EA016053B1

EA016053B1 - Применение молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную область, для лечения пролиферативного нарушения

Info

Publication number: EA016053B1
Application number: EA200900989A
Authority: EA
Inventors: Мари Дютри
Original assignee: Сантр Насьональ Де Ля Решерш Сьентифик; Энститю Кюри
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2012-01-30
Also published as: WO2008084087A3; EP1944369A9; CA2673972C; CN101622351B; JP5462632B2; AU2008204486C1; EA200900989A1; WO2008084087A2; JP2010515707A; CA2673972A1; EP2102343B1; CN101622351A; US20100022622A1; AU2008204486A1; EP1944369A1; US8093366B2; EP2102343A2; AU2008204486B2

Abstract

Изобретение относится к композициям и способам для нарушения путей репарации двухнитевого разрыва (ДНР) ДНК. Изобретение описывает новую двухцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты, которая действует как ловушка и захватывает холокомплекс ферментов, ответственных за пути распознавания повреждения ДНР ДНК, передачи сигнала и репарации, в частности пути негомологичного соединения концов (NHEJ) репарации ДНР. Изобретение описывает применение этих молекул как самостоятельного противоракового лекарственного средства в эффективном количестве, которое вводится в ядра опухолевых клеток для запуска их смерти.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к композициям и способам нарушения путей репарации двухнитевого разрыва ДНК в клетках млекопитающих. Соответственно изобретение относится к композициям и способам лечения пролиферативных нарушений.

Сведения о предшествующем уровне техники

Радиотерапия и химиотерапия, по отдельности или в сочетании с хирургическим вмешательством, составляют основной терапевтический арсенал против рака человека. Взаимосвязь между химиотерапией и радиотерапией широко использовалась в лечении рака. Хотя еще не совсем выяснено, биологическая основа действия цитотоксических агентов основывается на клеточных механизмах, таких как клеточный цикл или повреждение ДНК, которые также играют важную роль в клеточной гибели, вызванной воздействием радиоволн, приводя к аддитивным или даже более значительным синергическим эффектам посредством сочетания различных видов лечения в противоопухолевой терапии.

Последние успехи в развитии биологических лекарств (моноклональные антитела, ингибиторы цитокинов/киназ, иммунотерапия/вакцины) подтвердили их пригодность и специфичность относительно ряда опухолей. Но они часто используются в комбинации с химическими цитотоксическими агентами. Несмотря на многочисленные успехи в развитии новых цитотоксических лекарственных средств, лекарственная резистентность к химиотерапии остается до сих пор главной клинической проблемой в лечении злокачественных опухолей. Понимание механизма лекарственной резистентности, связанной с усвоением/выведением лекарственного средства, метаболической деградацией, мутагенезом мишени, усиленной репарацией, подачей сигнала клеточной гибели (апоптоз и некроз), является особенно важным для обеспечения эффективности химиотерапии и повышения терапевтического индекса, особенно для некоторых опухолей, резистентных к лечению.

В последнее десятилетие были выполнены многочисленные исследования в этой области, и сложность сигнальной трансдукции в ответ на облучение начинает определяться. В связи с чем, генами, представляющими особый интерес как мишени ионизирующих излучений, являются те, которые вовлечены в процесс регуляции механизмов летальности, вызванных излучением, таких как апоптоз или репарация ДНК. Поскольку двухнитевые разрывы (ДНР) представляют собой наиболее летальные повреждения ДНК разрушения, эффективность ионизирующего излучения снижается при увеличении эффективности репарации ДНР.

Два механизма вовлечены в процесс репарации ДНР: негомологичное соединение концов (ΝΗΕ1, не зависимый от последовательности путь) и гомологичная рекомбинация (ΗΚ, зависимый от последовательности путь) (обзор от 1аск§оп, 2002). Таргетинг генов, вовлеченных в эти два основных пути репарации ДНР, до сих пор приводил к слабой или умеренной радиочувствительности в зависимости от способов применения и раковых клеточных линий (Ве1епкоу е! а1., 2002; Матапдош е! а1., 2000а; ΟΗηίκΗί е! а1., 1998).

Белки Ки (например, Ки70 и Ки80) и ДНК-ПКкс играют важную роль в репарации ДНР ДНК, вызванной облучением и химическими агентами. Если повреждение не может быть восстановлено вовремя, то клетка погибает. Следовательно, они представляют потенциально привлеченные молекулярные мишени для сенсибилизации клеток-мишеней и тканей к радиотерапии и химиотерапии. Многие способы были разработаны и осуществлены в попытке ингибировать эти ключевые белки (Ки70/Ки80, ДНК-ПКкс и др.), которые входят в путь ΝΗΕ1, являющийся преобладающим в клетках млекопитающих:

1) ингибиторы Р13К (фосфатидилинозитол-3-киназа) (т.е. ДНК-ПКкс, АТМ, АТК) (Вои1оп е! а1., 2000; Энгат & Каггап, 2003; УШтоте е! а1., 2004; Уаидег е! а1., 2004);

2) негативное доминирование и пептиды (С-конец Ки80) (Матапдош е! а1., 2000Б; К1т е! а1., 2002);

3) вариабельный фрагмент одноцепочечного антитела (ксБу) (ДНК-ПКкс) (Ь1 е! а1., 2003а);

4) РНК-аптамер (8ЕЬЕХ: РНК, связывающая Ки) (Уоо & Эупап. 1998);

5) антисенс (Ки70, Ки80, ДНК-ПКкс) (Ь1 е! а1., 2003Б; Матапдош е! а1., 2000с; 8ак е! а1., 2002);

6) малая интерферирующая РНК (миРНК) (ДНК-ПКкс) (Репд е! а1., 2000).

Несмотря на эти огромные усилия, комбинирование таргетинга генов, вовлеченных в пути репарации ДНК, и противораковой терапии до сих пор находится на ранней экспериментальной стадии и до сих пор клинические исследования не показали каких-либо подтвержденных преимуществ. Имеет смысл отметить, что вышеуказанные способы имеют общий признак: они нацелены на один эффектор (белок), вовлеченный в сложный каскадный путь (такой как ΝΗΕ1) с возможными обходным путем или компенсацией.

Патентная заявка УО 2005/040378 описывала композиции и способы нарушения путей репарации двухнитевого разрыва ДНК в клетках млекопитающих. В частности, это относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые мешают, негеноспецифичным образом, механизмам распознавания, передачи сигнала и репарации повреждения ДНК, а также к их использованию для инициирования клеточной летальности опухолей, подвергаемых противораковому лечению. Указано, что чувствительность клеток к терапии, прямо или опосредованно повреждающей ДНК, может быть увеличена путем использования (химически модифицированных или нет) коротких молекул дцДНК, которые действуют как имитаторы поврежденных фрагментов ДНК и распознаются как участки ДНР, индуцированные терапией, повреж

- 1 016053 дающей ДНК (т.е. субстраты-имитаторы ДНР). Эти молекулы, также обозначаемые названием молекулы ДНР ловушки (сокращенно ЭЬа11), придают или повышают чувствительность любой опухолевой клетки к противораковому лечению, повреждающему ДНК, а именно химиотерапии и радиотерапии. Молекулы ЭЬай действуют путем привлечения и перехвата холокомплекса ферментов репарации ДНР ДНК и, тем самым, мешают процессам распознавания повреждения ДНК, передачи сигнала и репарации. Соответственно, данная заявка относится к молекулам ЭЬай в комбинации с физическим(и) и/или химическим(и) агентом(и), которые могут прямо или косвенно вызывать ДНР ДНК.

Сущность изобретения

Изобретатели неожиданно обнаружили, что опухолевые клетки чувствительны к присутствию молекул ИЬай в чистом виде в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК (т.е. химиотерапии, радиотерапии). Как показано в примерах, молекулы ЭЬай эффективны ίη νίΐΓΟ, а также ίη νίνο при применении в качестве самостоятельного противоракового лечения.

Соответственно, настоящее изобретение касается применения молекулы нуклеиновой кислоты для приготовления лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения в отсутствие какоголибо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит двухцепочечную часть по меньшей мере из 16 п.н., более чем 24 п.н., предпочтительно 32 п.н., имеет по меньшей мере один свободный конец и где указанная молекула представляет собой субстрат для связывания, по меньшей мере, белком Ки и способна активировать ДНК-ПКкс.

Настоящее изобретение также касается способа лечения пролиферативного нарушения у субъекта, включающего введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей двухцепочечную часть по меньшей мере из 16 п.н., предпочтительно из 32 п. н., имеющей по меньшей мере один свободный конец, представляющей собой субстрат для связывания, по меньшей мере, белком Ки и способной активировать ДНК-ПКкс.

Настоящее изобретение также касается способа оценки эффективности лечения нуклеиновой кислотой по настоящему изобретению, включающего определение фосфорилирования гистона Н2АХ.

Настоящее изобретение дополнительно касается способа повышения фосфорилирования гистона Н2АХ или активации гистона Н2АХ в клетках и/или ткани, включающего введение в указанные клетки и/или ткань нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.

Перечень чертежей

Фиг. 1 - Вестерн-блоттинг гистона Н2АХ и фосфорилированного гистона Н2АХ (у-Н2АХ) в различных клеточных линиях, полученных из опухолей человека (Не1а, Нер2 и МО59К) и из трансформированных фибробластов (МКС5). МО591 являются ДНК-ПК дефицитными (полученные из дикого типа МО59К). ΑΤ5ΒΙ являются АТМ-дефицитными (полученные из дикого типа МК.С5);

фиг. 2 - уровень фосфорилированного гистона Н2АХ (у-Н2АХ) и фосфорилированного белка контрольной точки С11к2 (Сйк2-Т68р) в Нер2 клетках через 5 ч после трансфекции различными молекулами ИЬай или через 1 ч после облучения 10 Гр;

фиг. 3 - анализ Вестерн-блоттинг уровня у-Н2АХ в удаленной опухоли Нер2;

фиг. 4 - ГА8С анализ уровня у-Н2АХ в удаленной опухоли Нер2;

фиг. 5 - график Каплана-Майера для ксенотрансплантата Нер2 (НЫ§СС) в голых мышах;

фиг. 6 - график Каплана-Майера для ксенотрансплантата ЬШ205 в голых мышах;

фиг. 7 - график Каплана-Майера для ксенотрансплантата 8К28 в голых мышах;

фиг. 8 - иммунный ответ на инъекции ИЬай у мышей Ва1Ь/С.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления

Как описано в патентной заявке АО 2005/040378, молекулы ЭЬай представляют новый класс терапевтических молекул, которые могут мешать негеноспецифическим образом системам репарации ДНР ДНК в клетках млекопитающих. Эти новые молекулы, именуемые молекулами ИЬай, являются субстратами для холокомплекса белков, входящих в путь ΝΗΕ1 (не зависимый от последовательности путь), в частности для белков Ки и/или ДНК-ПК, и могут нейтрализировать способность клеток к репарации ДНК, тем самым повышая их чувствительность к лечению, повреждающему ДНК.

