) CN101675067B (ja)
AU (1) AU2008206077A1 (ja)
CA (2) CA2989778C (ja)
WO (1) WO2008089491A2 (ja)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1994155T4 (da) 2006-02-13 2022-07-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Polynukleotid- og polypeptidsekvenser involveret i fremgangsmåden med knogleremodellering
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
US8987200B2 (en) 2006-11-16 2015-03-24 Kai Pharmaceuticals, Inc. Polycationic calcium modulator peptides for the treatment of hyperparathyroidism and hypercalcemic disorders
EP3248985B1 (en) 2007-01-19 2019-10-23 Kai Pharmaceuticals, Inc. Modifications of peptide compositions to increase stability and delivery efficiency
US20090318351A1 (en) * 2008-03-12 2009-12-24 Kevin Grimes Method of treating acute st-elevation myocardial infarction with a delta pkc antagonist
US20100311671A1 (en) * 2009-03-25 2010-12-09 Kai Pharmaceuticals Transdermal delivery of pkc modulatory peptides through microporated skin
CA2769525C (en) 2009-07-29 2017-02-21 Kai Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic agents for reducing parathyroid hormone levels
DK2717896T3 (en) 2011-06-08 2016-12-19 Kai Pharmaceuticals Inc Therapeutics for regulating phoshor serum
WO2013128003A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-06 Novo Nordisk A/S N-terminally modified oligopeptides and uses thereof
ES2723885T3 (es) 2012-07-19 2019-09-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-Siglec-15
WO2014172392A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
ES2688206T3 (es) 2013-06-17 2018-10-31 Armo Biosciences, Inc. Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas
SG11201510647TA (en) * 2013-06-28 2016-01-28 Amgen Inc Stable liquid formulation of amg 416 (velcalcetide)
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
CA2927592C (en) 2013-10-28 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Fgf-19 variants for treating a fgf-19 dependent cancer or tumor
RU2016122957A (ru) 2013-11-11 2017-12-19 Армо Байосайенсиз, Инк. Способы применения интерлейкина-10 для лечения заболеваний и расстройств
US10293043B2 (en) 2014-06-02 2019-05-21 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
US10350270B2 (en) 2014-10-14 2019-07-16 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
CA2963995A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2016126615A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US10456475B2 (en) 2015-02-03 2019-10-29 Kennsaw State University Research and Service Foundation, Inc. Cell penetrating protein adaptor molecules and their application in research and medicine
CN107847583A (zh) 2015-05-28 2018-03-27 阿尔莫生物科技股份有限公司 用于治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素‑10
EP3302528A1 (en) 2015-05-29 2018-04-11 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US10435446B2 (en) 2015-06-03 2019-10-08 Kennesaw State University Research and Service Foundation Inc. Cell penetrating protein adaptor molecules and their application in research and medicine
CN108025040A (zh) 2015-08-25 2018-05-11 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白介素-10治疗疾病和病症的方法
US10981957B2 (en) * 2015-12-02 2021-04-20 Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement Peptides having antimicrobial activity and new enzyme capable of converting L-configured residue in D-configured amino acid in a peptide
EP3411387A4 (en) 2016-02-03 2019-12-04 Kennesaw State University Research And Services Foundation Inc. SIGNAL MOLECULES USEFUL AS CELL PENETRATION AGENTS
US11246905B2 (en) 2016-08-15 2022-02-15 President And Fellows Of Harvard College Treating infections using IdsD from Proteus mirabilis
KR101772449B1 (ko) 2016-12-27 2017-08-30 주식회사 하이센스바이오 신규한 펩타이드
US20200353050A1 (en) 2017-11-10 2020-11-12 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of interleukin-10 in combination with immune check-point pathway inhibitors
EP3773669A4 (en) * 2018-03-29 2022-04-27 Contrafect Corporation ANTIMICROBIAL BACTERIOPHAGE-DERIVED POLYPEPTIDES AND THEIR USE AGAINST GRAM-NEGATIVE BACTERIA
US20210347842A1 (en) 2018-06-19 2021-11-11 Eli Lilly And Company Compositions and methods of use of il-10 agents in conjunction with chimeric antigen receptor cell therapy
US10905738B2 (en) * 2018-07-05 2021-02-02 Biozeus Desenvolvimento De Produtos Biofarmacêuticos Synthetic peptides, prodrugs, pharmaceutical compositions and uses
GB201903873D0 (en) * 2019-03-21 2019-05-08 Univ Nottingham Enhanced transfection
JP7545690B2 (ja) 2019-07-02 2024-09-05 Ａｇｃ株式会社 ペプチド及びその製造方法
MX2022005676A (es) 2019-11-13 2022-10-27 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipéptidos xten con código de barras y composiciones de estos, y métodos para preparar y usar los mismos.
CA3206148A1 (en) 2021-01-24 2022-07-28 Michael David FORREST Therapeutic modifiers of the reverse mode of atp synthase
JPWO2023048236A1 (ja) 2021-09-22 2023-03-30
KR102380732B1 (ko) 2021-09-23 2022-04-04 엘이솔루션 주식회사 축산분뇨처리시스템
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023193015A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002502376A (ja) * 1997-05-21 2002-01-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法
JP2002511885A (ja) * 1997-07-24 2002-04-16 ザ パーキン―エルマー コーポレーション 脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物
WO2003084985A1 (fr) * 2002-04-11 2003-10-16 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Peptide chimiquement modifie a l'aide de polyethyleneglycol
JP2004521108A (ja) * 2001-01-18 2004-07-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ δＰＫＣの活性化および阻害のためのペプチド
WO2004076621A2 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions of nucleic acids for treating and detecting influenza virus
JP2005500002A (ja) * 2000-10-02 2005-01-06 エリゼク・ファーマシュウティカルズ・インコーポレイテッド 生物学的に活性な薬剤を細胞関門を越えて輸送するための組成物および方法
JP2005523326A (ja) * 2002-04-22 2005-08-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ プロテインキナーゼｃのペプチドインヒビター
WO2006017578A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptide sequence for modulation of delta protein kinase c
JP2006219435A (ja) * 2005-02-10 2006-08-24 Osaka Univ 細胞透過性ペプチド

