JP2013534521A - 核酸コンジュゲートのためのエンドソーム溶解剤を用いた最適化ｉｎｖｉｖｏ送達システム - Google Patents

Abstract

本発明は、エンドサイトーシスを促進する分子にコンジュゲーションされた治療関心対象の核酸のための、特にガンの処置における使用のためのエンドソーム溶解剤を用いた最適化ｉｎ ｖｉｖｏ送達システムに関する。

Description

本発明は、医療、特に腫瘍学の分野に関する。

ガン処置は、主に、可能な場合は手術、化学療法などの細胞毒性剤及び放射線療法からなる。細胞膜レセプターをターゲティングするモノクローナル抗体、チロシンキナーゼレセプター又は細胞の増殖、死及び生存に関与するシグナル伝達をターゲティングする他のキナーゼの阻害剤などのガン処置の分子治療は、過去１０年間に登場した。細胞増殖抑制剤のように、それらの単剤療法レジメンは、十分な臨床的利点がないことが多い。細胞毒性剤との組み合わせによって相乗的な結果が得られることが多いが、それらの累積的副作用によって制限されている。

ほとんどのガン処置は、処置した増殖腫瘍細胞において、ＤＮＡ損傷を直接的又は間接的に引き起こし、これが、最終的にはそれらの死をもたらす。しかしながら、これらの処置に対する腫瘍の内因性耐性及び獲得耐性のいくつかは、少なくとも部分的には、腫瘍細胞の効率的なＤＮＡ修復活性が原因である。ＤＮＡ修復は、ガン治療の重要なターゲットであることが、現在ではよく認識されている（Helleday et al. Nat. Rev. Cancer, 2008, 8:193-204）。この分野における先進薬物開発のほとんどは、ＰＡＲＰの阻害剤である。

ＤＮＡ修復は、すべての生物界を通じて不可欠な生存プロセスであるので、複数の特殊な修復経路を有しており、ある経路が不完全であるか、又はＤＮＡ修復阻害剤などの治療剤によって遮断された場合に、このプロセスをロバストにする余剰性がいくらかある。従って、その生物学的重要性及び臨床的関連性が何であれ、ＤＮＡ修復プロセスに関与する重要な遺伝子／タンパク質をターゲティングする代わりに、革新的な分子治療は、最も効率的なガン処置になるように、従来の治療と併用して、１又はいくつかの重要な経路をグローバルターゲットとして扱わなければならない。

既存の処置に対するガンの防御を無効にするために、ＤＮＡ損傷、感知、シグナル及び修復経路をグローバルにターゲティングすることが考えられた。ある戦略は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を模倣する短い改変ＤＮＡ分子（Ｄｂａｉｔと名付けられた）を、それまではＤＳＢを効率的に修復して生存する細胞に導入することから構成される。放射線療法（ＲＴ）又は化学療法（ＣＴ）と併せたＤｂａｉｔの抗腫瘍効果は、Ｄｂａｉｔ分子が、開始ＤＳＢ感知複合体を捕捉し、下流の修復シグナル伝達を妨害し、続いて、すべてのＤＳＢ修復系（非相同末端結合及び相同的組換え経路の両方）を壊し、最終的に、ＤＳＢ修復を阻害するという事実によって説明される（WO2005/040378; WO2008/034866; Quanz et al, 2009, Clinical Cancer Research 15:1308 ; Quanz et al, 2009, PLoS ONE 4:e6298; Dutreix et al, 2010, Mut. Res. 704:182）。最終的には、ガン細胞は、死からもはや逃れることができない。Ｄｂａｉｔ分子は、放射線療法（ＲＴ）又は化学療法（ＣＴ）と組み合わせずに、単独で効果的であることもわかっている（WO2008/084087）。

しかしながら、臨床関心対象の活性薬剤が同定されるとすぐに、活性薬剤、特に核酸薬剤を送達するための最良の方法を見つけるという問題が再発する。効率的な非ウイルス性ＤＮＡ／ＲＮＡ送達システムの開発及び最適化は、毒性の問題、分解などの組織的及び全身的なバリア、荷電した血清成分による粒子のオプソニン化、急速な消失及び非ターゲット組織における蓄積、活性物質が全身経路によって投与される場合はそれらの送達に対する「細胞のバリア」（例えば、細胞膜を通じた取り込みが低いこと）、活性細胞内区画におけるＤＮＡ分子の不十分な放出、並びに、核ターゲティングの欠如（遺伝子治療に必要とされる）を解決しなければならない。

実際、これらの活性薬剤のほとんどは、有効であるためには、細胞によって取り込まれて、細胞質及び／又は核に到達しなければならない。特に、核酸を含む活性薬剤は、「遊離」又はネイキッドな形態で投与される場合、ターゲット細胞によって取り込まれる前後の分解に悩まされることが多い。細胞内では、この分解は、エンドサイトーシスによって細胞に入る核酸が、細胞エンドソーム（これは、最終的には、化学及び酵素分解が非常に効率的な場所であるリソソームへと発達する）に隔離されるという事実が主な原因である。

従来技術では、活性薬剤は、様々な担体にコンジュゲーションされ、リポソーム、ミセル及びナノパーティクルにカプセル化されており、血清中における分解から保護されている。従来技術は、核酸及び他の活性薬剤と分子担体（これは、デキストラン若しくはＰＥＧなどのポリマー、又は、クリアランスを減少させることを目的とする分子、トランスフェリンを含む担体、細胞取り込みを高めるためにｓｉＲＮＡに連結されたコレステロールなどの脂溶性分子を含む）の共有結合に関する様々な化学も使用している（Chen et al., 2010, J. Controlled Release 144:227）。このような担体は、抗体、ポリペプチド、核酸及び、活性薬剤を選択されたターゲット細胞に案内する他の物質などのターゲティング部分を含み得る。従来技術は、医薬組成物における使用のための、エンドサイトーシスを向上させる分子も開示している（US2008/0194540）。

しかしながら、活性ＤＮＡ／ＲＮＡ薬剤は、エンドサイトーシスプロセスを通じて細胞によって取り込まれる場合、最終的にはエンドソーム中に隔離されて、エスケープできないことが多いため、それらの治療的潜在力は大きく減少する。例えば、Zimmermannらは、マウスにおいて、コレステロール−ｓｉＲＮＡ（ＡｐｏＢ−１）コンジュゲートがそのリポソーム製剤（ＳＮＡＬＰベクター）よりも約１０００倍弱いことを示した：１００mg/kgのｃｈｏｌ−ｓｉＡｐｏＢ−１は、０．１mg/kgのＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢ−１と同等である（Zimmermann et al. Nature, 2006, 441:111-114, supplementary figure 1）。

核酸に関して、従来技術は、カチオン性ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（WO96/02655））又は融合脂質若しくはペプチドを有するリポソーム（例えば、ＳＮＡＬＰベクター）の使用によって、この問題を解決しようとした。ＰＥＩは、よく説明されているプロトンスポンジ効果によって、エンドソームを不安定化できるため、核酸の放出を促進できる。しかしながら、ＰＥＩの使用は、その細胞毒性によって制限されることが多く、今のところ、ヒトで使用することは承認されていない。リポソーム製剤も毒性を示すので、核酸のカプセル化は制限されており（通常、１〜２mg/mLの範囲）、高ペイロードの核酸薬剤を必要とする用途には好適ではないかもしれない。

クロロキンなどの「エンドソーム溶解」剤は、培養細胞において、核酸がエンドソームから細胞質にエスケープするのを促進することによって、核酸のトランスフェクションを高めることが公知である。しかしながら、クロロキンの使用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける使用に制限されており、ｉｎ ｖｉｖｏにおける核酸送達を支援することに関しては、あまり評価されていない。これは、核酸の分野における報告が、クロロキンの毒性を理由に、そのｉｎ ｖｉｖｏにおける使用を敬遠する教示をしていることが原因かもしれない。

Benns, et al (2000, Bioconj. Chem. 11: 637)は、「クロロキンは、細胞質へのプラスミドＤＮＡの放出に役立つことが証明されたが、毒性であるため、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用できないことがわかった」と報告した。この問題は、部分的には、エンドソームにおいて、核酸（すなわち、プラスミドＤＮＡ）と同じ部位に到達するには、比較的高濃度の遊離クロロキンが必要であるという事実が原因である。同様に、Zhang et al (2003, J Gene Med 5:209)は、肝臓への遺伝子送達のためのクロロキンのｉｎ ｖｉｖｏ使用を研究した。この論文において、Zhangらは、ペプチド（ポリリシン／モロシン）と共にプラスミドをＤＮＡベクターとして使用した。Zhangらは、クロロキンは、肝臓への遺伝子送達を促進するのに効果的であるにもかかわらず、複数投与が必要であり、その使用は全身毒性によって制限されるという結論を出した。実際、Zhangらは、急性全身クロロキン毒性が、ｉｎ ｖｉｖｏ使用を、最適な遺伝子送達に必要なレベルよりも大幅に低いレベルに制限することを実証した。クロロキンの局所送達も、クロロキンの局所毒性、及び、送達部位からそれらが拡散することによって制限される。最後に、Zhangらは、ネイキッドなＤＮＡを使用する場合の遺伝子送達は観察しなかった又は非常に低いレベルを観察した。

この文脈において、WO2007/040469は、高濃度のクロロキンが必要であるという問題に対する解決手段が、クロロキンと活性薬剤を共有結合させ、それにより全体的な必要投与量を減少させることによって解決される可能性を開示している。WO2009/126933は、送達する核酸を、エンドソーム溶解剤及びターゲティングリガンドの両方に共有結合させることを提案している。

クロロキン及びその誘導体（例えば、ヒドロキシクロロキン）は、マラリアの治療及び予防処置において使用されている。それは、ガンの放射線療法及び／又は化学療法との併用に関しても研究されている（Sotelo et al., 2006, Ann Intern Med 144:337-342; NCT01023477 and NCT00969306）。クロロキン／ヒドロキシクロロキンは、治療剤をそれらが分解されるリソソームに輸送することによって、正常細胞の防御プロセスである自食作用を阻害するという仮説がある。

結論として、核酸に基づく治療の最適化は、合成ＤＮＡ送達システムの効率及び細胞毒性についてさらに取り組むことを必要とする。

本発明は、治療関心対象の核酸とエンドサイトーシスを促進する分子との共有結合に基づく、治療関心対象の核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達のための新たな効率的方法、及び、エンドソーム溶解剤と組み合わせた治療関心対象のコンジュゲート核酸の使用を提供する。特に、このｉｎ ｖｉｖｏ送達システムは、Ｄｂａｉｔ分子に使用される。

従って、本発明は、少なくとも１つの自由末端と、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子と６０％未満の配列同一性を有する２０〜２００ｂｐのＤＮＡ二本鎖部分とを有するコンジュゲート核酸分子及びキノリンエンドソーム溶解剤を含む、医薬組成物であって、脂溶性分子又は細胞レセプターをターゲティングしてレセプター介在性エンドサイトーシスを可能にするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子に前記核酸分子が共有結合している、医薬組成物に関する。医薬組成物は、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤をさらに含み得る。

また、本発明は、少なくとも１つの自由末端と、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子と６０％未満の配列同一性を有する２０〜２００ｂｐのＤＮＡ二本鎖部分とを有するコンジュゲート核酸分子及びキノリンエンドソーム溶解剤を含む、同時、個別又は逐次使用のための複合調製物としての製品であって、脂溶性分子又は細胞レセプターをターゲティングしてレセプター介在性エンドサイトーシスを可能にするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子に前記核酸分子が共有結合している、製品に関する。製品は、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤をさらに含み得る。好ましくは、キノリンエンドソーム溶解剤は、コンジュゲート核酸分子の前及び／又は同時に投与される。特に、キノリンエンドソーム溶解剤は、少なくとも１週間の前処置として経口経路により投与され、次いで、コンジュゲート核酸分子及びキノリンエンドソーム溶解剤は、同時、個別又は逐次使用のための複合調製物として投与される。

本発明は、ガンの処置における使用のための、本明細書において開示される医薬組成物又は製品に関する。好ましくは、処置は、放射線療法又は、好ましくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による化学療法をさらに含む。場合により、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤は、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤及び有糸分裂紡錘体の阻害剤からなる群より選択される。

好ましい実施態様では、キノリンエンドソーム溶解剤は、クロロキン又はヒドロキシクロロキン、好ましくはクロロキンである。

好ましい実施態様では、エンドサイトーシスを促進する分子は、単鎖又は二本鎖脂肪酸（例えば、オクトデシル及びジオレオイル）、トコフェロール、葉酸塩又は葉酸、コレステロール、糖（例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそれらのオリゴ糖）、ペプチド（例えば、ＲＧＤ及びボンベシン）及びタンパク質（例えば、インテグリン）、からなる群より選択され、好ましくは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸塩及びコレステロールからなる群より選択され、より好ましくは、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸及びコレステロールからなる群より選択され、さらにより好ましくは、コレステロールである。

好ましい実施態様では、コンジュゲート核酸分子は、下記式：

（式中、Ｎは、ヌクレオチドであり、ｎは、１５〜１９５の整数であり、下線部のＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するか、又は有しないヌクレオチドを指し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、エンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１の整数である）の１つを有する。好ましくは、下線部のＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドを指す。好ましくは、連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ（ｈｙｄｒａｚａ）−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され；及び／又はｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコールであり；及び／又はＣは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸塩及びコレステロールからなる群より選択される。より好ましくは、連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され；及びｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコールであり；及びＣは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、トコフェロール、葉酸塩又は葉酸、コレステロール、糖（例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそれらのオリゴ糖）、ペプチド（例えば、ＲＧＤ及びボンベシン）及びタンパク質（例えば、インテグリン）からなる群より選択され、好ましくは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸塩及びコレステロールからなる群より選択される。より好ましくは、Ｃは、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸及びコレステロールからなる群より選択される。さらにより好ましくは、Ｃは、コレステロールである。

より特定の実施態様では、コンジュゲート核酸分子は、下記式：

（式中、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格を有するか、又は有しないヌクレオチドを指し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、エンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１の整数である）の１つを有する。好ましくは、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格を有するヌクレオチドを指す。好ましくは、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドを指し；及び／又は連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され；及び／又はｍは、１であり、Ｌは、オリゴエチレングリコール、好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコール、カルボキサミドテトラエチレングリコール、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、より好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコールであり；及び／又はＣは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、トコフェロール、葉酸塩又は葉酸、コレステロール、糖（例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそれらのオリゴ糖）、ペプチド（例えば、ＲＧＤ及びボンベシン）及びタンパク質（例えば、インテグリン）からなる群より選択され、好ましくは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸塩及びコレステロールからなる群より選択される。より好ましくは、連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され；及びｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドポリエチレングリコール、好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコールであり；及びＣは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸塩及びコレステロールからなる群より選択される。より好ましくは、Ｃは、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸及びコレステロールからなる群より選択される。さらにより好ましくは、Ｃは、コレステロールである。