Настоящее изобретение дополнительно описывает способность молекул ЭЬай инициировать фосфорилирование главного блюстителя целостности хромосом, гистона Н2АХ в отсутствие лечения, повреждающего ДНК. Такая посттрансляционная модификация Н2АХ опосредуется через ДНК-ПК (ДНКзависимая протеинкиназа)-опосредованный путь, но не зависима от АТМ (мутированный белок атаксиителеангиэктазии)-опосредованного пути.

Биологическим результатом такой неожиданной/ошибочной активации Н2АХ является дезорганизация систем репарации двухнитевого разрыва (ДНР) ДНК, в частности пути негомологичного соединения концов (ΝΗΕ1), вызывая тем самым клеточную летальность у опухолевых клеток, у которых более высокий уровень спонтанных (ошибки репликации) и эндогенных (окислительный стресс) ДНР, чем в нормальных клетках.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает доказательства, подтверждающие, что молекулы ЭЬай способны инициировать клеточную/тканевую летальность опухолей человека, ксенотранспланти

- 2 016053 рованных голым мышам, в отсутствие любого лечения, повреждающего ДНК.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению таких молекул в качестве самостоятельных терапевтических агентов, в особенности, для лечения пролиферативных заболеваний.

Молекулы ИЬай настоящего изобретения могут быть определены посредством ряда характеристик, таких как их минимальная длина, наличие по меньшей мере одного свободного конца и наличие двухцепочечной области. Как будет обсуждаться ниже, важный признак молекул ЭЬай состоит в том, что их точная нуклеотидная последовательность практически не оказывает влияние на их активность. Также молекулы ЭЬай могут содержать модифицированный и/или ненатуральный остов.

Молекула ИЬай предпочтительно имеет происхождение, не относящееся к человеку (т.е. ее нуклеотидная последовательность и/или структура (например, шпилька) не такая, как имеется в клетке человека), более предпочтительно синтетическое происхождение.

Исходя из механизма действия молекул ИЬай, последовательность молекул ЭЬай играет небольшую, если вообще таковая имеется, роль. В связи с чем по сравнению с молекулами, применяемыми в уровне техники для ген/белок-специфичного таргетинга (например, антисенс, антиген, миРНК, аптамер, ловушка, рибозим и др.), молекулы ИЬай могут не иметь какую-либо значительную степень гомологии последовательностей или идентичность с известными генами, промоторами, энхансерами, 5'- или 3'активирующими последовательностями, экзонами, нитронами и др. Другими словами, действие молекул ИЬай по нарушению пути ΝΗΕΤ не зависит от последовательности, и молекулы ЭЬай могут иметь менее 80 или 70%, даже менее 60 или 50% идентичности последовательностей с любым геном в геноме человека.

Такой механизм действия, не зависящий от последовательности, является отличительным признаком молекул ИЬай, который ясно отличает их от других ген-специфичных или белок-специфичных (с учетом последовательности) терапевтических агентов, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, малая интерферирующая РНК (миРНК, РНК-шпилька и микроРНК), и иммуностимулирующие СрСолигонуклеотиды, а также аптамеры/ловушки, разработанные для улавливания конкретного белка.

В предпочтительном воплощении последовательность молекул ИЬай имеет общую степень идентичности с последовательностями нуклеиновых кислот человека, которая составляет менее чем около 80, 70, 65, 60, 55 или 50%. Способы определения идентичности последовательностей хорошо известны из уровня техники и включают, например, В1аЧ.

В частном воплощении молекула ИЬай не гибридизуется при строгих условиях с геномной ДНК человека. Типичными строгими условиями являются такие, которые позволяют различить полностью комплементарные нуклеиновые кислоты от частично комплементарных нуклеиновых кислот.

В предпочтительном воплощении последовательность молекул ИЬай лишена СрС во избежание хорошо известных иммунологических реакций, опосредованных То11-подобными рецепторами, если такие эффекты являются нежелательными.

В частном воплощении молекулы 0Ьа11, имеющие двухцепочечную область по меньшей мере из 32 п.о. или из 32 п.н., содержат такую же нуклеотидную последовательность, как и ИЬай32 (8ЕС ΙΌ Νο 1), ИЬай32На (ЗЕС) ΙΌ Νο 28), 1Жш32НЬ (ЗЕС ΙΌ Νο 29), 1Ж1П.32Не (ЗЕС ΙΌ Νο 30) или ОЬай32Нб (ЗЕС ΙΌ Νο 31). Необязательно, молекулы ИЬай имеют аналогичный нуклеотидный состав, что и ЭЬа1132. ИЬай32На, ОЬай32НЬ, ИЬай32Нс или ИЬай32Нб, но их нуклеотидная последовательность отличается. Затем молекулы ИЬай содержат одну цепь двухцепочечной области вместе с 3А, 6С, 12С и 11Т. Предпочтительно последовательность молекул ИЬай не содержит какой-либо СрС динуклеотид.

Рассматривая их механизм действия, длина молекул ИЬай может меняться при условии, что она достаточна для надлежащего связывания комплекса белка Ки, содержащего белки Ки и ДНК-ПКис (каталитическая субъединица ДНК-ПК). Экспериментальная часть №О 2005/040378 показала, что длина молекул ИЬай должна быть более 16 п.н., предпочтительно 32 п.н., для обеспечения связывания с таким Ки комплексом и обеспечением активации ДНК-ПКкс. Предпочтительно молекулы ОЬаИ содержат между 16-200 п.н., более предпочтительно 24-100 п.н., еще более предпочтительно 26-100 и наиболее предпочтительно между 32-100 п.н. Например, молекулы ИЬай содержат между 24-160, 26-150, 28-140, 30120, 32-100 п.н. Под п.н. понимается, что молекула содержит двухцепочечную область определенной длины.

В частном воплощении двухцепочечная область содержит по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательно расположенных нуклеотидов из ИЬай32 (ЗЕС ΙΌ Νο 1), ИЬай32На (ЗЕС ΙΌ Νο 28), ИЬай32НЬ (ЗЕЕ) ΙΌ Νο 29), 1Жш32Нс (ЗЕЕ) ΙΌ Νο 30) или 1Жш321 ΕΙ (ЗЕЕ) ΙΌ Νο 31). В более частном воплощении двухцепочечная область состоит из 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательно расположенных нуклеотидов из ИЬай32 (8ЕС ΙΌ Νο 1), ИЬай32На (8ЕС ΙΌ Νο 28), ИЬай32НЬ (ЗЕЕ) ΙΌ Νο 29), ЭЬац32Нс (ЗЕЕ) ΙΌ Νο 30) или 1Жш321 ΕΙ (ЗЕЕ) ΙΌ Νο 31).

Молекулы ИЬай изобретения должны иметь по меньшей мере один свободный конец в качестве имитатора ДНР. Указанный свободный конец может быть либо свободным тупым концом, либо 5'-/3'выступающим концом. В частном воплощении они содержат только один свободный конец. В другом частном воплощении они содержат два свободных конца. Соответственно, настоящее изобретение также затрагивает молекулы ИЬай, которые являются двухцепочечными молекулами с двумя свободными кон

- 3 016053 цами и имеют нуклеотидную последовательность из ОЬай32 (8Е0 ΙΌ Νο 1), ОЬай32На 08 (8ЕО ГО Νο 28), ОЬай32НЬ сЕ (8ЕО ГО Νο 29), ПЬай32Не сЕ (8ЕО ГО Νο 30) или ПЬай32Нб Щ (8ЕО ГО Νο 31).

Молекулы ОЬаП могут быть линейными или предпочтительно состоять из двухцепочечного участка шпильки нуклеиновых кислот. В данном случае петля может являться нуклеиновыми кислотами или другими химическими группами, известными для специалиста в данной области, предпочтительно линкером, таким как гексаэтиленгликоль или тетрадезокситимидилат (Т4). Таким образом, в частном воплощении молекулы ОЬаН могут быть молекулой-шпилькой, имеющей двухцепочечную область, содержащую по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотидов из ОЬай32 (8ЕО ГО Νο 1), ПЬай32На (8ЕО ГО Νο 28), ПЬай32НЬ (8ЕО ГО Νο 29), ПЬай32Не (8ЕО ГО Νο 30) или ПЬай32Нб (8ЕО ГО Νο 31), и петлей, являющейся гексаэтиленгликолевым линкером или тетрадезокситимидилатным линкером (Т4). В более частном воплощении эти молекулы ЭЬа11 могут содержать двухцепочечную область, состоящую из 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательных нуклеотидов из ОЬай32 (8ЕО ГО Νο 1), ПЬай32На (8ЕО ГО Νο 28), ПЬай32НЬ (8ЕО ГО Νο 29), ПЬай32Не (8ЕО ГО Νο 30) или ОЬай32Нб (8ЕО ГО Νο 31).

В предпочтительном воплощении молекулы ОЬай являются таковыми, что:

1) двухцепочечные молекулы ОЬай способны поглощаться клетками/тканями организма в клеточное ядро при применении вместе с фармацевтически приемлемыми носителями/эксципиентами;

2) по меньшей мере один свободный конец молекул ОЬай является узнаваемым холокомплексом ферментов, включенных в процессы распознавания повреждения ДНК, передачи сигнала и репарации,

3) по меньшей мере один свободный конец молекул ОЬай поддается указанному комплексу для включения в геномную ДНК опухолевой клетки.

В частном воплощении молекулы ОЬай имеют нерепликативную структуру, вследствие их структуры, такой как петля и/или остов.

В этом отношении молекулы ЭЬа11 изобретения могут иметь исключительно или главным образом (около 50%) нативный фосфодиэфирный остов, или химически модифицированный фосфодиэфирный остов, или другой остов с химическими группами или комплексами химических групп, обеспечивающих модифицированные субстраты из оставшейся двухцепочечной ДНК для холокомплекса, входящего в путь ННЕ1, в частности белки Ки и ДНК-ПКкс, а также путь распознавания повреждения ДНР и передачи сигнала. Преимущественно химические модификации предназначены для придания химической стабильности молекулам ОЬай и/или для предохранения их от дальнейшей репликации (потенциальная причина мутагенного эффекта) при их геномной интеграции, если это происходит.

