JP2010515707A - Ｄｂａｉｔおよびその単独使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳動物細胞における二本鎖切断（ＤＳＢ）のＤＮＡ修復に干渉する組成物および方法に関する。本発明は、ＤＮＡ ＤＳＢ検知、シグナル伝達および／または修復経路、特にＤＳＢ修復の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路に関与する酵素のホロ複合体（ｈｏｌｏｃｏｍｐｌｅｘ）を引き寄せる、または、奪うことにより作用する二本鎖核酸分子を開示する。本発明は、死を誘発するために、有効量で腫瘍細胞の核に導入される単独の抗癌薬物としてのこれらの分子の使用を開示する。

Description

本発明は、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ二本鎖切断の修復経路に干渉する組成物および方法に関する。したがって、本発明は、増殖性疾患を処置するための組成物および方法に関する。

背景
放射線治療および化学治療は、単独または外科手術との併用で、ヒトの癌に対する必須の治療兵器である。化学治療と放射線治療の間の関連性は癌処置において広く使用された。依然として完全には解明されていないが、細胞毒性作用の生物学的基礎は、細胞周期またはＤＮＡ損傷などの細胞機構に依存しており、それは放射線誘発性の細胞死においても重要であり、癌治療において異なる処置を併用することにより、付加的な、またはさらには相乗的な利点をもたらす。

生物学的薬物（モノクローナル抗体、サイトカイン／キナーゼ阻害剤、免疫治療／ワクチン）の開発における最近の進歩によって、一部の腫瘍に対するそれらの効率および特異性が証明されている。しかし、それらは化学的細胞毒と併用されることが多い。新しい細胞毒性薬物の開発における多くの進歩にもかかわらず、化学治療に対する薬物耐性は依然として癌の処置における主な臨床上の懸念である。薬物の取り込み／排出、代謝分解、標的の突然変異誘発、修復促進、細胞死のシグナル伝達（アポトーシスおよび壊死）に関連する薬物耐性の機構の理解は、特に一部の処置耐性腫瘍において化学治療の効率を保証し、治療指数を改善するために必須である。

この１０年間において、多くの研究がこの分野においてなされ、放射線に反応するシグナル伝達の複雑さが描写され始めた。この点において、電離放射線で標的とされる特に対象となる遺伝子は、アポトーシスまたはＤＮＡ修復などの放射線誘発性の致死機構の制御に関与するものである。二本鎖切断（ＤＳＢ）は最も致死的なＤＮＡ損傷であるため、ＤＳＢ修復の有効性が増加するにつれて電離放射線の有効性は減少する。

２つの機構がＤＳＢの修復に関与する：非相同末端結合（ＮＨＥＪ、配列非依存的経路）および相同組み換え（ＨＲ、配列依存的経路）（Jackson, 2002により概説）。これらの２つの主なＤＳＢ修復経路に関与する遺伝子を標的にすることよって、使用されるアプローチおよび癌細胞株に応じて、これまでにわずかまたは中等度の放射線感受性がもたらされている（Belenkov et al., 2002 ; Marangonl et al., 2000a; Ohnishi et al., 1998）。

Ｋｕ（例、Ｋｕ７０およびＫｕ８０）およびＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質は、放射線または化学誘発性のＤＮＡ ＤＳＢの修復において重要である。損傷が時間どおりに修復できない場合、細胞は死ぬ。したがって、それらは、放射線治療および化学治療に対して標的の細胞および組織を感受性化するための潜在的に興味深い分子標的を表す。哺乳動物細胞において優勢である、ＮＨＥＪ経路に関与するこれらの重要タンパク質（Ｋｕ７０／Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓなど）を阻害することを試みるために、多くのアプローチがこのように想像され、実施されてきた：
１）ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ）の阻害剤（すなわち、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＡＴＭ、ＡＴＲ）（Bouton et al., 2000; Durant & Karran, 2003; Willmore et al., 2004; Yauger et al., 2004）；
２）ネガティブドミナント＆ペプチド（ＫＵ８０のＣ末端）（Marangoni et al., 2000b; Kim et al., 2002）；
３）一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）（Li et al., 2003a）；
４）ＲＮＡアプタマー（ＳＥＬＥＸ：ＲＮＡ結合Ｋｕ）（Yoo & Dynan, 1998）；
５）アンチセンス（Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）（Li et al., 2003b; Marangoni et al., 2000c; Sak et al., 2002）；
６）ｓｉＲＮＡ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）（Peng et al., 2000）。

これらの多大の努力にもかかわらず、ＤＮＡ修復経路に関与する遺伝子の標的化および癌治療の併用は依然として初期の実験段階にあり、これまでに臨床試験によってなんら証明済みの利点は示されていない。上記のアプローチが共通の特色を共有することは注目に値する：それらは可能なバイパスまたは補償を伴う複雑なカスケード経路（ＮＨＥＪなど）に関与する単一のエフェクター（タンパク質）を標的にする。

特許出願国際公開第２００５／０４０３７８号では、哺乳動物細胞におけるＤＮＡ二本鎖切断の修復経路に干渉する組成物および方法が開示された。特に、それは、遺伝子非特異的な方法で、ＤＮＡ損傷検知、シグナル伝達および／または修復経路に干渉する核酸分子、ならびに、抗癌治療を受けた腫瘍の細胞致死を誘発するためのそれらの使用に関する。それは、切断ＤＮＡフラグメントの模倣体として作用し、ＤＮＡ損傷治療により誘導されるＤＳＢ部位として認識される（化学修飾されている、または、されていない）短鎖ｄｓＤＮＡ（すなわち、ＤＳＢの基質模倣体）を使用することにより、直接的または間接的なＤＮＡ損傷治療に対する細胞の感受性が増強できることを記載する。これらの分子は、別名が「ＤＳＢベイト」分子（Ｄｂａｉｔ）であり、ＤＮＡ損傷癌治療・処置、すなわち、化学治療または放射線治療に対する任意の腫瘍細胞の感受性を付与または増加する。Ｄｂａｉｔ分子は、ＤＮＡ ＤＳＢ修復酵素のホロ複合体（ｈｏｌｏｃｏｍｐｌｅｘ）を引き寄せる、または、奪うことにより作用し、それによりＤＮＡ損傷の検知、シグナル伝達および／または修復の工程に干渉する。したがって、本願は、ＤＮＡのＤＳＢを直接的または間接的に起こすことのできる物理的および／または化学剤との併用でのＤｂａｉｔ分子に関する。

発明の概要
発明者らは、驚くべきことに、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置（すなわち、化学治療、放射線治療）の非存在下において、腫瘍細胞がＤｂａｉｔ分子単独の存在に対して感受性であることを見出した。実施例において示すとおり、Ｄｂａｉｔ分子は、単独の癌処置として使用するために、インビトロならびにインビボで効果的である。

したがって、本発明は、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置の非存在下において増殖性疾患を処置するための薬剤を調製するための核酸分子の使用に関し、ここで該核酸分子が、少なくとも１６bp、２４bp超、好ましくは３２bpの二本鎖部分を含み、少なくとも１つの自由末端を有し、およびここで該分子が少なくともＫｕタンパク質による結合のための基質であり、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを活性化できる。

本発明は、被験者に対して、少なくとも１６bp、好ましくは３２bpの二本鎖部分を含み、少なくとも１つの自由末端を有し、少なくともＫｕタンパク質による結合のための基質であり、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを活性化できる治療有効量の核酸分子を投与することを含む、該被験者における増殖性疾患の処置のための方法にも関する。

