CN104788523A - 用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物领域，具体为肿瘤学领域。本发明公开了用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统。具体地，本发明涉及用于与促进内吞的分子结合的有治疗用途的核酸的、具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统，尤其是用于治疗癌症。

Description

用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统
本申请是国际申请日为2011年6月21日、国际申请号PCT/EP2011/060280于2012年12月24日进入中国国家阶段、申请号201180031310.4、发明名称“用于核酸结合物的具有内涵体溶解剂的优化的体内递送系统”申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及药物领域，具体为肿瘤学领域。
背景技术
癌症的治疗主要由只要有可能的手术、细胞毒剂例如化学疗法以及放射疗法构成。在过去十年中，已出现了用于癌症治疗的分子疗法，例如：靶向细胞膜受体的单克隆抗体、酪氨酸激酶受体的抑制剂或靶向参与细胞增殖、死亡和存活的信号转导的其他激酶。作为细胞生长抑制剂，它们的单独治疗方案往往缺乏足够的临床效益。通过与细胞毒剂组合，往往获得协同性结果，但该结果受到它们累积的副作用的限制。
大多数癌症治疗直接或间接地在所治疗的增殖性肿瘤细胞中造成DNA损伤，这最终导致所述细胞的死亡。然而，肿瘤对这些治疗的几种固有和获得的耐受性至少部分是由于肿瘤细胞的有效DNA修复活性引起的。目前众所周知的是，DNA修复是癌症治疗的重要靶标(Helleday等.Nat.Rev.Cancer,2008,8:193-204)。该领域中最先进的药物开发是PARP抑制剂。
由于DNA修复在所有生命界中都是必不可少的存活过程，因此，它具有多种特化的修复途径，并具有一定的冗余度，使得当一种途径缺陷或被治疗剂例如DNA修复抑制剂阻断时，该过程仍然是健全的。因此，不是靶向参与DNA修复过程的关键基因/蛋白质，而是，不论其生物重要性和临床相关性如何，创新性的分子疗法必须将一种或数种关键途径作为整体性靶标并结合常规疗法来对待，从而达到最有效的癌症治疗。
为了使癌不能防御现有的治疗，设想了整体性靶向DNA损伤感应、信号转导和修复途径。一种策略由下面的方式构成：将模拟双链断裂(DSB)的、名为Dbait的修饰的短DNA分子导入到在那时之前可以有效地修复DSB并因此存活的细胞中。下面这一事实解释了Dbait联合放射疗法(RT)或化学疗法(CT)的抗肿瘤功效：Dbait分子捕获初始DSB感应复合物、干扰下游的修复信号转导，随后瓦解所有DSB修复系统(非同源末端连接和同源重组途径两种)，并最终抑制DSB修复(WO2005/040378；WO2008/034866；Quanz等,2009,ClinicalCancer Research 15:1308；Quanz等,2009,PLoS ONE 4:e6298；Dutreix等,2010,Mut.Res.704:182)。最终，癌细胞不再能够逃脱死亡。还发现，在不与放射疗法(RT)或化学疗法(CT)组合的情况下，Dbait分子单独也是有效的(WO2008/084087)。
然而，一旦鉴定到了有临床用途的活性剂后，经常出现的问题是要找到最佳的方式来递送活性剂，特别是核酸剂。有效的非病毒DNA/RNA递送系统的发展和优化必须解决毒性问题，《组织和全身性屏障》例如降解，带电的血清成分对粒子的调理作用，快速清除和在非靶组织的蓄积；当通过全身性途径施用活性物质时，对其递送而言的“细胞屏障”，例如低摄取跨越细胞质膜，DNA分子在活性细胞室中的释放不充分，以及缺乏细胞核靶向(基因治疗所需要的)。
事实上，大多数这些活性剂必须被细胞摄取并到达细胞质和/或细胞核，才能有效。具体地，当将包括核酸的活性剂以其“游离”或裸露形式施用时，它们常常在被靶细胞摄取之前和之后受到降解。在细胞内，这种降解主要是由于下面这一事实引起的：核酸通过内吞进入细胞，被隔离在细胞的内涵体中，内涵体最终发展成溶酶体，在溶酶体中，化学降解和酶降解是非常有效的。
在现有技术中，已将活性剂与多种载体结合并囊封到脂质体、胶束和纳米粒子中，它们在其中受到保护而免于在血清中降解。现有技术还采用了多种化学方法来将核酸和其他活性剂共价偶联至分子载体，所述分子载体包括聚合物例如葡聚糖或PEG，或旨在降低清除率的分子，包括转铁蛋白的载体，亲脂性分子例如与siRNA连接以增强细胞摄取的胆固醇(Chen等,2010,J.Controlled Release 144:227)。这样的载体可以包括靶向部分例如抗体、多肽、核酸和其他物质，以将活性剂导向所选择的靶细胞中。现有技术还公开了用于药物组合物的改善内吞的分子(US2008/0194540)。
然而，当活性DNA/RNA剂被细胞通过内吞过程摄取时，它们常常最终成为被隔离在它们无法逃脱的内涵体中，由此极大地降低了它们的治疗潜力。例如，Zimmermann等表明，胆固醇-siRNA(ApoB-1)结合物在小鼠中的效力比其脂质体制剂(SNALP载体)小约1000倍：100mg/kg chol-siApoB-1相当于0.1mg/kg SNALP-ApoB-1(Zimmermann等Nature,2006,441:111-114，补充图1)。
对于核酸，现有技术已尝试通过使用阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)(WO96/02655)或具有膜融合脂质或肽例如SNALP载体的脂质体来解决这个问题。PEI能够通过明确描述的质子海绵效应来使内涵体不稳定化，并由此促进核酸的释放。然而，PEI的使用往往受到其细胞毒性的限制，并且到目前为止还没有被批准用于人类。脂质体制剂也表现出毒性和受限的核酸囊封(通常在1-2mg/mL的范围内)，所述受限的核酸囊封可能不适合于需要核酸剂的高有效荷载的应用。
已知，“内涵体溶解(Endosomolytic)”剂例如氯喹在培养的细胞中通过促进核酸从内涵体逃脱进入细胞质来增强核酸的转染。然而，氯喹的应用仅限于体外应用，并且仅很少被评估用于辅助核酸的体内递送。其原因可能是，由于氯喹的毒性，现有技术中关于核酸的报道的教导与其体内应用相背离。
Benns等(2000,Bioconj.Chem.11:637)报道了“尽管氯喹已被证明有助于质粒DNA释放进入细胞质中，但据发现，氯喹是有毒的，因此不能在体内使用”。该问题的部分原因是下面这一事实：需要相对高浓度的游离氯喹来到达内涵体中核酸(即质粒DNA)的相同部位。类似地，Zhang等(2003,J Gene Med 5:209)研究了氯喹用于基因递送至肝脏的体内应用。在这篇文章中，他们将质粒与作为DNA载体的肽(聚赖氨酸/molossin)一起使用。他们的结论是，尽管氯喹可有效促进基因递送至肝脏，但需要多次给药，并且它的应用受到了全身性毒性的限制。事实上，他们证实了，氯喹的急性全身性毒性将体内应用水平限制到大大低于最佳基因递送所需要的水平。氯喹的局部递送也受到氯喹的局部毒性以及它们从递送部位向外扩散的限制。最后，当使用裸DNA时，他们没有观察到基因递送或观察到非常低的水平。
在这方面，WO2007/040469公开了如下解决方案：通过将氯喹与活性剂共价偶联，从而降低所需要的总剂量，可以克服必需的高浓度氯喹的问题。WO2009/126933提出将待递送的核酸与内涵体溶解剂和靶向配体两者共价连接。
氯喹及其衍生物例如羟氯喹被用于疟疾的治疗性和预防性治疗。还研究了它与癌症的放射疗法和/或化学疗法的组合使用(Sotelo等,2006,Ann Intern Med 144:337-342；NCT01023477和NCT00969306)。其假设是，氯喹/羟氯喹抑制自噬，自噬是通过将治疗剂输出到溶酶体中使它们在其中被降解的正常细胞防御过程。
总之，基于核酸的疗法的优化需要进一步解决合成DNA递送系统的效率和细胞毒性。
发明内容
本发明提供了用于体内递送有治疗用途的核酸的新型有效方法，所述方法是基于有治疗用途的核酸与促进内吞的分子的共价结合、以及结合的有治疗用途的核酸与内涵体溶解剂的组合使用。具体地，该体内递送系统被用于Dbait分子。
因此，本发明涉及包含结合的核酸分子和喹啉内涵体溶解剂的药物组合物，所述结合的核酸分子具有至少一个游离末端和与人类基因组中的任何基因具有小于60％序列同一性的20-200bp的DNA双链部分，所述核酸分子与促进内吞的分子共价连接，所述促进内吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的内吞的配体。所述药物组合物还可以包含DNA损伤性抗肿瘤剂。
本发明还涉及产品，所述产品包含结合的核酸分子和喹啉内涵体溶解剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂，所述结合的核酸分子具有至少一个游离末端和与人类基因组中的任何基因具有小于60％序列同一性的20-200bp的DNA双链部分，所述核酸分子与促进内吞的分子共价连接，所述促进内吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的内吞的配体。所述产品还可以包含DNA损伤性抗肿瘤剂。优选地，在结合的核酸分子之前和/或同时施用喹啉内涵体溶解剂。具体地，将喹啉内涵体溶解剂作为预处理通过口服途径施用至少一周，然后将结合的核酸分子和喹啉内涵体溶解剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂来施用。
本发明涉及如本文所公开的药物组合物或产品，所述药物组合物或产品用于治疗癌症。优选地，所述治疗还包含放射疗法或化学疗法，优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂。任选地，DNA损伤性抗肿瘤剂选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。
在优选实施方式中，喹啉内涵体溶解剂是氯喹或羟氯喹，优选为氯喹。
在优选实施方式中，促进内吞的分子选自单或双链脂肪酸例如十八烷基和二油酰基，生育酚，叶酸盐或叶酸，胆固醇，糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如整合素，优选为单或双链脂肪酸、叶酸盐和胆固醇，更优选为二油酰基、十八烷基、叶酸和胆固醇，还更优选为胆固醇。
在优选实施方式中，结合的核酸分子具有下式之一：
其中N是核苷酸，n是从15至195的整数，带下划线的N是指有或没有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'是接头，C是促进内吞的分子，L是接头，m是为0或1的整数。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。优选地，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或，m是1并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，优选为甲酰胺基三乙二醇；和/或，C选自单或双链脂肪酸、叶酸盐和胆固醇。更优选地，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；并且，m是1并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，优选为甲酰胺基三乙二醇；并且，C选自单或双链脂肪酸、生育酚、叶酸盐或叶酸、胆固醇、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽、以及蛋白质例如整合素，优选为单或双链脂肪酸、叶酸盐和胆固醇。更优选地，C选自二油酰基、十八烷基、叶酸和胆固醇。还更优选地，C是胆固醇。
在更具体的实施方式中，结合的核酸分子具有下式之一：
其中带下划线的核苷酸是指有或没有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，L'是接头，C是促进内吞的分子，L是接头，m是为0或1的整数。优选地，带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸。优选地，带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸；和/或，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或，m是1并且L是低聚乙二醇，优选为甲酰胺基三乙二醇、甲酰氨基四乙二醇、甲酰胺基低聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇；和/或，C选自单或双链脂肪酸、生育酚、叶酸盐或叶酸、胆固醇、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖，肽例如RGD和铃蟾肽、以及蛋白质例如整合素，优选为单或双链脂肪酸，叶酸盐和胆固醇。更优选地，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；并且，m是1并且L是甲酰胺基聚乙二醇，优选为甲酰胺基三乙二醇；并且，C选自单或双链脂肪酸、叶酸盐和胆固醇。更优选地，C选自二油酰基、十八烷基、叶酸和胆固醇。还更优选地，C是胆固醇。
在非常具体的实施方式中，结合的核酸分子是
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。
附图说明
图1：配制的Dbait的细胞摄取。(A)具有PEI11k的Dbait复合物的显微镜分析(a)。(B)对于各种转染条件，在开始处理后5小时进行细胞摄取的流式细胞术分析。具有superfect的Dbait-cy3，在转染前未用和用氯喹处理的2μg/ml coDbait-cy3，未用和用CQ的25μg/ml coDbait-cy3。