В предпочтительном воплощении молекулы ОЬай содержат 2'-дезоксинуклеотидный остов и необязательно содержат один или несколько (2, 3, 4, 5 или 6) модифицированных нуклеотидов и/или нуклеиновых оснований, отличных от аденина, цитозина, гуанина и тимина. Соответственно, молекулы ОЬай имеют, по существу, структуру ДНК.

Они также могут иметь имитаторы сахара, такие как 2'-О-алкилрибоза, 2'-О-алкил-С4' разветвленная рибоза, циклобутилы или другие карбоциклические группы или гексит вместо пентофуранозильной группы.

Предпочтительные ЭЬа11 содержат один или несколько химически модифицированный(х) нуклеотид(ов) или группу(п) на конце одной или каждой цепи. В частном предпочтительном воплощении свободный(ые) конец(ы) молекул ОЬай защищен(ы) одним, двумя или тремя модифицированными фосфодиэфирными остовами на конце одной или каждой цепи. Предпочтительные химические группы, в частности модифицированный фосфодиэфирный остов, содержат фосфотиоаты. Альтернативно, предпочтительные ОЬай имеют 3'-3'-нуклеотидную связь или нуклеотиды с метилфосфонатным остовом.

Другие модифицированные остовы изобретения содержат фосфорамидаты, морфолинонуклеиновую кислоту, закрытую замкнутую нуклеиновую кислоту с 2'-0,4'-С метиленовым/этиленовым мостиком, пептидно-нуклеиновую кислоту (ПНК) и короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные связи между остатками сахаров или короткоцепочечные гетероатомные или гетероциклические связи внутри остатков сахаров различной длины, или любые модифицированные нуклеотиды, известные специалисту.

Патент США № 5677437 описывает гетероароматические олигонуклеозидные связи. Содержащие азот линкеры или группы, содержащие азот, также могут применяться для приготовления имитаторов олигонуклеотидов (патент США №№ 5792844 и 5783682). Патент США № 5637684 описывает фосфорамидаты и фосфортиоамидатные олигомерные соединения. Также предусмотренными являются олигонуклеотиды, имеющие структуру на основе морфолинового остова (патент США № 5034506). В других воплощениях, таких как остов из пептидо-нуклеиновой кислоты (ΡΝΑ), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида может быть замещен полиамидным остовом, причем основания связаны непосредственно или опосредованно с аза-атомами азота полиамидного остова. Другие синтетические олигонуклеотиды могут содержать замещенные остатки сахара, содержащие одну из следующих групп в положении 2': ОН, 8Н, ОСН3, 8СН3, Е, ОС\. ОСН2СН2ОСН3, О(СН;)..\Н; или О(СН2)пСН3, где η представляет от 1 до около 10; С1 - С10-низший алкил, замещенный низшим алкилом, алкарилом или аралкилом; С1; Вг; СИ; СЕ₃; ОСЕ₃; О-8-; или Ν-алкил; О-, 8-, или Ν-алкенил; 8ОСН₃; 8О₂СН₃; ΟΝΟ; ΝΟ; Ν₃.

- 4 016053

Молекула ΌΒαίΐ может содержать по меньшей мере один встроенный элемент, который препятствует репликации ДНК, репарации ДНК или процессу передачи сигнала повреждения. Указанный(е) встроенный(е) элемент(ы) может(гут) присоединяться во внутреннем положении (например, в центре) или на конце двухцепочечного фрагмента. Он(они) может содержать: а) элемент, который не может использоваться как матрица для репликации ДНК, такой как полиэтиленгликолевая цепь, предпочтительно гексаэтиленгликолевая цепь, или любая углеводородная цепь, в конечном счете, прерываемая и/или замещенная одним или более гетероатомами, например кислородом, серой, азотом, или гетероатомными или гетероциклическими группами, содержащими один или более гетероатомов; Ь) элемент, который представляет собой блокирующий элемент, который не доступен ДНК полимеразам или экзонуклеазам, такой как З'-модифицированные нуклеотиды; или другой элемент, известный специалисту; с) нативный олигонуклеотид, такой как Тп, если используется в петлевом фрагменте шпильки, такой как тетрадезокситимидилат (Т4).

Указанные цепи изготавливают посредством химического синтеза, полубиосинтеза или биосинтеза и способа амплификации, за которым следуют любые способы экстракции и получения и любая химическая модификация.

Как описано в патентной заявке \¥О 2005/040378, биоактивность молекул ПЬай может быть определена с помощью анализов ίη νίΐτο и с культивируемыми клетками, как описано, например, в примерах 2 и 3, и/или также с помощью анализов ίη νίνο, как описано, например, в примерах 4 и 5. Самым простым и подходящим анализом является анализ определения активности ДНК-зависимой протеинкиназы (см. пример 2, фиг. 1.4). Этот простой анализ до сих пор предсказывает активность молекул ИЬай ίη νίνο. Однако также подходят и другие анализы, основанные на культивировании клеток, такие как анализ ингибирования незаконной интеграции при воздействии повышенного излучения (см. пример 3, фиг. 2.3 и 2.4).

Фактически, молекулы ИЬай настоящего изобретения должны обладать способностью активировать ДНК-ПК. В одном воплощении молекулы ИЬай также способны ингибировать ошибочную интеграцию ДНК, усиливаемую излучением. В другом частном воплощении молекулы ИЬай связывают Ки комплекс ίη νίΐτο, например, как определено с помощью анализа задержки в геле. Такой Ки комплекс содержит комбинацию из одного или нескольких белков Ки и, по меньшей мере, белка ДНК-ПКкс. В следующем частном воплощении молекулы ПЬай данного изобретения проникают внутрь ядра, предпочтительно с использованием фармацевтически приемлемых носителей/эксципиентов. Наиболее предпочтительные молекулы ПЬай данного изобретения совмещают некоторые или все вышеуказанные характеристики.

В предпочтительном воплощении молекулы ПЬай представляют собой химически модифицированные молекулы ЭЬа11. такие как указано выше и другие, применяемые в терапии человека. В другом воплощении молекулы ПЬай не являются химически модифицированными и соответствуют фрагментам нативных нуклеиновых кислот, но при этом проявляют характеристики химически модифицированных фрагментов, а именно имеют количество пар оснований и свойства, определенные в отношении указанных химически модифицированных молекул ПЬай.

Настоящее изобретение касается применения любой молекулы ПЬай, раскрытой в описании. В предпочтительном воплощении молекула ПЬай выбирается из группы, состоящей из ОЬай32 (8Ер ГО Νο 1), ОЬай32Н-ро (8Е(^ ГО Νο 3), ОЬай32Н (8Ες ГО Νο 4), ПЪай32-Т4 (КЕО ГО Νο 2), ПЬай32Нс-5’5‘ (8ЕЦ ГО Νο 14), ΠΒαΐΐ32-ΝΗ2 (8ЕО ГО Νο 15), ПЬай32Н-Р1ТС (8ЕС) ГО Νο 21), ПЬай32Н-СуЗ (8ЕЦ ГО Νο 22), Π6αίΐ32Η-Βίοΐ (8ЕЦ ГО Νο

23), ПЪай32На (8ЕЦ ГО Νο 8), ПЬай32НЬ (8ЕЦ ГО Νο 9), ПЬай32Нс (8Е0 ГО Νο 10), ПЬай32Н6 (8ЕЦ ГО Νο 11), ПЪай32Нс-3’шр (8Еф ГО Νο 12), ПЬай32Нс-5’3’тр (8Еф ГО Νο

13), ПЬай32Нс-СуЗ (8Е0 ГО Νο 25), ПЬай32Нс-Су5 (8Еф ГО Νο 26), ПЬай32Ш-Г1ТС (8ЕО

ГО Νο 27), ПЬаЙ32На 6з (8ЕС) ГО Νο 28), ПЬай32НЬ бз (8ЕЦ ГО Νο 29), 1ЭЬаИ3211с (8 ЕС) ГО Νο 30), ПЬай32Н<1 6з (8Εζ) ГО Νο 31), ПЬай64 (8ЕЦ ГО Νο 19) и ПЬай64Е (8ЕЦ ГО Νο 20).

Также может применяться комбинация из них.

Соответственно, изобретение относится к способу лечения пролиферативного нарушения в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК (т.е. химио- и радиотерапии), включающему введение в клетки и/или ткань, имеющие пролиферативные нарушения, молекул ЭЬай, таких как определено выше; тем самым индуцируя клеточную летальность указанных клеток и/или ткани.

Настоящее изобретение также относится к способу повышения фосфорилирования гистона Н2АХ или активации гистона Н2АХ в клетках и/или ткани, включающему введение в указанные клетки и/или ткань молекул ПЬай, таких как определено выше, тем самым повышая фосфорилирование гистона Н2АХ и активируя гистон Н2АХ. Гистон Н2АХ представляет собой белок, хорошо известный специалисту в данной области техники. Идентификационным номером в δ^ίδδ-Ρτοΐ является Р16104 и в Ишдепе НМ77879. Фосфорилирование осуществляется на 8ет-139 (Ь1 еΐ а1., 2005, для обзора).

- 5 016053

Настоящее изобретение в дополнении относится к способу индуцирования клеточной летальности клеток и/или ткани, имеющей пролиферативное нарушение, в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, включающему введение в указанные клетки и/или ткань молекул ΌόηίΙ. таких как определено выше; тем самым вызывая клеточную летальность указанных клеток и/или ткани.

В частном воплощении вышеуказанных способов на указанной стадии введения используют трансфекционный агент. Например, агент для трансфекции может выбираться из группы, состоящей из ΡΕΙ (И8 6013240), 8ирегГес1 Дадене), катионных липидов, таких как ЫроГеейи (ТиуИгодеи).

В способах и применениях настоящего изобретения молекулы ΌόαίΙ используются в эффективном количестве. В частности, количество молекул ΌόηίΙ позволяет молекулам достигать ядро подвергаемой лечению клетки. Кроме того, количество является достаточным для активации ДНК-ПК и для повышения фосфорилирования гистона Н2АХ и для его активации.

Настоящее изобретение касается применения молекул ΌόηίΙ для приготовления лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения при отсутствии какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК.