非常に具体的な実施態様では、コンジュゲート核酸分子は、

（式中、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドを指す）である。

製剤化Ｄｂａｉｔの細胞取り込み。（Ａ）ＰＥＩ１１ｋとのＤｂａｉｔ複合体の顕微鏡分析（ａ）。（Ｂ）様々なトランスフェクション条件の処置の開始後５時間に、細胞取り込みのフローサイトメトリー分析を実施した。superfectありの場合のＤｂａｉｔ−ｃｙ３、トランスフェクション前のクロロキン処置なし又はありの場合の２μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ−ｃｙ３、ＣＱなし又はありの場合の２５μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ−ｃｙ３。 製剤化Ｄｂａｉｔの細胞取り込み。（Ａ）ＰＥＩ１１ｋとのＤｂａｉｔ複合体の顕微鏡分析（ａ）。（Ｂ）様々なトランスフェクション条件の処置の開始後５時間に、細胞取り込みのフローサイトメトリー分析を実施した。superfectありの場合のＤｂａｉｔ−ｃｙ３、トランスフェクション前のクロロキン処置なし又はありの場合の２μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ−ｃｙ３、ＣＱなし又はありの場合の２５μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ−ｃｙ３。 製剤化Ｄｂａｉｔの活性。（Ａ）５０ｕの精製酵素複合体をＤＮＡなし、０．２５μg Ｄｂａｉｔ又は０．２５μg ｃｏＤｂａｉｔに添加した後に、ＤＮＡ−ＰＫ活性化を測定した。（Ｂ）１．６μg/ml Ｄｂａｉｔ（左）、１．６μg/ml Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ１１Ｋ（中央）、１６μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ＋ＣＱによる処置後２４時間の細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸの免疫検出。スケールバー：２０μm。（Ｃ）様々な製剤化Ｄｂａｉｔによる処置後５時間（黒色）及び２４時間（灰色）のγ−Ｈ２ＡＸの定量化。１．６μg/mL Ｄｂａｉｔ又は１６μg/mL ｃｏＤｂａｉｔを用いて、すべてのトランスフェクションを実施した。示されている場合は、トランスフェクション前に、ＣＱを添加した。 製剤化Ｄｂａｉｔの活性。（Ａ）５０ｕの精製酵素複合体をＤＮＡなし、０．２５μg Ｄｂａｉｔ又は０．２５μg ｃｏＤｂａｉｔに添加した後に、ＤＮＡ−ＰＫ活性化を測定した。（Ｂ）１．６μg/ml Ｄｂａｉｔ（左）、１．６μg/ml Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ１１Ｋ（中央）、１６μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ＋ＣＱによる処置後２４時間の細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸの免疫検出。スケールバー：２０μm。（Ｃ）様々な製剤化Ｄｂａｉｔによる処置後５時間（黒色）及び２４時間（灰色）のγ−Ｈ２ＡＸの定量化。１．６μg/mL Ｄｂａｉｔ又は１６μg/mL ｃｏＤｂａｉｔを用いて、すべてのトランスフェクションを実施した。示されている場合は、トランスフェクション前に、ＣＱを添加した。 製剤化Ｄｂａｉｔの活性。（Ａ）５０ｕの精製酵素複合体をＤＮＡなし、０．２５μg Ｄｂａｉｔ又は０．２５μg ｃｏＤｂａｉｔに添加した後に、ＤＮＡ−ＰＫ活性化を測定した。（Ｂ）１．６μg/ml Ｄｂａｉｔ（左）、１．６μg/ml Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ１１Ｋ（中央）、１６μg/ml ｃｏＤｂａｉｔ＋ＣＱによる処置後２４時間の細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸの免疫検出。スケールバー：２０μm。（Ｃ）様々な製剤化Ｄｂａｉｔによる処置後５時間（黒色）及び２４時間（灰色）のγ−Ｈ２ＡＸの定量化。１．６μg/mL Ｄｂａｉｔ又は１６μg/mL ｃｏＤｂａｉｔを用いて、すべてのトランスフェクションを実施した。示されている場合は、トランスフェクション前に、ＣＱを添加した。 １Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の細胞外空間にＤｂａｉｔを注射した後２４時間の表現型。（Ａ〜Ｃ）１Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の動物極にＤｂａｉｔ−ｃｙ３＋ＰＥＩを注射（２〜５nL）した後２４時間のゼブラフィッシュ胚の左側前方の側面図：上側のパネル、明視野の図；下側のパネル、赤色Ｄｂａｉｔ−ｃｙ３の落射蛍光オーバーレイ表示による頭部領域の２ｘ倍率。（Ａ）タイプ１、未注射（図示せず）と区別不能の表現型。（Ｂ）タイプ２、大規模な細胞死が頭部領域にあるマイルドな表現型。（Ｃ）タイプ３、強い奇形発生及び広範な細胞死。（Ｄ）アジュバントに依存する３つの表現型クラスの割合を示すヒストグラム。各病状に関して、１００個を超える胚を分析した。ＮＡ：Ｄｂａｉｔ注射単独；Ｓｕｐ：Superfect；対応するサイズの２５ｋ、２２ｋ、１１ｋＰＥＩ；ｃｈｌｏｒｏ：クロロキン；Ｌｕｔ：Lutrol。 １Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の細胞外空間にＤｂａｉｔを注射した後２４時間の表現型。（Ａ〜Ｃ）１Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の動物極にＤｂａｉｔ−ｃｙ３＋ＰＥＩを注射（２〜５nL）した後２４時間のゼブラフィッシュ胚の左側前方の側面図：上側のパネル、明視野の図；下側のパネル、赤色Ｄｂａｉｔ−ｃｙ３の落射蛍光オーバーレイ表示による頭部領域の２ｘ倍率。（Ａ）タイプ１、未注射（図示せず）と区別不能の表現型。（Ｂ）タイプ２、大規模な細胞死が頭部領域にあるマイルドな表現型。（Ｃ）タイプ３、強い奇形発生及び広範な細胞死。（Ｄ）アジュバントに依存する３つの表現型クラスの割合を示すヒストグラム。各病状に関して、１００個を超える胚を分析した。ＮＡ：Ｄｂａｉｔ注射単独；Ｓｕｐ：Superfect；対応するサイズの２５ｋ、２２ｋ、１１ｋＰＥＩ；ｃｈｌｏｒｏ：クロロキン；Ｌｕｔ：Lutrol。 １Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の細胞外空間にＤｂａｉｔを注射した後２４時間の表現型。（Ａ〜Ｃ）１Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の動物極にＤｂａｉｔ−ｃｙ３＋ＰＥＩを注射（２〜５nL）した後２４時間のゼブラフィッシュ胚の左側前方の側面図：上側のパネル、明視野の図；下側のパネル、赤色Ｄｂａｉｔ−ｃｙ３の落射蛍光オーバーレイ表示による頭部領域の２ｘ倍率。（Ａ）タイプ１、未注射（図示せず）と区別不能の表現型。（Ｂ）タイプ２、大規模な細胞死が頭部領域にあるマイルドな表現型。（Ｃ）タイプ３、強い奇形発生及び広範な細胞死。（Ｄ）アジュバントに依存する３つの表現型クラスの割合を示すヒストグラム。各病状に関して、１００個を超える胚を分析した。ＮＡ：Ｄｂａｉｔ注射単独；Ｓｕｐ：Superfect；対応するサイズの２５ｋ、２２ｋ、１１ｋＰＥＩ；ｃｈｌｏｒｏ：クロロキン；Ｌｕｔ：Lutrol。 １Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の細胞外空間にＤｂａｉｔを注射した後２４時間の表現型。（Ａ〜Ｃ）１Ｋ細胞期ゼブラフィッシュ胚の動物極にＤｂａｉｔ−ｃｙ３＋ＰＥＩを注射（２〜５nL）した後２４時間のゼブラフィッシュ胚の左側前方の側面図：上側のパネル、明視野の図；下側のパネル、赤色Ｄｂａｉｔ−ｃｙ３の落射蛍光オーバーレイ表示による頭部領域の２ｘ倍率。（Ａ）タイプ１、未注射（図示せず）と区別不能の表現型。（Ｂ）タイプ２、大規模な細胞死が頭部領域にあるマイルドな表現型。（Ｃ）タイプ３、強い奇形発生及び広範な細胞死。（Ｄ）アジュバントに依存する３つの表現型クラスの割合を示すヒストグラム。各病状に関して、１００個を超える胚を分析した。ＮＡ：Ｄｂａｉｔ注射単独；Ｓｕｐ：Superfect；対応するサイズの２５ｋ、２２ｋ、１１ｋＰＥＩ；ｃｈｌｏｒｏ：クロロキン；Ｌｕｔ：Lutrol。 腫瘍における拡散及び活性。１．６μg Ｄｂａｉｔ−ｃｙ５．５／ＰＥＩ又は１６μg ｃｏＤｂａｉｔ−ｃｙ５．５（同様の蛍光強度を維持するための１／１０のｃｙ５．５ラベル化ｃｄＤｂａｉｔ＋９／１０非ラベル化ｃｏＤｂａｉｔ）を腫瘍に注射し、翌日に、蛍光分布及びＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性に関して分析した。２種類の注射（腫瘍内注射１回又は皮下注射２回）後の蛍光Ｄｂａｉｔの拡散。 ＳＫ２８メラノーマ異種移植片を有するヌードマウスの５つのグループの生存：１）未処置（ｎ＝１６）；２）放射線照射（ＩＲ、ｎ＝１２）；３）１mgのクロロキンの腹腔内注射と放射線照射（ＣＱ、ＩＲ、ｎ＝＝１０）；４）０．６mgのＤＴ０１（ＣｏＤｂａｉｔとも称される）の腫瘍内注射と、５時間後の放射線照射による処置（ＤＴ０１、ＩＲ、ｎ＝１１）；及び５）０．６mgのＤＴ０１（ＣｏＤｂａｉｔとも称される）を腫瘍内注射する２時間前の１mgのクロロキンの腹腔内注射による前処置と、５時間後の放射線照射（ＤＴ０１、ＣＱ、ＩＲ、ｎ＝１３）。 ヌードマウスに移植したメラノーマＳＫ２８の腫瘍成長の研究。上側：処置プロトコール：２週間で放射線照射（ＲＴ）セッション４回と組み合わせたＤＴ０１（ＣｏＤｂａｉｔとも称される）処置４回。４mgのＤＴ０１を、腫瘍の境界から５mm離れた２つの対点に皮下注射した。処置開始前及びＤＴ０１＋ＲＴ処置中に、動物を、１mgのクロロキン（ＣＱ）で経口投与により週２回前処置した（ｐ．ｏ．）^＊。中央：様々な動物グループの腫瘍成長の平均値：未処置又はＣＱ：未処置又はＣＱによる処置のみ（ｎ＝１１）；ＲＴ又はＣＱ＋ＲＴ：クロロキンの同時処置あり又はなしの場合の放射線照射（ｎ＝１６）；ＤＴ０１＋ＲＴ：ＤＴ０１及び放射線照射による処置（ｎ１０）；ＤＴ０１＋ＣＱ＋ＲＴ：クロロキン及び放射線照射とＤＴ０１による処置（ｎ＝１２）。下側：グループＤＴ０１＋ＲＴ及びＤＴ０１＋ＣＱ＋ＲＴの詳細。各曲線は、１つの腫瘍成長に対応する。 kit SignaTECT DNA-dependent Protein Kinase Assay System (Promega, Madison, WI, USA)を使用して、ＤＮＡ−ＰＫ活性をモニタリングした。製造業者の説明書に従って、ビオチン化ペプチド基質、５０単位のＤＮＡ−ＰＫ（Promega, Madison, WI, USA）及び５００nMの様々なＤｂａｉｔ分子を、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰと共に３０℃で５分間インキュベーションした。ビオチン化基質を、ストレプトアビジン膜上に捕捉し、洗浄し、シンチレーションカウンターにおいてカウントした。結合放射能を１サンプルあたりの（γ−^３２Ｐ）ＡＴＰの総カウントで割ることによって、リン酸化のパーセンテージを算出した。Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃは、非コンジュゲートＤｂａｉｔ分子である。０８１３、０８１５、０９０２、０９０３、０９０４及び０９０５は、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子である（「別のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子」の表を参照）。Ｄｂａｉｔ８Ｈは、ＤＮＡ−ＰＫ活性のネガティブコントロールとして使用した短い（８−ｂｐ）Ｄｂａｉｔである。 Ｈ２ＡＸリン酸化によって測定したＤｂａｉｔ分子の活性。５０μMのクロロキンの前処置あり又はなしで、様々なコンジュゲートＤｂａｉｔ分子（「別のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子」の表を参照）をトランスフェクションした後２４時間のＭＲＣ５細胞株におけるγ−Ｈ２ＡＸの免疫検出。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で製剤化したＤｂａｉｔをポジティブコントロールとして使用した。

発明の詳細な説明
ＤＮＡ小分子（Ｄｂａｉｔ）の導入は、損傷した染色体のＤＮＡ修復を阻害し、腫瘍、特に耐性腫瘍における放射線療法又は化学療法の効率を高めるための効率的方法を提供する。しかしながら、Ｄｂａｉｔ分子の増感活性は、腫瘍細胞内におけるそれらの送達効率に依存する。

従って、本発明者らは、この重要な工程を改善するための異なる戦略を比較した。この戦略を試験するために、本発明者らは、アッセイのパイプラインを開発した：（ｉ）Ｄｂａｉｔ分子と形成された複合体の分子分析、（ｉｉ）Ｄｂａｉｔ取り込み及び活性に関する細胞試験、（ｉｉｉ）製剤化した分子のｉｎ ｖｉｖｏ分布及び生物学的活性に関する、生きているゼブラフィッシュ胚の共焦点顕微鏡モニタリングこれらの試験により、マウスにおける異種移植腫瘍でのアッセイ前に、最も効率的な製剤及び投与プロトコールの選択が可能となった。２つのクラスの製剤を比較した：直鎖状又は分岐状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むポリカチオン性ポリマー、及び、Ｄｂａｉｔが共有結合したコレステロール（ｃｏＤｂａｉｔ）。直鎖状ＰＥＩ複合体は、Ｄｂａｉｔのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに最も効率的であったが、高い毒性を示した。実際、異種移植メラノーマにおいて、ＰＥＩと製剤化した場合のＤｂａｉｔと同じ抗腫瘍効果を観察するのに、クロロキン１mg（これは、相対成長換算によれば、ヒトで使用される予防用量に等しい）と共に使用したｃｏＤｂａｉｔは、１０倍多い用量が必要であった。しかしながら、クロロキンと共に投与したｃｏＤｂａｉｔの試験用量は、非毒性であることがわかった。

従って、本発明は、顕著な毒性を伴わない、臨床関連用量で全身投与されたクロロキンとコレステロール−核酸コンジュゲートの組み合わせ及び投与プロトコール、特に、予防用量のクロロキン（動物への相対成長換算による）とのコレステロール−Ｄｂａｉｔコンジュゲートの使用を説明する。本発明者らは、従来技術に記載されているクロロキン非使用の１０００倍に代えて、非ウイルスベクター系によってベクター化された１ｘＤｂａｉｔと比較して、１０倍多い用量（１０ｘ）のコレステロール−Ｄｂａｉｔが、マウスにおいて類似の効力を有することを示した。これにより、脂溶性薬剤又は細胞ターゲティング剤への治療核酸のコンジュゲーションが、安全かつ経済的に使用可能な送達システムとなる。

従って、高用量のｃｏＤｂａｉｔが必要であるにもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、以下を見出した：
１）ｃｏＤｂａｉｔとクロロキンの組み合わせは、もしあったとしても、低い毒性をｉｎ ｖｉｖｏで示す。それにより、治療指数（有効用量／毒性用量の比率）を、ほぼ１（Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩの場合）から２０超（ｃｏＤｂａｉｔの場合）に改善できる；毒性がないことが、マウス、ラット、ウサギ及びサルにおける静脈内注射、皮下注射後に、そして脳内注射後にさえ認められた；
２）ｃｏＤｂａｉｔとクロロキンの組み合わせは、ＤＮＡ−ＰＫ（Ｄｂａｉｔの主なターゲット）の持続的な遅延活性化をもたらし、治療効果を延長させる。より具体的には、活性又は効果の増加は、この期間を通じて認められる；
３）驚くべきことに、ｃｏＤｂａｉｔは、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩと比較して、腫瘍／組織においてよく拡散される。
４）本発明者らは、クロロキンがｃｏＤｂａｉｔの細胞取り込みを増加させるのに対して、コレステロールをｓｉＲＮＡ分子にコンジュゲーションさせた場合、この効果はあまりはっきりしないことを初めて観察した。

