TR201807294T4 - Nükleik asit konjugatları için endosomolitik ajanlar ile optimize edilmiş in vivo aktarım sistemi. - Google Patents

Nükleik asit konjugatları için endosomolitik ajanlar ile optimize edilmiş in vivo aktarım sistemi. Download PDF

Info

Publication number
TR201807294T4
TR201807294T4 TR2018/07294T TR201807294T TR201807294T4 TR 201807294 T4 TR201807294 T4 TR 201807294T4 TR 2018/07294 T TR2018/07294 T TR 2018/07294T TR 201807294 T TR201807294 T TR 201807294T TR 201807294 T4 TR201807294 T4 TR 201807294T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
dbait
nucleic acid
leukemia
cancer
acid molecule
Prior art date
Application number
TR2018/07294T
Other languages
English (en)
Inventor
Sun Jian-Sheng
Dutreix Marie
Quanz-Schoeffel Maria
Original Assignee
Centre Nat Rech Scient
Inst Curie
Onxeo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre Nat Rech Scient, Inst Curie, Onxeo filed Critical Centre Nat Rech Scient
Publication of TR201807294T4 publication Critical patent/TR201807294T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4706—4-Aminoquinolines; 8-Aminoquinolines, e.g. chloroquine, primaquine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Mevcut buluş tıp alanıyla, özellikle de onkolojiyle ilgilidir.

Description

Tarifnamede tarif edilen farmasötik kompozisyonlar ve ürünler, kitler ya da kombine preparatlar, bir denekteki kanserin tedavisi için kullanilabilir. ile karakterize edilen memelilerdeki fizyolojik kosulu belirtmekte ya da tarif etmektedir.
Kanser örnekleri arasinda örnek olarak lösemi, lenfoma, blastoma, karsinom ve sarkom bulunmaktadir. Bu tür kanserlerin daha özel örnekleri arasinda kronik miyeloid lösemi, akut lenfoblastik lösemi, Philadelphia kromozom pozitifakut lenfoblastik lösemi (Ph+ ALL), skuamöz hücreli karsinom, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, glioma, gastrointestinal kanser, renal kanser, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, kolorektal kanser, endometrial kanser, böbrek kanseri, prostat kanseri, tiroid kanseri, nöroblastoma, pankreatik kanser, glioblastoma multiforme, serviks kanseri, mide kanseri, mesane kanseri, hepatom, meme kanseri, kolon karsinomu, bas ve boyun kanseri, gastrik kanser, germ hücreli tümör, pediatrik sarkom, sinonazal dogal katil, çoklu miyelom, akut miyelojenöz lösemi (AML), kronik lenfositik lösemi, mastositoz ve mastositoz ile iliskili herhangi bir semptom yer almaktadir. gelmektedir ve genel olarak, kan ve kemik iliginde Iökositlerin ve bunlarin öncülerinin oransiz bir çogalmasi ve gelismesi ile karakterize edilmektedir. Lösemi genellikle klinik olarak (1) hastalik-akut ya da kronik hastaligin süresi ve karakteri; (2) dahil olan hücre tipi; miyeloid (miyelojenöz), Ienfoid (Ienfojen) veya monositik; ve (3) kan- Iösemik ya da alösemik (sublösemik) anormal hücrelerin sayisindaki artma ya da artmama temelinde siniflandirilmaktadir. Lösemi arasinda örnek olarak, akut Ienfosittik olmayan lösemi, kronik lenfositik lösemi, akut granülositik lösemi, kronik granülositik lösemi, akut promiyelositik lösemi, yetiskin T-hücresi lösemi, alösemik lösemi, bir Iökositemik lösemi, bazofilik lösemi, blast hücre lösemi, sigir lösemi, kronik miyelositik lösemi, lösemi kütis, embriyonal lösemi, eozinofilik lösemi, Gross' lösemi, tüylü hücre lösemi, hemoblastik lösemi, hemositoblastik lösemi, histiyositik lösemi, kök hücre lösemi, akut monositik lösemi, Iökopenik lösemi, Ienfatik lösemi, lenfoblastik lösemi, lenfositik lösemi, lenfojenöz lösemi, lenfoid lösemi, Ienfosarkom hücresi lösemi, mast hücre lösemi, megakaryosit lösemi, mikromiyeloblastik lösemi, monositik lösemi, miyeloblastlar lösemi, miyelositik lösemi, miyeloid granülositik lösemi, miyelomonositik lösemi, Naegeli lösemi, plazma hücre lösemi, plazmasitik lösemi, promiyolesitik lösemi, Rieder hücre lösemi, Schilling,s lösemi, kök hücre lösemi, sublösemik lösemi ve farklilasmamis hücre lösemi yer almaktadir. Bazi görüslere göre mevcut bulus kronik miyeloid lösemi, akut lenfoblastik lösemi ve/veya Philadelphia kromozom pozitif akut lenfoblastik lösemi (Ph+ ALL) için tedavi saglamaktadir.
Asagidakiler dahil olmak üzere, çesitli kanserler de bulusun kapsami dahilindedir: mesane (hizlandirilmis ve metastatik mesane kanseri dahil), meme, kolon (kolorektal kanser dahil), böbrek, karaciger, akciger (küçük hücreli ve küçük hücreli olmayan akciger kanseri ve akciger adenokarsinom dahil), yumurtalik, prostat, testis, genitoüriner yol, lenf sistemi , rektum, larinks, pankreas (ekzokrin pankreatik karsinom dahil), özofagus, mide, safra kesesi, serviks, tiroid ve deri (skuamöz hücreli karsinom dahil) dahil olmak üzere karsinom; lösemi, akut lenfositik lösemi, akut Ienfoblastik lösemi, B-hücreli lenfoma, T hücreli lenfoma. Hodgkins lenfoma. Hodgkins olmayan lenfoma, tüylü hücreli lenfoma, histiyositik lenfoma ve Burketts lenfoma dahil olmak üzere lenfoid soyun hematopoietik tümörleri; akut ve kronik miyelojenöz lösemi, miyelodisplastik sendrom, miyeloid lösemi ve promiyelositik lösemi dahil olmak üzere miyeloid soyun hematopoietik tümörleri; astrositom, nöroblastoma, glioma ve schwannomalar dahil olmak üzere merkezi ve periferik sinir sisteminin tümörleri; fibrosarkom, rabdomiyosarkom ve osteosarkom dahil olmak üzere mezenkimal kaynakli tümörler; melanom, ksenoderma pigmentosum, keratoaktantoma, seminom, tiroid foliküler kanser ve teratokarsinom gibi diger tümörler; melanom, cerrahi olarak çikarilamayan evre lll ya da IV malign melanom, skuamöz hücreli karsinom, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, glioma, gastrointestinal kanser, renal kanser, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, kolorektal kanser, endometrial kanser, böbrek kanseri, prostat kanseri, tiroid kanseri, nöroblastoma, pankreatik kanser, glioblastoma multiforme, serviks kanseri, mide kanseri, mesane kanseri, hepatoma, meme kanseri, kolon karsinomu ve bas ve boyun kanseri, retinoblastoma, gastrik kanser, germ hücre tümörü, kemik kanseri, kemik tümörler, yetiskin malign fibröz histiyositoma; çocukluk çagi kemigin malign fibröz histiyositomasi, sarkom, pedlyatrik sarkom, sinonazal dogal katil, neoplazmlar, plazma hücreli neoplazm; miyelodisplastik sendromlar; nöroblastom; testiküler germ hücre tümörü, göz içi melanomu, miyelodisplastik sendromlar; miyelodisplastik/miyeloproliferatif hastaliklar, sinovyal sarkom. Ayrica, diger kanserlere ek olarak hastaliklar arasinda ürtiker plgmentoza, diffüz kutanöz mastositoz gibi mastositozlar, insanda soliter mastositoma köpek mastositoma ve büllöz, eritrodermik ve teleangiektatik mastositoz gibi bazi nadir alt tipler, miyeloproliferatif veya miyelodisplastik sendrom gibi iliskili hematolojik bir bozukluga sahip mastositoz ya da akut lösemi, mastositoz, mast hücreli lösemi ile iliskili miyeloproliferatif bozukluk yer almaktadir_ Diger kanserler de asagidakiler dahil olmak üzere hastaliklar kapsaminda yer almaktadir: mesane, ürotelyal karsinom, meme, kolon, böbrek, karaciger, akciger, yumurtalik, pankreas, mide, serviks, tiroid, testis, özellikle testis seminomlari ve deri dahil olmak üzere karsinom; skuamöz hücreli karsinom dahil olmak üzere; gastrointestinal stromal tümörler (“GIST"); lösemi, akut lenfositik lösemi, akut Ienfoblastik lösemi, B-hücreli Ienfoma, T hücreli Ienfoma, Hodgkins lenfoma, Hodgkins olmayan lenfoma, tüylü hücreli Ienfoma ve Burketts Ienfomayi içeren Ienfoid soy hematopoietik tümörleri; akut ve kronik miyelojenöz lösemi ve promiyelositik lösemi dahil olmak üzere miyeloid soyun hematopoietik tümörleri; fibrosarkom ve rabdomiyosarkom dahil olmak üzere mezenkimal kaynakli tümörler; melanom, seminom, teratokarsinom, nöroblastoma ve glioma dahil olmak üzere diger tümörler; astrositom, nöroblastoma, glioma ve schwannomalar dahil olmak üzere merkezi ve periferik sinir sistemi tümörleri; fibrosarkom, rabdomiyosarkom ve osteosarkom dahil olmak üzere mezenkimal kaynakli tümörler ve melanom, ksenoderma pigmentosum, keratoaktantoma, seminom, tiroid foliküler kanser, teratokarsinom, kemoterapi refrakter seminomatöz olmayan germ hücreli tümörler ve Kaposi”s sarkomu ve bunlarin herhangi bir metastazi dahil olmak üzere diger tümörler.