本発明は、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を測定することを含む、本発明の核酸による処置の効率を評価するための方法にも関する。

本発明は、さらに、細胞および／または組織に本発明の核酸を導入することを含む、該細胞および／または組織においてヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を増加するため、または、ヒストンＨ２ＡＸを活性化するための方法に関する。

ヒトの腫瘍（Ｈｅｌａ、Ｈｅｐ２、およびＭＯ５９Ｋ）および形質転換した繊維芽細胞（ＭＲＣ５）に由来する様々な細胞株におけるヒストンＨ２ＡＸおよびリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）のウエスタンブロットＭＯ５９ＪはＤＮＡ−ＰＫ欠損である（野生型ＭＯ５９Ｋに由来する）。ＡＴ５ＢＩはＡＴＭ欠損である（野生型ＭＲＣ５に由来する）。 様々なＤｂａｉｔ分子によるトランスフェクションから５時間後、または、１０Ｇｙ照射から１時間後のＨｅｐ２細胞におけるリン酸化Ｈ２ＡＸ（γ−Ｈ２ＡＸ）およびリン酸化したチェックポイントタンパク質Ｃｈｋ２（Ｃｈｋ２−Ｔ６８ｐ）のレベル Ｈｅｐ２腫瘍除去におけるγ−Ｈ２ＡＸレベルのウエスタンブロット解析 Ｈｅｐ２腫瘍除去におけるγ−Ｈ２ＡＸレベルのＦＡＣＳ解析 ヌードマウスでのＨｅｐ２（ＨＮＳＣＣ）異種移植のカプラン・マイヤープロット ヌードマウスでのＬＵ１２０５異種移植のカプラン・マイヤープロット ヌードマウスでのＳＫ２８異種移植のカプラン・マイヤープロット Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＤｂａｉｔ注入の免疫応答

本発明の詳細な説明特許出願国際公開第２００５／０４０３７８号において開示されるとおり、Ｄｂａｉｔ分子は、遺伝子非特異的な方法で、哺乳動物細胞においてＤＮＡ ＤＳＢ修復系に干渉できる治療用分子の新しいクラスである。これらの新しい分子は、Ｄｂａｉｔ分子と呼ばれ、ＮＨＥＪ経路（配列非依存的経路）に関与するタンパク質、特にＫｕおよび／またはＤＮＡ−ＰＫタンパク質のホロ複合体の基質であり、細胞のＤＮＡ修復能を中和でき、それによりＤＮＡ損傷処置に対するそれらの感受性を増加する。

本発明は、Ｄｂａｉｔ分子が、ＤＮＡ損傷処置の非存在下において、染色体の完全性の重要ガーディアンであるヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を誘発する能力をさらに開示する。Ｈ２ＡＸのこの翻訳後修飾はＤＮＡ−ＰＫ（ＤＮＡ依存的キナーゼ）媒介性経路により媒介されるが、しかし、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）媒介性経路に非依存的である。

そのような予想外の／間違ったＨ２ＡＸの活性化の生物学的結果は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復系、特に非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の混乱であり、これにより正常細胞よりも高レベルの自然発生的（複製エラー）および内因的（酸化ストレス）に生じるＤＳＢを有する腫瘍細胞において細胞致死を誘導する。

より具体的には、本発明は、Ｄｂａｉｔ分子が、任意のＤＮＡ損傷処置の非存在下において、ヌードマウスに異種移植したヒト腫瘍の細胞／組織の致死を誘発できる。

したがって、本発明は、このように、特に増殖性疾患を処置するための、単独の治療剤としてのそのような分子の使用に関する。

本発明のＤｂａｉｔ分子は、それらの最小長、少なくとも１つの自由末端の存在、および二本鎖部分の存在などの多くの特徴により定義できる。以下で考察するとおり、Ｄｂａｉｔ分子の重要な特色は、それらの厳密なヌクレオチド配列が実質的にそれらの活性に影響を及ぼさないことである。さらに、Ｄｂａｉｔ分子は、修飾した、および／または、非天然の骨格を含みうる。

Ｄｂａｉｔ分子は、好ましくは、非ヒト由来であり（すなわち、そのヌクレオチド配列および／または立体構造（例、ヘアピン）それ自体がヒト細胞において存在しない）、最も好ましくは合成由来である。

Ｄｂａｉｔ分子の作用機構によると、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、あるとしても、ほとんど役割を果たさない。したがって、遺伝子／タンパク質特異的ターゲティング（例、アンチセンス、アンチジーン、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、デコイ、リボザイムなど）のために先行技術において使用する分子とは対照的に、Ｄｂａｉｔ分子は、公知の遺伝子、プロモーター、エンハンサー、５’または３’上流配列、エクソン、イントロンなどと有意な程度の配列相同性または同一性を有さなくてもよい。換言すると、Ｄｂａｉｔ分子がＮＨＥＪ経路に干渉する作用は配列非依存的であり、Ｄｂａｉｔ分子はヒトゲノム中の任意の遺伝子に対して８０％または７０％未満、さらに６０％または５０％未満の配列同一性を有することができる。

この配列非依存的な作用機構は、Ｄｂａｉｔ分子の特徴であり、それらを他の遺伝子特異的またはタンパク質特異的（配列依存的）な治療剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ）、および免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ならびに、特定のタンパク質を捕捉するように設計されたアプタマー／デコイから明確に区別される。

好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子の配列は、約８０％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％未満であるヒト核酸配列に対する全体的な程度の同一性を有する。配列同一性を測定する方法は、当技術分野において周知であり、例えばＢｌａｓｔが挙げられる。

特定の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、ストリンジェントな条件下では、ヒトゲノムＤＮＡにハイブリダイズしない。典型的なストリンジェントな条件では、それによって部分的に相補的な核酸から完全に相補的な核酸を識別できる。

好ましい態様において、周知のｔｏｌｌ様受容体媒介性の免疫反応を、仮にそのような効果が望ましくない場合には避けるために、Ｄｂａｉｔ分子の配列はＣｐＧを欠く。

特定の態様において、少なくとも３２bpまたは３２bpの二本鎖部分を有するＤｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）と同じヌクレオチド配列を含む。場合により、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄと同じヌクレオチド組成を有するが、しかし、それらのヌクレオチド配列は異なる。次に、Ｄｂａｉｔ分子は、３Ａ、６Ｃ、１２Ｇ、および１１Ｔを伴う二本鎖部分の一本鎖を含む。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子の配列は任意のＣｐＧジヌクレオチドを含まない。

それらの作用機構を考慮すると、Ｄｂａｉｔ分子の長さは、それがＫｕおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質を含むＫｕタンパク質複合体の適切な結合を可能にするだけ十分な限り、可変でありうる。国際公開第２００５／０４０３７８号の実験の項では、そのようなＫｕ複合体へ結合すること、および、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性化を可能にすることを保証するために、Ｄｂａｉｔ分子の長さが１６bp、好ましくは３２bpより長くなければならないことが示された。好ましくは、Ｄｂａｉｔ分子は、１６〜２００bp、より好ましくは２４〜１００bp、さらにより好ましくは２６〜１００bp、および最も好ましくは３２〜１００bpを含む。例えば、Ｄｂａｉｔ分子は２４〜１６０、２６〜１５０、２８〜１４０、３０〜１２０、３２〜１００bpを含む。「bp」により、分子が、指示した長さの二本鎖部分を含むことを意図する。