图2：配制的Dbait的活性。(A)在向无DNA、0.25μg Dbait或0.25μg coDbait加入50u纯化的酶复合物后测定DNA-PK的活化，(B)在用1.6μg/ml Dbait(左)、1.6μg/ml Dbait/PEI11K(中)、16μg/mlcoDbait和CQ处理后24小时，对细胞中的γ-H2AX进行免疫检测。比例尺：20μm。(C)在用各种配制的Dbait处理后5小时(黑色)和24小时(灰色)，γ-H2AX的定量。所有转染都是用1.6μg/mL Dbait或16μg/mL coDbait进行的。在指出时，在转染前加入CQ。
图3：在Dbait注射到1K细胞期斑马鱼胚胎的细胞外空隙后24小时的表型。(A-C)在Dbait-cy3+PEI注射(2-5nL)到1K细胞期斑马鱼胚胎的动物极处后24小时，斑马鱼胚胎左侧前部的侧视图：顶排，明视场；底排，放大2倍的头部区域，其中落射荧光叠加显示红色的Dbait-cy3。(A)与未注射的(未示出)无法区分的1型表型。(B)在头部区域具有大量细胞死亡的2型轻度表型。(C)具有强致畸和广泛的细胞死亡的3型。(D)直方图显示了三种表型类别取决于佐剂的百分数。为每种条件分析超过100个的胚胎。NA：单独注射Dbait；Sup：Superfect；相应尺寸的25K、22K、11K PEI；chloro：氯喹；Lut：Lutrol。
图4：在肿瘤中的扩散和活性。用1.6μg Dbait-cy5.5/PEI或16μgcoDbait-cy5.5(1/10cy5.5标记的cdDbait+9/10未标记的coDbait，以便保持相似的荧光强度)注射肿瘤，并在次日对荧光分布和DNA-PKcs活性进行分析。在下面两种类型的注射后，荧光Dbait的扩散：一次瘤内注射或两次皮下注射。
图5：5组携带有SK28黑色素瘤异种移植物的裸鼠的存活：1)未治疗(n＝16)；2)辐射(IR，n＝12)；3)辐射和腹膜内注射1mg氯喹(CQ，IR，n＝10)；4)通过瘤内注射0.6mg DT01(也称为CoDbait)进行治疗并在5小时后进行辐射(DT01，IR，n＝11)；以及5)腹膜内注射1mg氯喹进行预处理，2小时后瘤内注射0.6mg DT01(也称为CoDbait)，并在5小时后进行辐射(DT01，CQ，IR，n＝13)。
图6.被移植到裸鼠上的黑色素瘤SK28的肿瘤生长研究。顶部：治疗方案：在两周内与4种辐射(RT)期组合的4种DT01(也称为CoDbait)治疗。在两个相对的点皮下注射4mg DT01，所述两个相对的点与肿瘤边界相隔5mm。在开始治疗前以及在DT01+RT治疗期间用1mg氯喹(CQ)通过口服施用(p.o.)*一周两次对动物进行预处理。中间：各种动物组的肿瘤生长的平均值：未治疗或CQ：未治疗或仅用CQ处理(n＝11)；RT或CQ+RT：有或无氯喹共处理进行辐射(n＝16)；DT01+RT：通过DT01和辐射进行治疗(n10)；DT01+CQ+RT：通过DT01与氯喹和辐射进行治疗(n＝12)。底部：DT01+RT和DT01+CQ+RT组的详情。每条曲线对应于一个肿瘤的生长。
图7：用试剂盒SignaTECT DNA依赖性蛋白激酶检测系统(SignaTECT DNA-dependent Protein Kinase Assay System)(Promega，Madison，WI，USA)监测DNA-PK活性。根据制造商的说明书，将生物素化的肽底物、50单位的DNA-PK(Promega，Madison，WI，USA)和500nM的各种Dbait分子在30℃下与(γ-32P)ATP孵育5分钟。将生物素化的底物捕获在链霉亲和素(streptavidin)膜上，洗涤，并在闪烁计数器中进行计数。通过结合的放射性除以每个样品的(γ-32P)ATP总数来计算磷酸化百分数。Dbait32Hc是未结合的Dbait分子。0813、0815、0902、0903、0904和0905是结合的Dbait分子(参见“可选的结合的Dbait分子”表)。Dbait8H是被用作DNA-PK活性的阴性对照的短(8-bp)Dbait。
图8：通过H2AX磷酸化测得的Dbait分子的活性。在有或无50μM氯喹前处理的条件下转染了各种结合的Dbait分子(参见“可选的结合的Dbait分子”表)后24小时，MRC5细胞系中γ-H2AX的免疫检测。通过聚乙烯亚胺(PEI)配制的Dbait被用作阳性对照。
具体实施方式
导入小DNA分子(Dbait)削弱了受损染色体的DNA修复，并提供了用于增强放射疗法或化学疗法在肿瘤、特别是耐受性肿瘤中的功效的有效方法。然而，Dbait分子的增敏活性取决于它们在肿瘤细胞内的递送效率。
因此，本发明人比较了不同的策略来改善这个关键步骤。为了对策略进行测试，他们开发了一系列试验：(i)用Dbait分子形成的复合物的分子分析，(ii)用于Dbait摄取和活性的细胞试验，(iii)活斑马鱼胚胎共聚焦显微镜监测所配制的分子的体内分布和生物活性。这些试验使得能够在小鼠上对异种移植瘤进行分析之前选择最有效的制剂和施用方案。比较了两类制剂：具有线性或支化的聚乙烯亚胺(PEI)的聚阳离子聚合物，以及与胆固醇共价连接的Dbait(coDbait)。对于Dbait的体外和体内转染来说，线性PEI复合物是最有效的，但显示出高毒性。事实上，与用PEI配制的Dbait相比，需要高10倍剂量的coDbait与1mg氯喹一起使用(根据异速生长转换，相当于人类中使用的预防剂量)，才能在异种移植的黑色素瘤上观察到相同的抗肿瘤效应。然而，据发现，所测试的与氯喹一起施用的coDbait剂量是无毒的。
因此，本发明描述了胆固醇-核酸结合物与全身性施用的临床相关剂量的氯喹的组合和施用方案，特别是胆固醇-Dbait结合物与预防剂量的氯喹(通过异速生长转换成动物)在没有显著毒性下的应用。本发明人表明，在小鼠中，与用非病毒载体系统作为载体的1x Dbait相比，高10倍量(10x)的胆固醇-Dbait具有相似的效力，而不是现有技术中所描述的在不使用氯喹的情况下高1000倍的量。这使得治疗性核酸与亲脂性或细胞靶向剂的结合成为安全且经济可用的递送系统。
因此，尽管需要更高剂量的coDbait，但本发明人令人惊奇地发现：
1)如果有的话，coDbait与氯喹的组合也表现出低体内毒性。这使得治疗指数(有效剂量/毒性剂量的比率)能够从Dbait/PEI的大致为1提高到coDbait的>20；在小鼠、大鼠、兔和猴中静脉内注射、皮下注射后，以及甚至在脑内注射后都观察到不存在毒性；
2)coDbait与氯喹的组合给出了延迟和持续的DNA-PK(Dbait的主要靶标)活化，并允许具有长期的治疗效果。更具体地，在该时间段中观察到增加的活性或效果；
3)令人惊奇地，与Dbait/PEI相比，coDbait良好地扩散在肿瘤/组织中。
4)本发明人首次观察到氯喹使得coDbait的细胞摄取增加，而使用与siRNA分子结合的胆固醇时，这种效果是不太明显的。
基于这些观察结果，本发明涉及
-药物组合物，其包含如下所述的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、和任选的b)DNA损伤性抗肿瘤剂、以及药学可接受的载体，具体地是用于治疗癌症；
-药物组合物，其包含a)如下所述的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b)如下所述的内涵体溶解剂、任选的c)DNA损伤性抗肿瘤剂、以及药学可接受的载体，具体地是用于治疗癌症；
-产品或试剂盒，其含有(a)如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、和任选的b)DNA损伤性抗肿瘤剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂，具体地是在癌症的治疗中；
-产品或试剂盒，其含有(a)如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b)如下所述的内涵体溶解剂、和任选的c)DNA损伤性抗肿瘤剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂，具体地是在癌症的治疗中；
-组合制剂，其包含用于同时、分开或顺序使用的(a)如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b)如下所述的内涵体溶解剂、和任选的c)DNA损伤性抗肿瘤剂，具体地是在癌症的治疗中；
-药物组合物，其包含如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子，所述药物组合物与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合用于治疗癌症；
-药物组合物，其包含a)如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、和b)如下所述的内涵体溶解剂，所述药物组合物与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合用于治疗癌症；
-产品或试剂盒，其含有(a)如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、和b)如下所述的内涵体溶解剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂，具体地是在癌症的治疗中与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合；
-包含如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造用于与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合治疗癌症的药物、或用于提高放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂治疗癌症的功效的药物、或用于增强肿瘤对放射疗法和/或对使用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗的敏感性的药物中的应用；
-包含如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造用于与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合以及与如下所公开的内涵体溶解剂组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a)如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b)如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造用于与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a)如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b)如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造用于提高放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂治疗癌症的功效的药物、或用于增强肿瘤对放射疗法和/或对使用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗的敏感性的药物中的应用；
-包含a)如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b)如下所述的内涵体溶解剂以及任选的c)DNA损伤性抗肿瘤剂和药学可接受的载体的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的应用；
-用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、和任选的DNA损伤性抗肿瘤剂、以及药学可接受的载体；
-用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含a)如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b)如下所述的内涵体溶解剂、和任选的c)DNA损伤性抗肿瘤剂、以及药学可接受的载体；
-用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括施用有效量的包含如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物、有效量的包含如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物、以及任选的有效量的包含DNA损伤性抗肿瘤剂的药物组合物；
-用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂组合施用有效量的包含a)如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物以及有效量的包含如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物；
-用于在需要的对象中提高放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂治疗癌症的功效或用于增强肿瘤对放射疗法和/或对使用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗的敏感性的方法，所述方法包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含a)如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b)如下所述的内涵体溶解剂、和药学可接受的载体；