Tercih edilen bir görüse göre, kanser bir kati tümördür. «Kati tümör” terimi özellikle gögüs kanseri, yumurtalik kanseri, kolon kanseri ve genel olarak GI (gastrointestinal) yol, serviks kanseri, akciger kanseri, özellikle küçük hücreli akciger kanseri ve küçük hücreli olmayan akciger kanseri, bas ve boyun kanseri, mesane kanseri, prostat kanseri veya Kaposi's sarkomu anlamina gelmektedir.
Bulusta tarif edilen farmasötik kompozisyonlar ve ürünler, kitler ya da kombine preparatlar, kati tümörlerin büyümesini inhibe etmek, tümör hacmini azaltmak, tümörlerin metastatik yayilmasini ve mikrometastazlarin büyümesini ya da gelismesini önlemek için yararli olabilir. Bulusta tarif edilen farmasötik kompozisyonlar ve ürünler, kitler ya da kombine preparatlar, özellikle kötü prognozlu hastalarin ya da radyo veya kemo-dirençli tümörlerin tedavisi için uygundur.
Bulus sahipleri, her bir tümör için (melanomlar, glioblastomalar, karsinomlar dahil olmak üzere) hücre dizilerinden ve hastalarin biyopsilerinden yüksek sayida farkli tümöral tipleri test etmistir. Bunlarin % 80'inden fazlasi tedaviye iyi cevap vermistir. Özellikle, asagidaki tümöral tipler için etkililik gözlenmistir: melanom, glioblastoma, meme kanseri, kolon kanseri, gastrointestinal kanser, karaciger kanseri ve bas ve boyun kanseri.
Tercih edilen bir görüse göre kanser, melanom, glioblastoma, meme kanseri, kolon kanseri, gastrointestinal kanser, karaciger kanseri ve bas ve boyun kanseri arasindan seçilebilir.
Rejim. doga] ve uvqulama vollari Bulusun kombine preparatinda kullanilan kombinasyon ortaklarinin her birinin etkili dozaji, kullanilan bilesige veya farmasötik kompozisyona, uygulama sekline, tedavi edilmekte olan duruma, tedavi edilen durumun ciddiyetine bagli olarak degisebilir. Bu nedenle, bulusun kombine preparatinin dozaj rejimi, uygulama yolu ve hasta durumu dahil olmak üzere çesitli faktörlere uygun olarak seçilmektedir. Olagan uzmanliga sahip bir hekim, klinisyen ya da veteriner, durumun ilerleyisini önlemek, karsi koymak ya da durdurmak için gerekli olan tek etken maddenin etkili miktarini kolayca belirleyebilir ve reçete edebilir. Etken maddelerin, toksisite olmaksizin etkinlik saglayan araliktaki konsantrasyonunun elde edilmesinde optimum hassasiyet, etken maddelerin hedef bölgelere ulasabilirliginin kinetigine dayali bir rejimi gerektirir.
Konjuge Dbait molekülleri için uygulama yolu oral, parenteral, intravenöz, intratümöral, subkütan, intrakraniyal, intra-arter, topikal, rektal, transdermal, intradermal, nazal, intramüsküler, intraperitoneal ve kemik içi olabilir. Tercih edilen bir görüse göre, konjuge Dbait molekülleri, tedavi edilecek olan tümöral bölgelerin yakinina uygulanacak ya da enjekte edilecektir.
DNA'ya hasar veren antitümoral ajan için uygulama yolu oral, parenteral, intravenöz, intratümöral, subkütan, intrakraniyal, intraarteryal, topikal, rektal, transdermal, intradermal, nazal, intramüsküler, kemik içi olabilir.
Radyoterapi ya da DNA'ya hasar veren antitümoral ajan ile tedaviye baslandiktan sonra, konjuge Dbait molekülleri ile tedavi, radyoterapi ya da DNA'ya hasar veren antitümoral ajan ile tedavi uygulanacagi ya da verilecegi sürece devam edebilir.
Alternatif olarak, konjuge Dbait molekülleri ile tedavi sonlandirilabilir.
Konjuge Dbait molekülleri için, bulusun kombine preparati, kiti ya da ürününde kullanilan DNA'ya hasar veren antitümoral ajanin etkili dozaji, uygulama sekline, tedavi edilmekte olan duruma, tedavi edilen durumun ciddiyetine bagli olarak degisebilir. Bu nedenle, konjuge Dbait moleküllerinin dozaj rejimi, uygulama yolu ve hasta durumu dahil olmak üzere çesitli faktörlere uygun olarak seçilmektedir. Olagan uzmanliga sahip bir hekim, klinisyen ya da veteriner, kanserin ilerlemesini önlemek, karsi koymak ya da durdurmak için gerekli özellikle seçilmis DNA“ya hasar veren tedavi ile kombinasyon halinde, konjuge Dbait moleküllerinin etkili miktarini kolayca belirleyebilir ve reçete edebilir. Örnek olarak, lokal uygulama için (örnek olarak, intratümöral ya da subkütan uygulama kullanildiginda), konjuge Dbait moleküllerinin etkin miktari, 1 cm3 tümör için en az 0.01 mg, tercih edilen sekliyle 1 cm3 tümör için 0.1-40 mg, en çok tercih edilen sekliyle 1 cm3 tümör için 1-20 mg'dir. Etkili miktar, günlük bir tedavi protokolünde (örnek olarak, 3 ila 6 hafta boyunca haftada 5 gün ya da 3 ila 6 hafta boyunca haftada 3 kere) uygulanabilir. Alternatif olarak, 1 cm3 tümör için en az 0.1 mg, tercih edilen sekliyle 1 etkili bir miktar, örnek olarak 3-6 hafta boyunca bir haftalik tedavi protokolünde uygulanabilir. Diger uygulama yollari kullanildiginda, teknik alanda uzman bir kisi, tümör içinde 1 cm3 tümör için en az 0.01 mg, tercih edilen sekliyle 1 cm3 tümör için 0.1- 40 mg, en çok tercih edilen sekliyle 1 cm3 tümör için 1-20 mg olan konjuge Dbait moleküllerinin etkili bir miktarinin elde edilmesi için miktari ayarlayabilir. Örnek olarak, sistemik bir yol için, konjuge Dbait moleküllerinin etkili miktari ya da birim dozaji, 0.1 ila 100 mg, tercih edilen sekliyle 4 ila 40 mg olabilir. Buna göre, sistemik bir yol için, konjuge Dbait moleküllerinin etkili miktari ya da birim dozaji, hastanin agirligina göre 0.06 ila 0.6 mg/kg olabilir. Kuskusuz, dozaj ve rejim, kemoterapi ve/veya radyoterapi rejimi göz önüne alindiginda, teknik alanda uzman bir kisi tarafindan ayarlanabilir.
Radyoterapi için, teknik alanda bilinen herhangi bir radyoterapi rejimi, özellikle stereotaktik isinlama (örnek olarak, 15 Gy) ya da fraksiyonel bir isinlama kullanilabilir.
Fraksiyonel bir isinlamanin kullanilmasi özellikle etkili olabilir, örnek olarak isinlama bir, iki, üç, dört, bes veya alti haftalik bir periyotta her gün ya da her 2-5 günde bir, tercih edilen sekliyle 3-4 günde bir uygulanabilir. Isinlama, 1 ila 10 Gy, tercih edilen sekliyle 2 ila 5 Gy, özellikle 2, 3, 4 veya 5 Gy olabilir. Örnek olarak, alti haftada 15x28y'nin ya da iki haftada 4 ila 6x5Gylnin fraksiyonel isinlamasi düsünülebilir. Tercih edilen bir görüse göre, düsünülen radyoterapi, iki haftada 5 Gy'nin 4 isinlamasi olan bir protokoldür. Isinlama ve Dbait molekülleri ile kanserin kombine tedavilerinin farkli rejimleri ya da kosullari test edilmis ve isinlama dozlarina degil ama Dbait moleküllerinin dozlarina bagli olarak Dbait molekülleri tarafindan tümörlerin radyo- sensibilizasyonunu göstermesine izin verilmistir.
Kemoterapi için, bulusun kombine preparati, kiti ya da ürününde ya da bulusun kompozisyonu ile kombinasyon halinde kullanilan DNA'ya hasar veren antitümoral ajanin etkili dozaji, kullanilan DNA'ya hasar veren antitümoral ajana, uygulama sekline, tedavi edilen durum, tedavi edilen durumun ciddiyetine bagli olarak degisebilir. Bu nedenle, DNA'ya hasar veren antitümoral ajanin dozaj rejimi, uygulama yolu ve hasta durumu da dahil olmak üzere çesitli faktörlere göre seçilmektedir. Olagan uzmanliga sahip bir hekim, klinisyen ya da veteriner, kanserin ilerlemesini önlemek, karsi koymak ya da durdurmak için gerekli DNA'ya hasar veren antitümoral ajanin etkili miktarini kolayca belirleyebilir ve reçete edebilir.