В предпочтительном воплощении указанные молекулы ΌόηίΙ содержат двухцепочечную область по меньшей мере из 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30 п.н., предпочтительно 32 п.н., имеют по меньшей мере один свободный конец, и где указанная молекула ΌόηίΙ является субстратом для связывания, по меньшей мере, белком Ки и способна активировать ДНК-ПКкс. Молекулы ОЬаП, по существу, представляют собой ДНК.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пролиферативного нарушения у субъекта в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекул ΌόηίΙ.

В частности, изобретение относится к способу повышения продолжительности жизни субъекта, страдающего от рака, в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК (т.е. химио- и радиотерапии), включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекул ИЬай, таких как определено выше; тем самым увеличивая продолжительность жизни указанного субъекта.

Субъект может быть млекопитающим или человеком. Предпочтительно субъект представляет собой человека. В общем, млекопитающий относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая лабораторных, домашних, сельскохозяйственных животных и животных из зоопарков, конкретно домашних животных, таких как мыши, крысы, кролики, свиньи, овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади и высшие приматы.

Такой способ касается нового терапевтического агента, который может быть использован для лечения заболеваний, возникающих вследствие бесконтрольной клеточной пролиферации, в частности рака. Хотя молекулы ОЬаР предназначены, главным образом, для применения в противораковой терапии в качестве альтернативы традиционным способам лечения, основанным на разрушении ДНК, они могут также использоваться в антипролиферативном лечении доброкачественных заболеваний, таких как заболевания, связанные с повышенной скоростью клеточного деления (пролиферация), например псориаз или стеноз/рестеноз. Антипролиферативная активность определяется путем инъекции молекул ЭЬа11 в клетки эмбриона рыбы полосатый данио на ранней стадии. Молекулы ОЬаР специфично убивают внутренние клетки, делящиеся быстро, и оказывают слабое действие на периферические клетки, делящиеся медленно.

Изобретение может применяться для лечения в качестве самостоятельной противоопухолевой терапии различных типов рака у млекопитающих субъектов, в особенности у человека, таких как солидные опухоли и лейкемия, в особенности радио- или химиорезистентных опухолей. Вовлеченным органом или областью может быть: легкие и бронхи, голова и шея, мозг, желудочно-кишечный тракт, поджелудочная железа, печень, колоректальный рак, мочеполовой рак, гинекологические органы, молочная железа, эндокринные органы, кожа, сетчатка, органы ЦНС, гематологические органы, метастазы из известного или неизвестного первичного очага и рудименты (тимус, например). Гистологической природой может быть эпителиальная, плоскоклеточная карцинома, аденокарцинома, переходно-клеточная карцинома, фибробластного/ангиобластного происхождения (саркомы), нейрональная, глиального происхождения, эндокринная, карциноидная, гастроинтестинальная строма, эндотелиальная, гематопоэтическая и эмбриональная. Предпочтительно опухоль выбирается из группы, состоящей из глиобластомы, рака головы и шеи, толстой кишки, печени, легких, кожи, рака молочной железы и рака шейки матки.

Молекулы ОЬаП могут быть введены любым подходящим способом, с подходящим приемлемым носителем/эксципиентом, таким как пероральное, или внутривенное или внутриопухолевое введение, или подкожные инъекции, или местное нанесение, или другие. Согласно воплощению изобретения трансфекционный агент используется в комбинации с молекулой ИЬа11.

Исходя из протокола, использующегося в исследованиях ίη νίνο, изобретение обеспечивает рациональную основу для создания клинического протокола применения молекул ИЬа11. Он будет без труда адаптирован специалистом в данной области для человека, а именно в зависимости от массы и поверхно

- 6 016053 сти тела пациента.

Композиция настоящего изобретения содержит молекулы ЭЬай в эффективном количестве, чтобы включаться в ядро опухолевых клеток. Например, если применяется внутриопухолевое введение, то указанное эффективное количество составляет по меньшей мере 0,1 мг на 1 см³ опухоли, предпочтительно 0,6 мг на 1 см³ опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см³ опухоли. Эффективное количество может быть введено в режиме ежедневного лечения (например, 5 дней в неделю в течение 3 последовательных недель или 3 раза в неделю в течение 5 последовательных недель). Альтернативно, эффективное количество по меньшей мере из 0,3 мг на 1 см³ опухоли, предпочтительно 1,8 мг на 1 см³ опухоли, наиболее предпочтительно 3 мг на 1 см³ опухоли может быть введено в режиме еженедельного применения в течение 5 последовательных недель, к примеру. Если применяются другие пути введения, то специалист в данной области может адаптировать количество для получения эффективного количества молекул ЭЬай в опухоли, составляющего по меньшей мере 0,1 мг на 1 см³ опухоли, предпочтительно 0,6 мг на 1 см³ опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см³ опухоли, в особенности в протоколе ежедневного лечения, или получения эффективного количества молекул ЭЬай в опухоли, составляющего по меньшей мере 0,3 мг на 1 см³ опухоли, предпочтительно 1,8 мг на 1 см³ опухоли, наиболее предпочтительно 3 мг на 1 см³ опухоли, в частности в протоколе еженедельного лечения.

В дополнение, настоящее изобретение также относится к гистону Н2АХ как маркеру эффективности лечения пролиферативного нарушения (например, рака), в частности с помощью молекул ЭЬай, как описано здесь. Также настоящее изобретение относится к способу оценки эффективности лечения молекулами ЭЬай. содержащему определение скорости фосфорилирования гистона Н2АХ. Фосфорилирование гистона Н2АХ может быть определено, например, как описано в примерах. Более высокий уровень фосфорилирования гистона Н2АХ по сравнению с уровнем фосфорилирования без какого-либо лечения указывает на эффективность лечения. В частности, способ включает введение молекул ЭЬай субъекту, определение уровня фосфорилирования гистона Н2АХ и сравнение определенного уровня фосфорилирования гистона Н2АХ с и без какого-либо лечения молекулами ЭЬай.

Конститутивный высокий уровень фосфорилированного гистона Н2АХ перед любым лечением в специфичной опухоли также является хорошим маркером эффективности проведения самостоятельного лечения ЭЬай на эту опухоль.

Другие характеристики и преимущества изобретения будут представлены в следующих примерах с ссылками на приведенные чертежи и таблицы.

Примеры

Хотя молекулы ЭЬай были подробно описаны в патентной заявке \¥О 2005/040378, для полной ясности конструкция, синтез и приготовление молекул ЭЬай суммированы в примере 1.

Молекулярные и клеточные исследования способности индуцировать фосфорилирование Н2АХ, а также демонстрация вовлеченности ДНК-ПКкс и не вовлеченности АТМ-опосредованного пути приведены в примере 2.

Анализы ίη νίνο, которые показывают регрессию опухоли и пролонгированное выживание в ксенотрансплантированных опухолях человека на голых мышах, описаны в примере 3.

Пример 1. Конструкция, синтез и приготовление молекул ЭЬай.

Создавали два типа молекул ЭЬай: линейные или шпилечные дцДНК (двухцепочечная ДНК) фрагменты. Для шпилечных молекул ЭЬай использовали гексаэтиленгликолевый линкер или тетрадезокситимидилат в качестве петли.

Конец(ы) стебля дцДНК может быть защищен от химического расщепления 3'-экзонуклеазами путем включения фосфоротиоатов, метилфосфонатов или 3'-3'-нуклеотидной связи. В принципе, могут применяться другие химические модификации, обеспечивающие совместимость с Ки70/Ки80 связыванием и активацию ДНК-ПКкс (Майеп55оп & Нашшайеп, 2002). Различные молекулы ЭЬай с разной длиной стебля 8 п.н. (ЭЬай8Н), 16 п.н. (ПЬай16Н), 24 п.н. (ЭЬай24Н) и 32 п.н. (ПЬай32Н), а также различные последовательности стебля с одинаковыми содержаниями СС/АТ (ПЬай32Н, ПЬай32На, ЭЬай32НЬ, ЭЬаП32Нс и ЭЬай32НД) были синтезированы и исследованы. Имеет смысл отметить отсутствие СрС последовательностей в ЭЬай32Нс. Также был создан фрагмент гантелевидной дцДНК (ПЬай32С), в котором оба конца закрыты двумя петлями из гексаэтилена, в качестве контроля. Некоторые молекулы ЭЬай были помечены посредством Т, меченного флуоресцеином (ПЬай32Н-Е1ТС), цианином 3 (ПЬай32Н-Су3), цианином 5 (ЭЬай32Нс-Су5) или биотином (ЭЬай32Н-Вю1). Табл. 1, 2 и 3 обобщают последовательности и химические структуры молекул ЭЬай, используемых в данной работе.

Молекулы ЭЬай описываются в перечне последовательностей под следующими регистрационными номерами:

НЬай32 (8Бф Ю Νο 1), ОЬай32-Т4 (ЙЕф ГО Νο 2),

- 7 016053

ОЬай32Н-ро (8ЕО ГО Νο 3), ПЬан32Н (8 Ер Ю Νο 4), ОЬай24Н (8Ер ГО Νο 5), ОЬаМбН (8Ер ГО Νο 6), ПЬаПЯН (8Ер ГО Νο 7), ПЬат132На (8Ер ГО Νο 8), ОЬай32НЬ (ЗЕф ГО Νο 9), ОЪай32Пс (8Ер ГО Νο 10), ОЬай321М (8ЕР ГО Νο 11), ОЬай32Пс-3’тр (ЗЕр ГО Νο 12), ОЬа1(32Нс-5’3’тр (8Ер ГО Νο 13), ОЬай32Нс-5’5’ (ЗЕр ΙΟ Νο 14), ОЪай32-ИН2 (8Ер ГО Νο 15), ОЬай32С (ЗЕР ГО Νο 16), ОЬай32зз (ЗЕр ГО Νο 17), ОЬай32Нсз5-ро (ЗЕР ГО Νο 18), ОЪай32На бз (ЗЕр ГО Νο 28), ОЪай32НЪ бз (ЗЕр ГО Νο 29), ОЬай32Нс бз (ЗЕр ГО Νο 30), ОЬай32Нб бз (ЗЕр ΙΟ Νο 31), ОЬаб32Н-НТС (ЗЕр ГО Νο 21), ОЬаЙ32Н-СуЗ (ЗЕр Ю Νο 22), ОЬаЙ32Н-Вкй (ЗЕр ГО Νο 23), ОЬаЙ32Нс-СуЗ (ЗЕр ГО Νο 25), ОЬаЙ32Нс-Су5 (ЗЕР ГО Νο 26), ОЪай32Нб-Е1ТС (ЗЕр ГО Νο 27), ОЬай64 (ЗЕр ГО Νο 19) и ОЬа11б4Ь (ЗЕр

ΙΠΝο 20).