特定の態様において、二本鎖部分は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）の少なくとも１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の連続ヌクレオチドを含む。さらに特定の態様において、二本鎖部分は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）の１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の連続ヌクレオチドに存する。

本発明のＤｂａｉｔ分子は、ＤＳＢの模倣体として、少なくとも１つの自由末端を有しなければならない。該自由末端は、自由平滑末端または５’／３’突出末端のいずれかでありうる。特定の態様において、それらは１つの自由末端のみを含む。別の特定の態様において、それらは２つの自由末端を含む。したがって、本発明は、２つの自由末端を伴う二本鎖分子であり、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ ｄｓ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ ｄｓ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ ｄｓ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ ｄｓ（配列番号３１）のヌクレオチド配列を有するＤｂａｉｔにも関する。

Ｄｂａｉｔ分子は直線状でよく、または、好ましくはヘアピン二本鎖核酸で作ることができる。そのような場合において、ループは核酸、または、当業者に公知の他の化学基、好ましくはヘキサエチレングリコールまたはテトラデオキシチミジル酸（Ｔ４）などのリンカーでよい。したがって、特定の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）の少なくとも１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の連続ヌクレオチドを含む二本鎖部分およびヘキサエチレングリコールリンカーまたはテトラデオキシチミジル酸（Ｔ４）リンカーであるループを有するヘアピン分子でよい。さらに特定の態様において、それらのＤｂａｉｔ分子は、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）の１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２の連続ヌクレオチドに存する二本鎖部分を有してよい。

好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子は以下のとおりである：
１）二本鎖Ｄｂａｉｔ分子は薬学的に許容される担体／賦形剤と使用した場合、細胞／組織体により細胞核に取り込ませることができる；
２）Ｄｂａｉｔの少なくとも１つの自由末端は、ＤＳＢ損傷検知、シグナル伝達、および／または修復工程に関与する酵素のホロ複合体により認識可能である；および
３）Ｄｂａｉｔ分子の少なくとも１つの自由末端は、前記の複合体により受け入れられて、腫瘍細胞のゲノムＤＮＡ中に取り入れられる。

特定の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、ループおよび／または骨格などのそれらの構造に起因して、非複製構造を有する。

この点において、修飾ｄｓＤＮＡがＮＨＥＪ経路に関与するホロ複合体、特にＫｕおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質、ならびに、ＤＳＢ損傷検知またはシグナル伝達経路の基質のままであるとの条件で、本発明のＤｂａｉｔ分子は、もっぱら、または、主に（５０％超）の天然ホスホジエステル骨格もしくは化学修飾したホスホジエステル骨格、または化学基もしくは化学基の混合体を伴う別の骨格を有しうる。有利なことに、化学修飾は、Ｄｂａｉｔ分子に化学的安定性を付与すること、および／または、生じる場合には、それらのゲノム挿入時のさらなる複製（変異原性効果の潜在的な原因）のためにそれらを保護することを意図する。

好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子は２’−デオキシヌクレオチド骨格を含み、場合により１または数個（２、３、４、５、または６）の修飾ヌクレオチドおよび／またはアデニン、シトシン、グアニン、およびチミン以外の核酸塩基を含む。したがって、Ｄｂａｉｔ分子は本質的にＤＮＡ構造である。

それらは、ペントフラノシル基の代わりに、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐リボース、シクロブチル、もしくは他の炭素環などの糖模倣体またはヘキシトールも有してよい。

好ましいＤｂａｉｔは、１つまたは各鎖の末端に、１または数個の化学修飾したヌクレオチドまたは基を含む。特に好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子の自由末端は、１つまたは各鎖の末端で、１、２、または３の修飾ホスホジエステル骨格により保護される。好ましい化学基、特に修飾ホスホジエステル骨格はホスホロチオエートを含む。あるいは、好ましいＤｂａｉｔは、３’−３’ヌクレオチド結合、またはメチルホスホン酸骨格を伴うヌクレオチドを有する。

本発明の他の修飾骨格は、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−０，４’−Ｃメチレン／エチレン架橋ロックド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および短鎖アルキル、またはシクロアルキル糖間結合もしくは可変長の短鎖ヘテロ原子または複素環の糖間結合、または当業者に公知の任意の修飾ヌクレオチドを含む。

米国特許第５，６７７，４３７号は、複素芳香族オリゴヌクレオチド結合を記載する。窒素リンカーまたは窒素を含む基を使用して、オリゴヌクレオチド模倣体を調製することもできる（米国特許第５，７９２，８４４号および第５，７８３，６８２号）。米国特許第５，６３７，６８４号は、ホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物を記載する。モルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも想定される（米国特許第５，０３４，５０６号）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格などの他の態様において、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格はポリアミド骨格により置換でき、塩基はポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。他の合成オリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む置換糖成分を含みうる：ＯＨ、ＳＨ、ＯＣＨ_３、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、またはＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、ここでｎは１から約１０である；Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｓｒ；ＣＮ；ＣＦ_３；ＯＣＦ_３−；Ｏ−Ｓ−；またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ＣＨ_３；ＯＮＯ；ＮＯ；Ｎ_３。

Ｄｂａｉｔ分子は、少なくとも１つの埋め込みエレメントを含むことができ、それによってＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、または損傷シグナル伝達過程が妨げられる。前記の埋め込みエレメントは、内部位置（例、中央に）または二本鎖フラグメントの末端に組み入れることができる。それ（それら）は、ａ）ＤＮＡ複製の鋳型として使用できないユニット、例えばポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、または１または複数のヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、窒素、または１または複数のヘテロ原子を含むヘテロ原子基もしくは複素環基により最終的に中断および／または置換された任意の炭化水素鎖；ｂ）任意の３’修飾ヌクレオチドなど、ＤＮＡポリメラーゼまたはエクソヌクレアーゼにより受け入れられないため遮断エレメントであるユニット、または当業者に公知の他のもの；ｃ）Ｔｎなどの天然オリゴヌクレオチド、ヘアピンフラグメントのループにおいて使用される場合、例えばテトラデオキシチミジル酸（Ｔ４）を含みうる。

前記の鎖は化学合成、半生合成または生合成、任意の増幅方法、それに続く任意の抽出および調製の方法ならびに任意の化学修飾により作られる。

特許出願国際公開第２００５／０４０３７８号において開示されるとおり、Ｄｂａｉｔ分子の生物活性は、例えば実施例２および３において記載するインビトロおよび培養細胞を使用したアッセイ、および／または、実施例４および５において記載するインビボアッセイによっても評価できる。最も簡単な関連アッセイは、ＤＮＡ依存的タンパク質キナーゼ活性アッセイ（実施例２、図１．４を参照）である。この簡単なアッセイは、これまでにＤｂａｉｔ分子のインビボ活性を予測してきた。しかし、放射線により増強される非正統的挿入の阻止のアッセイなど、他の培養細胞を使用したアッセイも関連する（実施例３、図２．３及び図２．４を参照）。