Tedavi bir ya da birkaç döngü içerebilir, örnek olarak iki ila on döngü, özellikle iki, üç, dört ya da bes döngü. Döngü devam ettirilebilir ya da bölünebilir. Örnek olarak, her bir döngü bir ila sekiz hafta, tercih edilen sekliyle üç ila dört hafta arasinda bir zaman araligi ile ayrilmistir. Örnekler Polietilenimin (PEI) ile kompleks haline getirilen veya kolesterole baglanan kisa DNA (Dbait) dagilimi ve aktivitesinin çok ölçekli bir karsilastirmasi.
Dbait/vektör komplekslerinin ve hücre aliminin karakterizasyonu PEl'nin DNA, oligonükleotidler ve RNA ile kovalent olmayan interpoliyelektrolit kompleksleri olusturabildigi gösterilmistir. Uzun PEI zincirleri gen transfeksiyonunda oldukça etkilidir, fakat daha fazla sitotoksiktir. Mucitler, Dbait ile birkaç PEI parçacikli polipleksleri test etmis ve aktivitelerini kolesterole kovalent olarak baglanmis modifiye edilmis bir Dbait ile (coDbait olarak adlandirilmistir) karsilastirmistir. CoDbait, ilave vektör olmaksizin kullanilan bir yag kolesterol zincirine kovalent olarak bagli bir Dbait molekülüdür. Test edilen her vektör için, mucitlerin temel hedefi, en yüksek Dbait konsantrasyonunda en homojen partikül büyüklügü dagilimina sahip bir formülasyon gelistirmek olmustur. Parçaciklarin çapi ve yüzey yükü, dinamik lazer isik saçilimi (DLS) ile ölçülmüstür. Çok modlu bir analiz kullanilarak, mucitler, ortalama boyutu lineer PEllnin benzer özelliklere sahip Dbait ile kompleksler olusturdugunu bulmustur Tablo 1. Formüle edilmis Dbait'in floresans ve hücresel alimi.
Moleküller/Yöntemler klorokin Elektroporasyon Elektroporasyon Dbait/PEI11k DbaIt/bPEl25K Dbait/PEI22k Dbait/superfect Dbait/superfect + CQ coDbait coDbait + CQ coDbait coDbait + CQ Klorokin floresansax10e- 6/pg/mL 26,46 51,62 54,49 ,02 ,71 65,74 236,43 cor MCCb24 MCCCS saat Tespit 3,2 Edilmedi 1,41 10,79 1,39 Tespit Edilmedi 0,43 3,45 13,78 13,26 16,98 57,98 16,41 42,74 34,32 203,78 34,01 Tespit Edilmedi 2,89 Tespit Edilmedi ,97 Tespit Edilmedi 18,95 64 68,14 214,3 4saat Tespit Edilmedi Tespit Edilmedi 19,07 12,87 31,79 Tespit Edilmedi Tespit Edilmedi Tespit Edilmedi 18,44 61,76 Moleküller/Yöntemler Klorokin Dbait floresansax10e- MCCbS cor MCCb24 cor (100 (ug/m L) 6/pg/mL saat MCCCS saat MCC°2 mg/mL) saat 4saat Edilmedi Edilmedi Edilmedi Edilmedi a FL2 degerinde floresans; bMCC= ortalama hücresel içerik FL2 degeri (> 3 deney); ccor MCC= düzeltilmis hücresel içerik FL2 / floresans Dbait üzerindeki farkli PEI oranlari test edilmistir. % 100 Dbait kompleksine yol açan en düsük oran jel kaydirma analizi ile belirlenmistir. Daha sonraki çalismalar için PEI11K, PEl22K ve bPEI25K için sirasiyla 6, 6 ve 9 N/P orani seçilmistir. Dbait-PEl kompleksi parçaciklari,% 10 sukroz içinde bir saatlik bir süre boyunca stabil kalmistir.
Popülasyondaki küresel parçaciklarin homojen morfolojisi (125 ila 140 nm arasinda degisen büyüklükte) transmisyon elektron mikroskobisi ile dogrulanmistir (Sekil 1A).
Seyreltme tamponunda 0.8 mg / mL'yi asan tuz konsantrasyonu veya uzun süreli depolama, PEl komplekslerinin topaklanmasini indüklemistir. Daha büyük ve çok yönlü dagilmis agregalar (> 2 pm) veren süperfect kompleksleri (60 pg Superfect/ug Dbait) pozitif kontrol olarak kullanilmistir. Yüksüz amhifilik kopolimer Lutrol, Dbait ile stabil bir etkilesim kompleksi olusturmamis ve bazi deneylerde negatif kontrol olarak kullanilmistir.
Mucitler, farkli komplekslerin hücresel alimini bir floresan cy3-modifiye Dbait kullanarak takip etmistir. CyS-Dbait kompleksinin baslangiç floresansi transfeksiyondan hemen önce izlenmistir. PEI komplekslerinde, Dbait floresansi, moleküllerin PEl ile sikistirilmasinin flüoresansi azaltabilecegini gösterir bir biçimde 2 ile 3 kat azalmistir (Tablo 1). coDbait, ayni zamanda, kolesterolün ayni molekül üzerindeki siyaninle etkilesime girebilecegini gösterir bir biçimde çiplak Dbait'ten daha az floresan olmustur. Superfect ya da Lutrol floresansi etkilememistir. Insan transfekte edilmis fibroblast hücrelerinin hücresel içerigi, akis sitometrisi analizi ile ölçülmüstür. Çiplak Dbait veya Dbait-Lutrol karisimi ile tedavi edilen hücrelerin floresans dagilimi, Dbait moleküllerinin hücrelere kendiliginden girmedigini gösterir bir biçimde, muamele edilmemis kontrolden farkli degildir. Elektroporasyon nispeten verimsiz olmustur ve Dbait konsantrasyonunun arttirilmasi transfeksiyon verimliligini artirmamistir. Tüm polikatyonik polimerler (PEI ve süperfect), verimli hücresel alimi arttirmis, fakat lineer PEI'Ier, Dbait/superfect veya Dbait/PEIb25K komplekslerinden daha genis bir dagilim göstermistir. CoDbait, transfeksiyon faktörlerinin yardimi olmaksizin ancak Dbait / PEI'den 10 kat daha düsük bir verimle hücrelere girmistir. CoDbait konsantrasyonunun -15 kat arttirilmasi etkili transfeksiyona olanak tanimistir (Sekil 18).
DNA transfer verimliliginin bir sinirlamasi, onun endozomlarda tutuluyor olmasidir ki bu da onun hedefiyle etkilesmesini veya transkripsiyonunu önlemektedir. DNA hücrenin içine girerken, bozunmaya yol açan normal endozomal yollardan kaçinmalidir. Bu nedenle, DNAlyi aktarmanin etkinligi sadece hücresel alim ile degil, ayni zamanda destabilizasyon ve endozomlardan kaçis ile de iliskilidir. PEl'nin, endozomlardan ve lizozomlardan ("proton sünger hipotezi") DNA salimini kolaylastiran yüksek bir tamponlama kapasitesine sahip oldugu bilinmektedir. Tersine, coDbait, endozomlardan verimli bir sekilde salinmak için Klorokin (CO) gibi fuzojenik ajanlarin yardimina ihtiyaç duyacaktir. Transfeksiyon verimliligini arttirmak için, transfeksiyondan yarim saat önce hücrelere 100 uM CQ ekledik. CQ, coDbait'in hücresel alimini 2-4 kat arttirmistir (Sekil 1). Hücrede salinan Dbait miktari, Dbait moleküllerine baglanmasi ile tetiklenen DNA-PKcs kinaz aktivasyonu ile izlenmistir (Quanz ve ark., 2009, supra). Kolesterol ilavesi, Dbait'in saflastirilmis DNA-PK'yi aktive etme yetenegini etkilememistir (Sekil 2A). Hücredeki DNA-PKcs kinaz aktivasyonu, kesin olarak DNA-PK'ye bagli oldugu gösterilen H2AX fosforilasyon miktari ile izlenmistir. Hem Dbait/PEI ve hem de coDbait, isleme tabi tutulan hücrelerde H2AX fosforilasyonunu indüklemistir (Sekil 28). Dallanmis ve dogrusal PEl/Dbait kompleksleri, transfeksiyonun baslangicindan sonra maksimum 6 saate ulasan ve transfeksiyondan 24 saat sonra devam eden H2AX fosforilasyonunu (Sekil 20) hizli bir sekilde desteklemistir. Dbait tarafindan indüklenen kinaz aktivitesi, herhangi bir zamanda gerçeklesen elektroporasyondan sonra çok düsüktür (Sekil 2). Yüksek CoDbait konsantrasyonlari, fosforile H2AX'e karsi çok etkisizdir ve en yüksek degere ulasmak için en az 24 saate ihtiyaç duymustur. Transfeksiyon sirasinda CQ ilavesi coDbait transfekte hücrelerde DNA-PKcs aktivasyonunu 10 kat daha az Dbait/PEI ile gözlemlenene kadar arttirmistir (Sekil 2C). CQ, Dbait/PEI transfekte edilmis hücrelerde aktiviteyi arttirmamistir ki bu da PEI'ye kompleks hale getirildiginde Dbait'in endozomlardan etkili bir sekilde salindigini göstermektedir. CoDbait”in hücresel alimi, transfeksiyondan sonra 5 saat ile 24 saat arasinda artmadigi için, coDbait tarafindan DNA-PK'nin yavas aktivasyonu, endozomlardan yavas salinmasini ortaya koymaktadir.