ОЬаП32

Молекулы ОЬай

Последовательности и химические структуры

5'АСССАССССТСТТСССТССТТТСТТСССАТСТЗ ' ' ТССОТССССАСААСССАССАААСААОССТА£Й.5 '

ОЬаИ32-Т4

5'АСССАССССТСТТСССТССТТТОТТСССАТСТ — ' Т<ЗССТЗСССАСААСССА6САААСААСССТА(5А —>

ОЬа!132Н-ро ’ АСССАССССТСТТСССТССТТТСТТСССАТСТ3¹· ' ТвССТССССАСААСССАССАААСААСССТАСА5'

Ζ>

оьайзгн

5'АСССАССССгетТбССТССТТТОТТСССАТСТЗ' ' ТСССТССССАСААСССАССАААСААСССТАСА5' □ЬаИ24Н

5' АсесАссбстеттссетсотттстз'

3' ТОССТОСССАСААСССАССАААСАЗ' —

ОЬаИ16Н

5'АСОСАССССТСТТСССЗ' —

3'ТОССТССССАСААССС5'

ОЬаИЗН

5' АСССАСССЗ

3'ТСССТССС5'—2

ОЬай32На

5'ССТАССТСТСТТТССТСССТТТССАСТСССАСЗ'

3'6САТССАСАСАААССАСССАААСетСАСССТС5'

ОЬаЙ32НЬ * ОСТАеОСТТОТТТеСТСССТТСТАОбСАСАОСЗ' 3' СОАТСССААСАААССАСССААСАТСССТСТСС5'

Ξ>

ОЬаП32Нс

5'ССТСТССССАСААСССАССАААСААСССТА6АЗ ' з' сеьсАссветсттес<зтсстттаттссоАтст5'

ОЬа|132Нс1

5'ССТАССТСТСТТТССТСОСТТТеСАСТСССАСЗ' ' СОАТССА(ЗАСАААССАСССАААС<ЗТСАСССТ65'

ОЬаН32а

5'ССТАССТСТСТТТССТ&ЗСТТТССАСТООСАСЗ '

3' ССАТССАСАСАААССАСССАААССТСАСССТС5'

ОЬай32Ь

5’ССТАСССТТСТТТССТСССТТСТАСССАСАССЗ'

3' СОАТСССАА.САААССАСССААСАТСССТСТСС5' □ЬаН32с

5'ССТСТеСССАСААСССАССАААСААСССТАСАЗ '

3' СОАСАССССТОТТСССТССТТТСТТССС.МГСТ5'·

ОЬаИ32б ' ССТАССТСТСТТТОатСССТТГССАатСОСАСЗ '

3¹ССАТССАСАСАААССАСССАААССТСАСООТСЗ '

ОЬа132Нс-3’тр

5' ССТСТЗСССАСААСССАОСАААСААСССТАСАЗ '

3'сдаСАсееотеттеобтсстттоттсссАтстБ' —✓ □ЬаЙ32Нс-5'3’тр

5'дсЪетОСССАСААСССАССАААСААСССТАСАЗ'

3'СдаСАССССТОТТОООТСОТТТОТТСС6АТСТ5'

ОЬай32Нс-5’5’

5’ССТАСССТТСТТТССТСССТТСТАСССАСАССЗ ’

5' СЗ' -3' САТССбААСЛААССАСССААСАТСССТСТССБ'

ОЬай32-МН2

5'АсесАСбсстоттоеотсоттгеттссблтстз' -ын₂ ' ТСССТССССАСААСССАОСАААСААСССТАСА5' -ΙΊΗ.

ОЬай32С

Сб'АСССАСОСЗТСТТбСЗТСбТТТСТТССЗАТСТЗ' —>.

3' ТЗСОТ<ЗСССАСААСССА<ЗСАААСААЗССТАОА5'

ОЬа113253

5'АСОСАССвСТСТТСССТССТТТСТТСЗСАТСТ-З '

ОЬай32Нсзэ-ро ' ССТСТЗСССАСААСССАССАААСААСССТАСАЗ

- 8 016053

ОЬайЗ Нс-СуЗ

ОЬай32 Нс-СуЗ

ОЬа|(32Нс-Су5

ОЬаЙ32Нб-Р1ТС

Таблица 1.1

Последовательности и химические структуры молекул Экак. Заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфодиэфирным остовом. Жирные заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфоротиоатным остовом. Полукруглая сплошная линия символизирует гексаэтиленгликолевый линкер. ЭЬак32-Т4 содержит четыре тимина (Т₄) в качестве линкера вместо гексаэтиленгликолевого линкера. ЭЬай32С является гантелевидной (закрытой) молекулой. ОЬа1132Нс-5'5' получена из ЭЬай32Нс. где 3'-3'связь была введена на прежний З'-конец, тем самым представляя только два 5'-конца.

Молекулы Экак Последовательности и химические структуры

ОЬаИ32Н-|=|ТС □Ьай32Н-СуЗ 5’АсссАсосстеттссстсстгтсттсссатсиЗ' -х.

□ЬаЙ32Н-Вю1 3 ' ТССеТОСССАСААСССАССАААСАА8ССТАСА5 ' ϋ = Лиогевсе1П (Р1ТС), суапше 3 (СуЗ) ог ΡϊοΙίη (В|о1)-1аддес! т

5' ССТСТССАЗ з'СЭАСАсоиз¹и = суапше 3 (СуЗ)-(аддеб т 'ССТСТССССАСААСССАССАААСААСССТАСАЗ’ 3'ССАСАСЗССТОТТСССТССТТТОТТСО6АТС£5'

Ь = суапше 3 (СуЗ) от Суапше 5 (Су5)-4аддеб Т

5'ОСТАСЗТСТСТТТССТОССТТТОСАОТСССАСЗ' -ч 3'СЕАТССАСАСАААССАСС0АААС0ТСАСС<Зе<35' -X с = 11иогезсе1П (НТС)-1аддеб т

Таблица 1.2

Последовательности и химические структуры различных меченных молекул Экак. как указано. Молекулы Экак

Последовательности и химические структуры

ОЬаД64 5 'АсссАСсеетоттссстсстттсттсссАтстАСцсАСОстсотттсттсбйтегтессеАтстз’ ' Т(ЗССТССССАСААСССА0САААСААССС ГЛ САТСССТ0ССАОСАЛАСААСССДСААССССТА5а5 ’

ОЬай64Ь

5'АСССАС&зстсгтссстссттаттссс.лтст—асоса ссстссттгсттссстсттссссатстз' З'ТОССТССССАСААСССАС САЛАС ААОССТАОА ТЭСбТСССАОСАААСААСССАСААССЗСТАСАЗ'

Таблица 1.3

Последовательности и химические структуры 64-п.н. ЭЬак64 и ОЬак64Ь молекул. Заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфодиэфирным остовом. Жирные заглавные буквы представляют нуклеотиды с фосфоротиоатным остовом. Полукруглая сплошная линия символизирует гексаэтиленгликолевый линкер.

Все молекулы Экак были приготовлены с помощью автоматизированного твердофазного олигонуклеотидного синтеза (Еигодеп1ес. Ве1дшт). Они были очищены посредством денатурирующей обращено-фазовой ВЭЖХ. Денатурирующий капиллярный гель-электрофорез. ΜΑΕΌΙ-ΤΟΕ/ЖХ-МС использовался для контроля качества. Более чем 85 или 90% олигонуклеотидов являются полноразмерными. Все образцы были лиофилизированы перед отправкой.

При получении все образцы растворяли в бидистиллированной воде.

Концентрации молекул ЭЬай рассчитывали по поглощаемости при длине волны 260 нм (Сап1ог е1 а1.. 1970) при денатурирующем условии (60-90°С в зависимости от тепловой стабильности молекул ЭЬай). Концентрации флуоресцентного красителя. которым мечены молекулы Экак. рассчитывали по поглощению при подходящей длине волны определенного красителя (ИТС: ε = 80000 М^-1-см^-1 при 490 нм; Су3: ε = 150000 М^-1-см^-1 при 550 нм; Су5: ε = 250000 М^-1-см^-1 при 650 нм). Фрагмент гантелевидной дцДНК (ЭЬа1132С) был приготовлен путем отжига и лигирования с помощью Т4 ДНК лигазы (ВюЬаЬк) двух полу-шпилек. содержащих гексаэтиленгликолевый линкер и с 3'-выступающими и комплементарными концами.

Исходя из термодинамических и кинетических соображений. следующие протоколы использовались для приготовления образцов молекул ЭЬай в соответствии с их молекулярностью:

для бимолекулярных молекул ЭЬай (ЭЬай32. ΟΕιίΐ32-ΝΗ2. ЭЬак64 и ПЬай64Ь) смесь из 1:1 основного раствора (предпочтительно с высокой концентрацией) каждой цепи в бидистиллированной воде нагревали при 90°С в течение 5 мин для полной денатурации каждой цепи. Отжиг осуществляли путем постепенного охлаждения до комнатной температуры (образцы обычно оставляли в

- 9 016053 водяной бане) и итоговые дуплексные молекулы хранили в аликвотах при -20°С;

для мономолекулярных молекул ИЬаб (шпилька) раствор, содержащий 200 мкМ шпильковой молекулы ИЬаб в бидистиллированной воде, нагревали при 90°С в течение 5 мин для полной денатурации. Отжиг осуществляли путем охлаждения образцов в ледяной воде (0°С). Хранили аликвоты при -20°С.

Пример 2. Молекулярная и клеточная биологические активности молекул Икай регке.

Патентная заявка XVО 2005/040378 обеспечивала экспериментальные данные и в присутствии клеточного неочищенного экстракта, и в отсутствие любого лечения, направленного на повреждение ДНК.

1) Молекулы ИЬаб являются ловушками для белков Ки, вовлеченных в первый этап пути ΝΗΕ1;

2) молекулы ИЬай являются конкурентами реакции соединения концов ДНК, но не перемещают связанный комплекс. Рекрутинг белков Ки предварительно требуется;

3) молекулы ИЬаб длиной 32 п.н. способны активировать ДНК-ПК. Простой анализ активности клеток, свободных от ДНК-ПК, показывает, что только длина (около 32 п.н.) и двухцепочечная ДНК со свободным концом молекулы ИЬай требуются для активности киназы независимо от их последовательности и в некоторой степени химических модификаций. Это согласуется с ролью ДНК-ПКкс в пути ΝΗΕ1, не зависимом от последовательности ДНК механизме соединения концов.