実際に、本発明のＤｂａｉｔ分子はＤＮＡ−ＰＫを活性化できなければならない。一態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、放射線により増強される非正統的挿入を阻止することもできる。別の特定の態様において、例えばゲルシフトアッセイにより測定するとおり、Ｄｂａｉｔ分子はインビトロでＫｕ複合体に結合する。そのようなＫｕ複合体は、１または複数のＫｕタンパク質および少なくともＤＮＡ−ＰＫｃタンパク質の組み合わせを含む。さらなる特定の態様において、本発明のＤｂａｉｔ分子は、好ましくは薬学的に許容される担体／賦形剤を使用することにより核に侵入する。本発明の最も好ましいＤｂａｉｔ分子は、上の特徴のいくつかまたはすべてを組み合わせる。

好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子は、ヒトの治療における上で定義する他の慣例などの化学修飾したＤｂａｉｔ分子である。別の態様において、Ｄｂａｉｔ分子は化学修飾されておらず、天然核酸フラグメントに対応するが、しかし、化学修飾フラグメントの特徴を呈し、特に該化学修飾Ｄｂａｉｔ分子に関して定義した塩基対の数および特性を有する。

本発明は、本明細書において開示する任意のＤｂａｉｔ分子の使用に関する。好ましい態様において、Ｄｂａｉｔ分子はＤｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ｐｏ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ（配列番号４）、Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’５’（配列番号１４）、Ｄｂａｉｔ３２−ＮＨ２（配列番号１５）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ（配列番号２１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３（配列番号２２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｂｉｏｔ（配列番号２３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号１０）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号１１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−３’ｍｐ（配列番号１２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’３’ｍｐ（配列番号１３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ３（配列番号２５）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ５（配列番号２６）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ−ＦＩＴＣ（配列番号２７）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ ｄｓ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ ｄｓ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ ｄｓ（配列番号３０）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ ｄｓ（配列番号３１）、Ｄｂａｉｔ６４（配列番号１９）、およびＤｂａｉｔ６４Ｌ（配列番号２０）からなる群より選択される。その組み合わせも使用できる。

したがって、本発明は、増殖性疾患を有する細胞および／または組織に上で定義するＤｂａｉｔ分子を導入し、それによって該細胞および／または組織の細胞致死を誘導することを含む、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置（すなわち、化学および放射線治療）の非存在下において増殖性疾患を処置するための方法に関する。

本発明は、細胞および／または組織に上で定義するＤｂａｉｔ分子を導入し、それによってヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を増加し、ヒストンＨ２ＡＸを活性化することを含む、該細胞および／または組織においてヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を増加し、ヒストンＨ２ＡＸを活性化するための方法にも関する。ヒストンＨ２ＡＸは当業者に周知のタンパク質である。スイスプロットにおける参照番号はＰ１６１０４であり、ＵｎｉｇｅｎｅはＨｓ４７７８７９である。リン酸化はＳｅｒ−１３９で実施する（Li et al., 2005の総説）。

本発明は、加えて、細胞および／または組織に上で定義するＤｂａｉｔ分子を導入し、それによって該細胞および／または組織の細胞致死を誘導することを含む、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置の非存在下において増殖性疾患を有する該細胞および／または組織の致死を誘導するための方法に関する。

上の方法の特定の態様において、トランスフェクション剤を前記の導入段階において使用する。例えば、トランスフェクション剤は、ＰＥＩ（米国特許第６，０１３，２４０号）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの陽イオン性脂質からなる群より選択できる。

本発明の方法および使用において、Ｄｂａｉｔ分子は有効量で使用される。特に、この量のＤｂａｉｔ分子によって、分子が処置される細胞の核酸に到達できる。加えて、この量はＤＮＡ−ＰＫを活性化し、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を増加して、それを活性化するために十分である。

本発明は、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置の非存在下において増殖性疾患を処置するための薬剤を調製するためのＤｂａｉｔ分子の使用に関する。

好ましい態様において、前記のＤｂａｉｔ分子が、少なくとも１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０bp、好ましくは３２bpの二本鎖部分を含み、少なくとも１つの自由末端を有し、およびここで該Ｄｂａｉｔ分子は少なくともＫｕタンパク質による結合のための基質であり、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを活性化できる。Ｄｂａｉｔ分子は本質的にＤＮＡである。

本発明は、被験者に治療有効量のＤｂａｉｔ分子を投与することを含む、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置の非存在下において、該被験者において増殖性疾患を処置するための方法にも関する。

特に、本発明は、被験者に治療有効量の上で定義するＤｂａｉｔ分子を投与し、それによって前記の被験者の生存時間を増加することを含む、任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置（すなわち、化学および放射線治療）の非存在下において癌を患う被験者の生存時間を増加するための方法に関する。

被験者は哺乳動物またはヒトでよい。好ましくは、被験者はヒトである。一般的に、「哺乳動物」とは、実験室、家庭、農場、および動物園の動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、および高等動物などの愛玩動物を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。

そのような動物は、無制御な細胞増殖、特に癌に起因する疾患を処置するために使用できる新しい治療剤に関する。Ｄａｂａｉｔ分子は従来のＤＮＡ損傷治療の代替物として抗癌治療において使用することが主に意図されるが、高過ぎる細胞分裂速度（増殖）に関連する疾患などの非悪性疾患、例えば乾癬または狭窄／再狭窄のための抗増殖処置においても使用できる。抗増殖活性は、初期段階のゼブラフィッシュ胚細胞においてＤｂａｉｔ分子を注入することにより評価されてきた。Ｄｂａｉｔ分子は急速に分裂する内部細胞を特異的に殺すが、ゆっくりと分裂する末梢細胞にはほとんど効果を有さない。

本発明を使用して、哺乳動物の被験体、特にヒトの被験者において、固形癌および白血病、特に放射線または化学耐性の癌などの様々な種類の癌の単独の癌処置として処置できる。関与する器官または部位は、肺および気管支、頭頸部、脳、胃腸管、膵臓、肝臓、大腸癌、泌尿生殖器、婦人科器官、乳房、内分泌、皮膚、網膜、ＣＮＳ、血液器官、原発部位が既知または未知の転移、および残遺物（例えば胸腺）でありうる。組織学的性質は上皮性、偏平上皮細胞癌、腺癌、移行性癌、繊維芽細胞／血管芽細胞由来の（肉腫）、神経細胞、膠細胞由来、内分泌、癌様体、胃腸間質、内皮、造血および胚性でありうる。好ましくは、癌は膠芽腫、頭頚部癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、皮膚癌、乳癌、および子宮頸癌からなる群より選択される。

Ｄｂａｉｔ分子は、適切な許容される担体／賦形剤と共に任意の適切な経路、例えば経口、または静脈内、または腫瘍内投与、または皮下注入、または局所投与などにより投与できる。本発明の態様によると、トランスフェクション剤はＤｂａｉｔ分子と併用される。

インビボ試験において使用するプロトコールに基づき、本発明は、Ｄｂａｉｔ分子の使用の臨床プロトコールを確立するための理論的根拠を提供する。それは、特に患者の体重／体表面に応じて、当業者により容易に適用される。