Zebra baligi erken embriyolarinda hücresel alim ve genel toksisite Hücre kültürleri üzerindeki Dbait alimi ve aktivitesinin analiz edilmesi, tüm organizmadaki ilaç difüzyonu, hücresel alim ve aktivite hakkinda sonuca varilmasina olanak tanimamaktadir. Mucitler, zebra baligi embriyolarinin 1000 hücre asamasinin (evre 1K) hücre içi bosluguna çiplak veya adjuvan ile Dbait-cy3 enjekte ederek bu hücresel ve alt hücresel düzeyde Dbait-cyS dagiliminin konfokal mikroskopi ile in vivo gözlemine ve yani sira erken zebra baligi embriyosunun hizli bölünen hücreleri üzerindeki aktivitesinin gözlemine olanak tanimistir. Evre 1K embriyolarinin hayvan kutbuna enjekte edilen çiplak Dbait-cy3, tüm blastoderm boyunca hizla dagilmis ve enjeksiyondan 15 dakika sonra artik tespit edilemez hale gelmistir. Lutrol eklenmesi, enjeksiyon noktasinin etrafinda hücre disi alanda Dbait tutulumuna izin vermis, ancak hücresel alimini kolaylastirmamistir. Superfect veya PEl'nin varliginda, hücrelerin içinde etkili hücresel alimi gösteren çok sayida floresan yamasi gözlenmistir. coDbait cy3, yamali intraselüler floresan ile birlikte plazmik membranlarin güçlü ve kalici lekelenmesi ile baska bir davranis tipi sergilemistir. Enjeksiyondan önce CO ile enkübe edilen embriyolar büyük coDbait floresans yamalari difüz hücre içi dagilima dönüstürmüstür.
Enjeksiyondan 20 saat sonra fenotipik etkilerin gözlemlenmesi, Dbait aktivitesinin ve tedavinin genel toksisitenin degerlendirilmesine olanak tanimistir. Pre-gastrulasyon embriyolarinin hayvan kutbunda enjekte edilen alandan elde edilen zebra baligi kader floresansi, larvalarin bas hücrelerinde enjeksiyondan 24 saat sonra tespit edilmistir (Sekil 3A-C). Dbaitin adjuvan (NA) olmadan veya Lutrol (Lu) ile kombine edilerek enjeksiyonu, yukarida tarif edilen Dbait'in zayif hücre içi alimi ile iliskili olarak gelisme (Sekil 3D) üzerinde hiçbir etki göstermemistir. Adjuvanin eklenmesi, kafada hücre ölümlerine yol açmistir ve enjekte edilen hacimle iliskili olarak, genis hücre ölümü ve teratojenez gözlenebilir. 24 saatlik fenotipler tarif edildigi gibi kategorize edilmistir (Sekil 3) ve bu da enjekte edilen karisimin toksisitesinin ölçülmesine olanak tanimistir.
Ayni konsantrasyonda Dbait için, hücre ölümüne ve müteakip gelisimsel anormalliklere göre, adjuvana bagli olarak belirgin farkliliklar ortaya çikmistir. Superfect (sup) ilavesi embriyonik hücreler için çok zehirliydi ve erken evrelerde genis hücre ölümü. yüksek oranda tip 2 fenotipe neden olmustur. Benzer sekilde, PEI'nin (25K, 22K, 11K) eklenmesi, zebra baligi blastomerlerine toksik oldugunu kanitlamistir. PEI ilavesinden daha az etkili olsa da, coDbaIt enjeksiyonu önemli ölçüde hücre ölümüne yol açmistir.
CQ ile önceden inkübe edilen embriyolar, toksisiteyi önemli ölçüde artirmamistir. Erken embriyonik hücre ölümü ve sonraki gelisimsel anormallikler hep beraber Zebra baligi embriyolarinda Dbait +/- adjuvan genel toksisitesini degerlendirmek için hizli ve güvenilir bir protokol sunmaktadir. Hücre ölümünün hücre alimiyla korelasyonu, embriyonik hücrelerde Dbait'in anti-tümör aktivitesinin toksik etkide önemli bir rol oynayabilecegini göstermistir.
Farelerde lokal ve sistemik toksisite Hücre kültürü, zebra baligi embriyolari ve fare verilerinin tutarliligini degerlendirmek için, mucitler, çiplak farelerin cildinin tekrarlanan Dbait/ PEI1K, Dbait / PEI22K, Dbait / bPEl25K ve coDbait uygulamasina toleransini analiz etmistir. Farkli sekilde formüle edilmis Dbait'in toksisitesi, 3 günlük subkütanöz (SC) enjeksiyondan sonra analiz edilmistir. Tüm Dbait/PEl enjeksiyonlari 3.75 mg/kg'da tolere edilen ancak bu, tedavinin durdurulmasiyla hizla ortadan kaybolan lokal nekroz ve iskemi ile iliskili lokal enflamasyonu tetiklemek için 5 mg/kg'da baslayan yüksek toksisite sergilemistir. intravenöz (lV) enjeksiyon toksisitesi benzer sonuçlar vermistir: Dbait / PEI intravenöz enjeksiyonlari, muhtemelen kan tikanmasi ile enjeksiyon sirasinda meydana gelen ölümle 3 mg/kg'da öldürücü olmustur. Perfüzyon ile yavas enjeksiyonlar (. 6 mg/kg Dbait / PEl'ye (6 nmol/enjeksiyon) kadar toleransi arttirmis, bu da IV toksisitesinin çogunun bolus enjeksiyon bölgesinde lokal konsantrasyona bagli oldugunu dogrulamistir. CQ ile ya da CQ olmaksizin coDbait, kullanilan yol ne olursa olsun (SC, IV bolus veya IV perfüzyonu) test edilen tüm dozlarda (800 mg/kg/enjeksiyona kadar; 800 nmoI/enjeksiyon) toksisite sergilememistir.
Ksenografli tümörlerde antitümoral aktivite Formüle edilmis Dbait'in antitümöral etkisi, SK28 ksenogreftli insan melanomunda radyoterapi ile kombinasyon halinde test edilmistir. Dbait/vektör kompleksleri, intratümöral enjeksiyonlar kullanilarak her bir isinlamadan 5 saat önce uygulanmistir.
Intratümöral enjeksiyonla ilaç uygulamasi (lT) birçok çalismada kullanilmasina ragmen, klinik deneylerde bu uygulama yolundan kaçinilmasi önerilmektedir. Mucitler, Dbait/PEI11k veya coDbait'in tümörün yanindaki alanda subkütanöz enjeksiyon (SC) ile nasil uygulanabilecegini arastirmislardir. Bazi klinik deneyler bu uygulama yolunu basariyla kullanmistir. Bulus sahipleri, ilk olarak, bir intratümöral enjeksiyon veya tümörün zit taraflarinda gerçeklestirilen iki subkütanöz enjeksiyon ile tedavi edilen tümörlerde moleküllerin difüzyonunu karsilastirmistir (Sekil 4). PEI11k'ye kompleks haline getirilen floresan Dbait, enjeksiyon bölgesinde agregatlar olusturma egilimindedir ve tümörün kenarina ilerleyen bir sekilde yayilmaktadir. Bunun tersine, coDbait, tümörün içinde veya çevresinde olsun, enjeksiyonun etrafinda daha esit bir dagilim sergilemistir. Dbait/PEI11k veya coDbait'in SC enjeksiyonlari, tümör büyümesinin kontrolü açisindan lT enjeksiyonlarindan biraz daha az etki göstermistir (Tablo 2). Bununla birlikte, enjeksiyon alanlarinin sayisinin arttirilmasi, lokal toksisite eklemeden tümör büyümesinin kontrolünü önemli ölçüde gelistirmeye olanak tanimalidir.
Tablo 2. Çesitli tedavilerle iliskili isinlama sonrasi ksenografli farelerin hayatta DbaitNektör Dbait uygulama Nb.fare Tedavi Medyan Göreceli Ortalama SD Ortalama kompleksleri konsantrasyonu modua edilmis hayatta risk (p TGD TGD % TGDC fareb kalim degeri) (3nm0l) (p<0.41) DbaitNektör Dbait uygulama Nb.fare Tedavi Medyan Göreceli Ortalama SD Ortalama kompleksleri konsantrasyonu modua edilmis hayatta risk (p TGD TGD % TGD° fareb kalim degeri) (3nm0l) (p<4.62.10- (3nm0l) (p<3.73.10- (3nm0l) (p<0,55) (7.5nmol) (p<1.05.10- (30nm0l) (p<4.02.10- (60nm0l) (p<1.05.10- a uygulama modu: lT, Intratümöral; SC, subkütanöz b tedavi edilen fareler, tedaviden sonraki 300 gün içinde hastalik nüksetmeyen hayvanlardir. anlatilmistir.