-用于在需要的对象中提高放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂治疗癌症的功效或用于增强肿瘤对放射疗法和/或对使用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗的敏感性的方法，所述方法包括施用有效量的包含如本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物以及有效量的包含如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物。
在本文中使用时，术语“试剂盒”、“产品”或“组合制剂”具体在下面这个意义上定义了“份的试剂盒”：即，可以独立地、或者通过使用如上所限定的组合伙伴(a)和(b)以及任选的(c)的显著量的不同的固定组合，即同时或在不同的时间点，对组合伙伴(a)和(b)以及任选的(c)进行给药。于是，例如可以同时或按时间顺序交错来施用所述份的试剂盒的份，也就是说，可以在不同时间点并对份的试剂盒的任何份以相等或不等的时间间隔来施用所述份的试剂盒的份。以组合制剂施用的组合伙伴(a)与组合伙伴(b)以及任选的(c)的总量比率可以变化。可以通过相同的途径或通过不同的途径来施用组合伙伴(a)和(b)以及任选的(c)。
在本发明的上下文内，术语治疗表示治疗性、症状性和预防性治疗。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂可以被用于目前患有癌症或肿瘤、包括癌症的早期或晚期进展阶段的人。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂并不一定会治愈患有癌症的患者，但会推迟或延缓疾病的进展或防止进一步进展，从而改善患者的病症。具体地，本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂在哺乳动物宿主中降低肿瘤的发展，减少肿瘤荷载，产生肿瘤消退，和/或防止转移发生和癌症复发。在治疗癌症中，以治疗有效量施用本发明的药物组合物。
“有效量”是指本发明的药物组合物在包括人的哺乳动物中单独或与药物组合物、试剂盒或组合制剂的其它活性成分组合而防止、消除或减少癌症的有害影响时的量。应了解，本领域技术人员可以根据患者、病理、施用方式等来调整施用剂量。
在这整个说明书中，每次对于本发明的药物组合物提及“治疗癌症”或类似的时，就是指：a)用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用本发明的药物组合物；b)本发明的药物组合物用于治疗癌症的应用；c)本发明的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的应用；和/或d)用于治疗癌症的本发明的药物组合物。
Dbait分子
Dbait分子已被广泛描述在PCT专利申请WO2005/040378、WO2008/034866和WO2008/084087中，所述专利申请的公开内容通过参考结合于此。
可以通过许多对于它们的治疗活性而言必需的特性来定义Dbait分子，例如它们的最小长度，存在至少一个游离末端，以及存在双链部分，优选为双链DNA部分。正如在下面要讨论的，重要的是要注意，Dbait分子的精确的核苷酸序列不影响它们的活性。此外，Dbait分子可以含有修饰的和/或非天然的骨架。
优选地，Dbait分子是非人类来源的(即，它们的核苷酸序列和/或构象(例如发夹)不像人细胞中那样存在)，最优选为合成来源的。因为如果有的话，Dbait分子的序列也起到非常少的作用，因此，Dbait分子优选与已知基因、启动子、增强子、5'-或3'-上游序列、外显子、内含子等具有非显著程度的序列同源性或同一性。换言之，Dbait分子与人类基因组中的任何基因具有小于80％或70％、甚至小于60％或50％的序列同一性。确定序列同一性的方法是本领域中公知的，并且包括例如BLASTN 2.2.25。对于人类基因组，优选考虑人类基因组结构37(Human Genome Build 37)(参考GRCh37.p2和替代集合(alternateassembly))用于确定同一性百分数。在严格条件下，Dbait分子不与人类基因组DNA杂交。典型的严格条件是它们允许完全互补的核酸与部分互补的核酸区分开这样的条件。
另外，为了避免公知的toll样受体介导的免疫反应，Dbait分子的序列优选没有CpG。
Dbait分子的长度是可以变化的，只要它足以允许包含Ku和DNA-PKcs蛋白的Ku蛋白复合物的适当的结合即可。已表明，Dbait分子的长度必须大于20bp，优选约32bp，以确保与这样的Ku复合物结合并允许DNA-PKcs活化。优选地，Dbait分子包含20-200bp、更优选24-100bp、还更优选26-100，并最优选在32-100bp之间。例如，Dbait分子包含24-160、26-150、28-140、30-120、或32-100bp。“bp”是指该分子包含指定长度的双链部分。
在具体实施方式中，具有至少32pb或约32bp双链部分的Dbait分子包含与Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)相同的核苷酸序列。任选地，Dbait分子具有与Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd相同的核苷酸组成，但它们的核苷酸序列是不同的。于是，Dbait分子包含具有3A、6C、12G和11T的双链部分的一条链。优选地，Dbait分子的序列不含有任何CpG二核苷酸。
或者，双链部分包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ IDNo 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸。在更具体的实施方式中，双链部分由Dbait32(SEQID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成。
Dbait分子必须具有至少一个游离末端作为DSB的模拟物。所述游离末端可以是游离的平末端或5'-/3'-突出末端。在本文中，“游离末端”是指核酸分子，特别是具有5'末端和3'末端两者、或者具有3'末端或5'末端的双链核酸部分。任选地，5'和3'末端中的一个可以被用于结合Dbait分子或者可以与封闭基团例如a或3'-3'核苷酸键连接。
在具体实施方式中，它们含有两个游离末端并且可以是线性的。因此，Dbait分子还可以是具有两个游离末端并具有Dbait32(SEQ ID No1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的核苷酸序列的双链分子。
在另一个具体实施方式中，它们只含有一个游离末端。优选地，Dbait分子由具有双链DNA茎和环的发夹核酸构成。所述环可以是核酸或技术人员已知的其他化学基团或其混合物。核苷酸接头可以包括2至10个核苷酸，优选为3、4或5个核苷酸。非核苷酸接头非穷举性地包括脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂质、聚烃、或其他聚合的化合物(例如，低聚乙二醇，例如那些具有2至10个乙二醇单元，优选4、5、6、7或8个乙二醇单元的低聚乙二醇)。优选的接头选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和其他接头例如2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。因此，在具体实施方式中，Dbait分子可以是具有双链部分或茎和环的发夹分子，所述双链部分或茎包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，并且所述环为六乙二醇接头、四脱氧胸苷接头(T4)或2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。在更具体的实施方式中，那些Dbait分子可以具有由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成的双链部分。
Dbait分子优选包含2'-脱氧核苷酸骨架，并任选包含一个或数个(2、3、4、5或6个)修饰的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶以外的核碱基。因此，Dbait分子本质上是DNA结构。具体地，Dbait分子的双链部分或茎是由脱氧核糖核苷酸构成的。
优选的Dbait分子在一条链或每条链的末端处包含一个或数个化学修饰的核苷酸或基团，特别是为了保护它们免于降解。在特别优选的实施方式中，在一条链或每条链的末端处，Dbait分子的游离末端被一个、两个或三个修饰的磷酸二酯骨架保护。优选的化学基团，特别是修饰的磷酸二酯骨架，包含硫代磷酸酯。或者，优选的Dbait具有3'-3'核苷酸键，或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。其它修饰的骨架是本领域公知的，并包含氨基磷酸酯、吗啉代核酸、2'-O,4'-C亚甲基/亚乙基桥连的锁核酸、肽核酸(PNA)、和短链烷基、或长度可变的环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖内键，或技术人员已知的任何修饰的核苷酸。在第一优选实施方式中，Dbait分子具有在一条链或每条链的末端处被一个、两个或三个修饰的磷酸二酯骨架保护的游离末端，更优选至少在3'末端处、但还更优选同时在5'和3'末端处被三个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯)保护的游离末端。
在最优选的实施方式中，Dbait分子是发夹核酸分子，所述发夹核酸分子包含32bp的DNA双链部分或茎(例如，具有选自SEQ ID No1-5、特别是SEQ ID No 4的序列)和连接DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自以下的接头或由选自以下的接头组成：六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，DNA双链部分或茎(即在环的对面处)的游离末端具有三个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯核苷酸间连接)。
所述Dbait分子是通过化学合成、半生物合成或生物合成、任何扩增方法，然后通过任何提取和制备方法以及任何化学修饰而制得的。提供的接头使得可通过标准核酸化学合成来掺入。
更优选地，Dbait分子是通过特别设计的汇集合成制造的：伴随着掺入适当的接头前体，通过标准核酸化学合成来制备两条互补链，在将它们纯化后，将它们共价偶联在一起。
结合的Dbait分子
本发明涉及与促进内吞或细胞摄取的分子结合的Dbait分子。
具体地，所述分子可以是亲脂性分子，例如胆固醇、单或双链脂肪酸；或者靶向细胞受体使实现受体介导的内吞的配体，例如叶酸和叶酸盐衍生物或转铁蛋白(Goldstein等Ann.Rev.Cell Biol.19851:1-39；Leamon&Lowe,Proc Natl Acad Sci USA.1991,88:5572–5576.)。脂肪酸可以是饱和或不饱和的，并可以为C4-C28，优选为C14-C22，还更优选为C18，例如油酸或硬脂酸。具体地，脂肪酸可以是十八烷基或二油酰基。发现，脂肪酸可以是用适当的接头例如甘油、磷脂酰胆碱或乙醇胺等连接的双链形式，或者可以是由用于连接在Dbait分子上的接头连接在一起的双链形式。在本文中使用时，术语“叶酸盐”的意思是指叶酸盐和叶酸盐衍生物，包括蝶酸衍生物和类似物。适用于本发明的叶酸类似物和衍生物包括但不限于抗叶酸剂，二氢叶酸盐，四氢叶酸盐，亚叶酸，蝶酰谷氨酸、1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、10-脱氮1,5-脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮和5,8-二脱氮叶酸盐，抗叶酸剂，以及蝶酸衍生物。其他叶酸盐类似物被描述在US2004/242582中。促进内吞的分子可以是生育酚、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖、肽例如RGD和铃蟾肽、以及蛋白质例如整合素。因此，促进内吞的分子可以选自单或双链脂肪酸、叶酸盐和胆固醇。更优选地，促进内吞的分子选自二油酰基、十八烷基、叶酸和胆固醇。在最优选的实施方式中，Dbait分子与胆固醇结合。
促进内吞的分子优选通过接头与Dbait分子结合。本领域中已知的任何接头都可以用于将促进内吞的分子与Dbait分子共价连接。例如，WO09/126933在第38-45页提供了关于方便的接头的宽泛性综述。非穷举性地，接头可以是脂族链、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂质、聚烃、或其他聚合的化合物(例如，低聚乙二醇，例如那些具有2至10个乙二醇单元，优选3、4、5、6、7或8个乙二醇单元，还更优选6个乙二醇单元的低聚乙二醇)，并且还掺入了可以被化学或酶解法切断的任何键，例如二硫键、受保护的二硫键、酸不稳定的键(例如腙键)、酯键、原酸酯键、膦酰胺键、可生物剪切的肽键、偶氮键或醛键。这种可剪切的接头详见WO2007/040469第12-14页、WO2008/022309第22-28页。