これらの観察結果に基づいて、本発明は、以下に関する。
− 特にガンの処置における使用のための医薬組成物であって、以下に記載されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、場合により、ｂ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及び薬学的に許容しうる担体とを含む、医薬組成物；
− 特にガンの処置における使用のための医薬組成物であって、ａ）以下に記載されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤と、場合により、ｃ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及び薬学的に許容しうる担体とを含む、医薬組成物；
− 特にガンの処置における同時、個別若しくは逐次使用のための複合調製物としての製品又はキットであって、（ａ）以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、場合により、ｂ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤とを含む、製品又はキット；
− 特にガンの処置における同時、個別若しくは逐次使用のための複合調製物としての製品又はキットであって、（ａ）以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤と、場合により、ｃ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤とを含む、製品又はキット；
− 特にガンの処置における同時、個別又は逐次使用のための複合調製物であって、（ａ）以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤と、場合により、ｃ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤とを含む、複合調製物；
− 放射線療法及び／又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤と組み合わせたガンの処置における使用のための医薬組成物であって、以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子を含む、医薬組成物；
− 放射線療法及び／又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤と組み合わせたガンの処置における使用のための医薬組成物であって、ａ）以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤とを含む、医薬組成物；
− 特に、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤と組み合わせたガンの処置における同時、個別若しくは逐次使用のための複合調製物としての製品又はキットであって、（ａ）以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤とを含む、製品又はキット；
− 放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤と組み合わせてガンを処置するか、又は、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤によるガンの処置効率を高めるか、又は、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による処置に対する腫瘍感受性を増強するための医薬品の製造のための、以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子を含む医薬組成物の使用；
− 放射線療法及び／又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤、並びに、以下に開示されるエンドソーム溶解剤と組み合わせてガンを処置するための医薬品の製造のための、以下に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子を含む医薬組成物の使用；
− 放射線療法及び／又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤と組み合わせてガンを処置するための医薬品の製造のための、ａ）本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤とを含む医薬組成物の使用；
− 放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤によるガンの処置効率を高めるか、又は、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による処置に対する腫瘍感受性を増強するための医薬品の製造のための、ａ）本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤とを含む医薬組成物の使用；
− ガンの処置のための医薬品の製造のための、ａ）本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤と、場合により、ｃ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及び薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物の使用；
− それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、場合により、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及び薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法；
− それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、ａ）本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤と、場合により、ｃ）ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及び薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法；
− それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子を含む医薬組成物の有効量と、以下に記載されるエンドソーム溶解剤を含む医薬組成物の有効量と、場合により、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤を含む医薬組成物の有効量とを投与することを含む、方法；
− それを必要とする被験体におけるガンを処置するための方法であって、放射線療法及び／又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤と組み合わせて、ａ）本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子を含む医薬組成物の有効量と、以下に記載されるエンドソーム溶解剤を含む医薬組成物の有効量とを投与することを含む、方法；
− それを必要とする被験体において、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤によるガンの処置効率を高めるか、又は、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による処置に対する腫瘍感受性を増強するための方法であって、ａ）本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、ｂ）以下に記載されるエンドソーム溶解剤と、薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法；
− それを必要とする被験体において、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤によるガンの処置効率を高めるか、又は、放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による処置に対する腫瘍感受性を増強するための方法であって、本明細書において開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子を含む医薬組成物の有効量と、以下に記載されるエンドソーム溶解剤を含む医薬組成物の有効量とを投与することを含む、方法。

本明細書において使用される「キット」、「製品」又は「複合調製物」という用語は、上記に定義される組み合わせパートナー（ａ）と（ｂ）と、場合により（ｃ）とが、独立して投薬され得るか、又は、区別される量の組み合わせパートナー（ａ）と（ｂ）と、場合により（ｃ）を有する異なる一定の組み合わせを使用することにより、すなわち同時又は異なる時点で投薬され得るという意味で、特に「パーツのキット」を定義する。次いで、パーツのキットのパーツは、例えば、同時に又は時間をずらして（すなわち、異なる時点で）、そして等しい又は異なる時間間隔で、パーツのキットの任意のパーツに関して投与され得る。複合調製物において投与される組み合わせパートナー（ａ）の総量の組み合わせパートナー（ｂ）と、場合により（ｃ）に対する比は、変わり得る。組み合わせパートナー（ａ）と（ｂ）と、場合により（ｃ）は、同じ経路又は異なる経路で投与され得る。

本発明の文脈の中では、処置という用語は、治療的、対症的及び予防的な処置を意味する。本発明の医薬組成物、キット、製品及び複合調製物は、早期若しくは末期のガンの進行を含む既存のガン又は腫瘍を有するヒトにおいて使用され得る。本発明の医薬組成物、キット、製品及び複合調製物は、ガンを有する患者を必ずしも治癒するのではなく、疾患の進行を遅延させるか、若しくは遅らせるか、又は疾患のさらなる進行を予防し、それにより患者の病状を改善する。特に、本発明の医薬組成物、キット、製品及び複合調製物は、腫瘍の増殖を減少させるか、腫瘍組織量を減少させるか、哺乳類ホストにおける腫瘍退縮を起こすか、並びに／又は、転移の発生及びガンの再発を予防する。ガンの処置において、本発明の医薬組成物は、治療有効量で投与される。

「有効量」は、単独で又は医薬組成物、キット、製品若しくは複合調製物の他の有効成分と組み合わせて、ヒトを含む哺乳動物におけるガンの有害効果を予防、除去又は軽減する、本発明の医薬組成物の量を意味する。当業者であれば、患者、病理、投与方法などに従って、投与量を適合し得ると理解される。

本明細書全体において、本発明の医薬組成物に関して「ガンの処置」などが言及される場合はいつでも、以下の意味である：ａ）ガンを処置するための方法であって、本発明の医薬組成物を当該処置を必要とする被験体に投与することを含む、方法。ｂ）ガンの処置のための、本発明の医薬組成物の使用；ｃ）ガンの処置のための医薬品の製造のための、本発明の医薬組成物の使用；及び／又はｄ）ガンの処置における使用のための、本発明の医薬組成物。

Ｄｂａｉｔ分子
Ｄｂａｉｔ（Ｄバイト）分子は、PCT patent applications WO2005/040378、WO2008/034866及びWO2008/084087（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。

Ｄｂａｉｔ分子は、それらの治療活性に必要な多数の特徴（例えば、最小長、少なくとも１つの自由末端の存在、及び、二本鎖部分、好ましくは二本鎖ＤＮＡ部分の存在）によって定義され得る。以下に考察されるように、Ｄｂａｉｔ分子の厳密なヌクレオチド配列は、それらの活性に影響を与えないことに注意することが重要である。さらに、Ｄｂａｉｔ分子は、改変された及び／又は非天然の骨格を含み得る。

好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、非ヒト由来（すなわち、それらのヌクレオチド配列及び／又はコンフォメーション（例えば、ヘアピン）は、ヒト細胞などにおいて存在しない）、最も好ましくは合成起源である。Ｄｂａｉｔ分子の配列は、もしあったとしても、わずかな役割しか果たしていないので、Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくは、公知の遺伝子、プロモーター、エンハンサー、５’又は３’上流配列、エクソン、イントロンなどとかなりの程度の配列相同性又は同一性を有しない。換言すれば、Ｄｂａｉｔ分子は、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子と、８０％又は７０％未満、さらに６０％又は５０％未満の配列同一性を有する。配列同一性を決定する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、BLASTN 2.2.25を含む。同一性パーセンテージの決定に関して、ヒトゲノムによって、好ましくは、Human Genome Build 37（参照GRCh37.p2及び別のアセンブリ）が考えられる。Ｄｂａｉｔ分子は、ストリンジェントな条件下で、ヒトゲノムＤＮＡとハイブリダイゼーションしない。典型的なストリンジェントな条件は、完全に相補的な核酸と部分的に相補的な核酸を区別できるようにするものである。

加えて、周知のｔｏｌｌ様レセプター介在性免疫学的反応を避けるために、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、好ましくは、ＣｐＧを持たない。

Ｄｂａｉｔ分子の長さは、それが、Ｋｕを含むＫｕタンパク質複合体とＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質との適切な結合を可能にするのに十分である限り、変化し得る。当該Ｋｕ複合体への結合及びＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性化を確保するために、Ｄｂａｉｔ分子の長さは、２０ｂｐよりも大きく、好ましくは約３２ｂｐでなければならないことが示された。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、２０〜２００ｂｐ、より好ましくは２４〜１００ｂｐ、さらにより好ましくは２６〜１００、最も好ましくは３２〜１００ｂｐ、を含む。例えば、Ｄｂａｉｔ分子は、２４〜１６０、２６〜１５０、２８〜１４０、３０〜１２０又は３２〜１００ｂｐを含む。「ｂｐ」は、この分子が、示される長さの二本鎖部分を含むことを意図する。

特定の実施態様では、少なくとも３２ｐｂ又は約３２ｂｐの二本鎖部分を有するＤｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）と同じヌクレオチド配列を含む。場合により、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄと同じヌクレオチド組成を有するが、それらのヌクレオチド配列は異なる。そして、Ｄｂａｉｔ分子は、３個のＡ、６個のＣ、１２個のＧ及び１１個のＴを有する二本鎖部分の一方の鎖を含む。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、いかなるＣｐＧジヌクレオチドも含まない。

あるいは、二本鎖部分は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）若しくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）の少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個又は３２個の連続するヌクレオチドを含む。より特定の実施態様では、二本鎖部分は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）若しくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）の２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個又は３２個の連続するヌクレオチドからなる。

Ｄｂａｉｔは、ＤＳＢの模倣物として、少なくとも１つの自由末端を有しなければならない。当該自由末端は、自由平滑末端又は５’／３’突出末端のいずれかであり得る。本明細書において、「自由末端」は、５’末端及び３’末端の両方を有するか、又は３’末端若しくは５’末端のいずれかを有する核酸分子、特に二本鎖核酸部分を指す。場合により、５’及び３’末端の一方は、Ｄｂａｉｔ分子をコンジュゲーションするのに使用され得るか、又は保護基に連結され得る（例えば、ａ又は３’−３’ヌクレオチド結合）。

特定の実施態様では、それらは、２つの自由末端を含み、直鎖状であり得る。従って、Ｄｂａｉｔ分子は、２つの自由末端を有し、かつ、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）のヌクレオチド配列を有する二本鎖分子でもあり得る。

別の特定の実施態様では、それらは、１つの自由末端のみを含む。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、二本鎖ＤＮＡステム及びループを有するヘアピン核酸からなる。ループは、核酸若しくは当業者に公知の他の化学基又はそれらの混合物であり得る。ヌクレオチドリンカーは、２〜１０個のヌクレオチド、好ましくは３個、４個又は５個のヌクレオチドを含み得る。非ヌクレオチドリンカーは、非網羅的に、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は、他のポリマー化合物（例えば、２〜１０個のエチレングリコール単位、好ましくは４個、５個、６個、７個又は８個のエチレングリコール単位を有するものなどのオリゴエチレングリコール）を含む。好ましいリンカーは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び他のリンカー（例えば、２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカン）からなる群より選択される。従って、特定の実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）若しくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）の少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個又は３２個の連続するヌクレオチドを含む二本鎖部分又はステムと、ヘキサエチレングリコールリンカー、テトラデオキシチミジレートリンカー（Ｔ４）又は２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンであるループとを有するヘアピン核酸であり得る。より特定の実施態様では、それらのＤｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）若しくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）の２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個又は３２個の連続するヌクレオチドからなる二本鎖部分を有し得る。

Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくは、２’デオキシヌクレオチド骨格を含み、場合により、１個若しくは数個（２個、３個、４個、５個又は６個）の改変されたヌクレオチド並びに／又はアデニン、シトシン、グアニン及びチミン以外の核酸塩基を含む。従って、Ｄｂａｉｔ分子は、本質的には、ＤＮＡ構造である。特に、Ｄｂａｉｔ分子の二本鎖部分又はステムは、デオキシリボヌクレオチドからなる。

特に、Ｄｂａｉｔ分子を分解から保護するために、好ましいＤｂａｉｔ分子は、一方の又は各鎖の末端に、１個若しくは数個の化学的に改変されたヌクレオチド又は基を含む。特に好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子の自由末端は、一方の若しくは各鎖の末端にある１個、２個又は３個の改変ホスホジエステル骨格によって保護される。好ましい化学基、特に改変ホスホジエステル骨格は、ホスホロチオエートを含む。あるいは、好ましいＤｂａｉｔは、３’−３’ヌクレオチド結合又はメチルホスホネート骨格を有するヌクレオチドを有する。他の改変骨格は、当技術分野において周知であり、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−０，４’−Ｃメチレン／エチレン架橋ロックド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び短鎖アルキル、又はシクロアルキル糖間結合若しくは可変長の短鎖ヘテロ原子又は複素環の糖間結合、又は当業者に公知の任意の改変ヌクレオチドを含む。第１の好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、一方の若しくは各鎖の末端にある１個、２個又は３個の改変ホスホジエステル骨格によって、より好ましくは少なくとも３’末端、しかしさらにより好ましくは５’及び３’末端の両方にある３個の改変ホスホジエステル骨格（特に、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート）によって保護された自由末端を有する。

最も好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、３２ｂｐのＤＮＡ二本鎖部分又はステム（例えば、配列番号１〜５からなる群より選択される配列、特に配列番号４を有する）と、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択されるリンカーを含むか、若しくは当該リンカーからなる、ＤＮＡ二本鎖部分又はステムの２つの鎖を連結するループとを含む、ヘアピン核酸分子であり、ＤＮＡ二本鎖部分又はステムの自由末端（すなわち、ループの反対側）は、３個の改変ホスホジエステル骨格（特に、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合）を有する。

前記Ｄｂａｉｔ分子は、化学合成、半生合成又は生合成、任意の増幅方法、続いて、任意の抽出及び調製方法並びに任意の化学的改変によって作製される。リンカーは、標準的な核酸化学合成によって組み込むことができるように提供される。

より好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、特別に設計された収束合成によって製造される：標準的な核酸化学合成によって、適切なリンカー前駆体が組み込まれた状態で２つの相補鎖が調製され、それらの精製後に、それらは互いに共有結合される。

コンジュゲートＤｂａｉｔ分子
本発明は、エンドサイトーシス又は細胞取り込みを促進する分子にコンジュゲーションしたＤｂａｉｔ分子に関する。

特に、この分子は、脂溶性分子（例えば、コレステロール、単鎖又は二本鎖脂肪酸）、又は、細胞レセプターをターゲティングしてレセプター介在性エンドサイトーシスを可能にするリガンド（例えば、葉酸若しくは葉酸塩誘導体又はトランスフェリン）であり得る（Goldstein et al. Ann. Rev. Cell Biol. 1985 1:1-39; Leamon & Lowe, Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88: 5572-5576.）。脂肪酸は、飽和又は不飽和のＣ_４−Ｃ_２８、好ましくはＣ_１４−Ｃ_２２、さらにより好ましくはＣ_１８（例えば、オレイン酸又はステアリン酸）であり得る。特に、脂肪酸は、オクタデシル又はジオレオイルであり得る。脂肪酸は、適切なリンカー（例えば、グリセロール、ホスファチジルコリン又はエタノールアミンなど）で結合したか、又はＤｂａｉｔ分子に結合するのに使用されるリンカーによって互いに結合した二本鎖形態として見られ得る。本明細書において使用される「葉酸塩」という用語は、プテロイン酸誘導体及び類似物を含む葉酸塩又は葉酸塩誘導体を指すことを意味する。本発明における使用に好適な葉酸の類似物及び誘導体は、抗葉酸剤塩、ジヒドロ葉酸塩、テトラヒドロ葉酸塩、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸、１−デザ、３−デアザ、５−デアザ、８−デアザ、１０−デアザ、１，５−デアザ、５，１０ジデアザ、８，１０−ジデアザ及び５，８−ジデアザ葉酸塩、抗葉酸剤塩並びにプテロイン酸誘導体を含むが、これらに限定されない。さらなる葉酸塩類似物は、US2004/242582に記載されている。エンドサイトーシスを促進する分子は、トコフェロール、糖（例えば、ガラクトース及びマンノース並びにそれらのオリゴ糖）、ペプチド（例えば、ＲＧＤ及びボンベシン）及びタンパク質（例えば、インテグリン）であり得る。従って、エンドサイトーシスを促進する分子は、単鎖又は二本鎖脂肪酸、葉酸塩及びコレステロールからなる群より選択され得る。より好ましくは、エンドサイトーシスを促進する分子は、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸及びコレステロールからなる群より選択される。最も好ましい実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、コレステロールにコンジュゲーションされる。