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US615977A (en) * 1898-12-13 Car-fender
US6316003B1 (en) 1989-12-21 2001-11-13 Whitehead Institute For Biomedical Research Tat-derived transport polypeptides
US5783405A (en) 1994-02-01 1998-07-21 Terrapin Technologies, Inc. Rapid screening method for effectors of signal transduction
US5776716A (en) * 1994-02-01 1998-07-07 Terrapin Technologies, Inc. Methods for identifying agents which block the interaction of fyn with PKC-theta, and uses thereof
US5935803A (en) * 1994-02-01 1999-08-10 Terrapin Technologies, Inc. Methods to identify immunomodulators using cognate interaction of PKC-theta
WO1998017299A1 (en) 1996-10-18 1998-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Isozyme-specific activators of protein kinase c, methods and compositions
US6258774B1 (en) * 1998-03-19 2001-07-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Carrier for in vivo delivery of a therapeutic agent
US20030108539A1 (en) * 2000-02-14 2003-06-12 Christophe Bonny Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
KR20020081330A (ko) * 2000-02-16 2002-10-26 노오쓰웨스턴 유니버시티 폴리펩토이드 폐 계면활성제
IL137290A0 (en) 2000-07-13 2001-07-24 Asher Eldad Ben An electronic circuit for reducing the danger of exposure to radiation from a transmitter
JP3710368B2 (ja) 2000-09-25 2005-10-26 シャープ株式会社 積層フィルムの製造方法
US20020168354A1 (en) 2000-11-10 2002-11-14 Daria Mochly-Rosen psiepsilonRack peptide composition and method for protection against tissue damage due to ischemia
US20030091640A1 (en) * 2001-02-08 2003-05-15 Srinivasan Ramanathan Enhanced oral and transcompartmental delivery of therapeutic or diagnostic agents
US20090075377A1 (en) * 2001-08-03 2009-03-19 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
US6933275B2 (en) 2002-05-01 2005-08-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Protein kinase C peptides for use in withdrawal
EP1567185B1 (en) * 2002-11-22 2020-02-19 Ansun Biopharma, Inc. Broad spectrum anti-viral therapeutics and prophylaxis
US20040175384A1 (en) * 2003-12-12 2004-09-09 Mohapatra Shyam S. Protein kinase C as a target for the treatment of respiratory syncytial virus
US7482016B2 (en) * 2003-03-19 2009-01-27 The J. David Gladstone Institutes Immunogenic compositions comprising HIV-1 acetylated Tat polypeptides
WO2004097017A2 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Avi Biopharma, Inc. Compositions for enhancing transport and antisense efficacy of nucleic acid analog into cells
CA2549052A1 (en) * 2003-12-11 2005-06-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Isozyme-specific antagonists of protein kinase c
US7265092B2 (en) * 2004-09-30 2007-09-04 Kai Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical formulation
US7767642B2 (en) * 2005-04-15 2010-08-03 Arizona Biomedical Research Commission Therapeutic peptides for the treatment of metastatic cancer
KR20080080486A (ko) * 2005-09-19 2008-09-04 카이 파마슈티컬즈 혈관신생의 단백질 키나아제 ｃ 펩티드 조절자
US7579318B2 (en) * 2005-12-06 2009-08-25 Centre De La Recherche De La Scientifique Cell penetrating peptides for intracellular delivery of molecules
WO2007143119A2 (en) * 2006-06-01 2007-12-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of preventing progression of hypertension-induced heart failure with pkc peptides
AU2007305268A1 (en) * 2006-10-02 2008-04-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptides derived from the C2 domain of epsilon PKC, and use thereof
US8987200B2 (en) * 2006-11-16 2015-03-24 Kai Pharmaceuticals, Inc. Polycationic calcium modulator peptides for the treatment of hyperparathyroidism and hypercalcemic disorders
KR20090117878A (ko) * 2007-01-19 2009-11-13 카이 파마슈티컬즈 통증의 완화를 위한 엡실론 억제제 화합물의 사용 방법
EP3248985B1 (en) 2007-01-19 2019-10-23 Kai Pharmaceuticals, Inc. Modifications of peptide compositions to increase stability and delivery efficiency