本発明の組成物は、腫瘍細胞の核に導入するための有効量のＤｂａｉｔ分子を含む。例えば、腫瘍内投与を使用する場合、前記の有効量は少なくとも０．１mg/cm³腫瘍、好ましくは０．６mg/cm³腫瘍、最も好ましくは１mg/cm³腫瘍である。有効量は、毎日の処置プロトコールにおいて投与できる（例、週５日連続３週間または週３回連続５週間）。あるいは、少なくとも０．３mg/cm³腫瘍、好ましくは１．８mg/cm³腫瘍、最も好ましくは３mg/cm³腫瘍の有効量を、例えば、毎週の処置プロトコールにおいて連続５週間に及び投与できる。他の投与経路を使用する場合、当業者は、特に毎日の処置プロトコールにおいて、少なくとも０．１mg/cm³腫瘍、好ましくは０．６mg/cm³腫瘍、最も好ましくは１mg/cm³腫瘍の腫瘍において有効量のＤｂａｉｔ分子を得るために、または、特に毎週の処置プロトコールにおいて、少なくとも０．３mg/cm³腫瘍、好ましくは１．８mg/cm³腫瘍、最も好ましくは３mg/cm³腫瘍の腫瘍において有効量のＤｂａｉｔ分子を得るために、この量を適応できる。

加えて、本発明は、特に本明細書において記載するＤｂａｉｔ分子による、増殖性疾患（例、癌）の処置の効率のマーカーとしてのヒストンＨ２ＡＸにも関する。次に、本発明は、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化率を測定することを含む、Ｄｂａｉｔ分子による処置の効率を評価するための方法に関する。ヒストンＨ２ＡＸのリン酸は、例えば実施例において記載されるとおりに検出できる。処置なしでのリン酸化レベルと比較して、より高いヒストンＨ２ＡＸのリン酸化レベルは、処置の効率を示す。特に、Ｄｂａｉｔ分子の被験者への投与、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化レベルの測定、およびＤｂａｉｔ分子による処置の有無による、測定したヒストンＨ２ＡＸのリン酸化レベルの比較を含む。

特定の腫瘍における任意の処置の前での構成的に高レベルなリン酸化ヒストンＨ２ＡＸも、この腫瘍でのＤｂａｉｔ単独処置の効率の良好なマーカーである。

添付の図および表を参照し、以下の実施例において本発明の他の特徴および利点を与える。

実施例
Ｄｂａｉｔ分子は特許出願国際公開第２００５／０４０３７８号において完全に記載されたが、明確さのために、Ｄｂａｉｔ分子の設計、合成、および調製を実施例１においてまとめる。

Ｈ２ＡＸのリン酸化を誘導する能力、ならびに、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの関与およびＡＴＭ媒介性経路の非関与の実証に関する分子・細胞試験を実施例２において示す。

ヌードマウスでの異種移植したヒト腫瘍における腫瘍退縮および生存延長を示すインビボアッセイを実施例３において記載する。

実施例１：Ｄｂａｉｔ分子の設計、合成、および調製
２種類のＤｂａｉｔ分子を設計した：直線状またはヘアピンｄｓＤＮＡフラグメント。ヘアピンＤｂａｉｔ分子のために、ヘキサエチレングリコールリンカーまたはテトラデオキシチミジル酸をループとして使用した。

ｄｓＤＮＡステムの末端は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸、または３’−３’ヌクレオチド結合の組み入れにより３’エクソヌクレアーゼによる化学分解に対して保護できる。原則として、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０結合およびＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性化と適合するという条件で、他の化学修飾を使用できる（Martensson & Hammarten, 2002）。様々なステム長、８bp（Ｄｂａｉｔ８Ｈ）、１６bp（Ｄｂａｉｔ１６Ｈ）、２４bp（Ｄｂａｉｔ２４Ｈ）、および３２bp（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ）、ならびに、同様のＧＣ／ＡＴ含量を伴う異なるステム配列（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ、およびＤｂａｉｔ３２Ｈｄ）を伴う異なるＤｂａｉｔ分子を合成し、アッセイした。Ｄｂａｉｔ３２ＨｃにおけるＣｐＧ配列の非存在は注目に値する。両方の末端が２つのヘキサエチレンループにより塞がれたダンベルｄｓＤＮＡフラグメント（Ｄｂａｉｔ３２Ｃ）も対照として設計した。一部のＤｂａｉｔ分子を、フルオレセイン（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ）、シアニン３（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３）、シアニン５（Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ５）、またはビオチン（Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｂｉｏｔ）でタグ付したＴを介して標識した。表１、２、および３には、本研究で使用したＤｂａｉｔ分子の配列および化学構造をまとめた。

Ｄｂａｉｔ分子は、以下の参照番号下で配列表において開示する：Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ｐｏ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ（配列番号４）、Ｄｂａｉｔ２４Ｈ（配列番号５）、Ｄｂａｉｔ１６Ｈ（配列番号６）、Ｄｂａｉｔ８Ｈ（配列番号７）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号１０）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号１１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−３’ｍｐ（配列番号１２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’３’ｍｐ（配列番号１３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’５’（配列番号１４）、Ｄｂａｉｔ３２−ＮＨ２（配列番号１５）、Ｄｂａｉｔ３２Ｃ（配列番号１６）、Ｄｂａｉｔ３２ｓｓ（配列番号１７）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃｓｓｐｏ（配列番号１８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ ｄｓ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ ｄｓ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ ｄｓ（配列番号３０）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ ｄｓ（配列番号３１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ（配列番号２１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３（配列番号２２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｂｉｏｔ（配列番号２３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ３（配列番号２５）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ５（配列番号２６）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ−ＦＩＴＣ（配列番号２７）、Ｄｂａｉｔ６４（配列番号１９）、およびＤｂａｉｔ６４Ｌ（配列番号２０）。

表１．１：Ｄｂａｉｔ分子の配列および化学構造大文字は、ホスホジエステル骨格を伴うヌクレオチドである。太い大文字は、ホスホロチオエート骨格を伴うヌクレオチドである。半円の実線は、ヘキサエチレングリコールリンカーを表す。Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４は、ヘキサエチレングリコールリンカーの代わりに、４つのチミジン（Ｔ４）をリンカーとして含む。Ｄｂａｉｔ３２Ｃはダンベル（閉じた）分子である。Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’５’は、３’−３’結合が先に３’末端に導入されたため、２つのみの５’末端を提示するＤｂａｉｔ３２Ｈｃに由来する。

表１．２：標識した様々な標識Ｄｂａｉｔ分子の配列および化学構造Ｄｂａｉｔ分子 配列および化学構造

表１．３：６４bpのＤｂａｉｔ６４およびＤｂａｉｔ６４Ｌ分子の配列および化学構造大文字はホスホジエステル骨格を伴うヌクレオチドである。太い大文字はホスホロチオエート骨格を伴うヌクレオチドである。実線はヘキサエチレングリコールリンカーを表す。

すべてのＤｂａｉｔ分子は、自動固相オリゴヌクレオチド合成により作られた（Eurogentec, Belgium）。それらを変性逆相ＨＰＬＣにより精製した。変性キャピラリーゲル電気泳動ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＬＣ−ＭＳを品質管理のために使用した。オリゴヌクレオチドの８５％または９０％超が全長である。すべてのサンプルを出荷前に凍結乾燥した。

受取時、すべてのサンプルを再蒸留水中に溶解した。Ｄｂａｉｔ分子の濃度を、変性条件下（Ｄｂａｉｔ分子の熱安定性に応じて６０℃〜９０℃）で２６０nmの吸光度から算出した（Cantor et al., 1970）。蛍光色素タグ付きＤｂａｉｔ分子の濃度は、特定の色素の適切な波長での吸光度から算出した（ＦＩＴＣ：４９０nmでε＝８００００M^-1.cm^-1；Ｃｙ３：５５０nmでε＝１５００００M^-1.cm^-1；Ｃｙ５：６５０nmでε＝２５００００M^-1.cm^-1）。ダンベルｄｓＤＮＡフラグメント（Ｄｂａｉｔ３２Ｃ）は、ヘキサエチレングリコールリンカーを持ち、３’突出および相補末端を伴う２つの半ヘアピンのＤＮＡ Ｔ４リガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ）によるアニーリングおよびライゲーションにより調製した。