エンドサイトーシスを促進する分子は、好ましくはリンカーによって、Ｄｂａｉｔ分子にコンジュゲーションされる。当技術分野において公知の任意のリンカーが、エンドサイトーシスを促進する分子をＤｂａｉｔ分子に共有結合するのに使用され得る。例えば、WO09/126933は、便利なリンカーの広範なレビューを提供する（pages 38-45）。リンカーは、非網羅的に、脂肪族鎖、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は、他のポリマー化合物（例えば、２〜１０個のエチレングリコール単位、好ましくは３個、４個、５個、６個、７個又は８個のエチレングリコール単位、さらにより好ましくは６個のエチレングリコール単位を有するものなどのオリゴエチレングリコール）であり得、化学的又は酵素的な方法によって破壊され得る任意の結合（例えば、ジスルフィド結合、保護されたジスルフィド結合、酸に不安定な結合（例えば、ヒドラゾン結合）、エステル結合、オルトエステル結合、ホスホンアミド結合、バイオ開裂可能なペプチド結合、アゾ結合又はアルデヒド結合）を導入する。当該開裂可能なリンカーは、WO2007/040469 pages 12-14、WO2008/022309 pages 22-28に詳述されている。

特定の実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子は、１個のエンドサイトーシスを促進する分子に結合され得る。あるいは、数個のエンドサイトーシスを促進する分子（例えば、２個、３個又は４個）が、Ｄｂａｉｔ分子に結合され得る。

具体的な実施態様では、エンドサイトーシスを促進する分子（特に、コレステロール）とＤｂａｉｔ分子との間のリンカーは、ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ（式中、ｎは、１〜１０の整数であり、好ましくは、ｎは、３、４、５及び６からなる群より選択される）である。非常に特定の実施態様では、リンカーは、ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_４（カルボキサミドトリエチレングリコール）である。リンカーは、Ｄｂａｉｔ分子の活性を改変しない任意の都合のよい位置で、Ｄｂａｉｔ分子に結合され得る。特に、Ｄｂａｉｔ分子がヘアピンである場合、リンカーは、５’末端、３’末端又はループで結合され得る。しかしながら、ヘアピンＤｂａｉｔ分子の場合、本発明者らは、驚くべきことに、リンカーによって５’末端でＤｂａｉｔ分子に結合したコレステロールが、リンカーによってループでＤｂａｉｔ分子に結合したコレステロールよりも効率的であることを見出した。従って、好ましい実施態様では、意図されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、ヘアピン構造を有し、かつ、好ましくはリンカーによって、５’末端で、エンドサイトーシスを促進する分子にコンジュゲーションされているＤｂａｉｔ分子である。

別の具体的な実施態様では、エンドサイトーシスを促進する分子（特に、コレステロール）とＤｂａｉｔ分子との間のリンカーは、ジアルキル−ジスルフィド｛例えば、（ＣＨ_２）_ｐ−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ_２）_ｑ（式中、ｐ及びｑは、１〜１０、好ましくは３〜８の整数、例えば６である｝である。

最も好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、３２ｂｐのＤＮＡ二本鎖部分又はステム（例えば、配列番号１〜５からなる群より選択される配列、特に配列番号４を有する）と、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択されるリンカーを含むか、若しくは当該リンカーからなる、ＤＮＡ二本鎖部分又はステムの２つの鎖を連結するループとを含む、ヘアピン核酸分子であり、ＤＮＡ二本鎖部分又はステムの自由末端（すなわち、ループの反対側）は、３個の改変ホスホジエステル骨格（特に、ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合）を有し、前記Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくはリンカー（例えば、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコール）によって、５’末端でコレステロールにコンジュゲーションされている。

コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、下記式：

（式中、Ｎは、ヌクレオチドであり、ｎは、１４より大きい整数であり、下線部のＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するか、又は有しないヌクレオチドを指し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、エンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１の整数である）によっても記載され得る。好ましくは、下線部のＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するヌクレオチドを指す。式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）において、Ｃ−Ｌ_ｍは、それぞれ、ヌクレオチドの５’末端又は３’末端に結合されている。式（Ｉ〜ＩＩＩ）において、Ｃ−Ｌ_ｍは、好ましくは、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）によって、Ｌ’に結合されている。

好ましい実施態様では、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の分子は、下記特徴の１つ又はいくつかを有する：
− Ｎは、ＣｐＧジヌクレオチドが存在しないように、好ましくは、Ａ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）及びＧ（グアニン）からなる群より選択され、ヒトゲノムにおける任意の遺伝子と８０％又は７０％未満、さらに６０％又は５０％未満の配列同一性を有するデオキシヌクレオチドである。；及び／又は、
− ｎは、１５〜１９５、好ましくは１９〜９５、より好ましくは２１〜９５、さらにより好ましくは２７〜９５の整数である。特に好ましい実施態様では、ｎは２７である；及び／又は、
− 下線部のＮは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格、より好ましくはホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドを指す；及び／又は、
− 連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択される；及び／又は、
− ｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、より好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコールである；及び／又は、
− Ｃは、コレステロール、単鎖若しくは二本鎖脂肪酸（例えば、オレイン酸又はステアリン酸）、又は、細胞レセプターをターゲティングするリガンド（ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む）（例えば、葉酸塩及びトランスフェリン）からなる群より選択され、好ましくは、コレステロール、オクタデシル、ジオレオイル又は葉酸塩であり、より好ましくは、コレステロールである。

好ましくは、Ｃ−Ｌｍは、トリエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−トリエチレングリコールラジカルである。

好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、下記式：

（式中、Ｎ、下線部のＮ、ｎ、Ｌ、Ｌ’、Ｃ及びｍに関しては、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）と同じ定義である）を有する。

好ましい実施態様では、ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎは、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）若しくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）の少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個又は３２個の連続するヌクレオチドを含むか、又は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）若しくはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）の２０個、２２個、２４個、２６個、２８個、３０個又は３２個の連続するヌクレオチドからなる。特定の実施態様では、ＮＮＮＮ−（Ｎ）_ｎ−Ｎは、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）又はＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号５）、より好ましくはＤｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号４）を含むか、又はこれからなる。

従って、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、

（式中、Ｌ、Ｌ’、Ｃ及びｍに関しては、式（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）と同じ定義である）からなる群より選択され得る。

好ましい実施態様では、式（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩｅ）及び（ＩＩＩｅ）、好ましくは式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）及び（ＩＩｅ）の分子は、下記特徴の１つ又はいくつかを有する：
− 下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート若しくはメチルホスホネート骨格を有するか、又は有しないヌクレオチド、より好ましくは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格を有するヌクレオチド、さらにより好ましくは、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドを指す；及び／又は、
− 連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択される；及び／又は、
− ｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドオリゴエチレングリコール、より好ましくはカルボキサミドトリエチレングリコールである；及び／又は、
− Ｃは、コレステロール、単鎖若しくは二本鎖脂肪酸（例えば、オレイン酸又はステアリン酸）、又は、細胞レセプターをターゲティングするリガンド（ペプチド、タンパク質、アプタマーを含む）（例えば、葉酸塩、トランスフェリン）からなる群より選択され、好ましくは、コレステロール、オクタデシル、ジオレオイル又は葉酸塩であり、より好ましくは、コレステロールである。

好ましくは、Ｃ−Ｌｍは、トリエチレングリコールリンカー（１０−Ｏ−［１−プロピル−３−Ｎ−カルバモイルコレステリル］−トリエチレングリコールラジカルである。

式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩｅ）及び（ＩＩＩｅ）、好ましくは式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）及び（ＩＩｅ）のＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子の具体的な実施態様では、Ｌ’は、好ましくは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択される。

式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（Ｉａ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩＩｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩｄ）、（Ｉｅ）、（ＩＩｅ）及び（ＩＩＩｅ）、好ましくは式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）及び（ＩＩｅ）のＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子の具体的な実施態様では、Ｃがコレステロールである場合、Ｃ−Ｌ_ｍは、ラジカル

である。

好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）及び（ＩＩｅ）（式中、Ｃ−Ｌ_ｍは、ラジカル

であり、
Ｌ’は、好ましくは、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され、より好ましくは２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンである）からなる群より選択される。

非常に具体的な実施態様では、Ｄｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、下記式

（式中、Ｃ−Ｌ_ｍは、ラジカル

であり、Ｌ’は、２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンであり、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有する）を有する。従って、この分子は、下記構造を有し、それは、実施例のセクションにおいて、「ｃｏＤｂａｉｔ」と称される。

ＤＴ０１と名付けられたコレステロール−Ｄｂａｉｔコンジュゲートの１つは、コレステリルテトラエチレングリコールを５’末端に有し、３個のホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を５’及び３’末端のそれぞれに有する、１，１９−ビス（ホスホ）−８−ヒドラザ−２−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンリンカーによって結合した２つの３２ｎｔ鎖の相補的配列からなる６４ｎｔのオリゴデオキシリボヌクレオチドである。溶液中において、この分子は、分子内ヘアピン３２ｂｐ二重ヘリックスを形成する。この二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構造は、その生物学的活性に不可欠であり、医薬品有効成分（ＡＰＩ）である。ナトリウム塩の分子式：Ｃ_６７８Ｈ_８２０Ｎ_２４４Ｎａ_６５Ｏ_３９２Ｐ_６５Ｓ_６；ナトリウム塩の分子量：２２３５９．２Da；遊離酸の分子量：２０９３１．４Da。この分子は、下記：

としても表され得る。

式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）又は（ＩＩｅ）に関する本発明の非常に驚くべき態様は、Ｄｂａｉｔ分子の活性は、少なくとも１つの自由末端の存在を必要とするが、５’末端に結合したエンドサイトーシスを促進する分子は、当該活性を減少させないことである。

従って、また、本発明は、以下に詳述されるように、上記に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子、それと場合により薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物、単独又は放射線療法及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の化学療法と組み合わせたガンの処置における使用のための上記に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子、上記に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の治療有効量を投与することを含むガンを処置するための方法、並びに、ガンを処置するための医薬品を調製するための上記に開示されるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の使用に関する。

エンドソーム溶解剤
コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、本明細書において、好ましくは、エンドソーム溶解剤（例えば、クロロキン、融合脂質又はペプチド）と組み合わせて使用される。実際、エンドソーム溶解剤による処置は、エンドソームからのコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の放出を促進する。加えて、この特定の組み合わせは、ｉｎ ｖｉｖｏでの毒性が低い例外的結果並びにＤｂａｉｔ介在性活性の遅延及び持続を含む、さらなる驚くべき効果を獲得することを可能にする。

特に、エンドソーム溶解剤は、ｐＨの変化に応じてエンドソームの溶解と、細胞成分又は細胞内成分に送達されるべき治療剤をパッケージ化できるカプセル化（又はパッケージ化）成分とに影響を与えることができる。エンドソーム溶解物質は、キノリン化合物、特に４−アミノキノリン及び２−フェニルキノリン化合物並びにそれらのアミノ、チオ、フェニル、アルキル、ビニル及びハロゲン誘導体、融合脂質、ペプチド又はタンパク質を含むが、これらに限定されない。

好ましい実施態様では、エンドソーム溶解剤は、小分子である。基本的なエンドソーム溶解剤は、キニーネ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、アモジアキン（カモキン）、アモピロキン、プリマキン、メフロキン、ニバキン、ハロファントリン、キノンイミン及びそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。好ましいエンドソーム溶解剤は、以下のリストに記載される化学名の化合物を含むキノリンエンドソーム溶解剤であるが、これらに限定されない：７−クロロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン（クロロキン）；７−クロロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチル−アミノ）キノリン；４−（４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−ジエチル−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン）；４−（４−ジエチル−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチル−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチル−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−ジエチルアミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（４−エチル−（２−ヒドロキシ−エチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ−）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；ヒドロキシクロロキンホスフェート；７−クロロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル（ｅｔｈｙ）−１）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン（デスメチルヒドロキシクロロキン）；７−フルオロ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−ブチルアミノ）キノリン；７−クロロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−フルオロ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；７−ヒドロキシ−４−（１−カルボキシ−４−エチル−（２−ヒドロキシエチル）−アミノ−１−メチルブチルアミノ）キノリン；８−［（４−アミノペンチル）アミノ−６−メトキシジヒドロクロリドキノリン；１−アセチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン；８−［（４−アミノペンチル）アミノ］−６−メトキシキノリンジヒドロクロリド；１−ブチリル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン；３−クロロ−４−（４−ヒドロキシ−α，α’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン、４−［（４−ジエチル−アミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；３−フルオロ−４−（４−ヒドロキシ−α，α’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン、４−［（４−ジエチルアミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；４−（４−ヒドロキシ−α，α’−ビス（２−メチル−１−ピロリジニル）−２，５−キシリジノキノリン；４−［（４−ジエチルアミノ）−１−メチルブチル−アミノ］−６−メトキシキノリン；３，４−ジヒドロ−１−（２Ｈ）−キノリンカルボキシアルデヒド；１，１’−ペンタメチレンキノリニウムジヨージド；８−キノリノール硫酸塩並びにそれらのアミノ、アルデヒド，カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフィドリル及びビニル誘導体又は類似物。他の薬剤は、Naisbitt et al (1997, J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893)及びUS 5,736,557に開示されている。より好ましい実施態様では、エンドソーム溶解剤は、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、デスメチルクロロキン、ヒドロキシクロロキンホスフェート及びデスメチル−ヒドロキシクロロキンからなる群より選択され得、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキンであり、より好ましくは、クロロキンである。

別の実施態様では、エンドソーム溶解剤は、融合脂質、ペプチド又はタンパク質である。実際、多数の融合脂質、ペプチド又はタンパク質が、当技術分野において公知である。例えば、融合脂質、ペプチド又はタンパク質は、以下の特許出願に開示されているものである：WO10057160、US2007/0293449、US2006/0051405、WO10053489、WO09126933。特に、WO09/126933は、融合脂質、ペプチド及びタンパク質を提供する（pages 23-29）。

本発明者らは、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子とクロロキンの組み合わせの高い抗腫瘍治療効果を実証した一方で、本発明者らは、単独の又は放射線照射との組み合わせた同量のクロロキンは、いかなる抗腫瘍活性も示さないことを観察した。

従って、本発明は、より具体的には、ガンの処置における使用のための医薬組成物であって、本発明のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、エンドソーム溶解剤とを含む医薬組成物に関する。また、本発明は、より具体的には、ガンの処置における同時、個別若しくは逐次使用のための複合調製物としての製品であって、本発明のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、エンドソーム溶解剤とを含む製品に関する。好ましくは、エンドソーム溶解剤は、クロロキン又はヒドロキシクロロキンからなる群より選択され、さらにより好ましくはクロロキンである。好ましくは、本発明のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、特定の上記コンジュゲートＤｂａｉｔ分子である。一実施態様では、特に、WO2007/040469に開示されているように、本発明のＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、さらにより好ましくはクロロキンに共有結合されている。別の好ましい実施態様では、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキンは、本発明のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子にコンジュゲーションされていない（すなわち、共有結合されていない）。