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002502376A (ja) * 1997-05-21 2002-01-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法
JP2002511885A (ja) * 1997-07-24 2002-04-16 ザ パーキン―エルマー コーポレーション 脂質膜を横切る輸送のための膜透過性構築物
JP2005500002A (ja) * 2000-10-02 2005-01-06 エリゼク・ファーマシュウティカルズ・インコーポレイテッド 生物学的に活性な薬剤を細胞関門を越えて輸送するための組成物および方法
JP2004521108A (ja) * 2001-01-18 2004-07-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ δＰＫＣの活性化および阻害のためのペプチド
WO2003084985A1 (fr) * 2002-04-11 2003-10-16 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Peptide chimiquement modifie a l'aide de polyethyleneglycol
JP2005523326A (ja) * 2002-04-22 2005-08-04 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ プロテインキナーゼｃのペプチドインヒビター
JP2005527209A (ja) * 2002-04-22 2005-09-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 疼痛管理のためのプロテインキナーゼＣγのペプチドインヒビター
WO2004076621A2 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions of nucleic acids for treating and detecting influenza virus
WO2006017578A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptide sequence for modulation of delta protein kinase c
JP2006219435A (ja) * 2005-02-10 2006-08-24 Osaka Univ 細胞透過性ペプチド

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
化学と生物, vol. 43, no. 10, JPN6019050778, 2005, pages 649 - 653, ISSN: 0004930515 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008089491A2 (en) 2008-07-24
CA2675665A1 (en) 2008-07-24
CA2989778C (en) 2020-06-30
JP2014224126A (ja) 2014-12-04
US20120178138A1 (en) 2012-07-12
CA2675665C (en) 2018-02-13
KR20190140111A (ko) 2019-12-18
US8067532B2 (en) 2011-11-29
KR20160005377A (ko) 2016-01-14
EP2109619A2 (en) 2009-10-21
JP2023078424A (ja) 2023-06-06
KR20090115852A (ko) 2009-11-09
CN101675067A (zh) 2010-03-17
EP3248985A1 (en) 2017-11-29
JP2018111717A (ja) 2018-07-19
CN103524623A (zh) 2014-01-22
KR102274003B1 (ko) 2021-07-08
CA2989778A1 (en) 2008-07-24
US9255124B2 (en) 2016-02-09
EP2109619A4 (en) 2013-04-24
US20220282239A1 (en) 2022-09-08
US20180371448A1 (en) 2018-12-27
AU2008206077A1 (en) 2008-07-24
US20160208237A1 (en) 2016-07-21
KR101775929B1 (ko) 2017-09-07
CN108948144A (zh) 2018-12-07
JP2010516707A (ja) 2010-05-20
EP2109619B1 (en) 2017-05-03
US20090042769A1 (en) 2009-02-12
US10077438B2 (en) 2018-09-18
EP3248985B1 (en) 2019-10-23
CN101675067B (zh) 2013-09-11
WO2008089491A3 (en) 2008-11-27
JP5937643B2 (ja) 2016-06-22
JP2016147905A (ja) 2016-08-18
US20200370032A1 (en) 2020-11-26
KR20170104634A (ko) 2017-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021098725A (ja) ペプチド組成物の安定性および送達効率を上昇させるための修飾方法
JP2018123169A (ja) ヘプシジン類似体及びその使用
JP2017206561A (ja) 長期間作用性ペプチド類似体のための組成物
US20230158100A1 (en) Treatment of panx1 associates diseases
KR20230146040A (ko) 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 길항물질
US20200129582A1 (en) Novel peptides and peptidomimetics
WO2024030934A2 (en) Glucagon-like peptide-1 receptor antagonists

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210406

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210324

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220404

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220629

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20221128