SK28 melanoma ksenograft tasiyan çiplak farelerin 5 grubunun hayatta kalimi çalisilmistir. Grup 1) tedavi edilmemis fareler (n = 16); Grup 2) isinlanmis fareler (lR. n = 12); Grup 3) intraperitoneal olarak enjekte edilen 1 mg klorokin ile isinlanmis fareler (CO, IR, n = 10); Grup 4) intratümoral olarak 0,6 mg DT01 (ayni zamanda coDbait olarak da adlandirilir) enjekte edilen ve 5 saat sonra isinlanan (DT01, IR, n =11)tedavi edilmis fareler; ve Grup 5) 0.6 mg DT01 (ayni zamanda voDbait olarak da adlandirilir) intratümöral enjeksiyondan 2 saat önce 1 mg klorokin ile intraperitoneal olarak enjekte edilen ve 5 saat sonra isinlanarak (DT01, CQ, IR, n = 13) daha önceden tedavi edilen Sonuçlar Sekil 5'te sunulmustur.
Intratümöral uygulanan 0.6 mg coDbait ile, klorokin ile yapilan ön tedavi, isin tedavisine karsi önemli derecede duyarli hale getirmis ve tek basina radyoterapiye (grup 2) kiyasla sagkalimi artirmisken (grup 5), ne coDbait (grup 4) ne de CQ (grup 3), isin tedavisine karsi duyarlilikta önemli bir artis saglamamistir. Grup 5'in isin tedavisine karsi hassasiyet derecesi, N/P = 6 oraninda polietilenimin (PEl) ile formüle edilen 0.06 mg Dbait ile tedavi edilene benzer olmustur.
SKDbait'in subkütanöz enjeksiyonuna dayanan bir uygulama rejimi, SK28 melanom ksenogreftini tasiyan çiplak farelerde de degerlendirilmistir. Bu rejim, Sekil 6'da sematik olarak açiklanmaktadir. Kisacasi bu rejim iki haftada coDbait ve isinlama ile dört kombine tedaviyi içermektedir. Özellikle, 4 mg coDbait, tümör sinirindan 5 mm ile ayrilan iki zit noktada subkütanöz olarak enjekte edilmistir. Buna ilaveten, hayvanlar, 1 mg klorokin (CQ) ile ön-tedaviye tabi tutulmus ve ayrica, coDbait ve isinlama ile tedavi sirasinda ayni dozajda CQ ile tedavi edilmistir. Tümör büyümesi bu uygulama rejiminden sonra degerlendirilmis ve sonuçlar Sekil 6'da verilmistir.
En düsük tümör büyümesinin, klorokin ile bir ön tedaviden sonra, coDbait'in ve klorokin ile isinlanmanin birlikte tedavisi ile gözlenmistir. Buna ilaveten, klorokin ile eszamanli tedavi edilen grup, klorokin tedavisi olmayanlara göre daha homojen sonuçlar sergilemistir.
Mevcut çalismada, mucitler, uygulama protokollerinin ve ilaç formülasyonunun gelistirilmesine rehberlik edecek bir dizi analiz kullanmistir. Bu analizler farelerde ön- klinik testler yapmadan önce farkli Dbait formülasyonlarinin karsilastirilmasina olanak tanimistir. Hücresel analizler ve zebra baligi embriyosu analizleri, antitümöral ilaç etkisinde bir önkosul olan Dbait hücresel aliminin etkinligini degerlendirmek ve memeliler üzerinde ön-klinik çalismalar için en uygun protokolleri ve formülasyonlari seçmek için kullanilmistir. Zebra baligi embriyosundaki genel toksisite, fare derisinde veya sistemik enjeksiyondan sonra toksisite ile iliskili degildir. Özellikle, zebra baligi embriyosundaki coDbait'in yüksek toksisitesi, ilaca temas eden hücrelerin çogunun muhtemelen öldügünü, ancak farenin derisinin coDbait'in yüksek dozlarinin enjeksiyonlarina herhangi bir reaksiyon sergilemedigini göstermistir. Bu fark, zebra baligi erken embriyosundaki toksisitenin, saglikli doku duyarliligindan ziyade tümör duyarliliginin bir göstergesi oldugunu düsündürmektedir. Aslinda, Dbait moleküllerinin tümörlerde spesifik olarak toksik oldugu, ancak normal deride toksik olmadigi gösterilmistir (Quanz ve ark., 2009, supra). Hücre kültüründe karsilastirilabilir DNA- PKcs aktivasyonunu tetikleyen Dbait / PEI (5 uM) ve coDbait (50 uM) + CQ Zebra baligi embriyolari (Sekil 38) üzerinde benzer toksik etkiye sahiptir ve fare tümörlerinde belirgin antitümoral aktivite sergilemistir (Tablo 2, Sekil 5 ve 6). Bu gözlem, mitotik indeks ve biyokimyasal ve fenotipik özellikler de dahil olmak üzere tümör hücreleri ile karakteristik özellikleri paylasan zebra baligi embriyonik hücrelerinin antitümoral aktivitesine duyarlilik ile tutarlidir. Bu hipotezle uyumlu olarak, mucitler son zamanlarda, 1 ila 16 hücre asamasi arasinda zebra baligi blastomerlerine çiplak Dbait'in dogrudan hücre içi enjeksiyonu yoluyla Dbait'in antiproliferasyon aktivitesini göstermistir.
PEI polimerleri, test edilmis tüm adjuvan moleküller arasinda, Dbait komplekslerinin olusturulmasinda en etkili olanlardir. Bununla birlikte kullanimlari, kan sisteminde oldugu gibi dokular üzerindeki toksisiteleriyle de sinirlidir. Lokal toksisite kismen yavas uygulama (perfüzyon) ve enjekte edilen dozlarin farkli enjeksiyon bölgelerine ayrilmasi ile kismen ortadan kaldirilmistir. Ancak kolesterol ve Dbait'in kovalent kombinasyonu, adjuvan eklenmeden hücrelere Dbait verilmesi için en iyi alternatifi saglamistir.
Gerçekten de, test edilen dozlarin araliginda toksisite olmamasi, bu molekülün antitümöral etki için gerekli en yüksek dozlara ragmen yararli olabilecegini düsündürmektedir. Sirasiyla Dbait/ PEl11K ve coDbait enjeksiyonu basina 3 nmol ve nmol dozlari, tek basina isinlama ile uyarilan tümör büyümesindeki gecikmeyi ikiye katlamistir. Her iki formülasyonun ilgili toksisitesi (6 nmol ve >800nm0l), Dbait/PEl11K için 0.5'lik verim dozu/toksisite dozu orani ve coDbait için <0.037'Iik verim dozu/toksisite dozu orani vermis, ve bu da klinik deney için coDbait'in çok iyi bir aday oldugunu göstermistir.
Materyal ve Yöntemler Dbait ve Parçacik olusumu Dbait ve coDbait molekülleri, daha önce tarif edildigi gibi (Quanz ve ark., 2009, supra) Eurogentec'ten (Seraing, Belçika) veya Agilent Technologies Nucleic Acid Solution Division`dan (Boulder, ABD) otomatik kati fazli oligonükleotid sentezi ile elde edilmistir.
Ters faz HPLC ve/veya HPLC-IEX ile denatüre edilerek saflastirilmislardir. Bazi Dbait türevleri, floroforlar Cy3 (Äeksitasyon = 540 nm; Äemisyon = 560 nm) veya Cy5.5 ()\ eksitasyon = X nm; Äemisyon = X nm) ile etiketlenmistir. Dogrusal PEI (11kDa ve 22kDa) Polyplus- Transfection'dan (lllkirch, Fransa) tedarik edilmis ve 300 mM nitrojen konsantrasyonuna sahip kullanima hazir bir çözelti halinde saglanmistir. Dallanmis bPEl25kd, SlGMA-Aldrich'ten (Saint Quentin, Fransa) satin alinmistir. Lutrol ln Cell Art'tan (Nantes, France) satin alinmistir. Dbait ve PEI çözeltileri (stok PEI), vektör/Dbait'in çesitli oranlarini elde etmek için % 10 Sükroz veya 150 mM NaCI (in vitro transfeksiyon deneyleri için) içinde seyreltilmistir. PEI/Dbait (veya N/P orani) orani, PEl için amin nitrojen ve Dbait için fosfat sayisina göre belirlenmistir. Tipik olarak, 0.6 mg/mL ve N/P 6'da ve istenen miktarda polimer çözeltisi (11,4 uL PEl stok çözeltisi 0.3 umol amin nitrojen içerir) seyreltilmistir. Superfect / Dbait partikülleri, üretici (Qiagen, Courtaboeuf, Fransa) talimatlarina göre, pg DNA basina 10 ul Superfect oraninda hazirlanmistir. Vektör/Dbait komplekslenmesi agaroz jel elektroforezi yöntemi ile analiz edilmistir. Numuneler (18 uL), bromofenol mavisi boyasi (1 uL) ile karistirilmis ve sonra TAE tamponu 1X (40mM Tris-asetat, pH içeren elektroforez haznesine % 1,5 agarozjeli üzerine yüklenmistir. Jel, 30 dakika boyunca 100 Volt'ta yürütülmüstür. Daha sonra jel 15 dakika etidyum bromür (EtBr) ile boyanmis ve bantlar UV isigi altinda gözlemlenmistir.