熱力学的および動態学的な考察に基づき、分子性に従ってＤｂａｉｔ分子のサンプルを調製するために以下のプロトコールを使用した：
二分子Ｄｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２、Ｄｂａｉｔ３２−ＮＨ２、Ｄｂａｉｔ６４、およびＤｂａｉｔ６４Ｌ）について：
再蒸留水中の各鎖の１：１原液（好ましくは高濃度）の混合物を、各鎖の完全な変性のために９０℃で５分間加熱する必要がある。アニーリングは室温に円滑に戻すことにより実施し（サンプルは典型的に水浴中に放置する）、結果として得られる二本鎖分子を一定分量で、−２０℃で保存した。

一分子Ｄｂａｉｔ分子（ヘアピン）について：
再蒸留水において２００μMのヘアピンＤｂａｉｔ分子を含む溶液を、完全な変性のために９０℃で５分間加熱する必要がある。アニーリングは、サンプルを氷水（０℃）中で冷却することにより実施する必要がある。一定分量の保存は２０℃であった。

実施例２：Ｄｂａｉｔ分子自体の分子および細胞生物活性
特許出願国際公開第２００５／０４０３７８号は、細胞抽出物の存在下において、および、任意のＤＮＡ損傷処置の非存在下において以下の証拠を提供する：
１）Ｄｂａｉｔ分子は、ＮＨＥＪ経路の第１工程に関与するＫｕタンパク質のためのベイトである；
２）Ｄｂａｉｔ分子は、ＤＮＡ末端結合反応の競合分子であるが、しかし、結合した複合体を置換しない。Ｋｕタンパク質の動員は必要条件である；
３）３２bp長のＤｂａｉｔ分子はＤＮＡ−ＰＫを活性化できる。簡単な無細胞ＤＮＡ−ＰＫ活性アッセイによって、その配列および化学修飾にある程度関係なく、Ｄｂａｉｔ分子の長さ（約３２bp）および自由末端を伴う二本鎖ＤＮＡのみがキナーゼ活性化のために必要とされることが指摘される。これは、ＮＨＥＪ経路におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ、配列非依存的なＤＮＡ末端結合メカニズムの意味と一致する。

任意のＤＮＡ損傷処置の非存在下においてＤｂａｉｔ分子が生物学的影響を有するか否かを評価するために、発明者らによりさらなる実験が実施されてきた。驚くべきことに、Ｄｂａｉｔ分子の存在が、リン酸化型のＨ２ＡＸであるγ−Ｈ２ＡＸがＤＳＢ部位にフォーカスを形成し、下流のＤＮＡ修復を誘発するため、ゲノムの完全性のガーディアンとして公知のヒストンの変異体Ｈ２ＡＸのリン酸化を誘導することが見出されている。培養細胞またはＤｂａｉｔ３２Ｈｃで処置した腫瘍において回収した細胞のいずれかにおけるγ−Ｈ２ＡＸの程度をウエスタンブロットおよびＦＡＣＳにより分析した。インビボでの有意な腫瘍の退縮が、ヌードマウスでの３つの異種移植したヒトの腫瘍において観察される。

樹立したヒト細胞株Ｈｅｐ２（頭頸部扁平上皮癌、ＨＮＳＣＣ）、ＬＵ１２０５、およびＳＫ２８（メラノーマ）を動物試験のために使用した。培養細胞の試験を、Ｈｅｐ２、ＨｅＬａ Ｓ３（上皮性の子宮頸癌）、ＭＯ５９ＫおよびＭＯ５９Ｊ（膠芽細胞腫）、ＭＲＣ５およびＡＴ５ＢＩ（線維芽細胞）を使用して実施した。細胞は、単層培養において、３７℃で、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ， Ｆｒａｎｃｅ）および抗生物質（１００μg/mlストレプトマイシンおよび１００μg/mlペニシリン）を含む完全ＤＭＥＭ中で、湿度１００％、９５％空気および５％ＣＯ_２の条件下で増殖した。ＬＵ１２０５は、４％熱不活化ＦＢＳ、１％グルタミン、および抗生物質（１００μg/mlストレプトマイシンおよび１００μg/mlペニシリン）を含むＭＣＤＢ中で増殖した。

６ウェルプレート中で対数増殖中の細胞を収集し、１０μl Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ/μg ＤＮＡの割合でＤｂａｉｔ分子およびＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ， Ｆｒａｎｃｅ）の混合物を含む７００mlの完全ＤＭＥＭでインキュベートした。標準条件下で３７℃５時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、完全ＤＭＥＭを加えた。

ウエスタンブロット解析のために、細胞を直径５cmのペトリ皿中で増殖し、２μgのＤｂａｉｔ３２Ｈｃ分子をＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）と共に製造者の指示に従いトランスフェクトし、次に様々な時間、３７℃で培地中に静置する。標準条件下で、３７℃で５時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、完全ＤＭＥＭを加えた。細胞を追加で１時間インキュベートし、３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー中で溶解した。タンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、それを、１ｘＰＢＳ、１％ ＢＳＡ中で１／１００希釈した抗Ｈ２ＡＸ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｎｖｅｒ， ＵＳＡ）およびマウス抗ホスホ‐ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）（Ｕｐｓｔａｔｅ， Ｔｅｍｐｃｕｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）、ウサギモノクローナル抗ホスホＴｈｒ６８Ｃｈｋ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｎｖｅｒ， ＵＳＡ）との一晩のインキュベーション前に、５％無脂肪牛乳でブロックした（１時間）。ブロットは、次に、ＴＢＳＴ中で１／５０００希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐ０４４８， Ｄａｋｏ）とインキュベートした。タンパク質‐抗体複合体をＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で感光し、ＩｍａｇｅＪ（Ｐｕｂｌｉｃ ｄｏｍａｉｎ）を使用して定量した。

ＦＡＣＳによるγ−Ｈ２ＡＸの免疫蛍光検出のために、細胞を直径５cmのペトリ皿中で増殖し、２μgのＤｂａｉｔ３２Ｈｃ分子をＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）と共に製造者の指示に従いトランスフェクトし、次に様々な時間、３７℃で培地中に静置する。３回の洗浄サイクル後、細胞を２％ ＰＦＡで１０分間固定した。追加で１回洗浄後、γ−Ｈ２ＡＸの存在を、１ｘＰＢＳ、１％ ＢＳＡ中で１／１００希釈したウサギ抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体（４４１１−ＰＣ， Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）で検出した。細胞を１ｘＰＢＳ、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、次に、室温で、１ｘＰＢＳ、１％ ＢＳＡで１／１００希釈したローダミン抱合ヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。細胞はＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ＦＡＣＳａｌｉｂｕｒ， Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， ＵＳＡ）により分析した。

Ｄｂａｉｔ３２Ｈ／Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃが粗抽出物中でＤＮＡ−ＰＫｃｓのキナーゼ活性を活性化したことから、発明者らは生細胞においてＤＮＡ−ＰＫｃｓの下流標的のリン酸化を誘導しうるか否かについて疑問に持った。発明者らは、したがって、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃトランスフェクト細胞においてＨ２ＡＸのリン酸化を分析した（Chowdhury et al., 2000; Paull et al., 2000）。