在具体实施方式中，Dbait分子可以与一个促进内吞的分子连接。或者，可以将数个促进内吞的分子(例如两个、三个或四个)与一个Dbait分子连接。
在特定的实施方式中，在促进内吞的分子、特别是胆固醇与Dbait分子之间的接头是CO-NH-(CH2-CH2-O)n，其中n是从1至10的整数，优选n选自3、4、5和6。在非常具体的实施方式中，接头是CO-NH-(CH2-CH2-O)4(甲酰胺基三乙二醇)。接头可以在任何方便的并且不改变Dbait分子活性的位置处与Dbait分子连接。具体地，可以在5'末端处、在3'末端处连接接头，或者当Dbait分子是发夹时，将接头连接在环中。然而，在发夹Dbait分子的情况下，本发明人惊奇地发现，在Dbait分子的5'末端处通过接头与Dbait分子连接的胆固醇比在环处通过接头与Dbait分子连接的胆固醇更有效。因此，在优选的实施方式中，所设想的结合的Dbait分子是具有发夹结构并且优选在其5'末端处通过接头与促进内吞的分子结合的Dbait分子。
在另一个具体实施方式中，在促进内吞的分子、特别是胆固醇与Dbait分子之间的接头是二烷基二硫化物{例如，(CH2)p-S-S-(CH2)q，其中p和q为从1至10、优选从3至8、例如6的整数}。
在最优选的实施方式中，结合的Dbait分子是发夹核酸分子，所述发夹核酸分子包含32bp的DNA双链部分或茎(例如，具有选自SEQID No 1-5、特别是SEQ ID No 4的序列)和连接DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自以下的接头或由选自以下的接头组成：六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，DNA双链部分或茎(即在环的对面处)的游离末端具有三个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯核苷酸间连接)，并且所述Dbait分子优选通过接头(例如甲酰胺基低聚乙二醇，优选甲酰胺基三乙二醇)在其5'末端处与胆固醇结合。
结合的Dbait分子或发夹核酸分子也可以由下式来描述：
其中N是核苷酸，n是大于14的整数，带下划线的N是指有或没有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'是接头，C是促进内吞的分子，L是接头，m是为0或1的整数。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。在式(II)和(III)中，C-Lm各自与核苷酸的5'末端或3'末端连接。在式(I-III)中，C-Lm优选通过二硫键(S-S)与L'连接。
在优选实施方式中，式(I)、(II)或(III)的分子具有一个或数个下面的特征：
-N是脱氧核苷酸，优选选自A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、胸腺嘧啶(T)和G(鸟嘌呤)，并且被选择成使得避免出现CpG二核苷酸并且与人类基因组中的任何基因具有小于80％或70％、甚至小于60％或50％的序列同一性的；和/或，
-n是从15至195、优选从19-95、更优选从21至95、还更优选从27至95的整数。在特别优选的实施方式中，n是27；和/或，
-带下划线的N是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选为硫代磷酸酯骨架的核苷酸；和/或，
-连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或，
-m是1并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇；和/或，
-C选自胆固醇、单或双链脂肪酸例如油酸或硬脂酸、或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、核酸适配体(aptamer))例如叶酸盐和转铁蛋白，优选为胆固醇、十八烷基、二油酰基或叶酸盐，更优选为胆固醇。
优选地，C-Lm是三乙二醇接头(10-O-[1-丙基-3-N-氨基甲酰基胆固醇基]-三乙二醇基团。
在优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子具有下式：
其中对N、带下划线的N、n、L、L'、C和m的定义与式(I)、(II)和(III)相同。
在优选实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，或者由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成。在具体实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)，更优选为Dbait32Hc(SEQ ID No 4)，或者由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)，更优选为Dbait32Hc(SEQ ID No 4)组成。
因此，结合的Dbait分子或发夹核酸分子可以选自：
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 1
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 2
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 3
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 4
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 5
其中对L、L'、C和m的定义与式(I)、(II)和(III)相同。
在优选实施方式中，式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)的分子，优选式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的分子，具有一个或数个下面的特征：
-带下划线的核苷酸是指有或没有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，更优选为具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，还更优选为具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸；和/或，
-连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或，
-m是1并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇；和/或，
-C选自胆固醇、单或双链脂肪酸例如油酸或硬脂酸、或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、核酸适配体)例如叶酸盐、转铁蛋白，优选为胆固醇、十八烷基、二油酰基或叶酸盐，更优选为胆固醇。
优选地，C-Lm是三乙二醇接头(10-O-[1-丙基-3-N-氨基甲酰基胆固醇基]-三乙二醇基团。
在式(I)、(II)、(III)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)，优选为式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的Dbait分子或发夹核酸分子的具体实施方式中，L'优选选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在式(I)、(II)、(III)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)，优选为式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的Dbait分子或发夹核酸分子的具体实施方式中，其中C是胆固醇，C-Lm是基团
在优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子选自(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)，其中C-Lm是基团
并且其中L'优选选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，更优选为2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在非常具体的实施方式中，Dbait分子或发夹核酸分子具有下式
其中C-Lm是基团
其中L'是2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，并且其中带下划线的核苷酸具有硫代磷酸酯骨架。因此，该分子具有下面的结构，并且它在实施例部分中被称作“coDbait”。
名为DT01的一种胆固醇-Dbait结合物是由通过1,19-双(磷)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷接头连接的两条具有互补序列的32-nt链组成的64-nt的寡脱氧核糖核苷酸，所述64-nt的寡脱氧核糖核苷酸在5'末端处具有胆固醇基四乙二醇并且在5'和3'末端处各具有3个硫代磷酸酯核苷酸间键。在溶液中，该分子形成分子内发夹32-bp双螺旋。该双链(ds)DNA结构对其生物活性而言是必不可少的，并且是活性药物成分(API)。钠盐的分子式：C678H820N244Na65O392P65S6；钠盐的分子量：22359.2Da；游离酸的分子量：20931.4Da。该分子也可以被表示如下：
对于式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIe)的分子来说，本发明的一个非常惊人的方面是：尽管Dbait分子的活性需要存在至少一个游离末端，但与5'末端连接的促进内吞的分子并不降低活性。
因此，本发明还涉及如上所公开的结合的Dbait分子；药物组合物，其包含所述结合的Dbait分子和任选的药学可接受的载体；如上所公开的结合的Dbait分子，其单独或与放射疗法和/或DNA损伤性抗肿瘤剂的化学疗法组合用于治疗癌症；用于治疗癌症的方法，其包括施用治疗有效量的如上所公开的结合的Dbait分子；以及如上所公开的结合的Dbait分子在制备用于治疗癌症的药物中的应用，详述如下。
内涵体溶解剂
此处，结合的Dbait分子或发夹核酸分子优选与内涵体溶解剂(例如氯喹、膜融合脂质或肽等)组合使用。事实上，通过内涵体溶解剂进行的治疗促进结合的Dbait分子从内涵体释放。另外，该具体组合允许获得进一步的令人惊奇的效果，包括低体内毒性以及延迟和持续的Dbait介导的活性这样例外的结果。
具体地，内涵体溶解剂能够响应于pH的变化而实现溶解内涵体、以及能够包裹待递送至细胞或亚细胞成分的治疗剂的囊封或包裹成分。内涵体溶解物质包括但不限于喹啉化合物，特别是4-氨基喹啉和2-苯基喹啉化合物及其氨基、硫代、苯基、烷基、乙烯基和卤素衍生物，膜融合脂质，肽或蛋白质。
在优选实施方式中，内涵体溶解剂是小分子。碱性内涵体溶解剂可以选自奎宁、氯喹、羟氯喹、阿莫地喹(氨酚喹)、阿莫吡喹、伯氨喹、甲氟喹、nivaquines、卤泛群、醌亚胺及其组合。优选的内涵体溶解剂是喹啉内涵体溶解剂，包括但不限于以其化学名称列在下面的化合物：7-氯-4-(4-二乙氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉(氯喹)、7-氯-4-(4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉(羟氯喹)、7-氟-4-(4-二乙氨基-1-甲基丁基-氨基)喹啉、4-(4-二乙氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(4-二乙基-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-氯-4-(4-二乙氨基-1-丁基氨基)喹啉(脱甲基氯喹)、7-氟-4-(4-二乙氨基-1-丁基氨基)喹啉)、4-(4-二乙基-氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(4-二乙氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-氯-4-(1-羧基-4-二乙氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-氨基-1-丁基氨基)喹啉、4-(1-羧基-4-二乙氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-氯-4-(1-羧基-4-二乙氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、4-(1-羧基-4-二乙氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-氟-4-(4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、4-(4-乙基-(2-羟基-乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基-)喹啉、7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、羟氯喹磷酸盐、7-氯-4-(4-乙基-(2-羟乙基-l)-氨基-1-丁基氨基)喹啉(脱甲基羟氯喹)、7-氟-4-(4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、4-(4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉、7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉、8-[(4-氨基戊基)氨基-6-甲氧基喹啉二盐酸盐、1-乙酰基-1,2,3,4-四氢喹啉、8-[(4-氨基戊基)氨基]-6-甲氧基喹啉二盐酸盐、1-丁酰基-1,2,3,4-四氢喹啉、3-氯-4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲代苯氨基喹啉、4-[(4-二乙基-氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉、3-氟-4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲代苯氨基喹啉、4-[(4-二乙氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉、4-(4-羟基-α,α'-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲代苯氨基喹啉、4-[(4-二乙氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉、3,4-二氢-1-(2H)-喹啉羧醛、1,1'-五亚甲基二喹啉鎓二碘化物、8-羟基喹啉硫酸盐，及其氨基、醛、羧基、羟基、卤素、酮、巯基和乙烯基衍生物或类似物。其他试剂被公开在Naisbitt等(1997,J Pharmacol Exp Therapy 280:884-893)和US 5,736,557中。在更优选的实施方式中，内涵体溶解剂可以选自氯喹、羟氯喹、脱甲基氯喹、羟氯喹磷酸盐和脱甲基羟氯喹，优选为氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。