Hücre kültürü. Dbait molekülleri ve transfeksiyonu Dbait molekülleri. otomatik kati-fazoligonükleotit sentezi ile yapilmistir. Dizi 5'- TTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC (DIZI ID NO: 4)'dir ve burada H, bir heksaetilenglikol baglayicidir. Kültürdeki hücreler üzerindeki çalismalar, SV4O transforme edilmis fibroblast MRC-5 kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hücreler % 100 ug/mL/mL streptomisin ve 100 ug/mL penisilin) ile tam DMEM (Gibco, Cergy Pontoise, Fransa) içinde tek tabakali kültürlerde 37 °C'de büyütülmüstür. Aksi belirtilmedigi sürece transfeksiyonlar 60 mm çapindaki plakalarda serum içermeyen 1.2 mL MEM ortaminda gerçeklestirilmistir. JetPEl (Polyplus-transfeksiyon, lllkirch, Fransa) ile transfeksiyon, üreticinin talimatlarina göre 6 N/P oraninda gerçeklestirilmistir. Kisaca, Dbait 150 mM NaCl içinde seyreltilmis ve 150mM NaCI içinde esit hacimde PEI ile hafifçe karistirilmis ve serum içermeyen DMEM ortamina ilave edilmistir. CoDbait, serum olmaksizin DMEM ortamina dogrudan eklenmistir. Dbait moleküllerinin transfeksiyonu, 5 saat boyunca serumla (60 mm çapinda plakalarda) 1.2 mL DMEM ortaminda Superfect reaktifi ile gerçeklestirilmis ve ardindan aksi belirtilmedigi sürece hücreler 1 saat iyilesmeye birakilmistir. Elektroporasyon için, 1.2><1O6 hücre, 2 ng Dbait ile, Gene Pulser II (Bio-Rad, Marnes-Ia-Coquette, Fransa) kullanilarak transfekte edilmistir. 5 saat transfeksiyonun sonunda (zaman sifir), ortam tam ortam ile degistirilmis ve hücreler analiz edilmeden önce belirtilen zamana kadar büyütülmüstür.
Transfeksiyondan 30 dakika önce klorokin (50uM) eklenmistir.
Akis sitometrisi Hücreler, 5 saat boyunca farkli kompleks Dbait-cy3 ile transfekte edilmis ve 5 saat veya 24 saat büyümeye birakilmis, hizla PBS Hücreler ile yikanmis, akis sitometrisi ile dogrudan analiz edilmistir. Akis sitometrisi ile immünofloresan tespiti için, hücreler immüno tespitten önce 10 dakika süreyle % 2 paraformaldehid içinde sabitlenmistir.
Permeabilizasyon tedavisinin, ayni hücreler üzerinde immünofloresan tespiti ve Dbait tespitini bozan Dbaitlerin çogunu uzaklastirdigi unutulmamalidir. Hücreler % 4 formaldehit içinde 15 dakika sabitlenmis, 1 saat boyunca % 0.2 Triton X-100'de geçirgen hale getirilmis, % 2 BSA ile bloke edilmis ve anti y-H2AX (Upstate Biotechnology, Temecula, CA, ABD) fare monoklonal antikorlari ile buz üzerinde 2 saat sürece birincil antikor ile inkübe edilmis ve oda sicakliginda 30 dakika boyunca Red (Rockland, Gilbertsville, PA, ABD) ile konjuge edilmis sekonder antikorlar ile ortaya çikarilmistir. Hücreler PBS ile yikanmis ve 50 ug/mL Iyodid Propidyum, 25U/ml RNaseA ile PBS içinde yeniden süspanse edilmistir. Hücreler bir FACScalibur akis sitometresi (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ABD) ile analiz edilmis ve veriler BD CellQuest Pro (BD Biosciences) ve ücretsiz WinMDl 2.8 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, ABD) yazilimlari kullanilarak analiz edilmistir.
Zebra baligi yetistiriciligi, embriyo toplama ve tedavisi Zebra baligi yumurtalari, vahsi tip veya transgenik (ßactin: egfp-ras) balik soylarinin dogal yumurtlamalarindan elde edilmistir. Epifloresan aydinlatma (Leica MZ16F) ile diseksiyon osiloskobuna sabitlenen Narishige (MN 153) mikromanipülatör ve hava enjektörü (Eppendorf FemtoJet) 1K hücre evresinde Dbait enjeksiyonunu gerçeklestirmek için kullanilmistir. Cam kilcal borular (Harvard Apparatus GC100-10), enjeksiyon igneleri yapmak için bir KopF dikey pipet çekicisi (KopF 720) ile çekilmistir. 2 ila 5 nl Dbait çözeltisi, 10 nolu hücre döngüsündeki embriyolarin hayvan kutbuna enjekte edilmis ve hemen 40x / 0.8 NA su daldirma lensi objektifiyle konfokal lazer tarama mikroskobu görüntülemesi (dik Leica SP2) için islenmistir. Görüntüleme eszamanli uyarimi ile gerçeklestirilmistir. Embriyolar ayrica 28,5 °C'de 24 hpf'ye kadar büyütülmüstür. Bir günlük larvalar, diseksiyon duragi altinda gözlenmis ve fenotipler Sekil 3'te açiklandigi gibi kategorize edilmistir.
Enjeksiyon öncesi klorokin tedavisi 50 uM klorokin ile embriyo ortaminda (Zebra baligi Kitabi) 2 saat inkübasyondan olusmaktadir. Dbait (coDbait)-cy3 50 uM ya tek basina ya da PEI25K (oran N/P = 9), PEI11K (oran N/P = 6), Superfect (10 pl/1 ug Dbait) ile kombinasyon halinde enjekte edilmistir.
Farelerde Dbait ve lsinlama tedavileri SK28 veya U87G ksenogreft tümörleri, yetiskin disi çiplak farelerin (Charles River susu; L'arbresle, France) yan tarafina 106 tümor hücresi enjekte edilerek elde edilmistir. Hayvanlar, deneylere baslamadan önce en az bir hafta laboratuvarda barindirilmistir. Aydinlik ve karanlik döngüleri (12 saatz12 saat), agil nem (% 55) ve sicaklik (21° C) gibi kontrollü kosullar altinda kafes basina 5-6 hayvan mevcuttur.
Hayvanlarin yiyecek ve çesme suyuna sinirsiz ulasimi vardir. Yaklasik 12 gün sonra, subkütan tümörler 150-200 mm3 olarak ölçüldügünde, fareler farkli tedavileri almak üzere en fazla 12 homojen gruba ayrilmistir. lsinlama, hayvanin vücudunun yaklasik üçte ikisini korumak üzere tasarlanmis bir kalkanla birlikte, 137Cs'lik bir ünitede (0.5 Gy / dakika) gerçeklestirilmistir. Dozlar termolüminesans dozimetrisi ile kontrol edilmistir.
Iki hafta boyunca haftada 5 Gy'lik 3 seanslik araliklarla 6 seansta toplam 30 Gy doz verilmistir. Dbait molekülleri, in vitro çalismalarda daha önce tarif edildigi gibi 100 pL Strazburg, Fransa) olmaksizin gerçeklestirilmistir. Dbait karisimlari, enjeksiyondan önce 15 dakika oda sicakliginda inkübe edilmistir. CoDbait, istenen konsantrasyonda miktardaki Dbait'in intratümöral enjeksiyonlari gerçeklestirilmistir. Sahte tedavi uygulanmis hayvanlara, ilgili analizlerin protokolüne göre 100 uL % 10 glikoz enjekte edilmistir. Tümör boyutu, her üç günde bir kaliper ölçümleri ile degerlendirilmis ve boyut, (2 x uzunluk x genislik?) formülü ile hesaplanmistir. Fareler tartilmis ve her hafta tümörlerin resimleri çekilmistir. Etik nedenlerden dolayi, tümörler 2 000 mm3'ye ulastiginda hayvanlar kurban edilmistir. Hayatta kalma analizinde kullanilan bu son nokta ölüm günüdür. Hayvan Deneyleri Etik Kurulu Yerel Komitesi (Orsay, Fransa) tüm deneyleri onaylamistir.
Istatistiksel analiz Tüm tedavi ve her tümör tipi için tümör yanitinin tanimlayici analizleri yapilmistir. 1.
Gün, ilk tedavi seansinin yapildigi gündür. Bütün hayvanlar en az 150 gün boyunca takip edilmistir. Medyan ömür Kaplan-Meier yöntemine göre tahmin edilmistir. Tümör büyüme gecikmesi (TGD), kontrol grubunun ortalama tümör hacminin dört katina çikma süresinin, her tedavi edilen gruptaki münferit farelerin tümör hacminin dört katina çikma zamanlarindan çikarilmasiyla hesaplanmistir. Her bir tedavi grubu için bireysel ölçümler kullanilarak ortalama TGD hesaplanmistir. Genel sagkalim egrileri Kaplan-Meier tahminleri ile degerlendirilmis ve veri normal bir dagilimi takip etmedigi Için parametrik olmayan LogRank testi kullanilarak karsilastirilmistir. Analiz statEL yazilimi (ad Science, Paris, Fransa) kullanilarak yapilmistir. Ayni tümör tipine sahip her grup için ilk olarak bir LogRank gerçeklestirilmistir. Daha sonra, Dbait ile yapilan tedaviler, sahte tedavi edilen kontrol ile karsilastirilmistir. Hayvan sayisi (n), göreceli risk (RR) ve p degeri Tablo 2'de rapor edilmistir. Bütün testler 0.05 anlamlilik düzeyinde anlamli kabul edilmistir.