図１は、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃによるトランスフェクションによって、すべてのＤＮＡ−ＰＫｃｓコンピテント腫瘍細胞株（Ｈｅｌａ、Ｈｅｐ２、ＭＯ５９Ｋ、および形質転換した繊維芽細胞株ＭＲＣ５）においてＨ２ＡＸのリン酸化を高度に刺激することを示す。しかし、Ｈ２ＡＸのリン酸化は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ欠損腫瘍細胞株（ＭＯ５９Ｋ由来のＭＯ５９Ｊ）においては認められず、ＤＮＡ−ＰＫｃｓコンピテントであるが、しかし、ＡＴＭ欠損の形質転換繊維芽細胞株（ＭＲＣ５由来のＡＴ５ＢＩ）においては認められる。これは、インビトロでのＤｂａｉｔ依存的なキナーゼ活性化が、細胞株の由来に依存しない一般的な過程であることを指示する。Ｈ２ＡＸのリン酸化は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの状態に依存するが、ＡＴＭのそれには依存しない。高レベルのγ−Ｈ２ＡＸは最大２４〜４８時間続く。

図２は、様々なＤｂａｉｔ分子のトランスフェクションから５時間後およびＤｂａｉｔ３２Ｈｃのトランスフェクションなしでの１０Gy照射から１時間後のＨｅｐ２細胞におけるＴｈｒ６８（Ｃｈｋ２−Ｔ６８ｐ）におけるＡＴＭによるリン酸化型のＨ２ＡＸおよびチェックポイントタンパク質Ｃｈｋ２のレベルを示す。高レベルのγ−Ｈ２ＡＸは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃによりトランスフェクトした細胞においてのみ観察される。このレベルは、照射済み細胞よりもＤｂａｉｔ３２Ｈｃでトランスフェクトした細胞において高い。対照的に、Ｃｈｋ２−Ｔ６８ｐのレベルは、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃでトランスフェクトした細胞においてはあまり増加せず、照射済み細胞においてずっと高い。これらの結果によって、Ｄｂａｉｔ３２ＨｃがキナーゼＡＴＭを活性化しないことが確認される。

図３は、６０μg Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（腫瘍内注入、トランスフェクション剤としてＰＥＩ）により処置したＨｅｐ２腫瘍から回収した細胞におけるγ−Ｈ２ＡＸのレベルを染めしており、処置なしのＨｅｐ２腫瘍におけるバックグラウンドレベルと比較している。腫瘍は処置から２４時間後に取り除き、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存した。分析する前に、細胞を機械的に解離し、次にウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ解析のために免疫標識した。γ−Ｈ２ＡＸレベルは未処置腫瘍においてでさえ非常に高いが、一方、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃで処置した腫瘍において観察されるレベルは有意に高いことが注目される。

図４は、約１０，０００個の細胞のＦＡＣＳ解析を示す。トランスフェクション対照として使用した６０μgのＤｂａｉｔ８Ｈによる未処置または処置済みと比較し、高レベルのγ−Ｈ２ＡＸが６０μgのＤｂａｉｔ３２Ｈｃにより処置した腫瘍のＨｅｐ２細胞において観察される。

実施例３：ヌードマウスでの異種移植したヒト腫瘍の処置
新しい分子治療としてのＤｂａｉｔ分子のインビボ活性、すなわち、従来のＤＮＡ損傷治療の代替物は、放射線耐性細胞株の皮下注射によりヒト腫瘍で異種移植したヌードマウスを使用して評価した（ヒト頭頸部扁平上皮癌由来のＨｅｐ２、ＨＮＳＣＣ；ならびにヒトメラノーマ由来のＬＵ１２０５およびＳＫ２８）。

インビボでの概念の証拠を確立するために、様々なヒト腫瘍で異種移植したマウスで研究を実施した。異種移植は、約１００万個のヒト腫瘍細胞の注入により実施した。処置は、腫瘍容積が約２００mm³に達した時（腫瘍細胞の接取から約７〜１０日後）に開始した。腫瘍の大きさを週２〜３回測定した。腫瘍容積を算出した（Ｖ＝２ｘａｘｂ^２、ここでａ＝長さ、ｂ＝幅）。マウスは少なくとも１５０日間追跡調査した。腫瘍容積が２cm³を超えた際、動物実験倫理に従って動物を屠殺し、屠殺の時間を死亡時間と見なした（カプラン・マイヤープロットにおいて使用する生存終点）。

典型的なアッセイ条件は、トランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ， Ｐｏｌｙｐｉｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）と一緒での１〜６nmoleのＤｂａｉｔ分子の適切な調製物の腫瘍内注入からなる。ＨＮＳＣＣの異種移植のために、製剤したＤｂａｉｔ分子（Ｄｂａｉｔ３２ＨまたはＤｂａｉｔ３２Ｈｃ）を週に２日ごと、３日ごとに５週間与えた。ＬＵ１２０５およびＳＫ２８の異種移植のために、製剤したＤｂａｉｔ３２Ｈｃ分子を３日連続注入し、次週に１回繰り返した。

図５は、ヌードマウスでのＨＮＳＣＣ異種移植のカプラン・マイヤープロットを示す。明確な生存期間の延長が６０１１９（３nmole）および１２０１１９（６nmole）のＤｂａｉｔ３２Ｈ／Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ分子による処置群において観察されるが、６０μg（６nmole）の単鎖対照（Ｄｂａｉｔ３２ｓｓ）での処置は陰性である。

Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃの利点は、図６および図７において示されるとおり、ヌードマウスでの２つの他の異種移植したヒト腫瘍（ＬＵ１２０５およびＳＫ２８）においても見られる。

Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃの利点は、所与の総量について投与頻度を問わず観察される。投与は、１週間に３回、２回、または理想的には１回の注射の頻度で分割できる。

各々の処置および各々の腫瘍型について腫瘍反応の記述的分析を実施した。１日目は、第１の処置期間の日であった。すべての動物を少なくとも１５０日間、または、それらの倫理的な屠殺まで追跡した。カプラン・マイヤー法に従い、寿命の中央値を推定した。ＴＧＤは、各々の処置群における個々のマウスの腫瘍容積の４倍から対照群の平均腫瘍容積の４倍を引くことにより算出した。個々の測定値を使用して、各々の処置群について平均ＴＧＤを算出した。

データが正規分布に従わないため、カプラン・マイヤー推定値により全生存曲線を評価し、ノンパラメトリックなログランク検定を使用して比較した。分析にはＳ−Ｐｌｕｓ ６．２ ｖｅｒｓｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭａｔｈＳｏｆｔ Ｉｎｃ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）およびｓｔａｔＥＬ（ａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。同じ腫瘍型を伴う各々の群について大域的ログランクを最初に実施した。次にＤｂａｉｔによる処置を未処置対照と比較した。動物の数（ｎ）、相対リスク（ＲＲ）、およびＰ値を表４において報告する。すべての検定は０．０５有意水準で有意と見なした。統計的な採点のために対照群として使用する未処置の腫瘍群 材料と方法において記載するＴＧＤの算出および統計解析治癒マウスは、処置の開始後２００日以上生存した動物である。