Дальнейшие эксперименты осуществлялись изобретателями для оценки, имеют ли молекулы ИЬай биологическое влияние в отсутствие какого-либо повреждающего ДНК лечения. Неожиданно было обнаружено, что присутствие молекул ИЬай вызывает фосфорилирование варианта гистона, Н2АХ, известного как блюститель геномной целостности, как фосфорилированной формы Н2АХ, у-Н2АХ, формы расположенные на участках ДНР, и активирует репарацию нижележащей ДНК. Размер у-Н2АХ в культивированных клетках или клетках, собранных в опухолях, обработанных ОЬай32Нс. анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и РАС8. Ιη νίνο, значимая регрессия опухоли наблюдалась в трех ксенотрансплантированных опухолях человека на голых мышах.

Устойчивые клеточные линии человека Нер2 (плоскоклеточная карцинома головы и шеи, Н№СС), БИ1205 и 8К28 (меланомы) использовали для изучения на животных. Исследования клеток осуществляли с использованием Нер2, НеЬа 83 (эпителиальные клетки карциномы шейки матки), МО59К и МО591 (глиобластома), МК.С5 и ΑΤ5ΒΙ (фибробласты). Клетки выращивали при 37°С в монослойных культурах в полной ИМЕМ, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку, инактивированную нагреванием (ФТС; Ιηνίίτο^η, Сегду Роп1още, Ргапсе) и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин и 100 мкг/мл пенициллин) при условиях 100% влажности, 95% воздуха и 5% СО₂. БИ 1205 выращивали в МСИВ, содержащей 4% инактивированную нагреванием фетальной телячьей сыворотки (ФТС), 1% глутамин и антибиотики (100 мкг/мл стрептомицин и 100 мкг/мл пенициллин).

Экспоненциально растущие клетки в 6-луночных планшетах собирали и инкубировали с 700 мл полной среды ИМЕМ, содержащей смесь молекул ИЬай и реагента 8нрегГес1 (01адеп, СоийаЬоеиБ, Ргапсе) в отношении 10 мкл 8иретГес1 на мкг ДНК. Через 5 ч при 37°С под стандартными условиями клетки промывали РВ8 и добавляли полную среду ИМЕМ.

Для анализа Вестерн-блоттинга клетки выращивали в чашках Петри диаметром 5 см, 2 мкг молекул ИЬай32Нс трансфицировали вместе с 8нрегГес1 (01адепе) в соответствии с инструкцией производителя, затем оставляли в покое в течение различного времени в среде при температуре 37°С. Через 5 ч при 37°С при стандартных условиях клетки промывали 3 раза РВ8 и добавляли полную среду ИМЕМ. Клетки инкубировали один дополнительный час, промывали 3 раза и лизировали в буфере Лэммли. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, которые были блокированы 5% обезжиренным молоком (1 ч) перед инкубацией в течение ночи вместе с антителами против Н2АХ (Се11 81дпа11пд Тесйпо1оду, Иепуег, И8А) и мышиными антителами против фосфо-Гистона Н2АХ (8ег139) (БрйаЩ Тетрси1а, СА, И8А), кроличьими моноклональными антителами против фосфоТ11г68-С11к2 (Се11 81дпа1шд Тесйпо1оду, Иепуег, И8А), разбавленными 1/100 в 1хРВ8,1% В8А. Блоты затем инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими вторичными антителами против кроличьего 1дО (Р0448, Иако), разведенными 1/5000 в ТВ8Т. Комплексы белок-антитело обнаруживали на пленке НурегШт (Атегкйат) и количество определяли при использовании 1таде1 (РиЬБс боташ).

Для иммунофлуоресцентного определения у-Н2АХ с помощью РАС8, клетки выращивали в чашках Петри диаметром 5 см, 2 мкг молекул ИЬай32Нс трансфицировали вместе с 8нрегГес1 (01адепе) в соответствии с инструкцией производителя, затем оставляли в покое в течение различного времени в среде при температуре 37°С. После 3 циклов промывки клетки фиксировали с 2% РРА в течение 10 мин. После одного дополнительного промывания присутствие у-Н2АХ определяли с кроличьим анти-у-Н2АХ антителом (4411-РС, Тгеу1деп), разведенным 1/100 в 1хРВ8, 1% В8А. Клетки промывали три раза с 1хРВ8, 0,5% ТгйопХ-100, затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с конъюгированными с родамином козьими антикроличьими антителами, разведенными 1/100 в 1хРВ8, 1% В8А. Клетки анализировали с помощью проточного цитометра РАС8сап (РАС8айЬиг, ВескЮп-Иккткоп, И8А).

Поскольку ИЬай32Н/ИЬай32Нс активировали киназную активность ДНК-ПКкс в исходном экстракте, изобретатели задались вопросом, будут ли они индуцировать фосфорилирование нижележащих ми

- 10 016053 шеней ДНК-ПКкс в живых клетках. Изобретатели анализировали, тем самым, фосфорилирование Н2АХ в ЭЬай32Нс-трансфицированных клетках (Сйотебйиту е! а1., 2000; Раи11 е! а1., 2000).

Фиг. 1 показывает, что трансфекция с помощью ЭЬах^ГО в большой степени стимулирует фосфорилирование Н2АХ во всех ДНК-ПКкс компетентных опухолевых клеточных линиях (Η^^ ГОр2, МО59К и измененная линия фибробластов МКС5). Однако фосфорилирование Н2АХ не наблюдалось в ДНК-ПКкс дефицитной опухолевой клеточной линии (МО591, полученная от МО59К), тогда как оно есть в ДНК-ПКкс компетентной, но АТМ-дефицитной измененной линии фибробластов (АТ5В1, полученная в МКС5). Это показывает, что, ίη уйто, ЭЬай-зависимая активация киназы является общим процессом, который не зависит от происхождения клеточной линии. Фосфорилирование Н2АХ зависит от статуса ДНК-ПКкс, но не от АТМ. Высокий уровень у-Н2АХ сохранялся до 24-48 ч.

Фиг. 2 показывает уровень фосфорилированной формы Н2АХ и контрольного протеина Сйк2 посредством АТМ на Т11г68 (Сйк2-Т68р) в Нер2 клетках через 5 ч после трансфекции различными молекулами ЭЬай и через 1 ч после облучения 10 Гр без трансфекции □Ьа1132Ис. Высокий уровень у-Н2АХ наблюдался только в клетках, трансфицированных ΟΦιίΐ32Ηα Этот уровень выше в □Ьа1132Ис трансфицированных клетках, чем в облученных клетках. В отличие от этого уровень Сйк2-Т68р мало повышался в ΟΦιίΐ32Η трансфицированных клетках и намного больше, чем в облученных клетках. Эти результаты подтверждают, что ΟΦιίΐ32Η не активирует киназу АТМ.

Фиг. 3 показывает уровень у-Н2АХ в клетках, отобранных из Нер2 опухолей, обработанных 60 мкг ΟΦιίΐ32Η (внутриопухолевая инъекция, с РЕ1 в качестве агента трансфекции), и сравнивается с фоновым уровнем в Нер2 опухолях без лечения. Опухоли удаляли через 24 ч после лечения, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80°С. Перед проведением анализа клетки разделяли механическим путем, затем метили для Вестерн-блоттинга или анализа БАС8 (см. ниже). Необходимо отметить, что уровень у-Н2АХ был довольно высоким даже в нелеченных опухолях, однако, уровень, наблюдаемый в опухолях, обработанных ЭЬах^ГО, был значительно выше.

Фиг. 4 показывает анализ БАС8 около 10000 клеток. Высокий уровень у-Н2АХ наблюдается в Нер2 клетках опухоли, обработанной 60 мкг ΟΦιίΐ32Ηα по сравнению с нелеченной или обработанной 60 мкг ΟΦιΦΗ, использующегося в качестве контроля трансфекции.

Пример 3. Лечение ксенотрансплантированных голым мышам опухолей человека.

Ιη у1уо активность молекул ЭЬай в качестве новой молекулярной терапии, альтернатива традиционной терапии, направленной на повреждение ДНК, оценивали с помощью использования голых мышей, которым ксенотрансплантировали опухоли человека путем подкожной инъекции клеточных линий, резистентных к воздействию радиоволн (Нер2, полученные из плоскоклеточной карциномы головы и шеи человека, И^СС; и БШ205 и 8К28, полученной из меланомы человека).

Исследования проводили на мышах, которым ксенотрансплантировали различные опухоли человека для обеспечения доказательства концепции ίη у1уо. Ксенотрансплантацию проводили посредством инъекций около 1 млн опухолевых клеток человека. Лечение начали, когда объем опухоли достиг около 200 мм (около 7-10 дней после инокуляции опухолевых клеток). Размер опухоли измеряли 2-3 раза в неделю. Объем опухоли рассчитывали (У=2хахЬ², где а=длина, Ь=ширина). За мышами наблюдали по меньшей мере до 150 дней. Когда объем опухоли превысил 2 см³, животных умерщвляли в соответствии с экспериментальной этикой и время умерщвления устанавливали как время смерти (предел выживаемости, использующийся в графике Каплана-Майера).

Типичные условия проведения анализа состояли во внутриопухолевой инъекции соответствующего препарата, содержащего 1-6 нмоль молекул ЭЬай вместе с трансфицирующим агентом полиэтиленимином (РЕ1, Ро1ур1и§ ТпиъГссйоп). Для ΗΝ8ί.’ί.’ ксенотрансплантата инъекция заключенной в готовую форму молекулы ЭЬай (^Ьа^!32Η или ^Ьа^!32Ηс) выполнялась каждые 2 дня, 3 дня в течение 5 недель. Для БШ205 и 8К28 ксенотрансплантата заключенную в готовую форму молекулу 0^1632^ инъецировали в течение трех последовательных дней и повторяли один раз на следующей неделе.

Фиг. 5 показывает график Каплана-Майера для ΗN8СС ксенотрансплантатов на голых мышах. Абсолютная пролонгированная выживаемость наблюдалась для групп, подвергнутых лечению 60 мкг (3 нмоль) и 120 мкг (6 нмоль) молекул ^Ьа^!32Η/^Ьа^!32Ηс, тогда как лечение 60 мкг (6 нмоль) одноцепочечного контроля (ЭЬа1!3288) было отрицательным.

Преимущество ΟΦιίΐ32Η также видно для двух других ксенотрансплантатов опухолей человека (БШ205 анб 8К28) на голых мышах, как показано на фиг. 6 и 7.

Преимущество ΟΦιίΙ.ΙΣΗ наблюдается независимо от частоты введения заданного общего количества. Введение может быть разделено по частоте 3, 2 или, в идеале, одна инъекция в неделю.