在另一个实施方式中，内涵体溶解剂是膜融合脂质、肽或蛋白质。事实上，许多膜融合脂质、肽或蛋白质是本领域中已知的。例如，膜融合脂质、肽或蛋白质是以下专利申请中公开的那些：WO10057160、US2007/0293449、US2006/0051405、WO10053489、WO09126933。具体地，WO09/126933在第23-29页提供了膜融合脂质、肽和蛋白质。
本发明人证实了结合的Dbait分子与氯喹的组合的高抗肿瘤治疗功效，但他们观察到，相同量的氯喹单独或与辐射组合并没有表现出任何抗肿瘤活性。
因此，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和内涵体溶解剂，更具体地是用于治疗癌症。本发明还涉及产品，其包含本发明的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和内涵体溶解剂作为同时、分开或顺序使用的组合制剂，更具体地是用于治疗癌症。优选地，内涵体溶解剂选自氯喹或羟氯喹，还更优选为氯喹。优选地，本发明的结合的Dbait分子或发夹核酸分子是如上所述的任何具体的结合的Dbait分子。在一个实施方式中，本发明的Dbait分子或发夹核酸分子共价连接至内涵体溶解剂，优选为氯喹或羟氯喹，还更优选为氯喹，具体如WO2007/040469中所公开的。在另一个优选的实施方式中，内涵体溶解剂，优选为氯喹不与本发明的结合的Dbait分子或发夹核酸分子结合(即，不共价连接)。
除了活性成分以外，本文中所设想的药物组合物还可以包含药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”的意思是包涵不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对其所施用的宿主没有毒性的任何载体(例如支持物、物质、溶剂等)。例如，对于胃肠外施用来说，可以介质例如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液将活性化合物配制在注射用单位剂量形式中。
药物组合物可以以本领域已知的方式配制成在药物相容性溶剂中的溶液，或者配制成在适当的药物溶剂或介质中的乳液、悬浮液或分散体，或者配制成含有固体介质的丸剂、片剂或胶囊。本发明的适合于口服施用的制剂可以是离散单位形式，作为胶囊、袋剂、片剂或锭剂，各含有预定量的活性成分；粉末或颗粒剂形式；在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液形式；或者水包油型乳液或油包水型乳液形式。适合于胃肠外施用的制剂方便地包含活性成分的无菌油性或水性制剂，其优选与接受者的血液等渗。每一种这样的制剂还可以含有其他药物相容性且无毒的辅助剂，例如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味物质。本发明的制剂包含活性成分以及药学可接受的载体，因此并任选地还有其它治疗性成分。载体从与制剂的其它成分相容并对其接受者无害的意义上来说必须是“可接受的”。有利情况下，通过注射或静脉内输注合适的无菌溶液来应用药物组合物，或者作为口服剂量，通过消化道来应用药物组合物。大部分这些化疗剂的安全和有效的施用方法是本领域技术人员已知的。另外，在标准文献中描述了它们的施用。
本发明的药物组合物不是脂质体组合物。具体地，本发明的产品的结合的Dbait分子没有被配制在脂质体组合物中。
具体地，本发明还涉及产品、试剂盒或组合制剂，其包含(a)一个或多个单位剂量形式的如前所公开的Dbait分子或发夹核酸分子，(b)一个或多个单位剂量形式的如前所公开的内涵体溶解剂，以及任选的(c)一个或多个单位剂量形式的如下所公开的DNA损伤性抗肿瘤剂。
DNA损伤性治疗
除了结合的Dbait分子和内涵体溶解剂以外，治疗还可以进一步包括抗肿瘤治疗，优选为通过DNA损伤剂进行的治疗或放射疗法。DNA损伤性治疗可以是放射疗法或使用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的化学疗法，或其组合。
通过电离辐射(放射疗法)可以实现DNA链断裂。放射疗法包括但并不限于γ-射线、X-射线、和/或放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。其他放射疗法包括微波和UV-辐射。本发明中还设想了放射疗法的其他方法。
DNA损伤性抗肿瘤剂优选选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。
拓扑异构酶I和/或II的抑制剂包括但不限于依托泊苷，拓泊替康，喜树碱，伊立替康，安吖啶，茚托利辛，蒽环类例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、伊达比星和米托蒽醌。拓扑异构酶I和II的抑制剂包括但不限于intoplecin。
DNA交联剂包括但不限于顺铂、卡铂和奥沙利铂。
抗代谢剂阻断负责核酸合成的酶，或变成掺入到DNA中，这产生了不正确的遗传密码并导致凋亡。其非穷举性实例包括但不限于抗叶酸剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，更具体地为甲氨喋呤、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨，喷司他丁、5-氟尿嘧啶、吉西他滨和卡培他滨。
DNA损伤性抗肿瘤剂可以是烷化剂，包括但不限于氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、金属盐和三氮烯。其非穷举性实例包括尿嘧啶氮芥、甲川氯、环磷酰胺(CYTOXAN(R))、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙撑密胺、三乙撑硫代磷酰胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、顺铂、卡铂、奥沙利铂、塞替派、链脲霉素、达卡巴嗪和替莫唑胺。
有丝分裂纺锤体的抑制剂包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨，larotaxel(也称为XRP9881；Sanofi-Aventis)、XRP6258(Sanofi-Aventis)、BMS-184476(Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-188797(Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-275183(Bristol-Meyer-Squibb)、沃塔紫杉醇(也称为IDN 5109、BAY 59-8862或SB-T-101131；Bristol-Meyer-Squibb)、RPR 109881A(Bristol-Meyer-Squibb)、RPR116258(Bristol-Meyer-Squibb)、NBT-287(TAPESTRY)、PG-紫杉醇(也称为CT-2103、PPX、聚谷氨酸紫杉醇、多聚谷氨酸紫杉醇或XyotaxTM)、(也称为Nab-Paclitaxel；ABRAXISBIOSCIENCE)、Tesetaxel(也称为DJ-927)、IDN 5390(INDENA)、Taxoprexin(也称为二十二碳六酸紫杉醇；PROTARGA)、DHA-紫杉醇(也称为)、和MAC-321(WYETH)。也可参见Hennenfent&Govindan的综述(2006,Annals of Oncology,17,735-749)。
待治疗的癌症或肿瘤
本发明中所描述的药物组合物以及产品、试剂盒或组合制剂可用于治疗对象中的癌症。
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”指的是或描述了哺乳动物中典型特征在于不受控的细胞生长的生理条件。癌症的实例包括例如白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、癌和肉瘤。这种癌症的更具体的实例包括慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(Ph+ALL)、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、以及头颈癌、胃癌、胚细胞瘤、小儿肉瘤、鼻型自然杀伤细胞、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞增多症以及任何与肥大细胞增多症相关的症状。
“白血病”指的是造血器官的进展性恶性疾病，并且一般特征在于血液和骨髓中的白细胞及其前体的扭曲的增殖和发育。白血病在临床上通常根据下面几点进行分类：(1)疾病的持续时间和特性——急性或慢性；(2)所涉及的细胞类型：髓性(骨髓性)、淋巴性(成淋巴的)、或单核细胞性；以及(3)血液中异常细胞的数量增加或不增加——白血性或非白血性(亚白血性)。白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病(leucocythemic leukemia)、嗜碱性白血病、干细胞白血病(blast cell leukemia)、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓性粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔细胞性白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病、和未分化细胞性白血病。在某些方面，本发明提供了用于慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、和/或费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(Ph+ALL)的治疗。
本发明的范围还包涵各种癌症，包括但不限于下面的这些：癌，包括膀胱癌(包括加速和转移性膀胱癌)、乳腺癌、结肠癌(包括结直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞和非小细胞肺癌以及肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括胰腺外分泌癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、子宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎瘤；黑色素瘤、不能手术切除的III期或IV期恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、以及头颈癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、成人骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童骨恶性纤维组织细胞瘤、肉瘤、小儿肉瘤、鼻型自然杀伤细胞、赘生物、浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合征；神经母细胞瘤；睾丸生殖细胞肿瘤、眼内黑色素瘤、骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、滑膜肉瘤。另外，疾病包括色素性荨麻疹，肥大细胞增多症例如弥漫性皮肤肥大细胞增多症，人类中的孤立性肥大细胞瘤，以及犬的肥大细胞瘤和一些罕见的亚型如大疱性、红皮病型和血管扩张性(teleangiectatic)肥大细胞增多症，伴有血液疾病例如骨髓增生性或骨髓增生异常综合征或急性白血病的肥大细胞增多症，与肥大细胞增多症相关的骨髓增生性疾病、肥大细胞白血病和其他癌症。其他癌症也被包括在疾病的范围内，包括但不限于下面的这些：癌，包括膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、尤其是睾丸精原细胞瘤、和皮肤癌；包括鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤(“GIST”)；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤和胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌、畸胎癌、化学疗法难治性非精原细胞瘤性生殖细胞肿瘤、和卡波西氏肉瘤，及其任何转移灶。