本明細書において意図される医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容しうる担体を含み得る。「薬学的に許容しうる担体」という用語は、有効成分の生物学的活性の効果を妨げず、それが投与されるホストに対して非毒性であるあらゆる担体（例えば、支持体、物質、溶媒など）を包含することを意味する。例えば、非経口投与の場合、有効成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液などのビヒクルに注射用の単位剤形で製剤化され得る。

医薬組成物は、薬学的適合性溶媒中の溶液として、又は適切な薬学的溶媒若しくはビヒクル中のエマルション、懸濁液若しくは分散液として、又は当技術分野において公知の方法で固体ビヒクルを含む丸剤、錠剤若しくはカプセル剤として、製剤化され得る。経口投与に好適な本発明の製剤は、それぞれが所定量の有効成分を含む不連続単位（例えば、カプセル剤、サシェ剤、錠剤又はトローチ剤）の形態；粉末若しくは顆粒の形態；水性液体若しくは非水液体の溶液若しくは懸濁液の形態；又は水中油型エマルション若しくは油中水型エマルションの形態であり得る。非経口投与に好適な製剤は、好ましくはレシピエントの血液と等張である、有効成分の滅菌油性又は水性調製物を都合よく含む。このような各製剤は、薬学的適合性かつ非毒性である他の補助剤（例えば、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、染料、乳化剤又は香味物質）も含み得る。本発明の製剤は、薬学的に許容しうる担体及び場合により他の治療成分と共に、有効成分を含む。担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容され得」なければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。医薬組成物は、有利には、適切な滅菌溶液の注射若しくは静脈内注入により、又は消化管による経口投与で適用される。これらの化学療法剤の大部分の安全かつ効果的な投与方法は、当業者に公知である。加えて、それらの投与は、標準的な文献に記載されている。

本発明の医薬組成物は、リポソーム組成物ではない。特に、本発明のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又は製品は、リポソーム組成物に製剤化されない。

特に、また、本発明は、（ａ）１つ以上の単位剤形の上記に開示されるＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子と、（ｂ）１つ以上の単位剤形の上記に開示されるエンドソーム溶解剤と、場合により、（ｃ）１つ以上の単位剤形の以下に開示されるＤＮＡ損傷抗腫瘍剤とを含む、製品、キット又は複合調製物に関する。

ＤＮＡ損傷処置
コンジュゲートＤｂａｉｔ分子及びエンドソーム溶解剤に加えて、処置は、抗腫瘍処置、好ましくは、ＤＮＡ損傷剤又は放射線療法による処置もさらに含み得る。ＤＮＡ損傷処置は、放射線療法若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による化学療法又はそれらの組み合わせであり得る。

ＤＮＡ鎖切断は、電離放射線（放射線療法）によって達成され得る。放射線療法は、γ線、Ｘ線、及び／又は、腫瘍細胞への放射性同位体の直接送達を含むが、これらに限定されない。他の放射線療法は、マイクロ波及びＵＶ照射を含む。本発明では、放射線療法への他のアプローチも意図される。

ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤は、好ましくは、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤及び有糸分裂紡錘体の阻害剤からなる群より選択される。

トポイソメラーゼＩ及び／又はＩＩの阻害剤は、エトポシド、トポテカン、カンプトセシン、イリノテカン、アムサクリン、イントプリシン、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン）及びミトキサントロンを含むが、これらに限定されない。トポイソメラーゼＩ及びＩＩの阻害剤は、イントプレシン（ｉｎｔｏｐｌｅｃｉｎ）を含むが、これらに限定されない。

ＤＮＡ架橋剤は、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンを含むが、これらに限定されない。

代謝拮抗剤は、核酸合成に関与する酵素を遮断するか、又はＤＮＡに組み込まれ、これが、誤った遺伝コードを生じさせ、アポトーシスを引き起こす。それらの非網羅的な例は、葉酸、アンタゴニスト、ピリミジン類似物、プリン類似物及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤、より具体的にはメトトレキサート、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチン、５−フルオロウラシル、ゲムシタビン及びカペシタビンを含むが、これらに限定されない。

ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素化合物、金属塩及びトリアゼンを含むＤＮＡアルキル化剤であり得るが、これらに限定されない。それらの非網羅的な例は、ウラシルマスタード、クロロメチン（Ｃｈｌｏｒｍｅｔｈｉｎｅ）、シクロホスファミド（CYTOXAN(R)）、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、フォテムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、チオテパ、ストレプトゾシン、ダカルバジン及びテモゾロミドを含む。

有糸分裂紡錘体の阻害剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ラロタキセル（XRP9881とも称される；Sanofi-Aventis）、XRP6258（Sanofi-Aventis）、BMS-184476（Bristol-Meyer-Squibb）、BMS-188797（Bristol-Meyer-Squibb）、BMS-275183（Bristol-Meyer-Squibb）、オルタタキセル（IDN 5109、BAY 59-8862又はSB-T-101131とも称される；Bristol-Meyer-Squibb）、RPR 109881A（Bristol-Meyer-Squibb）、RPR 116258（Bristol-Meyer-Squibb）、NBT-287（TAPESTRY）、ＰＧ−パクリタキセル（CT-2103、PPX、パクリタキセルポリグルメックス、ポリグルタメート化パクリタキセル又はXyotax（商標）とも称される）、ABRAXANE（登録商標）（Ｎａｂ−パクリタキセルとも称される；ABRAXIS BIOSCIENCE）、テセタキセル（DJ-927とも称される）、IDN 5390（INDENA）、タクサオプレキシン（ドコサヘキサエン酸−パクリタキセルとも称される；PROTARGA）、ＤＨＡ−パクリタキセル（Taxoprexin（登録商標）とも称される）及びMAC-321（WYETH）を含むが、これらに限定されない。Hennenfent & Govindan (2006, Annals of Oncology, 17, 735-749)のレビューも参照のこと。

処置されるべきガン又は腫瘍
本発明において記載される医薬組成物及び製品、キット又は複合調製物は、被験体におけるガンを処置するのに使用され得る。

「ガン」「ガン性」又は「悪性」という用語は、無秩序な細胞成長により典型的に特徴付けられる哺乳動物の生理的状態を指すか、又は説明する。ガンの例は、例えば、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、ガン及び肉腫を含む。このようなガンのより具体的な例は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、神経膠腫、胃腸ガン、腎ガン、卵巣ガン、肝ガン、直腸結腸ガン、子宮内膜ガン、腎ガン、前立腺ガン、甲状腺ガン、神経芽細胞腫、膵ガン、多形性神経膠芽腫、子宮頸ガン、胃ガン（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱ガン、肝ガン、乳ガン、結腸ガン、及び頭頚部ガン、胃ガン（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胚細胞性腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞症、及び、肥満細胞症に関連する症状を含む。

「白血病」は、造血器官の進行性悪性疾患を指し、一般的には、血液及び骨髄における白血球及びその前駆体のゆがめられた増殖並びに発生によって特徴付けられる。白血病は、一般的には、（１）疾患の継続期間及び特徴−急性又は慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄（骨髄性）、リンパ（リンパ性）又は単球；及び（３）血中の異常細胞数の増加又は非増加−白血性又は非白血性（亜白血性）に基づいて、臨床的に分類される。白血病は、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎児性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、有毛細胞白血病、血球母細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ）白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、リンパ性（ｌｙｍｐｈｏｉｄ）白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄性単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、及び、未分化細胞性白血病を含む。ある態様では、本発明は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病及び／又はフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）の処置を提供する。

以下ものを含む様々なガンも本発明の範囲に包含されるが、これらに限定されない：膀胱（加速性及び転移性膀胱ガンを含む）、乳房、結腸（結腸直腸ガンを含む）、腎臓、肝臓、肺（小細胞及び非小細胞の肺ガン及び肺腺ガン）、卵巣、前立腺、精巣、尿路、リンパ系、直腸、喉頭、膵臓（外分泌膵臓ガンを含む）、食道、胃、胆嚢、頚部、甲状腺及び皮膚（扁平上皮細胞ガンを含む）のガンを含むガン；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンズリンパ腫、非ホジキンズリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫及びバーケットリンパ腫を含むリンパ系の造血性腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血性腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；メラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞ガン及び奇形ガン腫を含む他の腫瘍；メラノーマ、病期ＩＩＩ又はＩＶの切除不能な悪性メラノーマ、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、神経膠腫、胃腸ガン、腎ガン、卵巣ガン、肝ガン、直腸結腸ガン、子宮内膜ガン、腎ガン、前立腺ガン、甲状腺ガン、神経芽細胞腫、膵ガン、多形性神経膠芽腫、子宮頸ガン、胃ガン（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱ガン、肝ガン、乳ガン、結腸ガン、及び頭頚部ガン、網膜芽腫、胃ガン（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、胚細胞性腫瘍、骨肉腫、骨腫瘍、骨の成人悪性線維性組織球腫；骨の小児悪性線維性組織球腫、肉腫、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、新生物、形質細胞新生物；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；精巣性胚細胞腫瘍、眼内メラノーマ、骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、滑膜肉腫。加えて、障害は、他のガンに加えて、色素性じんま疹、肥満細胞症、例えばびまん性皮膚肥満細胞症、ヒトの孤立性肥満細胞腫、並びにイヌ肥満細胞腫、水胞性、紅皮性及び毛細血管拡張性肥満細胞症のようないくつかの稀なサブタイプ、血液障害に関連する肥満細胞症、例えば骨髄増殖性若しくは骨髄異形成症候群、又は急性白血病、肥満細胞症に関連する骨髄増殖性障害、肥満細胞性白血病を含む。以下のものを含む他のガンも障害の範囲に含まれるが、これらに限定されない：膀胱、尿路上皮ガン、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頚部、甲状腺、精巣（特に、精巣精上皮腫）及び皮膚（扁平上皮細胞ガンを含む）のガンを含むガン；胃腸間質腫瘍（「ＧＩＳＴ」）；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫及びバーケットリンパ腫を含むリンパ球系の造血性腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病並びに前骨髄球性白血病を含む骨髄系の造血性腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；メラノーマ、精上皮腫、奇形ガン、神経芽細胞腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及びシュワン細胞腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；並びにメラノーマ、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞ガン、奇形ガン、化学療法不応性非精上皮腫胚細胞性腫瘍、及びカポジ肉腫及びあらゆるそれらの転移を含む他の腫瘍。

本発明の好ましい実施態様では、ガンは、固形腫瘍である。「固形腫瘍」という用語は、乳ガン、卵巣ガン、大腸及び一般的にはＧＩ（胃腸）管のガン、頸ガン、肺ガン、特に小細胞肺ガン及び非小細胞肺ガン、頭頸部ガン、膀胱ガン、前立腺ガン又はカポジ肉腫を特に意味する。

本発明において記載される医薬組成物及び製品、キット又は複合調製物は、固形腫瘍の成長を阻害するために、腫瘍容積を減少させるために、腫瘍の転移拡散及び微小転移の成長又は発生を予防するために有用であり得る。本発明において記載される医薬組成物及び製品、キット又は複合調製物は、予後不良患者又は放射線療法若しくは化学療法耐性腫瘍の処置に特に好適である。

本発明者らは、細胞株及び患者の生検に由来する各腫瘍（メラノーマ、膠芽細胞腫、ガン腫を含む）に関して、多数の異なる腫瘍型を試験した。それらの８０％超は、処置によく反応した。特に、以下の腫瘍型に関して、効果が認められた：メラノーマ、膠芽細胞腫、乳ガン、大腸ガン、消化管ガン、肝臓ガン及び頭頸部ガン。

好ましい実施態様では、ガンは、メラノーマ、膠芽細胞腫、乳ガン、大腸ガン、消化管ガン、肝臓ガン及び頭頸部ガンから選択され得る。

レジメン、投与量及び投与経路
本発明の複合調製物において使用される各組み合わせパートナーの有効投与量は、使用される特定の化合物又は医薬組成物、投与方法、処置中の病状、処置中の病状の重症度に応じて変わり得る。従って、本発明の複合調製物の投与量レジメンは、投与経路及び患者の状態を含む様々な要因に従って選択される。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医は、病状の進行を予防、対抗又は停止するのに必要な単一有効成分の有効量を容易に決定及び規定できる。毒性を伴わずに効果をもたらす範囲内の有効成分濃度を達成する最適精度は、ターゲット部位に対する有効成分の有効性の動態に基づくレジメンを必要とする。

エンドソーム溶解剤及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、同じ経路又は２つの異なる経路によって投与され得る。エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキン及び／又はコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の投与経路は、経口、非経口、静脈内、腫瘍内、皮下、頭蓋内、動脈内、局所、直腸、経皮、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、骨内などであり得る。好ましい実施態様では、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、処置されるべき腫瘍部位付近に投与されるか、又は注射される。

特定の実施態様では、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキンは、経口経路又は腹腔内経路、好ましくは経口経路によって投与され、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、頭蓋内注射、静脈内注射又は経口経路、より好ましくは腫瘍内、皮下又は静脈内注射、さらに最も好ましくは皮下経路によって投与され得る。

別の特定の実施態様では、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキン及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は両方とも、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射又は経口経路、より好ましくは腫瘍内、皮下注射又は経口経路、さらに最も好ましくは経口経路によって投与される。エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキン及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子が同時注射される場合、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキンの量が多いほど、その毒性限界内で、治療効果は良くなる。同時注射又は局所注射の利点は、血漿中の薬物動態プロファイルを適合させる必要がないことである。非常に具体的な実施態様では、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキンは、経口経路によって投与され、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、皮下注射によって投与される。本発明者らは、この組み合わせの投与経路による並外れた結果が、血漿中のクロロキンの定常状態レジメンを確立するためのクロロキンの前処置を提供したことを示す。

エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキンは、コレステロールコンジュゲートＤｂａｉｔ分子若しくはヘアピン核酸分子の２時間前及び／又はそれと同時及び／又はその後、より好ましくは、ｃｏＤｂａｉｔ投与の２時間前に投与される。

第１の好ましい実施態様では、処置レジメンは、コレステロールコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子による処置の開始前に、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキンによる患者の前処置の工程を含む。例えば、エンドソーム溶解剤は、処置されるべき腫瘍部位付近に投与（例えば、局所投与）される場合、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子若しくはヘアピン核酸分子の投与と共に、又はその少なくとも若しくは約１、２、３、４若しくは５時間前、好ましくは約１〜３時間前、より好ましくは約２時間前に投与され得る。あるいは、エンドソーム溶解剤は、全身投与によって投与される場合、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子の投与のかなり前、より長期の処置によって、好ましくは、コレステロールコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子の投与の約１〜３週間前の期間、より好ましくは約２週間の期間中に投与され得る。

コレステロールコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子が投与されているか、又は投与されたら、エンドソーム溶解剤による処置は、コレステロールコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子が投与されている限り、継続し得る。あるいは、エンドソーム溶解剤による処置も終了し得る。

ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤が、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子及びエンドソーム溶解剤と組み合わせて使用される場合、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及びコレステロールコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、同じ経路又は異なる経路によって投与され得る。ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の投与経路は、経口、非経口、静脈内、腫瘍内、皮下、頭蓋内、動脈内、局所、直腸、経皮、皮内、鼻腔内、筋肉内、骨内などであり得る。

特定の実施態様では、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及びエンドソーム溶解剤は、経口経路によって、同時、個別又は逐次投与され、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射又は経口経路、好ましくは腫瘍内、皮下若しくは腹腔内注射又は、経口経路、さらにより好ましくは腫瘍内又は皮下によって投与され得る。