Описательный анализ опухолевого ответа выполняли для каждого лечения и каждого типа опухоли. День 1 был днем первого сеанса лечения. Всех животных наблюдали в течение по меньшей мере 150 дней или до их этического умерщвления. Среднюю продолжительность жизни определяли согласно способу Каплана-Майера. ТОЭ рассчитывали путем вычитания среднего времени увеличения вчетверо объема опухоли контрольной группы из времени увеличения вчетверо объема опухоли индивидуальной мыши в каждой группе, подвергнутой лечению. Среднее значение ТОЭ рассчитывали для каждой груп

- 11 016053 пы, используя индивидуальные измерения.

Кривые общей выживаемости определяли по оценкам Каплана-Майера и сравнивали, используя непараметрический тест логарифмических рангов (Ьод Каик), поскольку данные не следовали нормальному распределению. Для анализа использовали программное обеспечение 8-Р1ик 6.2 уегкюп (Ма!к8ой 1пс., 8са111с. АЛ) и к!а!ЕЬ (аб 8с1епсе, Рапк, Етапсе). Глобальный Ьод Капк-тест был сначала выполнен для каждой группы с одинаковым типом опухоли. Затем лечение с помощью Экай сравнивали с не получавшим лечение контролем. Число животных (п), относительный риск (КК) и значение Р представлены в табл. 4. Все тесты оценены достоверными при уровне значимости 0,05.

Клеточная ЛИНИЯ	ЦЪай	Концентрация йЬаН	Количество мышей	Количество излеченных мышей**	Медиана времени выживаемо* * стн (дни)	* Относительный риск (Значение ₽)	‘Среднее *5ТО	Диапазон ТСЦ	‘Средний % ТОТ)
ют	тсо
Нер2			21		49	с	0	3.8	-5; 12	100
Нер2	32Н	15x20 мкг(1 нмоль)	10		55	0.62 (р<024)	Ί	6.7	-3; 17	168
Нер2	32Н	15x60 мкг (3 нмоль)	11	1		0.43(^1.5.10²)	>38	41.6	-5 ; 139	459
Нер2	32Нс	15x60 мкг (3 нмоль)	10		128	0.3^1.10¹)	34	213	7; 69	420
Нер2	32Н	15 х 120 мкг ( 6 нмоль)	11	1	14»	□^(рсЛЛЗЛО-⁴)	>56	38.7	-3; 139	624
Нер2		15 х 120 мкг( 12 нмоль)	12		46	0.71(р<0.29)	6	4.9	0; 19	156
Ш			21		24	с	0	2.3	-4;4	100
ΙΛΙ	32Нс	6 х 60 мкг ( 3 нмоль)	10		+1	0.25{р<3.2.10^,’‘)	9	2.8	1 ;12	207
5К			21		54	С	0	8.2	-19; 14	100
5К	32Нс	6 х 60 мкг (3 нмоль)	15		£8	О.29(р<1.45.10^!)	16	150	-4;64	179

С: группа с нелечеными опухолями, использующаяся как группа контроля для статистической оценки *ΤΟΌ расчет и статистический анализ, описанный в Материалах и методах **Излеченные мыши представляют животных, выживших более 200 дней после начала лечения

Таблица 4 Статистический анализ эффективности лечения ПЬай32Н/Нс ксенотрансплантированных опухолей у голых мышей

Статистически значимое преимущество прямого действия ПЬай32Н/ПЬай32Нс наблюдается в ксенотрансплантированных опухолях человека. Исходя из основополагающего механизма действия молекул ОЬаб и встречающегося повсеместно пути ΝΒΕΙ во всех клетках, предполагается, что они являются применимыми для других опухолей с различной гистологией.

Пример 4. Иммунный ответ на инъекций Экай.

Не было определено значимой индукции какого-либо цитокина ОЬай32Нс, как бы инъекция не вводилась - внутривенно или подкожно. Изобретатели оценивали иммунный ответ после внутривенного введения (IV) или подкожного (8С) ОЬай32Нс в Ва1Ь/С мышах. Уровни 1Ь2, 1Ь4, 1Ь5, 1Ь6, ΙΠ0, 1Ь12Р70, ΙΡΝγ и ΤΝΡα были измерены в образцах крови при различном временном периоде после повторных инъекций Экай. Животные, получившие семь инъекций 120 мг (9 нмоль) Экай в 24 дня, без развития какихлибо токсических проявлений или кожного воспаления. Изобретатели сравнивали иммунный ответ к ПЬай32Нс, которая не содержала какой-либо иммуногенной последовательности СрС, и ПЬай32Н, которая содержала четыре СрС. Только ОЬай32Н индуцировала быстрый ответ 1Ь6 и более замедленный ответ 1Ь12р70 (фиг. 8).

Ссылки

Ве1епкоу Α.Ι.; Ра1етеп! 1.Р.; Рапакс1 Ь.С.; Моша В.Р.; Скоте Τ.Υ. Ап апбкепке окдопис1ео!1бе 1агде1еб 1о китап Ки80 теккепдег ΚΝΑ кепкШхек М059К такдпап! дкота се11к 1о юшхшд габ1а!юп, Ыеотусш, апб е!ороябе Ьи! по! ΌΝΑ сгокк-кпкшд адеп!к. Сапсег Кек. (2002), 62, 5888-96.

Вои!оп 8.; Ку1е 8.; Эигкасх В.А. Мескатктк о! епкапсетеп! о! су!о!охюйу ш е!орок1бе апб юшкшд габ1а!юп-!геа!еб се11к Ьу !ке рто!еш кшаке шЫЬкот теойтапшп. Еиг. I. Сапсег (2000), 36, 535-41.

Сап!ог С.К.; Аагккате М.М.; 8кар1го Н. Окдопис1ео!1бе ш!етас!юпк. Ш.СопТогта!юпа1 бГТегепсек Ье!теееп беоху-апб пЬобйшс1еок1бе ркокрка!ек Вюро1утетк (1970), 9, 1059-77.

Скотебкигу Ό.; Кеодк М.С.; 1ккл Н.; Ре!егкоп С.Ь.; Вига!отекк1 8.; ЫеЬеттап I. датта-Н2АХ беркокркогу1а!юп Ьу рто!еш ркокрка!аке 2А ГасШ!а!ек ΌΝΑ боиЬ1е-к!гапб Ьгеак герак. Мо1. Се11. (2005) 20, 801-9.

Питал! 8.; Каггап Р. Vаш11шк-а поуе1 Татку о! ΌΝΑ-РК шЫЬйотк. Шс1ею ΑΦ6κ Кек. (2003), 31, 5501-

12.

1асккоп 8.Р. 8епкшд апб терашпд ΌΝΑ боиЬ1е-к!гапб Ьгеакк. Сатсшодепеяк. (2002), 23, 687-96.

- 12 016053

К1т С.Н.; Рагк 8.1; Ьее 8.Н. А 1агде1еб ίηΗίΜΐίοη οί ^NΑ-беρеηбеηΐ рго1еш ктахе хегМШех Ьгеах! сапсег се11х ίο11ο^ίη§ ίοηίζίη§ ηάίηΐίοη. ί. Рйагтасо1. Εχρ. Тйег. (2002), 303, 753-9.

Ь1 А.; Ε^^^η-^ορеζ 1М.; Аихю ί. Н2АХ: Ιηί1οπη§ ИхШие Н2А ίοτ сй^οтаΐ^η-беρеηбеηΐ дегюпис 1Шедгйу. Вшсйет. Се11 Βίο1. (2005), 83, 505-15.

Ы 8.; Такеба Υ.; Агадд 8.; Ваггей ί.; РЫШрх А.; □утаи А.8. Мοб^ί^саΐ^οη οί 1йе ίοηίζίη§ Γη6ίηΙίοη гехροηхе ίη Шшд се11х Ьуаη хсΡν адатх! 1йе ^NΑ-беρеηбеηΐ рго1ет ктахе. №.1с1ею Ас1б Кех. (2003а) 31, 584857.

Ь1 С.С; Не Р.; 81ιηο X.; Игам М.; 8йеи Ь.; К1т Ό.; Βοπΐ11ί М; Ье1Ье1 8.А.; Си6п Р.Н.; Ьшд С.С. Абеηον^^их-теб^аΐеб йеа1-асШ'а1еб аибхеихе Ки70 ехрсеххади габ^е^^ех ΐитο^ се11х ίη νίΐτο аиб ίη νίνο. Сапсег Кех. (2003Ь), 63, 3268-74.

Ма^аηдοη^ Ε.; Вау 1.О.; Уегге11е Р.; ΒοηΚ^ ί. Ти-пЛей бе деме ροи^ тοб^ί^е^ 1а г^гае а 1а габшШегар1е Саисег КабюШег. (2000а), 4, 175-80.

Ма^аηдοη^ Ε.; Ροήν Ν.; О'О^хотИ М.; ^οис-Каху 8.; Вегшег ί.; Βοи^й^х ί.; ^еддο Р. А Ки80 ГгадтегИ \\йй бοт^ηаηΐ медайте асйхйу ипрайх а таб^е^кКе ρйеηοΐуρе ΐο СНО-К1 се11х. ШсЫс Ас1б Кех. (2000Ь), 28, 4778-82.

Ма^аηдοη^ Ε.; Ье ^таисет М.; Ροήν Ν.; Ми11ег С.; ^οис-Каху 8.; Уадаиау 8.; АЬби1капт В.; Ваггснх М.; Са^и Р.; Вегшег ί.; 8а11ех В.; Βοи^й^х ί. Тгаг1хГег οί Ки80 ^А аибхеихе бесгеахех 1йе ^аб^ο^ех^хΐаηсе οί йитаи ПЬгоЬ1ах1х. Саисег СеиеТйег. (2000с), 7, 339-46.

Ма^ΐеηххοη 8.; Наттагх1еи О. ^NΑ-беρеηбеηΐ рго1ет ктахе са!а1у!1с хиЬшШ: хбисШга1 гецп!гетеи1х ίοτ кшахе асйхйу Ьу ^NΑ еибх. ί. Вю1. Сйе771. (2002), 277, 3020-29.

ОйшхЫ Т.; Так1 Т.; Ийада 8.; Агйа Ν.; Мο^^ΐа Т. Ιη νίΐτο аиб ίη νίνο ροΐеηΐ^аΐ^οη οί габш хеихШейу οί тайдиаи! д1штах Ьу аибхеихе ίηΗίΜΐίοη οί 1йе КАЭ51 деие. Вюсйет Вшрйух Кех Сοттиη. (1998), 245, 319-24.