表４：ヌードマウスでの異種移植した腫瘍におけるＤｂａｉｔ３２Ｈ／Ｈｃ処置の有効性の統計解析

Ｄｂａｉｔ３２Ｈ／Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃの統計的に有意な有益な結果が、すべての異種移植したヒト腫瘍において観察される。基礎をなすＤｂａｉｔ分子の作用機構およびすべての細胞における偏在性のＮＨＥＪ経路として、これは異なる組織像を伴う他の腫瘍に当てはまることが予測される。

実施例４：Ｄｂａｉｔ注入に対する免疫応答
注入が静脈内または皮下を問わず、任意のサイトカインの有意な誘導はＤｂａｉｔ３２Ｈｃで検出されなかった。発明者らは、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＤｂａｉｔ３２Ｈｃの静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）注入後の免疫応答を評価する。血液サンプルにおいてＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２Ｐ７０、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαのレベルを、Ｄｂａｉｔの反復注入後の様々な時間に測定した。動物は、毒性徴候または皮膚炎症を発症することなく、２４日間以内に１２０mg（９nmol）のＤｂａｉｔでの７回の注射を受けた。発明者らは、免疫原性のＣｐＧ配列を含まないＤｂａｉｔ３２Ｈｃと４つのＣｐＧを含むＤｂａｉｔ３２Ｈに対する免疫応答を比較した。唯一、Ｄｂａｉｔ３２ＨがＩＬ６の迅速な応答およびＩＬ１２ｐ７０のより遅延型の応答を誘導した（図８）。

Claims (23)

1. 任意の直接的または間接的なＤＮＡ損傷処置の非存在下において増殖性疾患を処置するための薬剤を調製するための核酸分子の使用であって、該核酸分子が、少なくとも１６bp、好ましくは２６bp超、より好ましくは３２bp超の二本鎖部分を含み、少なくとも１つの自由末端を有し、および、該分子が、少なくともＫｕタンパク質による結合のための基質であり、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを活性化できる、使用。
2. 該分子が、１６〜２００bp、最も好ましくは３２〜１００bpを含む、請求項１記載の使用。
3. 該分子が、直線状またはヘアピン核酸分子である、請求項１または２記載の使用。
4. 該分子が、ヘアピン核酸分子であり、該ループが核酸または化学基を含む、請求項３記載の使用。
5. 該自由末端が、平滑または５’または３’突出である、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
6. 該分子が、ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を増加する、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。
7. 該分子が、細胞により細胞核内に取り込まれることができる、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
8. 該分子が、ホスホジエステル骨格または化学修飾したホスホジエステル骨格または１もしくは数個の化学基を有する別の骨格を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
9. 該分子が、２’−デオキシヌクレオチド骨格を含み、および場合により１または数個の修飾ヌクレオチドおよび／またはアデニン、シトシン、グアニンおよびチミン以外の核酸塩基を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
10. 該骨格が、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、モルホリノ核酸、２’−０，４’−Ｃメチレン／エチレン架橋ロックド核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、短鎖アルキル、またはシクロアルキル糖間結合または可変長の短鎖ヘテロ原子または複素環の糖間結合を含む、請求項８または９記載の使用。
11. ペントフラノシル基の代わりに、２’−Ｏ−アルキルリボース、２’−Ｏ−アルキル−Ｃ４’分岐リボース、シクロブチル、もしくは他の炭素環などの糖模倣体またはヘキシトールをさらに含む、請求項８または９記載の使用。
12. 各鎖の末端または少なくとも３’末端鎖に１または数個の化学修飾したヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の使用。
13. 各鎖の末端または少なくとも３’末端鎖に１または数個のホスホロチオエートを含む、請求項１２記載の使用。
14. 少なくとも１つの埋め込みエレメントをさらに含み、それによってＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、または損傷シグナル伝達過程が妨げられ、該少なくとも１つのエレメントは、二本鎖分子の中央または末端に組み入れられる、請求項１〜１３のいずれか一項記載の使用。
15. ａ）ポリエチレングリコール鎖、好ましくはヘキサエチレングリコール鎖、または場合により１または複数のヘテロ原子、例えば酸素、硫黄、窒素、または１または数個のヘテロ原子を含む、ヘテロ原子基または複素環基により中断および／または置換された、任意の炭化水素鎖；および／または
    ｂ）任意の３’修飾ヌクレオチドなどの、ＤＮＡポリメラーゼまたはエクソヌクレアーゼにより受け入れられないことから遮断エレメントであるユニット；および／または
    ｃ）Ｔｎなどの天然オリゴヌクレオチド、ヘアピンフラグメントのループにおいて使用されるとき、好ましくはテトラデオキシチミジレート（Ｔ４）
    を含む、請求項１４記載の使用。
16. 該分子が、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）と同じヌクレオチド組成を含む少なくとも３２bpまたは３２bpの二本鎖部分を有する、請求項１〜１５のいずれか一項記載の使用。
17. 該分子が、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ｐｏ（配列番号３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ（配列番号４）、Ｄｂａｉｔ３２−Ｔ４（配列番号２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’５’（配列番号１４）、Ｄｂａｉｔ３２−ＮＨ２（配列番号１５）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−ＦＩＴＣ（配列番号２１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｃｙ３（配列番号２２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈ−Ｂｉｏｔ（配列番号２３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号１０）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号１１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−３’ｍｐ（配列番号１２）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−５’３’ｍｐ（配列番号１３）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ３（配列番号２５）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ−Ｃｙ５（配列番号２６）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ−ＦＩＴＣ（配列番号２７）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ ｄｓ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ ｄｓ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ ｄｓ（配列番号３０）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｄ ｄｓ（配列番号３１）、Ｄｂａｉｔ６４（配列番号１９）、およびＤｂａｉｔ６４Ｌ（配列番号２０）からなる群より選択される、請求項１６記載の使用。
18. 該分子の該二本鎖部分が、Ｄｂａｉｔ３２（配列番号１）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈａ（配列番号２８）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｂ（配列番号２９）、Ｄｂａｉｔ３２Ｈｃ（配列番号３０）、またはＤｂａｉｔ３２Ｈｄ（配列番号３１）の少なくとも１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０または３２の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載の使用。
19. 該増殖性疾患が、好ましくは、膠芽腫、頭頚部癌、大腸癌、肝臓癌、肺癌、皮膚癌、乳癌および子宮頸癌から選択される癌である、請求項１〜１８のいずれか一項記載の使用。
20. 該分子が、経口経路により、または静脈内、腫瘍内、もしくは皮下注入、頭蓋内もしくは動脈内注射もしくは注入により、または経口経路により投与される、請求項１〜１９のいずれか一項記載の使用。
21. 該分子が、毎日の処置プロトコールにおいて、少なくとも０．１mg/cm³腫瘍、好ましくは０．６mg/cm³腫瘍、最も好ましくは１mg/cm³腫瘍、または、毎週の処置プロトコールにおいて、少なくとも０．３mg/cm³腫瘍、好ましくは１．８mg/cm³腫瘍、最も好ましくは３mg/cm³腫瘍の有効量での腫瘍内投与により使用される、請求項１〜２０のいずれか一項記載の使用。
22. ヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を測定することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項記載の核酸による処置の効率を評価するための方法。
23. 該細胞および／または組織に請求項１〜１９のいずれか一項記載の核酸を導入することを含む、細胞および／または組織においてヒストンＨ２ＡＸのリン酸化を増加するため、または、ヒストンＨ２ＡＸを活性化するための方法。