Formüle edilmis Dbait partiküllerinin fiziko-kimvasal özellikleri Vektör/Dbaitin parçacik boyutu Zetasizer nano serisinde (Malvern instruments, Paris, Fransa) dinamik isik saçilimi (DLS) ile belirlenmistir: ortalama viskozite: 1.150 cP, kirilma indisi: 1.45, dagilim açisi: 90°, sicaklik: 25 °C. Veriler numune basina 3-5 ölçümün ortalamasidir ve her ölçüm 10-15 alt denemenin ortalamasidir. Veriler, cihazla birlikte temin edilen çok modlu sayi dagitim yazilimi kullanilarak analiz edilmistir. Zeta-potansiyeli ölçümü için, parçaciklar, 0.1 mg/mL'Iik bir son Dbait konsantrasyonu verecek sekilde % 10 sükroz/1O mM NaCI içinde seyreltilmis ve asagidaki spesifikasyonlar ile ölçülmüstür: 3 ölçüm, ortalama viskozite: 1.054 cP, ortalama dielektrik sabiti: 79, sicaklik: 25 °C.
Katyonik Oran 3 4 Zeta C(mV) Pdl [C]maks(mg/mL) tedarikçi polimerler (agirlik/agirlik) Boyutb(nm) Superfect - >1000 - 1 nd Qiagen Poliplus Transfeksiyonu < Poliplus 0.2 Transfeksiyonu a Maksimum Dbait aktivitesinin gözlemlendigi agirlik orani Dinamik isik saçilimi ile belirlenen ortalama çap (+/- SD) (Bakiniz Materyal ve Yöntemler).
C Sükrozda Partiküller % 1, 10mM NaCI Transmisvon Elektron Mikroskopisi Numuneler, uranil asetat ile negatif boyama yoluyla transmisyon elektron mikroskobu için hazirlanmistir. Bir damla numune (10 uL) izgara üzerinde (200 mesh bakir, AGAR scientific üzerinde formvar/karbon) biriktirilmis ve fazla siviyi kurutma kagidiyla uzaklastirmadan önce 3 dakika bekletilmistir. Daha sonra kompleksler, 2 dakika boyunca 10 uL sulu uranil asetat (% 2) ile boyanmis ve fazlalik, kurutma kagidi ile uzaklastirilmistir. Gözlemler Jeol JEM-1OOS Elektron Mikroskobu ile gerçeklestirilmistir.
Referans Örnekler: Alternatif konjuge Dbait molekülleri Alternatif konjuge Dbait molekülleri hazirlanmis ve asagida tarif edilmistir: Formül (Ile)'nin konjuge molekülleri Bilesik C-Lm L' Ölçülen fosfoetanolamin-N- [4-(p-fenil-3-((6- fosfoheksiltiyo) -sukkinimido)) bütiramit]- Referans Örnekler: Formül (le)'nin konjuge molekülleri Bilesik C-Lm L' Ölçülen kütle trietilenglikol (3-(6-fosfoheksiltiyo) süksinimido))undekamid diheksilsülfür 2-(6-fosf0heksil) Bu alternatif konjuge Dbait moleküllerinin aktivitesi, yukarida ayrintilari verilen DNA PK inhibisyonu yoluyla ölçülmüstür (Sekil 7). Konjuge moleküllerin aktivitelerini sürdürdügü gözlenmistir. Özellikle, 5' ucunda veya döngüde çesitli lipitlerin ve Iigandin konjügasyonunun, bu moleküllerin DNA-PK aktivitesini tetikleme kapasitesi üzerinde küçük bir etkisi mevcuttur.
Buna ilaveten, bunlarin aktiviteleri, yukarida detaylandirildigi gibi H2AX fosforilasyon miktarinin belirlenmesiyle, klorokin ile veya klorokin olmaksizin hücre dizileri üzerinde de ölçülmüstür (Sekil 8). Ilk olarak, test edilmis konjuge Dbait molekülleri için, aktivitelerinin klorokin ile ön muamele ile daha yüksek oldugu gözlemlenmistir. Buna ilaveten, kolesterolün 5' ucuna konjugasyonunun sasirtici bir sekilde saç tokasi seklindeki ilmekteki kolesterolün konjügasyonundan daha etkili moleküllere yol Konjuge Dbait moleküllerinin hücresel alimi Dbait ile karsilastirildiginda kolesterole konjuge edilmis Dbait'in, özellikle de CoDbait'in hücresel alimi, mucitler tarafindan akis sitometrisi analizi ile ölçülmüstür.
Sonuçlar asagidaki tabloda verilmistir.
Transfeksiyon kosullari Medyan Ortalama Dbait-Cy3 79nM 3 3 Dbait-Cy3 79nM + Superfect 426 327 CoDbait-Cy3 79nM 10 10 CoDbait-Cy3 79nM + CQ 50uM 20 21 CoDbait-Cy3 986 nM 63 66 Transfeksiyon kosullari Medyan Ortalama Co_siRNA_H2AX-Cy3 79nM 53 56 Co_siRNA referans örnektir.
MRC5 hücre dizisinde hücresel alimin akis sitometrisi analizi, tabloda tarif edildigi gibi çesitli transfeksiyon kosullarinin tedavisinin baslamasindan 5 saat sonra gerçeklestirilmistir. Bütün oligonükleotidler siyanin 3 (Cy3) boyasi ile etiketlenmistir: Dbait (Dbait-Cy3), kolesterol-Dbait (0813) (CoDbait-Cy3) ve bir siyanin 3 ile H2AX'i hedefleyen siRNA ve sens sarmalinin 5' ve 3' ucunda bir kolesterol (Co_siRNA_H2AX: GAUUCGCGUCUUCUUGUUGTT-S' (DIZI ID NO: 7). Özellikle belirtildiginde, transfeksiyondan önce 50 uM klorokin (CQ) eklenmistir.
DIZI LISTESI <110> DNA Therapeutics Institut Curie <120> Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates (Nükleik asit konjugatlari için endosomolitik ajanlar ile optimize edilmis in vivo aktarim sistemi) <130> B105OPC <160> 7 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <21 1> 32 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> Dbait32 <400> 1 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> Dbait32Ha <400> 2 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> Dbait32Hb <400> 3 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> Dbait32Hc <400> 4 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> Dbait32Hd <400> 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> siRNA <400> 6 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence (suni dizi) <220> <223> SIRNA <400> 7

Claims (9)

ISTEMLER
1. Bir konjuge nükleik asit molekülü olup, özelligi; asagidaki formüle sahip olmasidir:
2. Bir konjuge nükleik asit molekülü olup, özelligi; asagidaki formüllerden birine sahip 5 olmasi: burada alti çizili nükleotidin bir fosforotiyoat veya metilfosfonat omurgasina sahip olan veya olmayan bir nükleotide karsilik gelmesi, baglantili L' ifadesinin heksaetilenglikol, tetradeoksitimidilat (T4) ve 2,19-bis (fosfor) -8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso- nonadekandan olusan gruptan seçilmesi; m`nin 1 olmasi, L'nin bir karboksamido oligoetilen glikol olmasi ve C'nin dioleoil, oktadesil, folik asit, tokoferol ve kolesterolden olusan gruptan seçilmesidir.
3. Istem 2'ye göre konjuge nükleik asit molekülü olup, özelligi; C'nin tokoferol ve kolesterolden olusan gruptan seçilmesidir.
4. Istem 2'ye göre konjuge nükleik asit molekülü olup, özelligi; molekülün asagidaki gibi olmasi: ve burada alti çizili nükleotidin bir fosforotiyoat omurgasina sahip olan bir nükleotidi ifade etmesidir.
5. Bir farmasötik kompozisyon olup, özelligi; istem 1, 2 ve 4'ten herhangi birine göre bir konjuge nükleik asit molekülü içermesidir.
6. Istem 5'e göre bir farmasötik kompozisyon olup, özelligi; sözü edilen kompozisyonun ayrica DNA'ya zarar veren bir anti-tümöral ajan ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içermesidir.
7. Eszamanli, ayri veya ardisik kullanim için kombine bir preparat olarak bit kit olup, özelligi; istem 2 ya da 4'e göre bir konjuge nükleik asit molekülü ve DNA'ya zarar veren bir anti-tümöral ajan içermesidir.
8. Istem 1, 2 ve 4'ten herhangi birine göre bir konjuge nükleik asit molekülü olup, özelligi; ihtiyaç duyan bir kiside kanserin tedavisi için kullanima yönelik olmasidir.
9. istem 8'e göre kullanim için konjuge nükleik asit molekülü olup, özelligi; radyoterapi veya kemoterapi ile birlikte, istege bagli olarak DNA'ya zarar veren antitümoral ajan ile birlikte kullanilmasidir.
TR2018/07294T 2010-06-22 2011-06-21 Nükleik asit konjugatları için endosomolitik ajanlar ile optimize edilmiş in vivo aktarım sistemi. TR201807294T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10166936 2010-06-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201807294T4 true TR201807294T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=42727428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/07294T TR201807294T4 (tr) 2010-06-22 2011-06-21 Nükleik asit konjugatları için endosomolitik ajanlar ile optimize edilmiş in vivo aktarım sistemi.