在本发明的优选实施方式中，癌症是实体瘤。术语“实体瘤”尤其是指乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和通常的GI(胃肠)道癌、宫颈癌、肺癌、特别是小细胞肺癌和非小细胞肺癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌或卡波西氏肉瘤。
本发明中所描述的药物组合物以及产品、试剂盒或组合制剂可用于抑制实例瘤的生长，缩小肿瘤体积，防止肿瘤的转移播散以及微转移灶的生长或发展。本发明中所描述的药物组合物以及产品、试剂盒或组合制剂特别适用于治疗预后不良的患者或者放射疗法或化学疗法耐受性的肿瘤。
本发明人为来自细胞系和患者活组织检查的每种肿瘤(包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤、癌)测试了大量的不同肿瘤类型。其中超过80％对治疗的响应良好。具体地，对下面的肿瘤类型观察到功效：黑色素瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、胃肠癌、肝癌和头颈癌。
在优选实施方式中，癌症可以选自黑色素瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、胃肠癌、肝癌和头颈癌。
方案、剂量和施用途径
本发明的组合制剂中采用的每个组合伙伴的有效剂量可根据所采用的具体化合物或药物组合物、施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，根据多种因素，包括施用途径和患者状态，选择本发明的组合制剂的给药方案。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制病症进展所需要的单个活性成分的有效量。在获得在产生疗效而无毒性的范围内的活性成分浓度方面的最佳精确度需要基于活性成分在靶部位的利用度动力学的方案。
可以通过相同的途径或通过两种不同的途径来施用内涵体溶解剂和结合的Dbait分子。内涵体溶解剂，优选为氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹，和/或结合的Dbait分子的施用途径可以是口服、胃肠外、静脉内、瘤内、皮下、颅内、动脉内、局部、直肠、经皮、皮内、经鼻、肌内、腹膜内、骨内等。在优选实施方式中，在待治疗的肿瘤部位附近施用或注射结合的Dbait分子。
在具体实施方式中，通过口服途径或通过腹膜内途径，优选通过口服途径来施用内涵体溶解剂，优选为氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹，并且可以通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过颅内注射、通过静脉内注射、或通过口服途径，更优选通过瘤内、皮下或静脉内注射，还最优选通过皮下途径来施用结合的Dbait分子。
在另一个具体实施方式中，内涵体溶解剂、优选为氯喹或羟氯喹、更优选为氯喹以及结合的Dbait分子两者均通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过静脉内注射、或通过口服途径，更优选通过瘤内、皮下注射或通过口服途径，还最优选通过口服途径来施用。当将内涵体溶解剂、优选为氯喹或羟氯喹、更优选为氯喹与结合的Dbait分子共注射时，在毒性的限制范围内，内涵体溶解剂、优选为氯喹的量越高，治疗效果越好。共注射或局部注射的优点是，不需要匹配血浆中的药代动力学曲线。在非常具体的实施方式中，通过口服途径来施用内涵体溶解剂，优选为氯喹，并通过皮下注射来施用结合的Dbait分子。本发明人证实，这种施用途径组合的例外的结果提供了氯喹的预处理，从而建立了血浆中氯喹的稳态方案。
在施用胆固醇结合的Dbait分子或发夹核酸分子前2小时和/或同时，更优选在施用coDbait前2小时，施用内涵体溶解剂，优选为氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。
在第一优选实施方式中，治疗方案包括下面的步骤：在开始用胆固醇结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗之前，用内涵体溶解剂、优选为氯喹对患者进行预处理。例如，当在待治疗的肿瘤部位附近施用(例如局部施用)内涵体溶解剂时，可以与结合的Dbait分子或发夹核酸分子一起施用内涵体溶解剂，或者在施用结合的Dbait分子或发夹核酸分子之前至少或约1、2、3、4或5小时，优选在约1至3小时之间，更优选约2小时，来施用内涵体溶解剂。或者，当通过全身性施用来施用内涵体溶解剂时，可以在施用结合的Dbait分子或发夹核酸分子之前更长时间并通过更长的治疗，优选在施用胆固醇结合的Dbait分子或发夹核酸分子之前约1至3周的时间段期间，更优选为约2周左右的时间段期间，来施用内涵体溶解剂。
一旦施用或已施用胆固醇结合的Dbait分子或发夹核酸分子后，可以继续用内涵体溶解剂处理，只要将会施用胆固醇结合的Dbait分子或发夹核酸分子即可。或者，也可以终止用内涵体溶解剂处理。
当与结合的Dbait分子和内涵体溶解剂组合使用DNA损伤性抗肿瘤剂时，可以通过相同的途径或通过不同的途径来施用DNA损伤性抗肿瘤剂和胆固醇结合的Dbait分子。DNA损伤性抗肿瘤剂的施用途径可以是口服、胃肠外、静脉内、瘤内、皮下、颅内、动脉内、局部、直肠、经皮、皮内，经鼻、肌内、骨内等。
在具体实施方式中，通过口服途径，同时、分开或顺序施用DNA损伤性抗肿瘤剂和内涵体溶解剂，并且可以通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过静脉内注射，或通过口服途径，优选通过瘤内、皮下或腹膜内注射或者通过口服途径，还更优选通过瘤内或皮下，来施用结合的Dbait分子。
在另一个具体实施方式中，通过口服途径来施用DNA损伤性抗肿瘤剂，并可以通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过静脉内注射、或通过口服途径，优选通过瘤内、皮下或腹膜内注射或者通过口服途径，还更优选通过瘤内或皮下，同时、分开或顺序施用结合的Dbait分子和内涵体溶解剂。
在进一步的具体实施方式中，通过口服途径来施用内涵体溶解剂，并可以通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过静脉内注射、或通过口服途径，优选通过瘤内、皮下或腹膜内注射或者通过口服途径，还更优选通过瘤内或皮下，同时、分开或顺序施用结合的Dbait分子和DNA损伤性抗肿瘤剂。
在另外的具体实施方式中，通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过静脉内注射、或通过口服途径，优选通过瘤内、皮下或腹膜内注射或者通过口服途径，还更优选通过瘤内或皮下注射，同时、分开或顺序施用DNA损伤性抗肿瘤剂、内涵体溶解剂和结合的Dbait分子。
在辐射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂之前和/或同时和/或之后，更优选在辐射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂之前和/或同时，施用内涵体溶解剂和结合的Dbait分子或发夹核酸分子。进行辐射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂，条件是当施加辐射或者当DNA损伤性抗肿瘤剂到达肿瘤细胞时，结合的Dbait分子存在于肿瘤细胞中。基于活性成分、活性成分在靶部位的利用度动力学或者活性成分在血浆中的药代动力学曲线，具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以确定方案。初步结果表明，结合的Dbait分子在一天的时间内保持活性。在第一优选实施方式中，治疗方案包括下面的步骤：在开始用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗之前，用内涵体溶解剂、优选为氯喹或羟氯喹、更优选为氯喹对患者进行预处理。然后，在开始用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗时或者在用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗之后，施加辐射或者施用DNA损伤性抗肿瘤剂。例如，在开始用结合的Dbait分子治疗后3-24h，施加辐射或者施用DNA损伤性抗肿瘤剂。也可以同时施用DNA损伤性抗肿瘤剂和结合的Dbait分子。
一旦已经开始通过放射疗法或用DNA损伤性抗肿瘤剂进行治疗后，可以继续用内涵体溶解剂和/或结合的Dbait分子治疗，只要将会施加或施用通过放射疗法或用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗即可。或者，也可以终止用内涵体溶解剂和/或结合的Dbait分子治疗。
对于结合的Dbait分子，本发明的组合制剂、试剂盒或产品中所采用的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效剂量可能会根据施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，根据多种因素来选择结合的Dbait分子的给药方案，所述因素包括施用途径和患者状态。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制癌症进展所需要的，特别是与所选择的DNA损伤性治疗相组合的结合的Dbait分子的有效量。
例如，对于局部施用(例如，当使用瘤内或皮下施用时)，结合的Dbait分子的有效量为至少0.01mg/1cm3肿瘤，优选0.1-40mg/1cm3肿瘤，最优选1-20mg/1cm3肿瘤。可以以每日治疗方案(例如，每周5天，持续3至6个连续周，或者一周3次，持续3至6个连续周)来施用所述有效量。或者，例如可以以持续3-6个连续周的每周治疗方案来施用至少0.01mg/1cm3肿瘤、优选0.1-40mg/1cm3肿瘤、最优选1-20mg/1cm3肿瘤的有效量。当使用其他施用途径时，本领域技术人员可以调整所述量，从而获得结合的Dbait分子在肿瘤中的有效量为至少0.01mg/1cm3肿瘤，优选0.1-40mg/1cm3肿瘤，最优选1-20mg/1cm3肿瘤，特别是在每日治疗方案或每周治疗方案中。例如，对于全身性途径，结合的Dbait分子的有效量或单位剂量可以为0.1至100mg，优选为4至40mg。因此，对于全身性途径，结合的Dbait分子的有效量或单位剂量可以为0.06至0.6mg/kg患者。当然，考虑到化学疗法和/或放射疗法的方案，本领域技术人员可以调整剂量和方案。
对于内涵体溶解剂，特别是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹，本发明的组合制剂、试剂盒或产品中所采用的内涵体溶解剂的有效剂量可能会根据施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，根据多种因素来选择内涵体溶解剂的给药方案，所述因素包括施用途径和患者状态。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制癌症进展所需要的，特别是与结合的Dbait分子和所选择的DNA损伤性治疗相组合的内涵体溶解剂的有效量。
在具体实施方式中，当使用口服途径并且如果已知所选择的内涵体溶解剂可用于治疗或预防疟疾时，以用于治疗或预防疟疾的相同剂量和方案使用内涵体溶解剂，特别是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。例如，如果所选择的内涵体溶解剂是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹，则可以以100-600mg/天、优选200-400mg/天、更优选约300mg/天，一周一次、两次、三次或四次来施用氯喹或羟氯喹。在具体实施方式中，可以在1或2周期间以约100mg/天来施用氯喹或羟氯喹，或者在1或2周期间一周两次以约300mg施用氯喹或羟氯喹。
在另一个具体实施方式中，当设想了局部途径例如皮下或瘤内途径时，可以以100-300mg来使用内涵体溶解剂，特别是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。
对于放射疗法，可以使用本领域已知的任何放射疗法方案，特别是立体定向辐射(例如15Gy)或分次辐射(fractionated radiation)。使用分次辐射可能是特别有效的，例如，可以在1、2、3、4、5或6周的时间内，每天或每2-5天、优选每3-4天施加辐射。辐射可以为1至10Gy，优选2至5Gy，特别是2、3、4或5Gy。例如，可以设想到在6周内15x2Gy的分次辐射，或者在2周内4至6x5Gy的分次辐射。在优选实施方式中，所设想的放射疗法是在2周内4次5Gy辐射的方案。已测试了用辐射和Dbait分子组合治疗癌症的不同方案或条件，并允许证明Dbait分子对肿瘤的放射增敏取决于Dbait分子的剂量，而不是辐射剂量。