別の特定の実施態様では、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤は、経口経路によって投与され、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子及びエンドソーム溶解剤は、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射又は経口経路、好ましくは腫瘍内、皮下若しくは腹腔内注射又は、経口経路、さらにより好ましくは腫瘍内又は皮下によって、同時、個別又は逐次投与され得る。

さらに特定の実施態様では、エンドソーム溶解剤は、経口経路によって投与され、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子及びＤＮＡ損傷抗腫瘍剤は、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射又は経口経路、好ましくは腫瘍内、皮下若しくは腹腔内注射又は、経口経路、さらにより好ましくは腫瘍内又は皮下によって、同時、個別又は逐次投与され得る。

さらに特定の実施態様では、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤、エンドソーム溶解剤及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、腫瘍内注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射又は経口経路、好ましくは腫瘍内、皮下若しくは腹腔内注射又は、経口経路、さらにより好ましくは腫瘍内又は皮下注射によって、同時、個別又は逐次投与される。

エンドソーム溶解剤及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子は、放射線照射及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の投与の前並びに／又はそれと同時並びに／又はその後、より好ましくは、放射線照射及び／若しくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の投与の前並びに／又はそれと同時に投与される。放射線照射が適用される場合、又は、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤が腫瘍細胞に到達する場合、放射線照射及び／又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の投与は、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子が腫瘍細胞で存在するように実施される。有効成分、ターゲット部位に対するそれらの有効性の動態、又は、血漿中のそれらの薬物動態プロファイルに基づいて、通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医は、レジメンを決定できる。予備的な結果は、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子が、１日中活性であり続けることを示している。第１の好ましい実施態様では、処置レジメンは、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子による処置の開始前に、エンドソーム溶解剤、好ましくはクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキンによる患者の前処置の工程を含む。次いで、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子による処置の開始時に、又は、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子又はヘアピン核酸分子による処置後に、放射線照射が適用されるか、又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤が投与される。例えば、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置の開始後３〜２４時間に、放射線照射が適用されるか、又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤が投与される。ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤及びコンジュゲートＤｂａｉｔ分子は、同時投与もされ得る。

放射線療法又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による処置が開始すると、放射線療法又はＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による処置が適用されるか、又は投与される限り、エンドソーム溶解剤及び／又はコンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置は、継続し得る。あるいは、エンドソーム溶解剤及び／又はコンジュゲートＤｂａｉｔ分子による処置も終了し得る。

コンジュゲートＤｂａｉｔ分子に関して、本発明の複合調製物、キット又は製品において使用されるＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の有効投与量は、投与方法、処置中の病状、処置中の病状の重症度に応じて変わり得る。従って、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の投与量レジメンは、投与経路及び患者の状態を含む様々な要因に従って選択される。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医は、特に、選択されたＤＮＡ損傷処置と組み合わせて、ガンの進行を予防、対抗又は停止するのに必要なコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量を容易に決定及び規定できる。

例えば、局所投与の場合（例えば、腫瘍内又は皮下投与が使用される場合）、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量は、少なくとも０．０１mg/cm³腫瘍、好ましくは０．１〜４０mg/cm³腫瘍、最も好ましくは１〜２０mg/cm³腫瘍である。有効量は、毎日処置プロトコール（例えば、５日／週を３〜６週間連続、又は、週３回を３〜６週間連続）で投与され得る。あるいは、少なくとも０．１mg/cm³腫瘍、好ましくは０．１〜４０mg/cm³腫瘍、最も好ましくは１〜２０mg/cm³腫瘍の有効量は、例えば、週処置プロトコールで３〜６週間連続投与され得る。他の投与経路が使用される場合、当業者であれば、特に、毎日処置プロトコール、週処置プロトコールで、少なくとも０．０１mg/cm³腫瘍、好ましくは０．１〜４０mg/cm³腫瘍、最も好ましくは１〜２０mg/cm³腫瘍の腫瘍におけるコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量を得るための量を適合できる。例えば、全身経路の場合、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量又は単位投与量は、０．１〜１００mg、好ましくは４〜４０mgであり得る。従って、全身経路の場合、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の有効量又は単位投与量は、０．０６〜０．６mg/kg患者であり得る。当然ながら、当業者であれば、化学療法及び／又は放射線療法レジメンを考慮して、投与量及びレジメンを適合できる。

エンドソーム溶解剤、特にクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキンに関して、本発明の複合調製物、キット又は製品において使用されるエンドソーム溶解剤の有効投与量は、投与方法、処置中の病状、処置中の病状の重症度に応じて変わり得る。従って、エンドソーム溶解剤の投与量レジメンは、投与経路及び患者の状態を含む様々な要因に従って選択される。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医は、特に、コンジュゲートＤｂａｉｔ分子及び選択されたＤＮＡ損傷処置と組み合わせて、ガンの進行を予防、対抗又は停止するのに必要なエンドソーム溶解剤の有効量を容易に決定及び規定できる。

特定の実施態様では、経口経路が使用され、選択されたエンドソーム溶解剤が、マラリアを処置又は予防するのに有用であることが公知である場合、エンドソーム溶解剤、特にクロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキンは、マラリアを処置又は予防するのと同じ用量及びレジメンで使用される。例えば、選択されたエンドソーム溶解剤が、クロロキン又はヒドロキシクロロキン、より好ましくはクロロキンである場合、クロロキン又はヒドロキシクロロキンは、１００〜６００mg/日、好ましくは２００〜４００mg/日、より好ましくは約３００mg/日で、週１回、週２回、週３回又は週４回投与され得る。特定の実施態様では、クロロキン又はヒドロキシクロロキンは、１若しくは２週間に約１００mg/日で、又は１若しくは２週間に週２回約３００mgで投与され得る。

別の特定の実施態様では、局所経路、例えば皮下又は腫瘍内経路が意図される場合、エンドソーム溶解剤、特にクロロキン又はヒドロキシクロロキンより好ましくはクロロキンは、１００〜３００mgで使用され得る。

放射線療法に関して、当技術分野において公知の任意の放射線療法レジメンが使用され得る（特に、定位放射線照射（例えば、１５Gy）又は分割放射線照射）。分割放射線照射の使用は、特に効率的であり得、例えば、放射線照射は、毎日又は２〜５日ごと、好ましくは３〜４日ごとに、１、２、３、４、５又は６週間適用され得る。放射線照射は、１〜１０Gy、好ましくは２〜５Gy、特に２、３、４又は５Gyであり得る。例えば、６週間で１５ｘ２Gy、又は２週間で４〜６ｘ５Gyの分割放射線照射が、意図され得る。好ましい実施態様では、意図される放射線療法は、２週間で５Gyの放射線照射４回によるプロトコールである。放射線照射及びＤｂａｉｔ分子によるガンの併用処置の異なるレジメン又は条件を試験し、Ｄｂａｉｔ分子による腫瘍の放射線増感が、放射線量ではなくＤｂａｉｔ分子の用量に依存することを実証した。

化学療法に関して、本発明の複合調製物、キット又は製品において使用されるか、又は本発明の組成物と組み合わせて使用されるＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の有効投与量は、使用される特定のＤＮＡ損傷抗腫瘍剤、投与方法、処置中の病状、処置中の病状の重症度に応じて変わり得る。従って、ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の投与量レジメンは、投与経路及び患者の状態を含む様々な要因に従って選択される。通常の技術を有する医師、臨床医又は獣医は、ガンの進行を予防、対抗又は停止するのに必要なＤＮＡ損傷抗腫瘍剤の有効量を容易に決定及び規定できる。

処置は、１又はいくつかのサイクル、例えば２〜１０のサイクル、特に２、３、４又は５のサイクルを含み得る。サイクルは、連続してもよいし、分割されてもよい。例えば、各サイクルは、１〜８週間、好ましくは３〜４週間の期間によって分割される。

本発明のさらなる態様及び利点を以下の実験セクションに開示するが、これは例示的なものであって、本発明の範囲を限定しないとみなされるべきである。多数の参考文献が、本明細書において引用される；これらの各引用文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化したか、又はコレステロールに結合した短いＤＮＡ（Ｄｂａｉｔ）の分布及び活性のマルチスケール比較。
Ｄｂａｉｔ／ベクター複合体及び細胞取り込みの特性評価
ＰＥＩは、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド及びＲＮＡと非共有高分子電解質間複合体を形成できることが示された。長いＰＥＩ鎖は、遺伝子トランスフェクションにおいて非常に効果的であるが、それ以上に細胞毒性である。本発明者らは、Ｄｂａｉｔを有するいくつかのＰＥＩ粒子ポリプレックスを試験し、それらの活性を、コレステロールに共有結合した改変Ｄｂａｉｔ（ｃｏＤｂａｉｔと称する）と比較した。ｃｏＤｂａｉｔは、コレステロールの脂肪鎖に共有結合したｃｏＤｂａｉｔ分子であり、これは、追加のベクターなしで使用した。試験した各ベクターに関して、本発明者らの主な目標は、最高Ｄｂａｉｔ濃度で最も均一な粒径分布を有する製剤を開発することであった。動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）によって、粒子の直径及び表面電荷を測定した。多モード分析を使用して、本発明者らは、２５Kdの平均サイズを有する分岐状ＰＥＩ（ｂＰＥＩ２５Ｋ）、及び、２２Kdサイズを有する直鎖状ＰＥＩ（ＰＥＩ２２Ｋ）又は１１Kdサイズを有する直鎖状ＰＥＩ（ＰＥＩ１１Ｋ）が、類似特性を有するＤｂａｉｔとの複合体を形成することを見出した（表１）。

Ｄｂａｉｔに対する異なる比率のＰＥＩを試験した。ゲルシフトアッセイによって、Ｄｂａｉｔ複合体を１００％もたらす最低比率を決定した。さらなる研究のために、ＰＥＩ１１Ｋ、ＰＥＩ２２Ｋ及びｂＰＥＩ２５Ｋに関して、６、６及び９のＮ／Ｐ比をそれぞれ選択した。Ｄｂａｉｔ−ＰＥＩ複合体粒子は、１時間にわたって、スクロース１０％中で安定であった。透過電子顕微鏡法によって、（ｌ２５〜１４０nmの範囲のサイズを有する）集団において、高均一性形態の球形粒子を確認した（図１Ａ）。０．８mg/mLを上回る濃度を有する希釈緩衝液中の塩の存在又は長期保管が、ＰＥＩ複合体凝集を誘導した。より大きくて多分散な凝集体（＞２μm）をもたらすSuperfect複合体（６０μgSuperfect／μgＤｂａｉｔ）を、ポジティブコントロールとして使用した。非荷電両親媒性共重合体Lutrolは、Ｄｂａｉｔと安定な相互作用複合体を形成せず、いくつかの実験において、ネガティブコントロールとして使用した。

本発明者らは、蛍光ｃｙ３改変Ｄｂａｉｔを使用して、異なる複合体の細胞取り込みをモニタリングした。トランスフェクションの直前に、ｃｙ３−Ｄｂａｉｔ複合体の初期蛍光をモニタリングした。ＰＥＩ複合体において、Ｄｂａｉｔの蛍光は２〜３倍減少しており、これは、ＰＥＩを有する分子の圧縮が蛍光をクエンチし得ることを示している（表１）。ｃｏＤｂａｉｔもネイキッドなＤｂａｉｔよりも蛍光が少なく、これは、コレステロールが同じ分子上でシアニンと相互作用し得ることを示している。Superfect又はLutrolは、蛍光に影響を与えなかった。フローサイトメトリー分析によって、トランスフェクションしたヒト線維芽細胞の細胞内含有量を測定した。ネイキッドなＤｂａｉｔ又はＤｂａｉｔ−Lutrol混合物で処理した細胞の蛍光分布は、未処理のコントロールと違いがなく、これは、Ｄｂａｉｔ分子が細胞に自然に入らなかったことを示している。エレクトロポレーションは、比較的非効率的であり、Ｄｂａｉｔの濃度を増加しても、トランスフェクション効率は向上しなかった。すべてのポリカチオン性ポリマー（ＰＥＩ及びSuperfect）は、効率的な細胞取り込みを促進したが、直鎖状ＰＥＩは、Ｄｂａｉｔ／Superfect又はＤｂａｉｔ／ＰＥＩｂ２５Ｋ複合体よりも広範な分布を示した。ｃｏＤｂａｉｔは、トランスフェクション因子の支援なしで、細胞に入ったが、効率は、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩよりも１０倍低かった。ｃｏＤｂａｉｔの濃度を１０〜１５倍増加すると、効率的なトランスワェクションが可能になった（図１Ｂ）。

ＤＮＡ輸送効率の限界の１つは、ＤＮＡがエンドソーム中に保持されることであり、これが、ＤＮＡがそのターゲットと相互作用するか、又は転写されるのを妨げている。ＤＮＡは、分解につながる通常のエンドソーム経路から細胞中にエスケープしなければならない。従って、ＤＮＡ送達の効率は、細胞取り込みだけでなく、不安定化及びエンドソームからのエスケープにも相関している。ＰＥＩは、エンドソーム及びリソソームからのＤＮＡ放出を促進する高い緩衝能力を有することが公知である（「プロトンスポンジ仮説」）。対照的に、ｃｏＤｂａｉｔは、エンドソームから効率的に放出されるために、クロロキン（ＣＱ）などの融合誘導因子の支援を必要とするであろう。トランスフェクション効率を向上する観点から、本発明者らは、トランスフェクションの３０分前に、１００μMＣＱを細胞に添加した。ＣＱは、ｃｏＤｂａｉｔの細胞取り込みを２〜４倍増加させた（図ｌ）。Ｄｂａｉｔ分子との結合によりトリガーされるＤＮＡ−ＰＫｃｓキナーゼの活性化（Quanz et al., 2009、前掲）によって、細胞中に放出されたＤｂａｉｔの量をモニタリングした。コレステロールの添加は、精製ＤＮＡ−ＰＫを活性化するＤｂａｉｔの能力に影響を与えなかった（図２Ａ）。ＤＮＡ−ＰＫに厳密に依存することが示されているＨ２ＡＸリン酸化の量によって、細胞中で、ＤＮＡ−ＰＫｃｓキナーゼの活性化をモニタリングした。Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ及びｃｏＤｂａｉｔは両方とも、処理した細胞におけるＨ２ＡＸリン酸化を誘導した（図２Ｂ）。分岐状及び直鎖状ＰＥＩ／Ｄｂａｉｔ複合体は、Ｈ２ＡＸリン酸化を迅速に促進し（図２Ｃ）、これは、トランスフェクションの開始後６時間に最高に達し、トランスフェクション後２４時間持続した。エレクトロポレーション後のいつの時点でも、Ｄｂａｉｔ誘導性キナーゼ活性は、非常に低かった（図２）。高濃度のｃｏＤｂａｉｔは、Ｈ２ＡＸをリン酸化するのに全く非効率的であり、最高値に達するのに少なくとも２４時間を必要とした。トランスフェクション中のＣＱの添加は、ｃｏＤｂａｉｔをトランスフェクションした細胞において、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの活性化を、１０倍少ないＤｂａｉｔ／ＰＥＩで観察されたものまで増加させた（図２Ｃ）。ＣＱは、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩをトランスフェクションした細胞において、活性を増加させなかったが、これは、Ｄｂａｉｔが、ＰＥＩと複合体を形成する際に、エンドソームから効率的に放出されることを示している。トランスフェクション後５時間〜２４時間の間に、ｃｏＤｂａｉｔ細胞取り込みは増加しなかったので、ｃｏＤｂａｉｔによるＤＮＡ−ＰＫの緩徐活性化は、それがエンドソームから持続放出されることを明らかにしている。