Раи11 Т.Т.; ^да^и ΕΕ.; Υатаζак^ У.; Кйсйдеххиег С.и.; Се11еб М.; Εοη^!· А.М. А сгШса1 го1е ίοτ ЫхШие Н2АХ ίη гесгийтегИ οί герай ίасΐο^х ΐο шс1еаг ίοα айег ^NΑ батаде. Сигг. Вш1. (2000), 10, 886-95.

Реид Υ.; Ζ1ιηη§ О.; №1даха\га Н.; Окауахи К.; ЫЬег Н.Ь.; Вебйгб 18. 8Пег1стд ехргеххюи οί 1йе саΐа1уйс хиЬшШ οί ^NΑ-беρеηбеηΐ ρ^οΐе^η ктахе Ьу хта11 ^ηΐе^Ге^^ηд К¥А хеηх^ΐ^ζех йитаи се11х ίοτ ^аб^аΐ^οηтбисеб сй^οтοхοте батаде, се11 к1111ид, аиб тиΐаΐ^οη. Саисег Кех. (2002), 62, 6400-4.

8ак А.; 8Шхсйке М.; Аигт К.; 8сйгоебег С.; 8ίηη В.; Αο1ί С.; Вибасй У. 8е1есйхе ίηκίίνηΐίοη οί ^NΑ-беρеηбеηΐ ρ^οΐе^η ктахе \\йй аШхеихе ο1^дοбеοxуηис1еοΐ^бех: сοηхе^иеηсех ίοτ 1йе Γοίοίηίη§ οί габ1аΐ^οη-^ηбисеб ^NΑ бοиЬ1е-хΐ^аπб Ьгеакх аиб ^аб^οхеηх^ΐ^ν^ΐу οί йитаи саисег се11 1тех. Саисег Кех. (2002), 62, 6621-24.

Уеидег 8.1; Сийт Ν.1; 8тбй С.С.; ΟιιγΙμκζ В.А. ΕΓΓ6οϊ8 οί ηονе1 1пй|ЫЮгх οί ρο1у(Α^Р-^^Ьοхе) ρο1утегахе-1 аиб 1йе ^NΑ-беρеηбеηΐ ρ^οΐе^η ктахе οη еηζуте асйхШех аиб ^NΑ герай. Ои^еие (2004) 23, 7322-9.

АШпюге Ε.; бе Саих 8.; 8иШсг Ν.1; ТбЬу М.1; ^аскхοη С.Н.; Аихйи С.А.; ΟιιγΙμκζ В.А. А ηονе1 ^NΑ-беρеηбеηΐ ρ^οΐе^η кшахе ίηΜΜΐοΓ, Νυ7026, ροΐеηΐ^аΐех 1йе суккхкбу οί ΐορο^хοте^ахе II ρο^хοηх ихеб ίη 1йе 1геа1теШ οί 1еикет1а. В^б. (2004), 103, 4659-65.

Υοο 8.Н.; Ονηηη А.8. Сйа^асΐе^^ζаΐ^οη οί 1йе ^А Ьшбшд ргорегйех οί Ки ρ^οΐе^η. Вюсйетхбгу (1998), 37, 1336-43.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение молекулы нуклеиновой кислоты для приготовления лекарственного средства для лечения пролиферативного нарушения в отсутствие какого-либо лечения, прямо или опосредованно повреждающего ДНК, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит двухцепочечную область по меньшей мере из 16 п.н., предпочтительно более чем 26 п.н., более предпочтительно 32 п.н., имеет по меньшей мере один свободный конец и в котором указанная молекула является субстратом для связывания, по меньшей мере, посредством белка Ки и способна активировать ДНК-ПК.
2. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит между 16 и 200 п.н., наиболее предпочтительно между 32 и 100 п.н.
3. Применение по п.2, в котором указанная молекула является линейной или шпилечной молекулой нуклеиновой кислоты.
4. Применение по п.1, в котором указанная молекула является шпилечной молекулой нуклеиновой кислоты и в котором петля содержит нуклеиновую кислоту или химические группы.
5. Применение по п.1, в котором свободный конец является тупым или 5'- или 3'-выступающим.
6. Применение по п.1, в котором указанная молекула увеличивает фосфорилирование гистона Н2АХ.
7. Применение по п.1, в котором указанная молекула способна быть поглощенной клеткой в клеточное ядро.
8. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит фосфодиэфирный остов, или химически модифицированный фосфодиэфирный остов, или другой остов с одной или несколькими химиче

- 13 016053 скими группами.
9. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит 2'-дезоксинуклеотидный остов и необязательно содержит один или несколько модифицированных нуклеотидов и/или нуклеиновых оснований, отличных от аденина, цитозина, гуанина и тимина.
10. Применение по п.8, в котором указанный остов содержит метилфосфонаты, фосфорамидаты, морфолинонуклеиновую кислоту, замкнутую нуклеиновую кислоту с 2'-0,4'-С метиленовым этиленовым мостиком, пептидно-нуклеиновую кислоту (ПНК) и короткоцепочечные алкильные или циклоалкильные связи между остатками сахара или короткоцепочечные гетероатомные или гетероциклические связи внутри остатков сахара различной длины.
11. Применение по п.9, в котором указанная молекула дополнительно содержит имитаторы остатков сахара, такие как 2'-О-алкилрибоза, 2'-О-алкил-С4' разветвленная рибоза, циклобутилы или другие карбоциклические группы или гексит вместо пентофуранозильной группы.
12. Применение по п.1, в котором указанная молекула содержит один или несколько химически модифицированных нуклеотид(ов) на конце каждой цепи или по меньшей мере на З'-концевой цепи.
13. Применение по п.12, в котором указанная молекула содержит один или несколько фосфоротиоатов на конце каждой цепи или по меньшей мере на З'-концевой цепи.
14. Применение по п.1, в котором указанная молекула дополнительно содержит по меньшей мере один встроенный элемент, который препятствует репликации ДНК, репарации ДНК или процессу передачи сигнала повреждения, причем указанный по меньшей мере один элемент встроен в центре или на конце двухцепочечной молекулы.
15. Применение по п.14, в котором указанная молекула содержит:

a) полиэтиленгликолевую цепь, предпочтительно гексаэтиленгликолевую цепь, или любую углеводородную цепь, необязательно оборванную и/или замещенную одним или более гетероатомами, например кислородом, серой, азотом, или гетероатомными или гетероциклическими группами, содержащими один или более гетероатомов; и/или

b) элемент, который представляет собой блокирующий элемент, который не доступен ДНК полимеразам или экзонуклеазам, такой как любые З'-модифицированные нуклеотиды, и/или

c) нативный олигонуклеотид, такой как Тп, если используется в петле шпилечного фрагмента, предпочтительно тетрадезокситимидилат (Т4).
16. Применение по п.1, в котором указанная молекула имеет двухцепочечную область по меньшей мере из 32 п.о. или из 32 п.н., содержащая такой же нуклеотидный состав, что

ПЬай32 (8Е(2 ГО Νο 1), ОЬай32На (8ЕЦ ГО По 28), ОЪай32НЬ (ЗЕ<3 ГО Νο 29),

ОЬай32Нс (8ЕЦ ГО Νο 30) или ОЬаП32Нб (8Еф ГО Νο 31).
17. Применение по п.16, в котором указанная молекула выбирается из группы, состоящей из ЦЬай32 (8Εζ) ГО Νο 1), ОЪаЮ2Н-ро (8ЕЦ ГО Νο 3), ОЬай32Н (8ЕЦ ГО Νο 4),

1)ЬаЮ2-Т4 (8Еф ГО Νο 2), ГЛаО32ТТс-5’5’ (8Еф ГО Νο 14), Τ96οίΐ32-ΝΗ2 (8Еф ГО Νο 15),

1)Ьа1(32Н-Е1ТС (8Еф ГО Νο 21), Е)Ьай32Н-СуЗ (8Еф ГО Νο 22), ОЬай32Н-Вю1 (8Еф ГО Νο

23), ОЬай32На (8Еф ГО Νο 8), ОЬайЗЗНЬ (8Еф ГО Νο 9), ОЬайЗЗНс (8Еф ГО Νο 10),

ПЬай32Нб (8Εΰ Ιϋ Νο 11), ОЬай32Нс-3’тр (8Еф ГО Νο 12), ОЬай32Нс-5’3’тр (8ЕО ГО Νο

13), ОЪай32Нс-СуЗ (8Еф ГО Νο 25), ПЬай32Нс-Су5 (ЯЕф ГО Νο 26), ТЖиЗЗНО-ПТС (8ЕО

ГО Νο 27), Е)Ьай32На бз (8Еф ГО Νο 28), ОЬаИ32НЬ бз (8Еф ГО Νο 29), ОЬаИ32Нс бз (8ЕЦ

ГО Νο 30), ϋ0ώ32Η6 бз (8Еф ГО Νο 31), ОЬай64 (8Ер ГО Νο 19) и ОЪайб4Ь (5Еф ГО Νο

20).
18. Применение по п.1, в котором двухцепочечная область указанной молекулы содержит по меньшей мере 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32 последовательно расположенных нуклеотида из ОЬа032 (81Υ) ГО Νο 1), ОЬай32На (81Υ) ГО Νο 28), 1Ж1П.32НЬ (81Υ) ГО Νο 29), 1Ж1П.32Нс (8ЕС) ГО Νο 30) или ОЬай32Нб (8ЕО ГО Νο 31).
19. Применение по любому из пп.1-18, в котором указанное пролиферативное нарушение представляет собой рак, предпочтительно выбранный из глиобластомы, рака головы и шеи, толстой кишки, печени, легких, кожи, молочной железы и рака шейки матки.
20. Применение по п.19, в котором лекарственное средство предназначено для введения пероральным путем или посредством внутривенной, внутриопухолевой или подкожной инъекции, интракраниально или посредством внутриартериальной инъекции или инфузии или посредством перорального пути введения.
21. Применение по п.19, в котором лекарственное средство предназначено для внутриопухолевого введения в эффективном количестве по меньшей мере 0,1 мг на 1 см³ опухоли, предпочтительно 0,6 мг на 1 см³ опухоли, наиболее предпочтительно 1 мг на 1 см³ опухоли в режиме ежедневного лечения или по меньшей мере 0,3 мг на 1 см³ опухоли, предпочтительно 1,8 мг на 1 см³ опухоли, наиболее предпочтительно 3 мг на 1 см³ опухоли в режиме еженедельного лечения.