对于化学疗法，本发明的组合制剂、试剂盒或产品中所采用的或者与本发明的组合物组合的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效剂量可能会根据所采用的具体DNA损伤性抗肿瘤剂、施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，根据多种因素来选择DNA损伤性抗肿瘤剂的给药方案，所述因素包括施用途径和患者状态。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制癌症进展所需要的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效量。
所述治疗可以包括一个或数个循环，例如2至10个循环，特别是2、3、4或5个循环。所述循环可以是持续的或分开的。例如，各循环被1至8周、优选3至4周的时间段分隔开。
在下面的实验部分会公开本发明的其他方面和优点，所述实验部分应被认为是说明性的，而不限制本申请的范围。本说明书中引用了许多参考文献，所引用的这些参考文献中每一个均通过参考结合于此。
实施例
与聚乙烯亚胺(PEI)复合或与胆固醇结合的短DNA(Dbait)的分布和活性的多尺度比较。
Dbait/载体复合物的表征和细胞摄取
已表明，PEI能够与DNA、寡核苷酸和RNA形成非共价的聚电解质间复合物。长PEI链在基因转染中是高度有效的，但具有更多的细胞毒性。本发明人测试了几种具有Dbait的PEI粒子多聚物，并将它们的活性与共价连接至胆固醇的修饰的Dbait(称为coDbait)进行比较。coDbait是与胆固醇的脂肪链共价结合的Dbait分子，无需另外的载体即可使用coDbait。对于所测试的各载体，本发明人的主要目标是开发出在最高的Dbait浓度下具有最均匀的粒径分布的制剂。通过动态激光散射(DLS)测定粒子的直径和表面电荷。利用多峰分析，本发明人发现平均尺寸为25Kd的支化的PEI(bPEI25K)和尺寸为22Kd(PEI22K)或11Kd(PEI11K)的线性PEI与Dbait形成具有相似特性的复合物(表1)。
表1.配制的Dbait的荧光和细胞摄取
a在FL2值下的荧光；bMCC＝平均细胞含量FL2值(>3次实验)；ccor MCC＝校正的细胞含量FL2/荧光
测试了PEI对Dbait的不同比率。通过凝胶迁移试验确定引起100％Dbait复合的最低比率。为供进一步研究用的PEI11K、PEI22K和bPEI25K分别选择了6、6和9的N/P比率。在10％蔗糖中，Dbait-PEI复合粒子在1小时期间是稳定的。通过透射电镜证实了群体中球形粒子的高度均匀的形态(尺寸范围为125至140nm)(图1A)。在稀释缓冲液中存在浓度超过0.8mg/mL的盐、或者长时间存放，可引起PEI复合物聚集。产生更大和多分散性的聚集体的Superfect复合物(60μgSuperfect/μg Dbait)(>2μm)被用作阳性对照。不带电的两亲性共聚物Lutrol不与Dbait形成稳定的相互作用的复合物，并且在某些实验中被用作阴性对照。
本发明人使用荧光cy3-修饰的Dbait来监测不同复合物的细胞摄取。在转染前立即监测cy3-Dbait复合物的初始荧光。在PEI复合物中，Dbait荧光降低2至3倍，这表明该分子与PEI的紧束化可能淬灭荧光(表1)。coDbai的荧光也比裸Dbait低，这表明胆固醇可能与花青相互作用在相同的分子上。Superfect或Lutrol不影响荧光。通过流式细胞术分析测定人转染的成纤维细胞的细胞含量。用裸Dbait或Dbait-Lutrol混合物处理后的细胞的荧光分布与未经处理的对照没有不同，这表明Dbait分子没有自发进入到细胞中。电穿孔是相对低效的，并且增加Dbait的浓度并没有提高转染效率。所有聚阳离子聚合物(PEI和superfect)都促进有效的细胞摄取，但线性PEI显示出比Dbait/superfect或Dbait/PEIb25K复合物更宽的分布。coDbait在没有转染因子的帮助下进入细胞，但效率比Dbait/PEI低10倍。使coDbait浓度增加10-15倍允许有效转染(图1B)。
DNA转移效率的一个限制是它保留在内涵体中，这阻止了它与其靶标相互作用，或阻止了它被转录。进入细胞内，DNA必须从正常的内涵体途径逃脱，所述正常的内涵体途径会导致降解。因此，DNA的递送效率不仅与细胞摄取相关，而且还与不稳定化和从内涵体逃脱相关。已知PEI具有高缓冲能力，高缓冲能力有利于DNA从内涵体和溶酶体释放(“质子海绵假说”)。相反，coDbait需要膜融合剂例如氯喹(CQ)的帮助，以有效地从内涵体释放。从提高转染效率的角度来看，我们在转染前半小时向细胞添加了100μM CQ。CQ使coDbait的细胞摄取提高2-4倍(图1)。通过由DNA-PKcs激酶与Dbait分子结合所触发的DNA-PKcs激酶的活化来监测被释放在细胞中的Dbait的量(Quanz等，2009，同上)。加入胆固醇不影响Dbait激活纯化的DNA-PK的能力(图2A)。在细胞中，通过据显示严格依赖于DNA-PK的H2AX磷酸化的量来监测DNA-PKcs激酶的活化。Dbait/PEI和coDbait两者在处理后的细胞中都诱导H2AX磷酸化(图2B)。支化和线性PEI/Dbait复合物快速促使H2AX磷酸化(图2C)，H2AX磷酸化在开始转染后6小时达到最高，并在转染后持续24小时。在电穿孔后，Dbait诱导的激酶活性在任何时间都是非常低的(图2)。高浓度CoDbait对于磷酸化的H2AX而言是非常低效的，并需要至少24小时来达到最大值。在转染期间加入CQ使coDbait转染细胞中的DNA-PKcs活化增加至用少10倍的Dbait/PEI所观察到的水平(图2C)。CQ没有使Dbait/PEI转染细胞中的活性增加，这表明当Dbait与PEI复合时，Dbait被有效地从内涵体释放。由于在转染后5小时和24小时之间，coDbait的细胞摄取没有增加，因此，coDbait对DNA-PK的缓慢活化表明它缓慢地从内涵体释放。
斑马鱼早期胚胎中的细胞摄取和整体毒性
在细胞培养物上分析Dbait摄取和活性不允许总结有关在整个生物体中的药物扩散、细胞摄取和活性。本发明人通过将裸Dbait-cy3或具有佐剂的Dbait-cy3注射到1000细胞期(1K期)斑马鱼胚胎的细胞间空隙中来评估该问题(Kimmel等,1995,Dev Dyn 203:253-310)。该方案允许通过共聚焦显微镜对Dbait-cy3在细胞和亚细胞水平的分布及其在早期斑马鱼胚胎的快速分裂细胞上的活性进行体内观察。被注射在1K期胚胎的动物极处的裸Dbait-cy3迅速扩散通过整个胚盘，并在注射后15分钟就不再能检测到。加入Lutrol允许将Dbait保留在注射点周围的细胞外空隙中，但不促进细胞摄取。在存在Superfect或PEI的条件下，在细胞内观察到许多荧光斑块，这表明有效的细胞摄取。coDbait cy3显示出另一种类型的行为，该行为具有强且持久的原生质膜染色以及斑块状细胞内荧光。在注射前将胚胎与CQ孵育，使大的coDbait荧光斑块转变成弥散性细胞内分布。
在注射后20小时观察表型效应允许对Dbait活性和治疗的整体毒性进行评估。在幼体的头部细胞中，在注射后24小时检测到Dbait荧光(图3A-C)，根据斑马鱼的命运图发育(Woo等,1995,Curr Opin GenetDev 5:439-443)，所述头部细胞源自于原肠胚前胚胎的动物极处的注射区域。注射无佐剂(NA)的Dbait或与Lutrol(Lu)组合的Dbait显示出对发育没有影响(图3D)，这与上述Dbait的弱细胞内摄取相关。加入佐剂导致头部中的细胞死亡并与注射体积相关，可能会观察到大量的细胞死亡和致畸。如所描述的，对24小时表型进行分类(图3)，允许对注射混合物的毒性进行定量。对于相同浓度的Dbait，根据佐剂的不同，在细胞死亡和随后的发育异常方面出现明显的差异。加入Superfect(sup)对胚胎细胞是非常有毒的，并且早期的大量细胞死亡导致高比例的2型表型。类似地，加入PEI(25K、22K、11K)被证明对斑马鱼卵裂球有毒性。尽管效率比加入PEI低，但注射coDbait导致显著的细胞死亡。将胚胎与CQ预孵育没有显著增加毒性。总之，早期胚胎细胞死亡和随后的发育异常是用于评估Dbait+/-佐剂在斑马鱼胚胎中的整体毒性的快速且可靠的方案。细胞死亡与细胞摄取的相关性表明，Dbait在胚胎细胞中的抗肿瘤活性可能在毒性效应方面起到重要的作用。
在小鼠中的局部和全身毒性
为了评估细胞培养物、斑马鱼胚胎和小鼠数据的一致性，本发明人分析了裸鼠皮肤对重复施用Dbait/PEI1K、Dbait/PEI22K、Dbait/bPEI25K和coDbait的耐受性。在3次每日皮下(SC)注射后，分析不同的配制的Dbait的毒性。所有Dbait/PEI均显示出高毒性，其中耐受3.75mg/kg的注射，但从5mg/kg开始，注射触发了与局部坏死和缺血相关的局部炎症，在停止治疗后，局部坏死和缺血迅速消失。静脉内(IV)注射毒性给出类似的结果：3mg/kg的Dbait/PEI静脉内注射是致死性的，其中注射过程中发生的死亡可能是由血液堵塞引起的。通过灌注缓慢注射(0.4μL/mn)使耐受性提高到6mg/kg Dbait/PEI(6纳摩尔/注射)，这证实大多数IV毒性是由于推注部位的局部浓度引起的。无论使用了何种途径：SC、IV推注或IV灌注，用或未用CQ的coDbait在所测试的所有剂量(高达800mg/kg/注射，800纳摩尔/注射)下均没有显示出任何毒性。
在异种移植瘤中的抗肿瘤活性
与放射疗法组合，在SK28异种移植的人黑色素瘤上测试了配制的Dbait的抗肿瘤效应。在每次辐射前5小时，利用瘤内注射来施用Dbait/载体复合物。
尽管在许多试验中已使用通过瘤内注射(IT)来施用药物，但目前建议在临床试验中应避免该递送途径。本发明人研究了如何可以通过在肿瘤附近区域中皮下注射(SC)来施用Dbait/PEI11k或coDbait。几个临床试验已成功使用了该施用途径。本发明人首先比较了用1次瘤内注射或在肿瘤的相对侧执行的两次皮下注射处理后的肿瘤中的分子扩散(图4)。与PEI11k复合的荧光Dbait倾向于在注射部位形成聚集体，并逐步扩散到肿瘤的边缘。相反，在注射周围，无论是在肿瘤内部还是在其附近，coDbait都显示出更均匀的分布。在肿瘤生长控制方面，SC注射Dbait/PEI11k或coDbait比IT注射略低效(表2)。然而，增加注射部位的数目将会允许显著改善肿瘤生长控制，而不增加局部毒性。
表2.在辐射与各种不同的治疗组合后异种移植小鼠的存活
a施用方式：IT，瘤内；SC，皮下
b治愈小鼠是在治疗后300天内无复发的动物
c TGD计算和统计学分析被描述在材料和方法中
研究了5组携带有SK28黑色素瘤异种移植物的裸鼠的存活。组1)未治疗小鼠(n＝16)；组2)辐射小鼠(IR，n＝12)；组3)腹膜内注射1mg氯喹的辐射小鼠(CQ，IR，n＝10)；组4)通过瘤内注射0.6mgDT01(也称为coDbait)并在5小时后进行辐射的治疗小鼠(DT01，IR，n＝11)，以及组5)腹膜内注射1mg氯喹、2小时后瘤内注射0.6mg DT01(也称为voDbait)、并在5小时后进行辐射的预处理小鼠(DT01，CQ，IR，n＝13)。
结果示于图5中。
与单独的放射疗法(组2)相比，伴随着瘤内施用0.6mg coDbait，通过氯喹进行的预处理显著放射增敏化并使存活提高(组5)，而coDbait(组4)或CQ(组3)都没有显示出显著的放射增敏。组5的放射增敏程度类似于通过用聚乙烯亚胺(PEI)以N/P比率＝6配制的0.06mgDbait治疗后的程度。
还在携带有SK28黑色素瘤异种移植物的裸鼠上评估了基于皮下注射coDbait的施用方案。该方案被示意性地公开在图6中。简单地说，该方案包括coDbait和辐射在两周内的4种组合治疗。具体地，在两个相对的点皮下注射4mg coDbait，所述两个相对的点与肿瘤边界相隔5mm。另外，用1mg氯喹(CQ)对动物进行预处理，并在用coDbait和辐射治疗期间进一步用CQ以相同剂量进行处理。在该施用方案之后评估肿瘤生长，图6中给出了结果。
已观察到，在用氯喹预处理后，用coDbait和辐射以及氯喹共处理时，观察到了最低的肿瘤生长。另外，用氯喹共处理的组显示出比不用氯喹处理的那些组更均匀的结果。
结论
在本研究中，本发明人使用了一系列试验来引导施用方案和药物制剂的开发。这些试验使得能够在小鼠上进行临床前试验之前比较Dbait的不同制剂。细胞和斑马鱼胚胎试验被用于评估Dbait细胞摄取的效率，并为哺乳动物上的临床前研究选择最合适的方案和制剂，所述细胞摄取是抗肿瘤药物效应中的前提步骤。在斑马鱼胚胎中的整体毒性与在小鼠皮肤中的毒性或全身性注射后的毒性没有相关性。具体地，coDbait在斑马鱼胚胎中的高毒性表明大多数接触到药物的细胞可能死亡，而小鼠皮肤对coDbait高剂量注射没有显示出任何反应。这种差异表明，在斑马鱼早期胚胎中的毒性是肿瘤敏感性而不是健康组织敏感性的指标。事实上，据显示，Dbait分子特异性地在肿瘤中有毒性，但在正常皮肤中无毒性(Quanz等，2009，同上)。Dbait/PEI(5μM)与coDbait(50μM)+CQ在细胞培养物中触发相当的DNA-PKcs活化，在斑马鱼胚胎上具有相似的毒性效应(图3D)，并在小鼠肿瘤上显示出显著的抗肿瘤活性(表2，图5和6)。该观察结果与斑马鱼胚胎细胞的抗肿瘤活性的敏感性一致，所述斑马鱼胚胎细胞与肿瘤细胞具有共同的特征性性质，包括有丝分裂指数以及生化和表型特征。与该假说一致，本发明人最近通过将裸Dbait直接细胞内注射到在1和16细胞期之间的斑马鱼卵裂球中，证实了Dbait的抗增殖活性。
PEI聚合物是所测试的所有佐剂分子中在形成Dbait复合物方面最有效的。然而，它们在组织上以及血液系统中的毒性限制了它们的应用。通过缓慢施用(灌注)以及通过将注射剂量分割成在不同的注射部位，部分克服了局部毒性。但是，胆固醇和Dbait的共价组合提供了用于将Dbait递送至细胞而无需加入佐剂的最佳替代物。事实上，在所测试的剂量范围内不存在毒性，表明该分子可能证明是有用的，尽管抗肿瘤效应需要一定的最高剂量。Dbait/PEI11K和coDbait分别为3纳摩尔/注射和30纳摩尔/注射的剂量使由辐射单独引起的肿瘤生长延迟增加一倍。Dbait/PEI11K和coDbait这两种制剂(6纳摩尔和>800纳摩尔)各自的毒性分别给出有效剂量/毒性剂量的相对比率为0.5和<0.037，这表明coDbait是一个非常好的临床试验候选物。
材料和方法
Dbait和粒子形成
Dbait和coDbait分子是通过自动固相寡核苷酸合成从Eurogentec(Seraing，Belgium)或者从Agilent Technologies Nucleic Acid SolutionDivision(Boulder，USA)获得的，如前所述(Quanz等，2009，同上)。通过变性反相HPLC和/或HPLC-IEX对它们进行纯化。某些Dbait衍生物标记有荧光基团Cy3(λ激发＝540nm，λ发射＝560nm)或Cy5.5(λ激 发＝X nm，λ发射＝X nm)。线性PEI(11kDa和22kDa)来自于Polyplus-Transfection(Illkirch，France)，并被提供为300mM氮浓度的即用型溶液。支化的bPEI25kd购自SIGMA-Aldrich(Saint Quentin，France)。Lutrol购自In Cell Art(Nantes，France)。将Dbait和PEI溶液(PEI原液)稀释在10％蔗糖或150mM NaCl(用于体外转染实验)中，以获得不同的载体/Dbait比率。根据PEI的胺氮数目和Dbait的磷酸盐数目，确定PEI/Dbait的比率(或N/P比率)。通常，对于300μL在0.6mg/mL和N/P 6下的复合物而言，将Dbait(180μg，0.54μmol磷酸盐)和所需量的聚合物溶液(含有0.3μmol胺氮的11,4μL PEI原液)各自稀释成150μL(10％蔗糖)。根据制造商(Qiagen，Courtaboeuf，France)，以10μl Superfect/μg DNA的比率制备Superfect/Dbait粒子。通过琼脂糖凝胶电泳方法分析载体/Dbait的复合。将样品(18μL)与溴酚蓝染料(1μL)混合，然后荷载到在含有TAE缓冲液1X(40mM Tris-乙酸盐，pH 8.3，1mM EDTA)的电泳槽中的1,5％琼脂糖凝胶上。将凝胶在100伏特下运行30分钟。然后用溴化乙锭(EtBr)将凝胶染色15分钟，并在UV光下观察条带。
细胞培养、Dbait分子和转染
通过自动固相寡核苷酸合成来制备Dbait分子。序列为5'-GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-(H)-TCTAGGCTTG TTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC(SEQ ID No 4)，其中H是六乙二醇接头。使用SV40转化的成纤维细胞MRC-5进行培养中细胞上的研究。在100％湿度、95％空气和5％CO2的条件下，细胞以单层培养的形式在37℃下生长在具有10％FCS和抗生素(100μg/mL链霉素和100μg/mL青霉素)的完全DMEM(Gibco，Cergy Pontoise，France)中。除非另有说明，否则在60mm直径的板中的1.2mL无血清的MEM培养基中进行转染。根据制造商的说明书，在N/P比率为6下用jetPEI(Polyplus-transfection，Illkirch，France)进行转染。简单地说，将Dbait稀释在150mM NaCl中并与在150mM NaCl中的等体积PEI轻柔混合，并加入到无血清的DMEM培养基中。coDbait被直接加入到无血清的DMEM培养基中。如果没有另外说明，用Superfect试剂在1.2ml含血清的DMEM培养基(在60mm直径的板中)中进行5小时的Dbait分子转染，然后让细胞恢复1小时。对于电穿孔，使用Gene Pulser II(Bio-Rad，Marnes-la-Coquette，France)用2μg Dbait转染1.2×106个细胞。在5小时转染结束时(零时间)，培养基被替换为完全培养基，并将细胞生长所指定的时间，然后进行分析。在转染前30分钟加入氯喹(50μM)。
流式细胞术
用具有Dbait-cy3的不同的复合物转染细胞5h，并让细胞生长5小时或24小时，立即用PBS进行洗涤。通过流式细胞术直接分析细胞。对于通过流式细胞术进行的免疫荧光检测，将细胞在2％多聚甲醛中固定10分钟，然后进行免疫检测。注意，透化处理去除了大部分Dbait，削弱了相同细胞上的免疫荧光检测和Dbait检测。将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，在0.2％Triton X-100中透化1小时，用2％BSA进行封闭，并与第一抗体抗γ-H2AX的小鼠单克隆抗体(UpstateBiotechnology，Temecula，CA，USA)在冰上孵育2小时，并用结合有Alexa-488(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)、得克萨斯红(Rockland，Gilbertsville，PA，USA)的第二抗体以1/200稀释在室温下显露30分钟。将细胞用PBS洗涤，并重悬在具有50μg/mL碘化丙啶、25U/ml RNaseA的PBS中。通过FACScalibur流式细胞仪(BDBiosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)分析细胞，并使用BD CellQuestPro(BD Biosciences)和免费的WinMDI 2.8(Scripps Research Institute，La Jolla，CA，USA)软件分析数据。
斑马鱼的饲养、胚胎收集和处理
从野生型或转基因(βactin:egfp-ras)鱼品种的自然产卵获得斑马鱼卵。被固定在具有落射荧光照明(Leica MZ16F)和空气注射器(Eppendorf FemtoJet)的解剖观测仪器(dissectting scope)上的Narishige(MN 153)显微操纵器被用来执行1K细胞期的Dbait注射。用KopF垂直移液管拉制仪(KopF vertical pipette puller)(KopF 720)拉伸玻璃毛细管(Harvard Apparatus GC100-10)，以制成注射针。将2至5nl的Dbait溶液注射在细胞周期10中的胚胎的动物极处，并立即进行处理，以用40x/0.8NA水浸泡的透镜物镜进行激光扫描共聚焦显微成像(直立型Leica SP2)。通过480nm(eGFP)和561nm(cy3)同时激发，进行成像。将胚胎在28.5℃下进一步生长至24hpf。在解剖站(dissecting stop)下观察一日龄的幼体，并如图3中所述对表型进行分类。注射前的氯喹处理为在胚胎培养基中与50μM氯喹孵育2小时(斑马鱼手册(The Zebrafish Book))。单独或与PEI25K(N/P比率＝9)、PEI11K(N/P比率＝6)、Superfect(10μl/1μg Dbait)组合注射50μM Dbait(coDbait)-cy3。
小鼠中的Dbait和辐射治疗
通过将106个肿瘤细胞注射到成年雌性裸鼠(Charles River strain；L’arbresle，France)的腋下，获得了SK28或U87G异种移植肿瘤。在开始实验之前至少一周，将动物安置在实验室中。在明暗循环(12小时：12小时)、相对湿度(55％)和温度(21℃)的受控条件下，每笼有5-6只动物。可自由获得食物和自来水。在约12天后，当测量到皮下肿瘤为150-200mm3时，将小鼠分成均匀的组以接受不同的治疗，每组至多12只小鼠。以137Cs单位(0.5Gy/min)进行辐射，所采用的护罩被设计成保护动物身体的约三分之二。通过热致发光剂量测定法控制剂量。在2周期间，每隔3期5Gy/周，分6期来递送30Gy的总剂量。如前面为体外研究所描述的，将Dbait分子制备在100μL 10％蔗糖中，区别在于不用NaCl来执行PEI混合物(Polyplus Transfection，Strasbourg，France)。在注射前，将Dbait混合物在室温下孵育15min。以所需的浓度将CoDbait稀释在10％蔗糖中。在每个放射治疗期前5小时，进行指定量的Dbait的瘤内注射。根据相关试验的方案，用100μL 10％葡萄糖对Mock治疗的动物进行注射。每3天通过游标卡尺测量来估计肿瘤尺寸，并通过式(2x长度x宽度2)来计算尺寸。对小鼠进行称重，并每周拍摄肿瘤的照片。出于伦理学原因，当动物的肿瘤达到2000mm3时，将它们处死。存活分析中所使用的终点是死亡日。当地的动物实验伦理委员会(Local Committee on Ethics of AnimalExperimentation)(Orsay，France)批准了所有实验。
统计学分析
为每种治疗和每种肿瘤类型进行肿瘤反应的描述性分析。第1天是第一个治疗期当天。所有动物均被跟踪至少150天。根据Kaplan-Meier方法估计中位寿命。通过从每个治疗组中单只小鼠的肿瘤体积四倍的时间减去对照组的平均肿瘤体积四倍的时间，来计算肿瘤生长延迟(TGD)。使用各个测量结果为每个治疗组计算TGD平均值。通过Kaplan-Meier估计来评估总存活曲线，并用非参数LogRank检验进行比较，因为数据不遵循正态分布。用statEL软件(ad Science，Paris，France)进行分析。首先对具有相同肿瘤类型的各组进行总LogRank。然后将采用Dbait的治疗与mock治疗的对照进行比较。动物数量(n)、相对风险(RR)和p值被报告在表2中。所有测试均在0.05显著性水平下被认为是显著性的。
配制的Dbait粒子的物理化学性质
采用下面的规格在Zetasizer纳米系列(Malvern instruments，Paris，France)上通过动态光散射(DLS)来测定载体/Dbait的粒径：介质粘度：1.150cP，折射率：1.45，散射角：90°，温度：25℃。数据是每个样品3-5次测量的平均值，其中每次测量对10-15次亚运行的数据进行平均。使用随仪器提供的多峰数分布软件(multimodal numberdistribution software)对数据进行分析。对于ζ电位测量，将粒子稀释在10％蔗糖/10mM NaCl中以得到0.1mg/mL的终浓度，并用下面的规格进行测量：3次测量，介质粘度：1.054cP，介质的介电常数：79，温度：25℃。
a观察到最大Dbait活性时的重量比
b通过动态光散射(参见补充材料和方法)测定的平均直径(+/-SD)。
c在1％蔗糖、10mM NaCl中的粒子
透射电镜
通过用乙酸双氧铀负染色来制备用于透射电镜的样品。将一滴样品(10μL)沉积在载网(在200目铜上的formvar/碳，AGAR scientific)上并放置3分钟，然后用吸墨纸去除过量的液体。然后，用10μL水性乙酸双氧铀(2％)将复合物染色2分钟，并用吸墨纸去除过量的所述物质。用Jeol JEM-100S电镜进行观察。
可选的结合的Dbait分子
制备并在下面描述了可选的结合的Dbait分子：
下式(IIe)的结合的分子
其中
下式(Ie)的结合的分子
其中
已通过DNA PK抑制测定了这些可选的结合的Dbait分子的活性，如上文所详述(图7)。观察到这些结合的分子保持了其活性。具体地，在5'末端处或在环中结合各种脂质和配体，对这些分子触发DNA-PK活性的能力影响较少。
另外，还通过测定H2AX磷酸化的量，用或未用氯喹在细胞系上测定了它们的活性，如上文所详述(图8)。首先，对于所测试的结合的Dbait分子，观察到用氯喹进行前处理时，它们的活性较高。另外，可注意到，与将胆固醇结合在发夹环中相比，将胆固醇结合到5'末端，令人惊奇地导致更有效的分子(参见0902，与0813和0815相比)。
结合的Dbait分子的细胞摄取
本发明人通过流式细胞术分析测定了与胆固醇结合的Dbait、特别是CoDbait的细胞摄取，并与Dbait进行比较。
结果列在下面的表中。
在开始用如表中所述的各种转染条件处理后5小时，进行MRC5细胞系中的细胞摄取的流式细胞术分析。用花青3(Cy3)染料标记所有寡核苷酸：Dbait(Dbait-Cy3)、胆固醇-Dbait(0813)(CoDbait-Cy3)和在有义链的5'和3'具有花青3和胆固醇的靶向H2AX的siRNA(Co_siRNA_H2AX：Cy3-5'-CAACAAGAAGACGCGAAUCTT-3'-胆固醇(SEQ D No 6)；5'-GAUUCGCGUCUUCUUGUUGTT-3'(SEQ ID No7)。在指出时，在转染前加入50μM氯喹(CQ)。

Claims (4)

1.结合的核酸分子，其具有下式之一：
其中带下划线的核苷酸是指有或没有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷(T4)和2,19-双(磷)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m是1并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，C选自二油酰基，十八烷基，叶酸，生育酚和胆固醇。
2.权利要求1的结合的核酸分子，其中促进内吞的分子选自生育酚和胆固醇。
3.权利要求1的结合的核酸分子，其中所述分子是
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。
4.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项的结合的核酸分子。
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