ゼブラフィッシュ初期胚における細胞取り込み及び全体的な毒性
細胞培養物のＤｂａｉｔ取り込み及び活性を分析することによって、全生物における薬物拡散、細胞取り込み及び活性について結論を出すことはできない。本発明者らは、Ｄｂａｉｔ−ｃｙ３をネイキッドで又はアジュバントと共に、１０００細胞期（１Ｋ期）のゼブラフィッシュ胚（Kimmel et al., 1995, Dev Dyn 203:253-310）の細胞間隙に注射することによって、この組織を評価した。このプロトコールによって、ゼブラフィッシュ初期胚の急速に分裂する細胞で、細胞及び細胞内レベルのＤｂａｉｔ−ｃｙ３分布並びにその活性を、共焦点顕微鏡法によりｉｎ ｖｉｖｏ観察できた。１Ｋ期胚の動物極に注射したネイキッドなＤｂａｉｔ−ｃｙ３は、全胚盤葉の全体に急速に拡散し、注射後１５分までにもはや検出されなかった。Lutrolの添加は、Ｄｂａｉｔを注射地点付近の細胞外空間に保持することを可能にしたが、細胞取り込みを促進しなかった。Superfect又はＰＥＩの存在下において、多数の蛍光パッチが細胞内に観察されたが、これは、効率的な細胞取り込みを示している。ｃｏＤｂａｉｔ ｃｙ３は、パッチ状の細胞内蛍光と共に、原形質膜が持続的かつ濃く染色されるという別の種類の挙動を示した。注射前にＣＱと共に胚をインキュベーションすると、大きなｃｏＤｂａｉｔ蛍光パッチが、拡散した細胞内分布に変わった。

注射後２０時間の表現型効果の観察により、Ｄｂａｉｔ活性及び処置の全体的な毒性を評価できた。注射後２４時間に、ゼブラフィッシュ原基分布図発生（Woo et al., 1995, Curr Opin Genet Dev 5:439-443）に従って、原腸形成前の胚の動物極における注射領域に由来する幼生の頭部細胞（図３Ａ〜Ｃ）において、Ｄｂａｉｔ蛍光を検出した。アジュバントなし（ＮＡ）で又はLutrol（Ｌｕ）と組み合わせてＤｂａｉｔを注射しても、発生に対する効果は示されなかったが（図３Ｄ）、これは、上記Ｄｂａｉｔの細胞内取り込み不良に相関している。アジュバントの添加は、頭部において細胞死を引き起こしたが、注射量に相関して、大規模な細胞死及び奇形発生が観察される可能性がある。記載のように（図３）２４時間の表現型を分類することにより、注射した混合物の毒性を定量化できた。同じ濃度のＤｂａｉｔの場合、アジュバントに依存して、細胞死及びそれに続く発生異常に関して明らかな違いがあった。Superfect（ｓｕｐ）の添加は胚細胞に対して非常に毒性であり、タイプ２表現型の高い割合で大規模な早期細胞死が起こった。同様に、ＰＥＩ（２５Ｋ、２２Ｋ、１１Ｋ）の添加は、ゼブラフィッシュの割球に対して毒性であることが証明された。ＰＥＩ添加よりも効率が低いが、ｃｏＤｂａｉｔ注射は、有意な細胞死を引き起こした。ＣＱと共に胚をプレインキュベーションすると、毒性は有意に増加しなかった。要するに、早期胚細胞死及びそれに続く発生異常は、ゼブラフィッシュ胚において、Ｄｂａｉｔ＋／−アジュバントの全体的な毒性を評価するための高速かつ信頼できるプロトコールであった。細胞死と細胞取り込みの相関は、胚細胞におけるＤｂａｉｔの抗腫瘍活性が、毒性効果において重要な役割を果たす可能性があることを示唆していた。

マウスにおける局所及び全身毒性
細胞培養、ゼブラフィッシュ胚及びマウスのデータの整合性を評価するために、本発明者らは、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ１Ｋ、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ２２Ｋ、Ｄｂａｉｔ／ｂＰＥＩ２５Ｋ及びｃｏＤｂａｉｔの反復投与に対するヌードマウスの皮膚の耐性を分析した。３日間の毎日皮下（ＳＣ）注射後に、異なる製剤化Ｄｂａｉｔの毒性を分析した。すべてのＤｂａｉｔ／ＰＥＩが、注射による高い毒性を示し、これは、３．７５mg/kgでは許容されたが、５mg/kgから、局所壊死及び虚血に関連する局所炎症（これは、処置の停止により急速に消失した）をトリガーした。静脈内（ＩＶ）注射の毒性は、同様の結果を示した：Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ静脈内注射は、３mg/kgで致死的であり、これは、おそらく血液の詰まりによって注射中に死亡するためであった。潅流（０．４μL/mn）によって徐々に注射すると、６mg/kg Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ（６nmole／注射)まで許容値が上昇したが、これは、ＩＶ毒性のほとんどが、ボーラス注射部位の局所濃度に起因することを裏付けている。ＣＱの有無にかかわらず、ｃｏＤｂａｉｔは、使用した経路（ＳＣ、ＩＶボーラス又はＩＶ潅流）が何であれ、すべての試験用量（最大８００mg/kg／注射；８００nmole／注射）でいかなる毒性も示さなかった。

異種移植腫瘍における抗腫瘍活性
製剤化Ｄｂａｉｔの抗腫瘍効果を、放射線療法と組み合わせて、ＳＫ２８異種移植ヒトメラノーマで試験した。各放射線照射の５時間前に、腫瘍内注射を使用して、Ｄｂａｉｔ／ベクター複合体を投与した。

腫瘍内注射（ＩＴ）による薬物投与は、多くの試験で使用されていたが、現在では、臨床アッセイにおいてこの送達経路を避けるように推奨されている。本発明者らは、皮下注射（ＳＣ）によってＤｂａｉｔ／／ＰＥＩ１１ｋ又はｃｏＤｂａｉｔを腫瘍付近の領域に投与できる方法を調査した。いくつかの臨床アッセイをこの投与経路で上手く使用した。最初に、本発明者らは、腫瘍内注射１回又は腫瘍の反対側に施す皮下注射２回で処置した腫瘍における分子の拡散を比較した（図４）。ＰＥＩ１１ｋと複合体化した蛍光Ｄｂａｉｔは、注射部位で凝集体を形成する傾向があり、腫瘍の端に徐々に拡散した。対照的に、ｃｏＤｂａｉｔは、注射が腫瘍内か又はその周辺であろうと、注射付近でより均一な分布を示した。腫瘍成長コントロールに関して、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ１１ｋ又はｃｏＤｂａｉｔのＳＣ注射は、ＩＴ注射よりもわずかに効率的ではなかった（表２）。しかしながら、注射数を増加することにより、局所毒性を高めずに、腫瘍成長コントロールを大幅に改善できるはずである。

ＳＫ２８メラノーマ異種移植片を有するヌードマウスの５つのグループの生存を研究した。グループ１）未処置マウス（ｎ＝１６）；グループ２）放射線照射マウス（ＩＲ、ｎ＝１２）；グループ３）１mgのクロロキンを腹腔内注射した放射線照射マウス（ＣＱ、ＩＲ、ｎ＝１０）；グループ４）０．６mgのＤＴ０１（ｃｏＤｂａｉｔとも称される）を腫瘍内注射し、５時間後に放射線照射した処置マウス（ＤＴ０１、ＩＲ、ｎ＝１１）；及びグループ５）０．６mgのＤＴ０１（ｖｏＤｂａｉｔとも称される）を腫瘍内注射する２時間前に、１mgのクロロキンを腹腔内注射し、５時間後に放射線照射した前処置マウス（ＤＴ０１、ＣＱ、ＩＲ、ｎ＝１３）。

結果を図５に示す。

０．６mgのｃｏＤｂａｉｔを腫瘍内投与することにより、クロロキンによる前処置は、放射線療法単独（グループ２）と比較して、著しく放射線増感し、生存を増加させた（グループ５）のに対して、ｃｏＤｂａｉｔ（グループ４）及びＣＱ（グループ３）はいずれも、有意な放射線増感を示さなかった。グループ５の放射線増感の程度は、Ｎ／Ｐ＝６の比率でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と製剤化した０．０６mgのＤｂａｉｔで処置したものに類似していた。

ＳＫ２８メラノーマ異種移植片を有するヌードマウスにおいて、ｃｏＤｂａｉｔの皮下注射に基づく投与レジメンも評価した。このレジメンを図６に概略的に開示する。つまり、このレジメンは、２週間に、ｃｏＤｂａｉｔ及び放射線照射による４回の併用処置を含む。特に、４mgのｃｏＤｂａｉｔを、腫瘍の境界から５mm離れた２つの対点に皮下注射した。加えて、動物を、１mgのクロロキン（ＣＱ）で前処置し、ｃｏＤｂａｉｔ及び放射線照射による処置中に、同じ投与量のＣＱでさらに処置した。この投与レジメン後に腫瘍成長を評価し、結果を図６に示す。

最低腫瘍成長は、クロロキンによる前処置後に、クロロキンとｃｏＤｂａｉｔ及び放射線照射とを同時処置することによって観察されることが観察された。加えて、クロロキンで同時処置したグループは、クロロキン処置なしのものよりも均一な結果を示した。

結論
本研究において、本発明者らは、投与プロトコール及び製剤の開発を導くためのアッセイのセットを使用した。これらのアッセイにより、マウスにおける前臨床アッセイを実施する前に、Ｄｂａｉｔの異なる製剤を比較できた。Ｄｂａｉｔ細胞取り込み（これは、抗腫瘍薬物効果の必要条件工程である）の効率を評価するため、並びに、動物における前臨床試験に最も適切なプロトコール及び製剤を選択するために、細胞及びゼブラフィッシュ胚のアッセイを使用した。ゼブラフィッシュ胚における全体的な毒性は、マウスの皮膚又は全身注射後の毒性に相関しなかった。特に、ゼブラフィッシュ胚におけるｃｏＤｂａｉｔの高い毒性は、薬物と接触する細胞のほとんどがおそらく死亡したことを示したのに対して、マウスの皮膚は、ｃｏＤｂａｉｔ高用量の注射に対していかなる反応も示さなかった。この違いは、ゼブラフィッシュ初期胚における毒性が、健常組織感受性よりもむしろ腫瘍感受性の指標であることを示唆している。実際、Ｄｂａｉｔ分子は、正常皮膚ではなく腫瘍において特異的に毒性であることが示されている（Quanz et al., 2009、前掲）。細胞培養において同等のＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性化をトリガーしたＤｂａｉｔ／ＰＥＩ（５μM）及びｃｏＤｂａｉｔ（５０μM）＋ＣＱは、ゼブラフィッシュ胚に対する毒性効果が類似しており（図３Ｄ）、マウス腫瘍に対して有意な抗腫瘍活性を示した（表２、図５及び６）。この観察結果は、腫瘍細胞と特性（分裂指数並びに生化学的特性及び表現型形質を含む）が共通しているゼブラフィッシュ胚細胞の抗腫瘍活性に対する感受性と一致している。この仮説に一致して、本発明者らは、最近、１〜１６細胞期のゼブラフィッシュの割球にネイキッドなＤｂａｉｔを直接的に細胞内注射することによって、Ｄｂａｉｔの抗増殖活性を実証した。

試験したすべてのアジュバント分子の中で、ＰＥＩポリマーは、Ｄｂａｉｔ複合体を形成するのに最も効率的であった。しかしながら、組織及び血液系におけるそれらの毒性によって、それらの使用が制限されていた。徐々に投与すること（潅流）によって、及び、注射用量を異なる注射部位に分割することによって、局所毒性を部分的に解決した。しかし、コレステロールとＤｂａｉｔの共有結合は、アジュバントを添加せずにＤｂａｉｔを細胞に送達するための最良の代替手段を提供した。実際、試験用量の範囲内で毒性がないことは、抗腫瘍効果には最高用量が必要であるにもかかわらず、この分子が有用である可能性を示唆している。３nmole／注射の用量のＤｂａｉｔ／ＰＥＩ１１Ｋ及び３０nmole／注射の用量のｃｏＤｂａｉｔはそれぞれ、放射線照射単独で誘導した腫瘍成長の遅延を２倍にした。両製剤（６nmole及び８００nmole超）の各毒性は、Ｄｂａｉｔ／ＰＥＩ１１Ｋに関しては０．５及びｃｏＤｂａｉｔに関しては０．０３７未満という有効用量／毒性用量の相対比率を示したが、これは、ｃｏＤｂａｉｔが、臨床試験の非常に良い候補であることを示している。

材料と方法
Ｄｂａｉｔ及び粒子形成
前述のように（Quanz et al., 2009、前掲）、Eurogentec (Seraing, Belgium)又はAgilent Technologies Nucleic Acid Solution Division (Boulder, USA)の自動化固相オリゴヌクレオチド合成によって、Ｄｂａｉｔ及びｃｏＤｂａｉｔ分子を得た。変性逆相ＨＰＬＣ及び／又はＨＰＬＣ−ＩＥＸによって、それらを精製した。いくつかのＤｂａｉｔ誘導体を、蛍光Ｃｙ３（λ_励起＝５４０nm；λ_放出＝５６０nm）又はＣｙ５．５（λ_励起＝Ｘnm；λ_放出＝Ｘnm）でラベル化した。直鎖状ＰＥＩ（１１kDa及び２２kDa）は、Polyplus-Transfection (Illkirch, France)製であり、３００mM窒素濃度の即時使用可能な溶液として提供された。SIGMA-Aldrich (Saint Quentin, France)から、分岐状ｂＰＥＩ２５ｋｄを購入した。In Cell Art (Nantes, France)から、Lutrolを購入した。Ｄｂａｉｔ及びＰＥＩ溶液（ストックＰＥＩ）を、１０％スクロース又は１５０mM ＮａＣｌ（ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション実験用）中で希釈して、様々な比率のベクター／Ｄｂａｉｔを得た。ＰＥＩに関してはアミン窒素の数、及び、Ｄｂａｉｔに関してはリン酸塩の数によって、ＰＥＩ／Ｄｂａｉｔの比率（又はＮ／Ｐの比率）を決定した。典型的には、０．６mg/mL及びＮ／Ｐ６の複合体３００μLに関して、Ｄｂａｉｔ（１８０μg、０．５４μmolのリン酸塩）及び所望量のポリマー溶液（１１，４μLのＰＥＩストック溶液は、０．３μmolのアミン窒素を含む）を、１５０μL（１０％スクロース）にそれぞれ希釈した。製造業者（Qiagen, Courtaboeuf, France）に従って、１０μl Superfect／μgＤＮＡの比率でSuperfect／Ｄｂａｉｔ粒子を調製した。アガロースゲル電気泳動法によって、ベクター／Ｄｂａｉｔの錯体を分析した。サンプル（１８μL）をブロモフェノールブルー色素（１μL）と混合し、次いで、１，５％アガロースゲル上で、ＴＡＥバッファー１Ｘ（４０mMＴｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８．３、１mMＥＤＴＡ）を含む電気泳動チャンバーにロードした。ゲルを、１００ボルトで３０分間ランした。次いで、ゲルをエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で１５分間染色し、ＵＶ光の下でバンドを観察した。

細胞培養、Ｄｂａｉｔ分子及びトランスフェクション
自動化固相オリゴヌクレオチド合成によって、Ｄｂａｉｔ分子を作製した。配列は、５’−ＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＡＧＣＣＴＡＧＡ−（Ｈ）−ＴＣＴＡＧＧＣＴＴＧＴＴＴＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号４）（式中、Ｈは、ヘキサエチレングリコールリンカーである）である。ＳＶ４０でトランスフォーメーションした線維芽細胞ＭＲＣ−５を使用して、培養細胞での研究を実施した。１００％湿度、９５％空気及び５％ＣＯ_２の条件下、１０％ＦＣＳ及び抗生物質（１００μg/mLストレプトマイシン及び１００μg/mLペニシリン）を含む完全ＤＭＥＭ（Gibco, Cergy Pontoise, France）の単層培養で、細胞を３７℃で増殖させた。特に明記しない限り、６０mm直径プレートにおける１．２mLの血清不含ＭＥＭ培地中でトランスフェクションを実施した。製造業者の説明書に従って、ｊｅｔＰＥＩ（Polyplus-transfection, Illkirch, France）によるトランスフェクションを、６のＮ／Ｐ比率で実施した。つまり、Ｄｂａｉｔを１５０mM ＮａＣｌ中で希釈し、１５０mM ＮａＣｌ中で等量のＰＥＩと穏やかに混合し、血清不含ＤＭＥＭ培地に添加した。ｃｏＤｂａｉｔを、血清不含ＤＭＥＭ培地に直接添加した。Superfect試薬を用いて、Ｄｂａｉｔ分子のトランスフェクションを（６０mm直径プレートにおける）１．２mLの血清含有ＤＭＥＭ培地中で５時間実施し、次いで、特に示さない場合は、細胞を１時間放置して回収した。エレクトロポレーションの場合、Gene Pulser II (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)を使用して、１．２×１０^６個の細胞を、２μgのＤｂａｉｔでトランスフェクションした。５時間のトランスフェクションの終了時に、培地を完全培地に交換し、分析する前に、細胞を、指示された時間増殖させた。トランスフェクション前に、クロロキン（５０μM）を３０分間添加した。

フローサイトメトリー
細胞を、Ｄｂａｉｔ−ｃｙ３を有する異なる複合体で５時間トランスフェクションし、５時間又は２４時間増殖させ、ＰＢＳで速やかに洗浄した。フローサイトメトリーによって、細胞を直接分析した。フローサイトメトリーによる免疫蛍光検出の場合、免疫検出の前に、細胞を２％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。透過処理により、同じ細胞における免疫蛍光検出及びＤｂａｉｔ検出を害するＤｂａｉｔのほとんどが排除されたことに留意すべきである。細胞を４％ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で１時間透過処理し、２％ＢＳＡでブロッキングし、氷上で一次抗体、マウスモノクローナル抗体抗γ−Ｈ２ＡＸ（Upstate Biotechnology, Temecula, CA, USA）と共に２時間インキュベーションし、１／２００の希釈、３０分間、室温（RT）で、Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)、Texas Red (Rockland, Gilbertsville, PA, USA)とコンジュゲーションした二次抗体により可視化した。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μg/mLヨウ化プロピジウム、２５U/ml ＲＮａｓｅＡを含むＰＢＳ中で再懸濁した。FACScaliburフローサイトメーター（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA）によって細胞を分析し、BD CellQuest Pro (BD Biosciences)及びフリーのWinMDI 2.8 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA)ソフトウェアを使用してデータを分析した。

ゼブラフィッシュの管理、胚採取及び処置
野生型又はトランスジェニック（βアクチン：ｅｇｆｐ−ｒａｓ）フィッシュ系統の自然産卵から、ゼブラフィッシュの卵を得た。落射蛍光照明（Leica MZ16F）及び空気注入器（Eppendorf FemtoJet）を備える解剖顕微鏡上に固定したNarishige (MN 153)マイクロマニピュレーターを、１Ｋ細胞期にＤｂａｉｔ注射を実施するのに使用した。ＫｏｐＦ垂直ピペットプラー（KopF 720）でガラスキャピラリー（Harvard Apparatus GC100-10）を引き伸ばして、注射針を作製した。２〜５nlのＤｂａｉｔ溶液を１０細胞周期の胚の動物極に注射し、４０ｘ／０．８ＮＡ水浸漬対物レンズを備える共焦点レーザー走査顕微鏡イメージング（upright Leica SP2）のためにすぐに加工した。４８０nm（ｅＧＦＰ）及び５６１nm（ｃｙ３）の同時励起によって、イメージングを実施した。２４ｈｐｆまで、胚を２８．５℃でさらに成長させた。解剖ストップ（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｓｔｏｐ）の下で１日齢の幼生を観察し、図３に記載するように、表現型を分類した。注射前のクロロキン処置は、５０μMクロロキン含有胚培地（The Zebrafish Book）における２時間のインキュベーションであった。Ｄｂａｉｔ（ｃｏＤｂａｉｔ）−ｃｙ３ ５０μMを、単独で又はＰＥＩ２５Ｋ（Ｎ／Ｐ＝９の比率）、ＰＥＩ１１Ｋ（Ｎ／Ｐ＝６の比率）、Superfect（１０μl／１μgＤｂａｉｔ）と組み合わせて注射した。

マウスにおけるＤｂａｉｔ及び放射線照射処置
成体雌性ヌードマウス（Charles River strain; L’arbresle, France）の側腹に１０^６個の腫瘍細胞を注射することによって、ＳＫ２８又はＵ８７Ｇ異種移植腫瘍を得た。実験を開始する前に、動物を研究室で少なくとも１週間飼育した。明暗周期（１２時間：１２時間）、相対湿度（５５％）及び温度（２１℃）のコントロール条件下で、動物５〜６匹／ケージであった。餌及び水道水は、自由に利用可能であった。約１２日後に、測定した皮下腫瘍が１５０〜２００mm³である場合、多くても１２匹ずつの均一なグループにマウスを分けて、異なる処置を施した。動物の身体の約３分の２を保護するためのシールドデザインを用いて、^１３７Ｃｓ単位（０．５Gy/分）で放射線照射を実施した。熱ミネセンス線量測定法によって、線量をコントロールした。１週間あたり５Gyのセッションを３回の間隔で、６回のセッションによって、３０Gyの総線量を２週間で送達した。ＰＥＩとの混合をＮａＣｌ（Polyplus Transfection, Strasbourg, France）なしで実施した点を除いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に関して前述したように、１００μLの１０％スクロース中でＤｂａｉｔ分子を調製した。注射前に、Ｄｂａｉｔ混合物を室温で１５分間インキュベーションした。ｃｏＤｂａｉｔを１０％スクロース中で必要濃度に希釈した。各放射線療法セッションの５時間前に、指示量のＤｂａｉｔの腫瘍内注射を実施した。関連アッセイのプロトコールに従って、１００μLの１０％グルコースをモック処置動物に注射した。キャリパー測定によって３日ごとに腫瘍サイズを評価し、定式（２ｘ長さｘ幅^２）によってサイズを算出した。マウスの体重を量り、腫瘍の写真を毎週撮影した。腫瘍が２０００mm³に達した場合、倫理的理由により、動物を屠殺した。いくつかの分析において使用したこの評価項目は、死亡日とした。Local Committee on Ethics of Animal Experimentation (Orsay, France)がすべての実験を承認した。

統計的分析
各処置及び各腫瘍型に関して、腫瘍反応の記述的分析を実施した。１日目を、最初の処置セッションの日とした。すべての動物を少なくとも１５０日間追跡した。Kaplan-Meier法に従って、平均寿命を評価した。各処置グループにおける個々のマウスの腫瘍容積の４倍から、コントロールグループの平均腫瘍容積の４倍を引くことによって、腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）を算出した。個別測定を使用して、各処置グループの平均ＴＤＧを算出した。Kaplan-Meier評価によって全生存曲線を評価し、データが正規分布に従わないので、ノンパラメトリックLogRank検定を使用して比較した。statELソフトウェア（ad Science, Paris, France）を使用して、分析を実施した。最初に、同じ腫瘍型を有する各グループに関して、グローバルなLogRankを実施した。次いで、Ｄｂａｉｔによる処置をモック処置コントロールと比較した。動物の数（ｎ）、相対リスク（ＲＲ）及びｐ値を表２に報告する。有意水準０．０５で、すべての試験を有意であると判断した。

製剤化Ｄｂａｉｔ粒子の物理化学特性
これらの仕様：中間粘度：１．１５０ｃＰ、屈折率：１．４５、散乱角：９０°、温度：２５°ＣによるZetasizer nanoシリーズ（Malvern instruments, Paris, France）での動的光散乱（ＤＬＳ）によって、ベクター／Ｄｂａｉｔの粒子サイズを測定した。データは、１サンプルあたり３〜５回の測定の平均であり、各測定は、１０〜１５回のサブラン（ｓｕｂ−ｒｕｎ）のデータを平均している。機器に付属の多モード数分布ソフトウェアを使用して、データを分析した。ゼータ電位測定に関して、粒子を１０％スクロース／１０mM ＮａＣｌ中で希釈して、０．１mg/mLの最終Ｄｂａｉｔ濃度とし、以下の仕様：３回の測定、中間粘度：１．０５４ｃＰ、中間誘電率：７９、温度：２５°Ｃで測定した。

透過電子顕微鏡法
酢酸ウラニルでネガティブ染色することによって、透過電子顕微鏡法用のサンプルを調製した。サンプル１滴（１０μL）をグリッド（formvar/carbon on 200 mesh copper, AGAR scientific）上に付着させ、余分な液体を吸い取り紙で除去する前に、３分間放置した。次いで、複合体を、１０μLの水性酢酸ウラニル（２％）で２分間染色し、余剰分を吸い取り紙で除去した。Jeol JEM-100S電子顕微鏡で観察を行った。

別のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子
別のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子を調製し、以下に記載する：

式（ＩＩｅ）のコンジュゲート分子

と、

式（Ｉｅ）のコンジュゲート分子

と、

上記に詳述するように（図７）、ＤＮＡ ＰＫ阻害によって、これらの別のコンジュゲートＤｂａｉｔ分子の活性を測定した。コンジュゲート分子は、活性を維持していることが認められた。特に、５’末端又はループのいずれかにおける様々な脂質とリガンドのコンジュゲーションは、ＤＮＡ−ＰＫ活性をトリガーするこれらの分子の能力に対する影響が小さかった。

加えて、上記に詳述するように（図８）、Ｈ２ＡＸリン酸化の量を測定することによって、クロロキンあり又はなしの場合のそれらの活性も細胞株で測定した。最初に、試験したコンジュゲートＤｂａｉｔ分子に関して、それらの活性は、クロロキンによる前処置により高くなることが認められた。加えて、驚くべきことに、５’末端へのコレステロールのコンジュゲーションは、ヘアピンループにおけるコレステロールのコンジュゲーションよりも効果的な分子をもたらすことに留意すべきである（０８１３及び０８１５と比較して、０９０２を参照）。

コンジュゲートＤｂａｉｔ分子の細胞取り込み
本発明者らは、フローサイトメトリー分析によって、コレステロールにコンジュゲーションしたＤｂａｉｔ、特にＣｏＤｂａｉｔの細胞取り込みを、Ｄｂａｉｔと比較して測定した。

結果を以下の表に示す。

表に記載される様々なトランスフェクション条件の処置の開始後５時間に、ＭＲＣ５細胞株における細胞取り込みのフローサイトメトリー分析を実施した。すべてのオリゴヌクレオチドをシアニン３（Ｃｙ３）色素でラベル化した：Ｄｂａｉｔ（Ｄｂａｉｔ−Ｃｙ３）、コレステロール−Ｄｂａｉｔ（０８１３）（ＣｏＤｂａｉｔ−Ｃｙ３）、及び、センス鎖の５’及び３’にシアニン３とコレステロールとを有するＨ２ＡＸターゲティングｓｉＲＮＡ（Ｃｏ＿ｓｉＲＮＡ＿Ｈ２ＡＸ：Ｃｙ３−５’−ＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＧＣＧＡＡＵＣＴＴ−３’−コレステロール（配列番号６）；５’−ＧＡＵＵＣＧＣＧＵＣＵＵＣＵＵＧＵＵＧＴＴ−３’（配列番号７）。示されている場合は、トランスフェクション前に、５０μMのクロロキン（ＣＱ）を添加した。

Claims (14)

1. 少なくとも１つの自由末端と、ヒトゲノムの遺伝子と８０％未満の配列同一性を有する２０〜２００ｂｐのＤＮＡ二本鎖部分とを有するコンジュゲート核酸分子及びキノリンエンドソーム溶解剤を含む、医薬組成物であって、脂溶性分子又は細胞レセプターをターゲティングしてレセプター介在性エンドサイトーシスを可能にするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子に前記核酸分子が共有結合している、医薬組成物。
2. 少なくとも１つの自由末端と、ヒトゲノムの遺伝子と８０％未満の配列同一性を有する２０〜２００ｂｐのＤＮＡ二本鎖部分とを有するコンジュゲート核酸分子及びキノリンエンドソーム溶解剤を含む、同時、個別又は逐次使用のための複合調製物としての製品であって、脂溶性分子又は細胞レセプターをターゲティングしてレセプター介在性エンドサイトーシスを可能にするリガンドから選択されるエンドサイトーシスを促進する分子に前記核酸分子が共有結合している、製品。
3. キノリンエンドソーム溶解剤が、コンジュゲート核酸分子の前及び／又は同時に投与される、詰求項２記載の製品。
4. キノリンエンドソーム溶解剤が、少なくとも１週間の前処置として経口経路により投与され、次いで、コンジュゲート核酸分子及びキノリンエンドソーム溶解剤が、同時、個別又は逐次使用のための複合調製物として投与される、請求項２又は３記載の製品。
5. ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
6. ガンの処置における使用のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
7. 処置が、放射線療法又は、好ましくはＤＮＡ損傷抗腫瘍剤による化学療法をさらに含む、請求項６記載の組成物又は製品。
8. ＤＮＡ損傷抗腫瘍剤が、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡアルキル化剤、代謝拮抗剤及び有糸分裂紡錘体の阻害剤からなる群より選択される、請求項７記載の組成物又は製品。
9. キノリンエンドソーム溶解剤が、クロロキン又はヒドロキシクロロキン、好ましくはクロロキンである、詰求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
10. エンドサイトーシスを促進する分子が、単鎖又は二本鎖脂肪酸、例えばオクトデシル及びジオレオイル、トコフェロール、葉酸塩又は葉酸、コレステロール、糖、例えばガラクトース及びマンノース並びにそれらのオリゴ糖、ペプチド、例えばＲＧＤ及びボンベシン、及びタンパク質、例えばインテグリンからなる群より選択され、好ましくは、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸及びコレステロールからなる群より選択され、より好ましくは、コレステロールである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
11. コンジュゲート核酸分子が、下記式：
    

    

    
    （式中、Ｎは、ヌクレオチドであり、ｎは、１５〜１９５の整数であり、下線部のＮは、改変ホスホジエステル骨格を有するか、又は有しないヌクレオチドを指し、Ｌ’は、リンカーであり、Ｃは、エンドサイトーシスを促進する分子であり、Ｌは、リンカーであり、ｍは、０又は１の整数である）の１つを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
12. コンジュゲート核酸分子が、下記式：
    

    

    
    

    

    
    （式中、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート又はメチルホスホネート骨格を有するか、又は有しないヌクレオチドを指し、連結されたＬ’は、ヘキサエチレングリコール、テトラデオキシチミジレート（Ｔ４）及び２，１９−ビス（ホスホル）−８−ヒドラザ−１−ヒドロキシ−４−オキサ−９−オキソ−ノナデカンからなる群より選択され；ｍは、１であり、Ｌは、カルボキサミドオリゴエチレングリコールであり、Ｃは、単鎖又は二本鎖脂肪酸、例えばオクトデシル及びジオレオイル、トコフェロール、葉酸塩又は葉酸、コレステロール、糖、例えばガラクトース及びマンノース並びにそれらのオリゴ糖、ペプチド、例えばＲＧＤ及びボンベシン及びタンパク質、例えばインテグリンからなる群より選択され、好ましくは、ジオレオイル、オクタデシル、葉酸及びコレステロールからなる群より選択され、より好ましくは、コレステロールである）の１つを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
13. エンドサイトーシスを促進する分子が、コレステロールである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物又は製品。
14. コンジュゲート核酸分子が、
    

    

    
    （式中、下線部のヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するヌクレオチドを指す）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物又は製品。

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