Country Status (20)

Country Link
US (5) US9205099B2 (tr)
EP (4) EP3372248B1 (tr)
JP (1) JP5860874B2 (tr)
CN (2) CN103025356B (tr)
AU (1) AU2011269041B2 (tr)
CA (1) CA2802463C (tr)
CY (1) CY1120560T1 (tr)
DK (2) DK3372248T3 (tr)
EA (2) EA032867B9 (tr)
ES (2) ES2784793T3 (tr)
HR (1) HRP20180934T1 (tr)
HU (1) HUE037926T2 (tr)
IL (2) IL223467A (tr)
LT (1) LT3135301T (tr)
PL (1) PL3135301T3 (tr)
PT (1) PT3135301T (tr)
RS (1) RS57439B1 (tr)
SI (1) SI3135301T1 (tr)
TR (1) TR201807294T4 (tr)
WO (1) WO2011161075A1 (tr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3372248B1 (en) * 2010-06-22 2020-03-11 Onxeo Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
EP2527440A1 (en) * 2011-05-27 2012-11-28 Institut Curie Cancer treatment by combining DNA molecules mimicking double strand breaks with hyperthermia
CN103550783A (zh) * 2013-04-27 2014-02-05 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法
CA2993270C (en) 2015-07-23 2019-07-16 Institut Curie Use of a combination of dbait molecule and parp inhibitors to treat cancer
WO2017053995A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
CN109069528B (zh) * 2016-03-01 2021-11-05 欧恩科斯欧公司 DBait分子在制备用于治疗三阴性乳腺癌的药物中的用途
WO2017186882A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Onxeo A method of predicting a response to an anti-tumor treatment by means of signal interfering dna molecules
CN117919431A (zh) 2016-12-01 2024-04-26 国立大学法人埼玉大学 药物递送系统用胞吞作用增强剂及其制备方法
EP3570814B1 (en) 2017-01-19 2023-11-29 Universiteit Gent Molecular adjuvants for enhanced cytosolic delivery of active agents
WO2018162439A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 Onxeo New predictive biomarker for the sensitivity to a treatment of cancer with a dbait molecule
WO2018175445A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Northwestern University Poly(lactic-co-glycolic acid) (plga) spherical nucleic acids
EP3461488A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 Onxeo Combination of a dbait molecule and a hdac inhibitor for treating cancer
EP3765613A1 (en) 2018-03-13 2021-01-20 Onxeo A dbait molecule against acquired resistance in the treatment of cancer
CA3114299A1 (en) * 2018-11-01 2020-05-07 Alpha Tau Medical Ltd. Intratumoral alpha-emitter radiation and activation of cytoplasmatic sensors for intracellular pathogen
MX2021007271A (es) * 2018-12-21 2021-07-15 Onxeo Nuevas moleculas de acido nucleico conjugado y sus usos.
MA55219A (fr) * 2019-03-06 2022-01-12 Generation Bio Co Nanoparticules lipidiques non actives avec adn dépourvu de capside, non viral
EP3942045A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Onxeo A dbait molecule in combination with kinase inhibitor for the treatment of cancer
WO2021148581A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Onxeo Novel dbait molecule and its use
TW202210633A (zh) 2020-06-05 2022-03-16 法商昂席歐公司 用於治療癌症之dbait分子與kras抑制劑的組合
AR122644A1 (es) 2020-06-19 2022-09-28 Onxeo Nuevas moléculas de ácido nucleico conjugado y sus usos
CN118660964A (zh) 2021-12-16 2024-09-17 瓦莱里奥治疗公司 新型缀合核酸分子及其用途
WO2024119101A1 (en) * 2022-12-01 2024-06-06 Yale University Stimuli-responsive traceless engineering platform for intracellular payload delivery

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0537299A1 (en) * 1990-03-29 1993-04-21 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates
US5843643A (en) * 1992-02-21 1998-12-01 Ratner; Paul L. Site-specific transfection of eukaryotic cells using polypeptide-linked recombinant nucleic acid
US5646042A (en) 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
DE4418965A1 (de) 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
EP0765313B1 (en) 1994-06-17 2003-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag N,n'-bis(quinolin-4-yl)-diamine derivatives, their preparation and their use as antimalarials
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
JP2002514892A (ja) * 1995-06-08 2002-05-21 コブラ セラピューティクス リミテッド 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
AUPN741696A0 (en) * 1996-01-05 1996-01-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of nucleic acids ii
EP1024836B1 (en) * 1997-09-15 2006-12-13 Genetic Immunity, LLC Compositions for delivering genes to antigen presenting cells of the skin
ATE427948T1 (de) 2001-04-24 2009-04-15 Purdue Research Foundation Folat-mimetika und deren folatrezeptorbindende konjugate
DE10310196A1 (de) 2003-03-06 2004-09-23 Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh Verwendung eines trizyklischen Antidepressivums zur Förderung der Endozytose
US7476729B2 (en) * 2003-10-24 2009-01-13 Institut Curie Dbait and uses thereof
EP1526177A1 (en) * 2003-10-24 2005-04-27 Institut Curie Nucleic acids useful for triggering tumor cell lethality
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
WO2007040469A2 (en) * 2005-09-15 2007-04-12 Kosak Ken M Chloroquine coupled compositions and methods for their synthesis
US20070293449A1 (en) 2006-06-20 2007-12-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for delivery of double-stranded rna
MX2009001207A (es) 2006-08-18 2009-02-11 Hoffmann La Roche Policonjugados para el suministro in vivo de polinucleotidos.
EP1944369A1 (en) * 2007-01-12 2008-07-16 The Centre National de la Recherche Scientifique Dbait and its standalone uses thereof
JPWO2009063998A1 (ja) * 2007-11-14 2011-03-31 株式会社リボミック 疎水性物質付加核酸及びその使用
JP5788312B2 (ja) 2008-04-11 2015-09-30 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達
EP2365796A4 (en) 2008-11-07 2015-04-29 Childrens Hosp Medical Center FUSOGENIC PROPERTIES OF SAPOSIN C AND RELATED PROTEINS AND PEPTIDES FOR APPLICATION TO TRANSMEMBRANE DRUG DELIVERY SYSTEMS
EP2355799A4 (en) 2008-11-17 2012-09-05 Enzon Pharmaceuticals Inc CLEANABLE FUSOGENIC LIPIDS FOR NUCLEIC ACID RELIEF SYSTEMS
EP3372248B1 (en) * 2010-06-22 2020-03-11 Onxeo Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
EP2527440A1 (en) * 2011-05-27 2012-11-28 Institut Curie Cancer treatment by combining DNA molecules mimicking double strand breaks with hyperthermia

Also Published As

Publication number Publication date
US10765758B2 (en) 2020-09-08
JP2013534521A (ja) 2013-09-05
PT3135301T (pt) 2018-07-16
EA201690782A1 (ru) 2016-08-31
CA2802463C (en) 2019-02-26
EP3689381A1 (en) 2020-08-05
EP3135301B1 (en) 2018-05-02
DK3135301T3 (en) 2018-06-25
EP2585113A1 (en) 2013-05-01
EA023927B1 (ru) 2016-07-29
PL3135301T3 (pl) 2018-11-30
EP3372248A1 (en) 2018-09-12
IL252241A0 (en) 2017-08-31
US9205099B2 (en) 2015-12-08
HRP20180934T1 (hr) 2018-10-05
AU2011269041A1 (en) 2013-01-31
US10363317B2 (en) 2019-07-30
EP3372248B1 (en) 2020-03-11
CN103025356A (zh) 2013-04-03
CN104788523A (zh) 2015-07-22
LT3135301T (lt) 2018-07-10
AU2011269041A2 (en) 2013-07-11
ES2674412T3 (es) 2018-06-29
DK3372248T3 (da) 2020-04-06
HUE037926T2 (hu) 2018-09-28
IL223467A (en) 2017-09-28
ES2784793T3 (es) 2020-09-30
US9428538B2 (en) 2016-08-30
CY1120560T1 (el) 2019-07-10
EA032867B1 (ru) 2019-07-31
US20160046662A1 (en) 2016-02-18
WO2011161075A1 (en) 2011-12-29
US20170298089A1 (en) 2017-10-19
US20190314511A1 (en) 2019-10-17
CN103025356B (zh) 2015-02-18
US20130131155A1 (en) 2013-05-23
CA2802463A1 (en) 2011-12-29
US9687557B2 (en) 2017-06-27
RS57439B1 (sr) 2018-09-28
AU2011269041B2 (en) 2015-05-07
EA032867B9 (ru) 2020-01-22
EP3135301A1 (en) 2017-03-01
CN104788523B (zh) 2017-09-08
EA201300039A1 (ru) 2013-05-30
US20160339107A1 (en) 2016-11-24
JP5860874B2 (ja) 2016-02-16
SI3135301T1 (en) 2018-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201807294T4 (tr) Nükleik asit konjugatları için endosomolitik ajanlar ile optimize edilmiş in vivo aktarım sistemi.
US20210023116A1 (en) Treatment of cancer by systemic administration of dbait molecules
Tortora et al. Oral antisense that targets protein kinase A cooperates with taxol and inhibits tumor growth, angiogenesis, and growth factor production
Cruickshanks et al. Lapatinib and obatoclax kill tumor cells through blockade of ERBB1/3/4 and through inhibition of BCL-XL and MCL-1
Kyrgidis et al. Better targeting melanoma: options beyond surgery and conventional chemotherapy
AU2015202211B2 (en) Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates