CN101622351B - 双链断裂诱饵及其单独的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于干扰双链断裂(DSBs)的DNA修复的组合物和方法。本发明公开了新型双链核酸分子,其充当诱饵并劫持(hijack)负责DNA DSB感应、信号转导和/或修复途径,尤其是DSB修复的非同源性末端连接(NHEJ)途径的酶的全复合物。本发明公开了这些分子作为单独的抗癌药物,以有效量导入肿瘤细胞的细胞核,以引发它们的死亡的用途。
Description
本发明涉及干扰哺乳动物细胞中DNA双链断裂修复途径的组合物和方法。因此,本发明涉及用于治疗增生性病症的组合物和方法。
背景技术
放疗法和化疗法,单独使用或与手术联用,是抗击人类癌症的重要治疗手段。化疗与放疗的结合被广泛用于癌症治疗。尽管仍未被完全阐明,细胞毒素作用的生物学基础依赖于细胞机制,诸如细胞周期或DNA损伤,这对于放射诱导的细胞死亡同样重要,导致癌症治疗中联合不同疗法的加合甚至更好的协同效益。
最近在生物药物(单克隆抗体,细胞因子/激酶抑制剂,免疫疗法/疫苗)开发中的进展证明了它们对肿瘤亚型的有效性和特异性。但它们经常与化学细胞毒素联用。尽管在新型细胞毒药物的开发中取得许多进展,对化疗的抗药性仍然是癌症治疗中主要的临床顾虑。对与药物摄取/流出、代谢性降解、靶诱变、增强的修复、细胞死亡(凋亡和坏死)的信号转导相关的抗药性机制的了解对于特别是在某些对治疗有抗性的肿瘤中保证化疗的效力和改善治疗指标是非常必要的。
最近十年中,本领域进行了许多研究,有人开始描述对辐射应答的信号转导的复杂性。在这方面,作为电离辐射靶标的特定目标基因是那些参与调节辐射诱导的致死机制,诸如凋亡或DNA修复的基因。因为双链断裂(DSBs)是最致命的DNA损伤,当DSB修复效率增加时,电离辐射的效率降低。
DSBs的修复涉及两种机制:非同源性末端连接(NHEJ,不依赖于序列的途径)和同源重组(HR,依赖序列的途径)(Jackson综述,2002)。根据所使用的方法和癌细胞系,参与这两种主要DSB修复途径的靶基因到目前为止导致较小或中等的放射敏感性(Belenkov等,2002;Marangoni等,2000a;Ohnishi等,1998)。
Ku(例如,Ku70和Ku80)和DNA-PKcs蛋白在辐射或化学诱导的DNA DSBs的修复中非常重要。如果损伤不能被及时修复,细胞死亡。因此,它们代表了用于使靶细胞和组织对放射疗法和化学疗法致敏的潜在有兴趣的分子靶。据此,已经设想了许多方法并进行了尝试,以抑制这些参与在哺乳动物细胞中占优势的NHEJ途径的关键蛋白(Ku70/Ku80,DNA-PKcs等):
1)PI3K抑制剂(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即,DNA-PKcs,ATM,ATR)(Bouton等,2000;Durant&Karran,2003;Willmore等,2004;Vauger等,2004);
2)显性失活肽(KU80的C-末端)(Marangoni等,2000b;Kim等,2002);
3)单链抗体可变区片段(scFv)(DNA-PKcs)(Li等,2003a);
4)RNA适体(SELEX:RNA结合Ku)(Yoo&Dynan,1998);
5)反义(Ku70,Ku80,DNA-PKcs)(Li等,2003b;Marangoni等,2000c;Sak等,2002);
6)siRNA(DNA-PKcs)(Peng等,2000)。
尽管付出了这些巨大努力,但以参与DNA修复途径的基因作为靶与癌症疗法的结合仍处在早期实验阶段,到目前为止还没有临床研究显示任何得到证实的效果。值得注意的是上述方法具有共同的特征:它们靶向于参与具有可能的旁路或补偿途径的复杂的级联途径(例如NHEJ)的单个效应子(蛋白)。
专利申请WO2005/040378公开了干扰哺乳动物细胞中DNA双链断裂修复途径的组合物和方法。尤其是,其涉及以非基因特异性方式干扰DNA损伤感知、信号转导和/或修复途径的核酸分子,以及它们用于引发接受抗癌治疗的肿瘤的细胞致死的用途。其描述了利用(化学修饰或非化学修饰)短dsDNA分子可以增强细胞对直接或间接DNA损伤疗法的敏感性,所述短dsDNA分子充当断裂DNA片段的模拟物,并被认为是DNA损伤性治疗诱导的DSB位点(即DSB的模拟底物)。这些分子,还称作“DSB诱饵”分子(简称Dbait),赋予或增加任意肿瘤细胞对DNA损伤癌症治疗性疗法(即化疗和放疗)的敏感性。Dbait分子通过引诱并劫持DNA DSB修复酶的全复合物(holocomplex),从而干扰DNA损伤感知、信号转导和/或修复过程发挥作用。因此,本申请涉及结合能够直接或间接地造成DNA的DSBs的物理和/或化学剂的Dbait分子。
发明概述
本发明的发明人出人意料地发现,在没有任何直接或间接DNA损伤性治疗(即,化疗,放疗)的情况下,肿瘤细胞对单独的Dbait分子的存在敏感。如实施例所示,作为单独的癌症疗法,Dbait分子在体外以及体内都是有效的。
因此,本发明涉及在没有任何直接或间接DNA损伤性治疗的情况下,核酸分子制备用于治疗增生性病症的药物中的用途,其中所述核酸分子包括至少16bp、大于24bp、优选32bp的双链部分,具有至少一个游离末端,其中所述分子是被至少一个Ku蛋白结合的底物,并能够活化DNA-PKcs。
本发明还涉及一种治疗受试者的增生性病症的方法,包括给所述受试者施用治疗有效量的核酸分子,所述核酸分子包括至少16bp、优选32bp的双链部分,具有至少一个游离末端,是被至少一个Ku蛋白结合的底物并且能够活化DNA-PKcs。
本发明还涉及一种用于评估本发明核酸的治疗效率的方法,包括确定组蛋白H2AX的磷酸化。
本发明还涉及一种用于在细胞和/或组织中增加组蛋白H2AX的磷酸化或活化组蛋白H2AX的方法,包括向所述细胞和/或组织中导入本发明的核酸。
附图说明
图1:源自人肿瘤(Hela,Hep2和MO59K)和转化的成纤维细胞(MRC5)的各种细胞系中组蛋白H2AX和磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的Western印迹。MO59J是DNA-PK缺陷型(源自野生型MO59K)。AT5BI是ATM缺陷型(源自野生型MRC5)。
图2:用各种Dbait分子转染后5小时或10Gy照射后1小时,Hep2细胞中磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)和磷酸化关卡蛋白Chk2(Chk2-T68p)的水平。
图3:取出的Hep2肿瘤中γ-H2AX水平的Western印迹分析。
图4:取出的Hep2肿瘤中γ-H2AX水平的FASC分析。
图5:裸鼠中Hep2(HNSCC)异种移植物的Kaplan-Meier曲线。
图6:裸鼠中LU1205异种移植物的Kaplan-Meier曲线。
图7:裸鼠中SK28异种移植物的Kaplan-Meier曲线。
图8:Balb/C小鼠中注射Dbait的免疫应答。
发明详述
如专利申请WO2005/040378所公开的,Dbait分子是一种新型治疗分子,其可以非基因特异性的方式干扰哺乳动物细胞的DNA DSB修复系统。这些新分子,被称为Dbait分子,是参与NHEJ途径(不依赖序列的途径)的蛋白,尤其是Ku和/或DNA-PK蛋白的全复合物的底物,能够中和细胞的DNA修复能力,从而增加它们对DNA损伤性治疗的敏感性。
本发明还公开了在无DNA损伤性治疗的情况下,Dbait分子引发染色体完整性的关键保障,组蛋白H2AX的磷酸化的能力。H2AX的这种翻译后修饰由DNA-PK(DNA依赖性激酶)-介导的途径调节,但不依赖于ATM(共济失调毛细血管扩张症突变物)-介导的途径。
H2AX的这种意外/错误地活化的生物学后果是DNA双链断裂(DSB)修复系统,尤其是非同源性末端连接(NHEJ)途径的瓦解,从而诱导肿瘤细胞中的细胞致死,所述肿瘤细胞比正常细胞具有更高水平的自发性(复制错误)和内源性(氧化应激)发生的DSBs。
更具体地,本发明提供以下证据:在没有任何DNA损伤性治疗的情况下,Dbait分子能够引发裸鼠中异种移植的人肿瘤的细胞/组织致死。
因此,本发明涉及这种分子作为单独治疗剂的用途,尤其用于治疗增生性疾病。
可以通过大量特征定义本发明的Dbait分子,诸如它们的最小长度,至少一个游离末端的存在,以及双链部分的存在。就如将在下文论述的,Dbait分子的一个重要特征是它们精确的核苷酸序列基本上不影响它们的活性。此外,Dbait分子可以包含修饰的和/或非天然的骨架。
Dbait分子优选的是非人类来源的(即,其核苷酸序列和/或构象(例如,发夹)不与在人类细胞中存在的一样),最优选是合成来源的。
根据Dbait分子的作用机制,Dbait分子的序列几乎不起作用(即使有的话)。因此,与现有技术中用于基因/蛋白特异性靶向(例如,反义,反基因(antigene),siRNA,适体,诱饵(decoy),核酶,等)的分子不同,Dbait分子可以与已知的基因、启动子、增强子、5′-或3′-上游序列、外显子、内含子等具有任一显著水平的序列同源性或同一性。换句话说,Dbait分子干扰NHEJ途径的作用是不依赖序列的,Dbait分子与人类基因组的任一基因可以具有低于80%或70%,甚至低于60%或50%的序列同一性。
这种不依赖序列的作用机制是Dbait分子的标志,其将Dbait分子与其他基因特异性或蛋白特异性(依赖序列的)治疗剂诸如反义寡核苷酸,小干扰RNA(siRNA,shRNA和miRNA),和免疫刺激性CpG寡核苷酸,以及被设计成捕获特定蛋白的适体/诱饵清楚区分开来。
在一个优选的实施方案中,Dbait分子的序列与人类核酸序列总的同一性程度低于约80%,70%,65%,60%,55%或50%。确定序列同一性的方法是本领域公知的,包括例如Blast。
在一个具体的实施方案中,在严格条件下,Dbait分子不与人类基因组DNA杂交。典型的严格条件是能够将完全互补的核酸与部分互补的核酸区分开来的条件。
在一个优选的实施方案中,Dbait分子的序列不含CpG,目的是避免公知的toll样受体介导的免疫反应,如果这种作用是不需要的话。
在一个具体的实施方案中,具有至少32bp或32bp的双链部分的Dbait分子包括与Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc(SEQ ID No 30)或Dbait32Hd(SEQ ID No 31)相同的核苷酸序列。任选地,Dbait分子具有与Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd相同的核苷酸组成,但它们的核苷酸序列是不同的。然后,Dbait分子包括具有3A、6C、12G和11T的双链部分的一条链。优选地,Dbait分子的序列不包含任何CpG二核苷酸。
考虑到它们的作用机制,Dbait分子的长度是可以变化的,只要它们足以允许包含Ku和DNA-PKcs蛋白的Ku蛋白复合物的适当结合。WO2005/040378的实验部分显示,Dbait分子的长度必须大于16bp,优选为32bp,以确保结合这种Ku复合物并允许DNA-PKcs活化。优选地,Dbait分子包括16-200bp,更优选24-100bp,仍然更优选26-100,和最优选32-100bp。例如,Dbait分子包括24-160,26-150,28-140,30-120,32-100bp。“bp”旨在表示分子包括指定长度的双链部分。
在一个具体的实施方案中,双链部分包括Dbait32(SEQ ID No1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc(SEQ ID No 30)或Dbait32Hd(SEQ ID No 31)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸。在一个更具体的实施方案中,双链部分由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No28)、Dbait32Hb(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc(SEQ ID No 30)或Dbait32Hd(SEQ ID No 31)的16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成。
本发明的Dbait分子必须具有至少一个游离末端,作为DSB的模拟物。所述游离末端可以是游离的平末端或5′-/3′-突出末端。在一个具体的实施方案中,它们只包含一个游离末端。在另一个具体的实施方案中,它们包含两个游离末端。因此,本发明还涉及如下所述的Dbait分子:其是具有两个游离末端的双链分子,并具有Dbait32(SEQID No 1)、Dbait32Ha ds(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb ds(SEQ ID No29)、Dbait32Hc ds(SEQ ID No 30)或Dbait32Hd ds(SEQ ID No 31)的核苷酸序列。
Dbait分子可以是线性的或,优选的,由发夹双链核酸组成。在这种情况下,环可以是核酸,或本领域技术人员已知的其他化学基团,优选是接头诸如六乙二醇或四脱氧胸苷酸(T4)。因此,在一个具体的实施方案中,Dbait分子可以是具有双链部分和环的发夹分子,所述双链部分包括Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc(SEQ ID No 30)或Dbait32Hd(SEQ ID No 31)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸,环是六乙二醇接头或四脱氧胸苷酸接头(T4)。在一个更具体的实施方案中,那些Dbait分子可以具有由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc(SEQ ID No 30)或Dbait32Hd(SEQ ID No 31)的16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成的双链部分。
在一个优选的实施方案中,Dbait分子如下所述:
1)当与药学上可接受的载体/赋形剂一起使用时,双链Dbait分子能够被细胞/组织体摄入到细胞核中;
2)Dbait分子的至少一个游离末端可被参与DSB损伤感知、信号转导和/或修复过程的酶的全复合物识别;以及,
3)Dbait分子的至少一个游离末端可被所述复合物整合到肿瘤细胞的基因组DNA中。
在一个具体的实施方案中,因为其结构诸如环和/或骨架,Dbait分子具有不能复制的结构。
在这方面,本发明的Dbait分子可仅仅具有或主要(超过50%)具有天然的磷酸二酯骨架或化学修饰的磷酸二酯骨架,或具有化学基团或化学基团混合物的另一种骨架,前提是所述修饰的dsDNA仍然是参与NHEJ途径,尤其是Ku和DNA-PKcs蛋白,以及DSB损伤感知或信号转导途径的全复合物的底物。有利地,化学修饰的目的在于,如果发生基因组整合,为Dbait分子赋予化学稳定性和/或防止它们的进一步复制(诱变效应的可能原因)。
在一个优选的实施方案中,Dbait分子包括2′-脱氧核苷酸骨架,任选的包括一个或数个(2、3、4、5或6个)除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶以外的修饰核苷酸和/或核酸碱基。因此,Dbait分子基本上是DNA结构。
也可以具有糖模拟物诸如2′-O-烷基核糖,2′-O-烷基-C4′支链核糖,环丁基或其他碳环或己糖醇来代替呋喃戊糖基。
优选的Dbait在一条链或每条链的末端包括一个或数个化学修饰的核苷酸或基团。在一个具体的优选实施方案中,Dbait分子的游离末端受到一条链或每条链末端的一个、两个或三个修饰的磷酸二酯骨架的保护。优选的化学基团,尤其是修饰的磷酸二酯骨架包括硫代磷酸酯。或者,优选的Dbait具有3′-3′核苷酸键,或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。
本发明其他修饰的骨架包括氨基磷酸酯,吗啉代核酸,2′-O,4′-C亚甲基/亚乙基桥连的锁核酸,肽核酸(PNA),和短链烷基,或长度可变的环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖内键,或技术人员已知的任何修饰的核苷酸。
美国专利5,677,437描述了杂芳香寡核苷酸键。氮接头或含氮基团也可用于制备寡核苷酸模拟物(美国专利5,792,844和5,783,682)。美国专利5,637,684描述了氨基磷酸酯和硫代氨基磷酸酯(phosphorothioamidate)寡聚化合物。还预见了具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸(美国专利5,034,506)。在其他实施方案中,诸如寡核苷酸的肽核酸(PNA)骨架、磷酸二酯骨架可以被聚酰胺骨架取代,碱基直接或间接地结合到聚酰胺骨架的氮杂氮原子上。其他合成的寡核苷酸可以包含取代的糖部分,所述糖部分在2′位置包括下列基团中的一个:OH,SH,OCH3,SCH3,F,OCN,OCH2CH2OCH3,O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3,其中n是1到约10;C1到C10的低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基;Cl;Br;CN;CF3;OCF3.;O-S-;或N-烷基;O-,S-,或N-链烯基;SOCH3;SO2CH3;ONO;NO;N3。
Dbait分子可以包括至少一个嵌入元件(embedded element),其阻碍DNA复制、DNA修复或阻碍损伤信号转导过程。所述嵌入元件可以整合到双链片段的内部位置(例如,在中心)或末端。它(它们)可以包括:a)不能用作DNA复制模板的单元,诸如聚乙二醇链,优选六乙二醇链,或任何烃链,最终被一个或多个杂原子例如氧、硫、氮或包括一个或多个杂原子的杂原子或杂环基团所阻断和/或取代;b)作为阻断元件的单元,因为其不受DNA聚合酶或核酸外切酶的作用,诸如任何3′-修饰的核苷酸,或本领域技术人员已知的其他核苷酸;c)天然的寡核苷酸,诸如Tn,当用于发夹片段的环中时,诸如四脱氧胸苷酸(T4)。
所述链通过化学合成、半生物合成或生物合成,任何扩增方法,然后是任意提取和制备方法及任意化学修饰进行制备。
如专利申请WO2005/040378所公开,可以按照例如实施例2和3描述的体外和基于培养细胞的分析,和/或也可以按照例如实施例4和5描述的体内分析,评估Dbait分子的生物活性。最容易和最相关的分析是依赖DNA的蛋白激酶活性分析(参见实施例2,图1.4)。到目前为止这种简单的分析已被用于预测Dbait分子的体内活性。但是,其他基于培养细胞的分析,诸如辐射增强的非常规整合(illegitimateintegration)的抑制分析也是相关的(参见实施例3,图2.3&图2.4)。
实际上,本发明的Dbait分子必须能够活化DNA-PK。在一个实施方案中,Dbait分子还能够抑制辐射增强的非常规DNA整合。在另一个具体实施方案中,例如通过凝胶迁移分析确定的Dbait分子在体外结合Ku复合物。这种Ku复合物包括一个或数个Ku蛋白与至少一个DNA-PKc蛋白的组合。在一个进一步的具体实施方案中,优选的通过利用药学上可接受的载体/赋形剂,本发明的Dbait分子渗入细胞核中。最优选的本发明Dbait分子组合了上述特性中的数个或全部。
在一个优选实施方案中,Dbait分子是化学修饰的Dbait分子,如上述定义及人类治疗中其他实践的Dbait分子。在另一个实施方案中,Dbait分子不是化学修饰的,并对应于天然的核酸片段,但显示化学修饰片段的特征,尤其是具有根据所述化学修饰的Dbait分子限定的碱基对的数目和特性。
本发明涉及说明书中公开的任意Dbait分子的用途。在一个优选实施方案中,Dbait分子选自:Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32H-po(SEQ ID No 3)、Dbait32H(SEQ ID No 4)、Dbait32-T4(SEQ ID No 2)、Dbait32Hc-5’5’(SEQ ID No 14)、Dbait32-NH2(SEQ ID No 15)、Dbait32H-FITC(SEQ ID No 21)、Dbait32H-Cy3(SEQ ID No 22)、Dbait32H-Biot(SEQ ID No 23)、Dbait32Ha(SEQ ID No 8)、Dbait32Hb(SEQ ID No 9)、Dbait32Hc(SEQ ID No 10)、Dbait32Hd(SEQ ID No11)、Dbait32Hc-3’mp(SEQ ID No 12)、Dbait32Hc-5’3’mp(SEQ ID No13)、Dbait32Hc-Cy3(SEQ ID No 25)、Dbait32Hc-Cy5(SEQ ID No 26)、Dbait32Hd-FITC(SEQ ID No 27)、Dbait32Ha ds(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb ds(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc ds(SEQ ID No 30)、Dbait32Hd ds(SEQ ID No 31)、Dbait64(SEQ ID No 19)和Dbait64L(SEQ ID No 20)。还可以使用其组合。
因此,本发明涉及一种在没有任何直接或间接DNA损伤性治疗(即,化疗和放疗)的情况下治疗增生性病症的方法,包括:向患有增生性病症的细胞和/或组织中导入如上定义的Dbait分子;从而诱导所述细胞和/或组织的细胞致死。
本发明还涉及一种在细胞和/或组织中增加组蛋白H2AX的磷酸化或活化组蛋白H2AX的方法,包括向所述细胞和/或组织中导入如上定义的Dbait分子,从而增加组蛋白H2AX的磷酸化和活化组蛋白H2AX。组蛋白H2AX是本领域技术人员公知的蛋白。Swiss-Prot中的参考号是P16104,Unigene是Hs477879。磷酸化在Ser-139上进行(Li等,2005,综述)。
本发明涉及一种在没有任何直接或间接DNA损伤性治疗的情况下诱导患有增生性病症的细胞和/或组织的细胞致死的方法,包括:向所述细胞和/或组织中导入如上定义的Dbait分子;从而诱导所述细胞和/或组织的细胞致死。
在上述方法的一个具体实施方案中,在所述导入步骤中使用转染剂。例如,转染剂可以选自PEI(US 6,013,240),Superfect(Qiagene),阳离子脂质诸如Lipofectin(Invitrogen)。
在本发明的方法和用途中,使用有效量的Dbait分子。尤其是,Dbait分子的量使该分子到达被治疗细胞的细胞核。此外,所述量足以活化DNA-PK,以及增加组蛋白H2AX的磷酸化并活化组蛋白H2AX。
本发明涉及Dbait分子在制备药物中的用途,所述药物用于在没有任何直接或间接的DNA损伤性治疗的情况下治疗增生性病症。
在一个优选实施方案中,所述Dbait分子包括至少16、18、20、22、24、26、28或30bp的双链部分,优选32bp,具有至少一个游离末端,其中所述Dbait分子是被至少一个Ku蛋白结合的底物并能够活化DNA-PKcs。Dbait分子基本上是DNA。
本发明还涉及一种在没有任何直接或间接的DNA损伤性治疗的情况下治疗受试者的增生性病症的方法,包括给所述受试者施用治疗有效量的Dbait分子。
尤其是,本发明涉及一种在没有任何直接或间接的DNA损伤性治疗(即,化疗和放疗)的情况下增加患有癌症的受试者的存活时间的方法,包括给所述受试者施用治疗有效量的如上定义的Dbait分子;从而增加所述受试者的存活时间。
受试者可以是哺乳动物或人。优选的,受试者是人。通常,“哺乳动物”是指被划分为哺乳动物的任何动物,包括实验室、家养、农场和动物园动物,具体为宠物动物,诸如小鼠,大鼠,兔,猪,绵羊,山羊,牛,马和更高级的灵长类动物。
这种方法涉及一种新型治疗剂,所述治疗剂可用于治疗由不受控制的细胞增殖尤其是癌症引起的疾病。尽管Dbait主要旨在作为常规DNA损伤性治疗的替代物用于抗癌治疗,它也可用于非恶性疾病的抗增殖治疗,诸如与过高细胞分裂率(增殖)相关的疾病,例如银屑病或狭窄(stenosise)/再狭窄(restenosis)。已经通过在早期阶段向斑马鱼胚胎细胞注射Dbait分子来评估抗增殖活性。Dbait分子特异性杀伤快速分裂的内部细胞,而对分裂缓慢的外周细胞几乎没有影响。
本发明可以被用作哺乳动物受试者(尤其是人类受试者)中各种类型癌症的单独的癌症疗法,诸如实体癌和白血病,尤其是放射或化学抗性的癌症。相关的器官或区域可以是:肺和支气管,头和颈,脑,胃肠道,胰腺,肝,结肠直肠癌,泌尿生殖道,妇科器官,乳腺,内分泌腺,皮肤,视网膜,CNS,血液学器官,已知或不明原发部位的转移瘤,和残遗物(例如胸腺)。组织学本质可以是上皮的,鳞状细胞癌,腺癌,移行癌,成纤维细胞/成血管细胞来源的(肉瘤),神经元,神经胶质来源的,内分泌腺的,类癌,胃肠道间质的,内皮的,造血的,和胚胎的。优选的,癌症选自恶性胶质瘤,头颈癌,结肠癌,肝癌,肺癌,皮肤癌,乳腺癌和宫颈癌。
Dbait分子可以与合适的可接受的载体/赋形剂一起,通过任意合适的途径施用,诸如口服或静脉内或肿瘤内施用,或皮下注射或局部施用或其他途径。根据本发明的实施方案,转染剂与Dbait分子联用。
根据体内研究使用的方案,本发明提供了建立使用Dbait分子的临床方案的合理性。本领域技术人员可以使其轻易地适合于人,尤其取决于患者的重量/体表。
本发明的组合物包括将被导入肿瘤细胞细胞核的有效量的Dbait分子。例如,当使用肿瘤内施用时,所述有效量至少为0.1mg每1cm3肿瘤,优选0.6mg每1cm3肿瘤,最优选的1mg每1cm3肿瘤。所述有效量可按每日治疗方案施用(例如,每周5天连续3周或每周3次连续5周)。或者,以下有效量可以按例如每周的治疗方案连续5周进行施用:至少0.3mg每1cm3肿瘤,优选1.8mg每1cm3肿瘤,最优选3mg每1cm3肿瘤。当使用其他给药途经时,本领域技术人员可以改变所述量以在肿瘤中获得尤其是按照每日的治疗方案以下有效量的Dbait分子:至少0.1mg每1cm3肿瘤,优选0.6mg每1cm3肿瘤,最优选1mg每1cm3肿瘤;或尤其是按照每周的治疗方案,至少0.3mg每1cm3肿瘤,优选1.8mg每1cm3肿瘤,最优选3mg每1cm3肿瘤。
此外,本发明还涉及作为增生性病症(例如,癌症)治疗效率的标记物的组蛋白H2AX,尤其是本文描述的Dbait分子。然后,本发明涉及一种用于评估Dbait分子的治疗效率的方法,包括测定组蛋白H2AX的磷酸化率。例如可以按照实施例中的描述检测组蛋白H2AX的磷酸化。与未经任何治疗的磷酸化水平相比更高的组蛋白H2AX磷酸化水平指示治疗效率。尤其是,所述方法包括,给受试者施用Dbait分子,测定组蛋白H2AX的磷酸化水平,并比较经历和未经历任何Dbait分子治疗的组蛋白H2AX的被测磷酸化水平。
在任意治疗前特定肿瘤中磷酸化组蛋白H2AX的组成型高水平还是Dbait单独疗法对该肿瘤效果的良好标记物。
本发明的其他特征和优点将参考附图和表格,在下列实施例中给出。
实施例
尽管专利申请WO2005/040378中完整描述了Dbaits分子,为了清楚起见,Dbait分子的设计、合成和制备概述于实施例1。
实施例2显示了对诱导H2AX磷酸化的能力的分子和细胞研究,以及DNA-PKcs参与和ATM介导途径的未参与的证明。
实施例3描述了对裸鼠中异种移植的人肿瘤的体内分析,该分析显示肿瘤消退和延长的生存。
实施例1:Dbait分子的设计、合成和制备。
设计两种类型的Dbait分子:线性或发夹dsDNA片段。对于发夹Dbait分子来说,六乙二醇接头或四脱氧胸苷酸被用作环。
dsDNA茎的末端可通过整合硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或3′-3′核苷酸键保护其不被3′-核酸外切酶化学降解。原则上,可以使用其他化学修饰,只要它们适合Ku70/Ku80结合和DNA-PKcs活化(Martensson&Hammarten,2002)。合成并分析各种茎长8bp(Dbait8H)、16bp(Dbait16H)、24bp(Dbait24H)和32bp(Dbait32H)的不同Dbait分子,以及具有类似的GC/AT含量的不同茎序列(Dbait32H,Dbait32Ha,Dbait32Hb,Dbait32Hc和Dbait32Hd)。需要注意Dbait32Hc中CpG序列的缺失。还设计哑铃形dsDNA片段(Dbait32C)作为对照,所述片段的两个末端被两个六乙烯环密封。一些Dbait分子经荧光素(Dbait32H-FITC)、花菁3(Dbait32H-Cy3)、花菁5(Dbait32Hc-Cy5)或生物素(Dbait32H-Biot)标记的T标记。表1、2和3概述了本研究中使用的Dbait分子的序列和化学结构。
序列表中按照下列参考号公开了Dbait分子:Dbait32(SEQ ID No1)、Dbait32-T4(SEQ ID No 2)、Dbait32H-po(SEQ ID No 3)、Dbait32H(SEQ ID No 4)、Dbait24H(SEQ ID No 5)、Dbait16H(SEQ IDNo 6)、Dbait8H(SEQ ID No 7)、Dbait32Ha(SEQ ID No 8)、Dbait32Hb(SEQ ID No 9)、Dbait32Hc(SEQ ID No 10)、Dbait32Hd(SEQID No 11)、Dbait32Hc-3’mp(SEQ ID No 12)、Dbait32Hc-5’3’mp(SEQID No 13)、Dbait32Hc-5’5’(SEQ ID No 14)、Dbait32-NH2(SEQ ID No15)、Dbait32C(SEQ ID No 16)、Dbait32ss(SEQ ID No 17)、Dbait32Hcss-po(SEQ ID No 18)、Dbait32Ha ds(SEQ ID No 28)、Dbait32Hb ds(SEQ ID No 29)、Dbait32Hc ds(SEQ ID No 30)、Dbait32Hd ds(SEQ ID No 31)、Dbait32H-FITC(SEQ ID No 21)、Dbait32H-Cy3(SEQ ID No 22)、Dbait32H-Biot(SEQ ID No 23)、Dbait32Hc-Cy3(SEQ ID No 25)、Dbait32Hc-Cy5(SEQ ID No 26)、Dbait32Hd-FITC(SEQ ID No 27)、Dbait64(SEQ ID No 19)和Dbait64L(SEQ ID No 20)。
Dbait分子 序列和化学结构
表1.1:Dbait分子的序列和化学结构。大写字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗体大写字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。半环实线代表六乙二醇接头。Dbait32-T4含有4个胸腺嘧啶(T4)作为接头,代替六乙二醇接头。Dbait32C是哑铃形(闭合)分子。Dbait32Hc-5′5′来源于Dbait32Hc,其中3′-3′键被引入3′末端前,因此只呈现两个5′-末端。
Dbait分子 序列和化学结构
表1.2:如指示的各种标记Dbait分子的序列和化学结构。
Dbait分子 序列和化学结构
表1.3:64-bp Dbait64和Dbait64L分子的序列和化学结构。大写字母是具有磷酸二酯骨架的核苷酸。粗体大写字母是具有硫代磷酸酯骨架的核苷酸。实线代表六乙二醇接头。
所有Dbait分子通过自动化固相寡核苷酸合成(Eurogentec,Belgium)来制备。它们通过变性反相HPLC进行纯化。变性毛细管凝胶电泳、MALDI-TOF/LC-MS被用于质量控制。超过85%或90%的寡核苷酸是全长的。在运输之前所有样品都被冻干。
一经接收,将所有样品都溶于双蒸水。变性条件(60℃-90℃,取决于Dbait分子的热稳定性)下260nm处的吸光度计算Dbait分子的浓度(Cantor等,1970)。通过特定染料相应波长处的吸光度计算荧光染料标记的Dbait分子的浓度(490nm处FITC:ε=80000M-1.cm-1;550nm处Cy3:ε=150000M-1.cm-1;650nm处Cy5:ε=250000M-1.cm-1)。将具有六乙二醇接头和3′-突出及互补末端的两半发夹退火,并通过DNA T4连接酶(BioLabs)连接,制备哑铃形dsDNA片段(Dbait32C)。
基于对热力学和动力学的考虑,根据它们的分子性状,使用下列方案制备Dbait分子的样品:
-对于双分子的Dbait分子(Dbait32、Dbait32-NH2、Dbait64和Dbait64L):
溶于双蒸水的每条链的1∶1母液(优选在高浓度)的混合物必须在90℃加热5分钟以便每条链完全变性。通过平稳的恢复到室温(样品通常置于水浴中)进行退火,并将产生的双链分子等分量保存于-20℃。
-对于单分子Dbait分子(发夹):
溶于双蒸水的含有200μM发夹Dbait分子的溶液必须在90℃加热5分钟以便完全变性。必须通过将样品置于冰水(0℃)冷却进行退火。等分量保存于-20℃。
实施例2:Dbait分子本身的分子和细胞生物活性。
专利申请WO2005/040378提供了以下证据,在存在细胞粗提物而没有任何DNA损伤性治疗的情况下:
1)Dbait分子是参与NHEJ途径第一步的Ku蛋白的诱饵;
2)Dbait分子是DNA末端连接反应的竞争物,但不取代结合的复合物。Ku蛋白的募集是前提;
3)32-bp长的Dbait分子能够活化DNA-PK。一种简单的无细胞DNA-PK活性分析表明,激酶活化只需要所述长度(约32-bp)和具有Dbait分子游离末端的双链DNA,在一定程度上与它们的序列和化学修饰无关。这与NHEJ途径,一种不依赖序列的DNA末端连接机制,中DNA-PKcs的参与一致。
本发明人已经进行进一步的实验来评估在没有任何DNA损伤性治疗的情况下Dbait分子是否有生物学效果。出人意料的发现,Dbait分子的存在诱导组蛋白变体H2AX的磷酸化,H2AX被称为基因组完整性的保障,因为H2AX的磷酸化形式,γ-H2AX在DSB位点形成焦点(foci)并引发下游DNA修复。通过western印迹和FACS分析培养的细胞中或从Dbait32Hc治疗的肿瘤收集的细胞中γ-H2AX的程度。在裸鼠的3种异种移植的人肿瘤中观察到体内显著的肿瘤消退。
动物研究使用建立的人类细胞系Hep2(头颈鳞状细胞癌,HNSCC)、LU1205和SK28(黑素瘤)。利用Hep2、HeLa S3(上皮宫颈癌)、MO59K和MO59J(恶性胶质瘤),MRC5和AT5BI(成纤维细胞)进行培养细胞的研究。在100%湿度、95%空气和5%CO2条件下,细胞在含有10%热灭活的胎牛血清(FBS;Invitrogen,Cergy Pontoise,法国)和抗生素(100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素)的完全DMEM的单层培养物中37℃生长。LU1205在含有4%热灭活FBS、1%谷氨酰胺和抗生素(100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素)的MCDB中生长。
收集6孔板中指数生长的细胞,将其与700ml完全DMEM孵育,所述完全DMEM含有Dbait分子和Superfect试剂(Qiagen,Courtaboeuf,法国)的混合物,其比例为每μg DNA,10μl Superfect。在标准条件下37℃5小时后,用PBS清洗细胞,并添加完全DMEM。
为了进行Western印迹分析,细胞在5cm直径的培养皿中生长,按照制造商的说明书用Superfect(Qiagene)转染2μg Dbait32Hc分子,然后在培养基中于37℃静置不同时间。在标准条件下37℃5小时后,用PBS清洗细胞3次,并添加完全DMEM。细胞再孵育1小时,清洗3次并用Laemmli缓冲液裂解。蛋白被转移到硝化纤维素膜上,该硝化纤维素膜用5%脱脂乳封闭(1小时),然后与在1x PBS,1%BSA中1/100稀释的抗-H2AX(Cell Signaling Technology,Denver,USA)和小鼠抗磷酸组蛋白H2AX(Ser139)(Upstate,Tempcula,CA,USA)、兔单克隆抗磷酸Thr68-Chk2抗体(Cell Signaling Technology,Denver,USA)温育过夜。印迹然后与在TBST中1/5000稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG二抗(P0448,Dako)温育。蛋白抗体复合物在hyperfilm(Amersham)上显示,并用ImageJ(Public domain)定量。
为了通过γ-H2AX的FACS进行免疫荧光检测,细胞在5cm直径的培养皿中生长,按照制造商的说明书用Superfect(Qiagene)转染2μgDbait32Hc分子,然后在培养基中于37℃静置不同时间。在3次清洗循环后,细胞用2%PFA固定10分钟。再清洗一次后,利用在1x PBS,1%BSA中1/100稀释的兔抗γ-H2AX抗体(4411-PC,Trevigen)检测γ-H2AX的存在。细胞用1x PBS,0.5%TritonX-100清洗3次,然后在室温下与在1x PBS,1%BSA中1/100稀释的若丹明偶联的山羊抗兔抗体温育1小时。通过FACScan流式细胞仪(FACSalibur,Beckton-Dickinson,USA)分析细胞。
因为Dbait32H/Dbait32Hc活化粗提物中DNA-PKcs的激酶活性,本发明人想知道它是否将诱导活细胞中DNA-PKcs的下游靶的磷酸化。因此本发明人分析了Dbait32Hc转染的细胞中H2AX的磷酸化(Chowdhury等,2000;Paull等,2000)。
图1显示Dbait32Hc转染极大刺激了所有DNA-PKcs感受态肿瘤细胞系(Hela,Hep2,MO59K和转化的成纤维细胞系MRC5)中H2AX的磷酸化。但是,在DNA-PKcs缺陷肿瘤细胞系(源自MO59K的MO59J)中未观察到H2AX的磷酸化,而在DNA-PKcs感受态但ATM-缺陷的转化的成纤维细胞系(源自MRC5的AT5BI)中存在H2AX的磷酸化。这表明,在体外,依赖Dbait的激酶活化是与细胞系起源无关的普遍过程。H2AX的磷酸化取决于DNA-PKcs的状态,但与ATM的状态无关。γ-H2AX的高水平持续直至24-48小时。
图2显示用各种Dbait分子转染后5小时和无Dbait32Hc转染的10Gy照射后1小时,Hep2细胞中H2AX的磷酸化形式的水平及在Thr68被ATM磷酸化的关卡蛋白Chk2(Chk2-T68p)的水平。只在Dbait32Hc转染的细胞中观察到γ-H2AX的高水平。在Dbait32Hc转染细胞中这种水平高于在辐射过的细胞中。相反,Chk2-T68p的水平在Dbait32Hc转染细胞中增加很少,而在辐射过的细胞中要高得多。这些结果证明Dbait32Hc不活化激酶ATM。
图3显示从接受60μg Dbait32Hc治疗(肿瘤内注射,用PEI作为转染剂)的Hep2肿瘤收集的细胞中γ-H2AX的水平,并与未治疗的Hep2肿瘤中的背景水平比较。治疗后24小时取出肿瘤,将其在液氮中冷冻,并保存于-80℃。在分析前,细胞用机械法解离,然后进行免疫标记用于western印迹或FACS分析(见下文)。应当注意到甚至在未治疗的肿瘤中γ-H2AX水平也是相当高的,但是在Dbait32Hc治疗的肿瘤中观察到的水平显著更高。
图4显示约10.000细胞的FACS分析。与未治疗或用60μgDbait8H作为转染对照的治疗相比,在用60μg Dbait32Hc治疗的肿瘤的Hep2细胞中观察到高水平的γ-H2AX。
实施例3:裸鼠中异种移植的人肿瘤的治疗
通过使用由皮下注射放射抗性的细胞系(源自人头颈鳞状细胞癌HNSCC的Hep2;及源自人黑素瘤的LU1205和SK28)异种移植的人肿瘤的裸鼠,评估Dbait分子的体内活性,Dbait分子是作为一种新型分子疗法和常规DNA损伤疗法的替代。
为了建立体内概念的证据,对异种移植了各种人肿瘤的小鼠进行研究。通过注射约1百万个人肿瘤细胞进行异种移植。当肿瘤体积达到约200mm3(在接种肿瘤细胞后约7-10天)时开始治疗。每周测量肿瘤大小2-3次。计算肿瘤体积(V=2×a×b2,其中a=长度,b=宽度)。跟踪小鼠至少150天。当肿瘤体积超过2cm3时,根据动物实验伦理规则处死动物,处死时间被认定为死亡时间(用于Kaplan-Meier曲线的存活终止点)。
典型的分析条件由肿瘤内注射1-6纳摩尔(nmole)Dbait分子和转染剂聚乙烯亚胺(PEI,Polyplus Transfection)的相应制剂组成。对于HNSCC异种移植来说,每2天、一周3天共5周注射配制的Dbait分子(Dbait32H或Dbait32Hc)。对于LU1205和SK28异种移植来说,连续3天注射配制的Dbait32Hc分子,并在之后一周重复一次。
图5显示裸鼠中HNSCC异种移植物的Kaplan-Meier曲线。在60μg(3纳摩尔)和120μg(6纳摩尔)Dbait32H/Dbait32Hc分子治疗组中观察的明显延长的生存,而60μg(6纳摩尔)单链对照(Dbait32ss)的治疗是阴性的。
如图6和图7所示,在裸鼠的两种其他异种移植的人肿瘤(LU1205和SK28)中也观察到Dbait32Hc的有益效果。
无论施用频率如何只要达到指定总量就能观察到Dbait32Hc的有益效果。施用可以被划分为每周3次、2次或理论上1次注射的频率。
对每种治疗和每种肿瘤类型进行肿瘤应答的描述性分析。第1天是第一次治疗的日子。跟踪所有动物至少150天或直至它们按伦理规则被处死。根据Kaplan-Meier方法估算中值生存期。通过从每个治疗组单个小鼠的肿瘤体积四倍增时间(quadrupling times)减去对照组的平均肿瘤体积四倍增时间,计算TGD。利用个体测量计算每个治疗组的平均TGD。
通过Kaplan-Meier估算评价总体生存曲线,并利用非参数LogRank检验进行比较,因为数据不符合正态分布。所述分析使用S-Plus6.2版软件(MathSoft Inc,Seattle,WA)和statEL(ad Science,Paris,法国)。首先对相同肿瘤类型的每个组进行全面Log Rank。然后比较Dbait治疗与未治疗的对照。动物数量(n)、相对危险度(RR)和P值在表4中给出。所有检验都被认为在0.05显著性水平是显著的。
C:未治疗的肿瘤组用作统计评分的参照组
*TGD计算和统计学分析描述于材料和方法。
**治愈小鼠是治疗开始后存活超过200天的动物。
表4:Dbait32H/Hc治疗对裸鼠异种移植肿瘤效果的统计学分析。
在所有异种移植的人肿瘤中都观察到统计学显著的Dbait32H/Dbait32Hc有益结果。因为Dbait分子的根本作用机制和所有细胞中普遍存在的NHEJ途径,可以预料这将适用于具有不同组织学的其他肿瘤。
实施例4:对Dbait注射的免疫应答
无论是静脉内注射或皮下注射,没有检测到Dbait32Hc显著的诱导任何细胞因子。本发明人评价了给Balb/C小鼠静脉内(IV)或皮下(SC)注射Dbait32Hc后的免疫应答。在重复注射Dbait后的不同时间测量血液样品中IL2,IL4,IL5,IL6,IL10,IL12P70,IFNγ和TNFα的水平。动物在24天内接受120mg(9纳摩尔)Dbait的七次注射,没有显示任何中毒现象或皮肤炎症。本发明人比较了针对不包含任何免疫原性CpG序列的Dbait32Hc和包含4个CpG的Dbait32H的免疫应答。只有Dbait32H诱导IL6的快速应答和IL12p70的更延迟的应答(图8)。
参考文献
Belenkov A.I.;Paiement J.P.;Panasci L.C.;Monia B.P.;ChowT.Y.An antisense oligonucleotide targeted to human Ku80 messengerRNA sensitizes M059K malignant glioma cells to ionizing radiation,bleomycin,and etoposide but not DNA cross-linking agents.Cancer Res.(2002),62,5888-96.
Bouton.,S.;,Kyle S.;Durkacz.B.W.Mechanisms of enhancementof cytotoxicity in etoposide and ionising radiation-treated cells by theprotein kinase inhibitor wortmannin.Eur.J Cancer(2000),36,535-41.
Cantor,C.R.;Warshaw,M.M.;Shapiro,H.Oligonucleotideinteractions.III.Conformational differences between deoxy-andribodinucleoside phosphates Biopolymers(1970),9,1059-77.
Chowdhury,D.;Keogh,M.C.;Ishii,H.;Peterson,C.L.;Buratowski,S.;Lieberman,J.gamma-H2AX dephosphorylation byprotein phosphatase 2A facilitates DNA double-strand break repair.Mol.Cell.(2005)20,801-9.
Durant,S.;Karran,P.Vanillins--a novel family of DNA-PKinhibitors.Nucleic Acids Res.(2003),31,5501-12.
Jackson,S.P.Sensing and repairing DNA double-strand breaks.Carcinogenesis.(2002),23,687-96.
Kim,C.H.;Park,S.J.;Lee,S.H.;A targeted inhibition ofDNA-dependent protein kinase sensitizes breast cancer cells followingionizing radiation.J;Pharmacol.Exp.Ther.(2002),303,753-9.
Li,A;Eirin-Lopez,J.M.;Ausio,J.H2AX:tailoring histone H2Afor chromatin-dependent genomic integrity.Biochem.Cell Biol.(2005),83,505-15.
Li,S.;Takeda,Y.;Wragg,S.;Barrett,J.;Phillips,A.;Dynan,W.S.Modification of the ionizing radiation response in living cells byanscFv against the DNA-dependent protein kinase.Nucleic Acid Res.(2003a)31,5848-57.
Li,G.C.;He,F.;Shao,X.;Urano,M.;Shen,L.;Kim,D.;Borrelli,M.;Leibel,S.A.;Gutin,P.H.;Ling,C.C.Adenovirus-mediated heat-activated antisense Ku70 expressionradiosensitizes tumor cells in vitro and in vivo.Cancer Res.(2003b),63,3268-74.
Marangoni,E.;Bay,J.O.;Verrelle,P.;Bourhis,J.Tranfert degène pour modifier la réponse àla radiotherapie Cancer Radiother.(2000a),4,175-80.
Marangoni,E.;Foray,N.;O′Driscoll,M.;Douc-Rasy,S.;Bernier,J.;Bourhis,J.;Jeggo,P.A Ku80 fragment with dominantnegative activity imparts a radiosensitive phenotype to CHO-K1 cells.Nucleic Acid Res.(2000b),28,4778-82.
Marangoni,E.;Le Romancer,M.;Foray,N.;Muller,C.;Douc-Rasy,S.;Vaganay,S.;Abdulkarim,B.;Barrois,M.;Calsou,P.;Bernier,J.;Salles,B.;Bourhis J.Transfer of Ku80 RNA antisensedecreases the radioresistance of human fibroblasts.Cancer GeneTher.(2000c),7,339-46.
Martensson,S.;Hammarsten,O.DNA-dependent protein kinasecatalytic subunit:structural requirements for kinase activity by DNAends.J Biol.Che77i.(2002),277,3020-29.
Ohnishi,T.;Taki,T.;Hiraga,S.;Arita,N.;Morita,T.In vitroand in vivo potentiation of radiosensitivity of malignant gliomas byantisense inhibition of the RAD51 gene.Biochem Biophys Res Commun.(1998),245,319-24.
Paull,T.T.;Rogakou,E.P.;Yamazaki,V.;Kirchgessner C.U.;Gellert,M.;Bonner W.M.A critical role for histone H2AX in recruitmentof repair factors to nuclear foci after DNA damage.Curr.Biol.(2000),10,886-95.
Peng,Y.;Zhang,Q.;Nagasawa,H.;Okayasu,R.;Liber,H.L.;Bedford,J.S.Silencing expression of the catalytic subunit ofDNA-dependent protein kinase by small interfering RNA sensitizes humancells for radiation-induced chromosome damage,cell killing,and mutation.Cancer Res.(2002),62,6400-4.
Sak,A.;Stuschke,M.;Wurm,R.;Schroeder,G.;Sinn,B.;Wolf,G.;Budach,V.Selective inactivation of DNA-dependent protein kinasewith antisense oligodeoxynucleotides:consequences for the rejoining ofradiation-induced DNA double-strand breaks and radiosensitivity ofhuman cancer cell lines.Cancer Res.(2002),62,6621-24.
Veuger,S.J.;Curtin,N.J.;Smith,G.C.;Durkacz,B.W.Effects ofnovel inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase-1 and theDNA-dependent protein kinase on enzyme activities and DNA repair.Oncogene(2004)23,7322-9.
Willmore,E.;de Caux,S.;Sunter,N.J.;Tilby,M.J.;Jackson,G.H.;Austin,C.A.;Durkacz,B.W.A novel DNA-dependent proteinkinase inhibitor,NU7026,potentiates the cytotoxicity of topoisomerase IIpoisons used in the treatment of leukemia.Blood.(2004),103,4659-65.
Yoo,S.H.;Dynan,W.S.Characterization of the RNA bindingproperties of Ku protein.Biochemsitry(1998),37,1336-43.
序列表
<110>法国国家科学研究中心(Centre National de la Recherche Scientifique)
法国居里学院(INSTITUT CURIE)
<120>双链断裂诱饵及其单独的用途(Dbait and its standalone uses thereof)
<130>SCT092081-60
<150>EP07300728.8
<151>2007-01-12
<160>31
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<223>/note=″at the 5’and 3’ends of the complementary strand the
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nucleotides wi th phosphorothioate backbone″
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<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(36)
<223>loop
<400>2
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ctttttagat ccgaacaaac gacccaacac 60
ccgtgcgt 68
<210>3
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait 32H-po
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>3
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>4
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait24H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(24)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>5
acgcacgggt gttgggtcgt ttgt 24
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait16H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(16)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>6
acgcacgggt gttggg 16
<210>7
<211>8
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait8H
<220>
<221>misc_feature
<223>/note:″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(8)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>7
acgcacgg 8
<210>8
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Ha
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=at the 3’end of the complementary strain the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>8
cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hb
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>9
gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc
<220>
<221>misc_feature
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<400>10
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>11
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hd
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″at the 3’end of the complementary strand the three last
nucleotides with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>11
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210>12
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc-3’mp
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″last 3nucleotides at the 3’end of the complementary
strand with methylphosphonate linkage″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>12
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>13
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc-5’3’mp
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with methylphosphonate linkage″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=methylphosphonate linkage
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>13
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>14
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc-5’5’
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the last nucleotide at the 3’end of the complementary
strand is linked with 3’-3’linkage″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>14
gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32
<210>15
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32-NH2
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the nucleotide at the 5’end of the complementary strand
is linked to NH2group″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_binding
<222>(32)..(32)
<223>linker=NH2
<400>15
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32C
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>16
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32ss
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>modified_base
<222>(30)..(32)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<400>17
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>18
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hcss-po
<400>18
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>19
<211>64
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait64
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three nucleotides at the 5’end of the complementary
strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>modified_base
<222>(62)..(64)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<400>19
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat c tacgcacgg tcgtttgttc ggtgttggcg 60
atct 64
<210>20
<211>63
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait64-L
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three nucleotides at the 5’end of the complementary
strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>repeat_region
<222>(32)..(33)
<223>rpt_type=hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>modified_base
<222>(61)..(63)
<223>mod_base=hexaethyleneglycol linker
<400>20
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat cacgcacggt cgtttgttcg gtgttggcga 60
tct 63
<210>21
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32H-FITC
<220>
<221>misc_eature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc-binding
<222>(32)..(32)
<223>linker=FITC
<400>21
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>22
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32H-Cy3
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<220>
<221>misc-binding
<222>(32)..(32)
<223>linker=Cyanine3
<400>22
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>23
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32H-Biot
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the three last nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc-binding
<222>(32)..(32)
<223>linker=biotine
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>23
acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcggat ct 32
<210>24
<211>8
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait8Hc-Cy3
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the nucleotide at the 5’end of the complementary strand
linked to cyanine 3″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the last three nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(8)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>24
gctgtgca 8
<210>25
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32Hc-Cy3
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the last three nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the nucleotide at the 5’end of the complementary strand
linked to Cyanine 3″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>25
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>26
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32Hc-Cy5
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the last three nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the nucleotide at the 5’end of the complementary strand
linked to Cyanine-5″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>26
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>27
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Dbait32Hd-FITC
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the last three nucleotides at the 3’end of the
complementary strand with phosphorothioate backbone″
<220>
<221>misc_feature
<223>/note=″the second nucleotide from the 5’end of the complementary
strand linked to FITC″
<220>
<221>stem_loop
<222>(1)..(32)
<220>
<221>modified_base
<222>(1)..(3)
<223>mod_base=phosphorothioate backbone
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>loop=hexaethyleneglycol linker
<400>27
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210>28
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Ha ds
<400>28
cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210>29
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hb ds
<400>29
gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32
<210>30
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hc ds
<400>30
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210>31
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>Dbait32Hd ds
<400>31
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
Claims (6)
1.核酸分子在制备用于治疗没有接受任何直接或间接DNA损伤性治疗的增生性病症的药物中的应用,所述核酸分子选自SEQ ID No4的Dbait32H和SEQ ID No10的Dbait32Hc,其中所述Dbait32H和Dbait32Hc是发夹核酸分子,并且其中所述分子是被至少一个Ku蛋白结合的底物,并能够活化DNA-PK。
2.如权利要求1所述的应用,其中所述增生性病症是癌症。
3.如权利要求2所述的应用,其中的癌症选自恶性胶质瘤,头颈癌,结肠癌,肝癌,肺癌,皮肤癌,乳腺癌和宫颈癌。
4.如权利要求2所述的应用,其中所述分子通过口服途径或静脉内、肿瘤内或皮下注射,颅内或动脉内注射或灌注,或口服途径施用。
5.如权利要求2所述的应用,其中所述药物被配制成适于通过在每日治疗方案中肿瘤内施用有效量的每1cm3肿瘤至少0.1mg使用所述分子。
6.在细胞和/或组织中增加组蛋白H2AX的磷酸化或活化组蛋白H2AX的体外方法,包括向所述细胞和/或组织中导入如权利要求1所述的核酸。
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WO2017186882A1 (en) * | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Onxeo | A method of predicting a response to an anti-tumor treatment by means of signal interfering dna molecules |
WO2018162439A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | Onxeo | New predictive biomarker for the sensitivity to a treatment of cancer with a dbait molecule |
EP3638252A4 (en) * | 2017-06-12 | 2021-03-10 | University of Miami | STING-DEPENDENT ACTIVATORS FOR THE TREATMENT OF A DISEASE |
CN107793468A (zh) * | 2017-06-26 | 2018-03-13 | 上海悦良生物科技有限公司 | 一种检测dna损伤的方法 |
EP3461488A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-03 | Onxeo | Combination of a dbait molecule and a hdac inhibitor for treating cancer |
JP2021515580A (ja) * | 2018-03-13 | 2021-06-24 | オンクセオOnxeo | がんの治療における獲得耐性に対抗するdbait分子 |
CN109321585B (zh) * | 2018-09-30 | 2021-08-06 | 山东大学 | 一种利用t4脱氧核糖核酸连接酶提高原核微生物诱变育种效率的方法 |
MX2021007271A (es) | 2018-12-21 | 2021-07-15 | Onxeo | Nuevas moleculas de acido nucleico conjugado y sus usos. |
BR112021018168B1 (pt) | 2019-03-21 | 2023-11-28 | Onxeo | Composição farmacêutica, combinação e kit compreendendo uma molécula dbait e um inibidor de quinase para o tratamento de câncer |
WO2021148581A1 (en) | 2020-01-22 | 2021-07-29 | Onxeo | Novel dbait molecule and its use |
US20230095192A1 (en) * | 2020-03-03 | 2023-03-30 | University Of Washington | Synthetic agonists of dna-pk and their use |
US11897888B1 (en) | 2020-04-30 | 2024-02-13 | Stinginn Llc | Small molecular inhibitors of sting signaling compositions and methods of use |
TW202210633A (zh) | 2020-06-05 | 2022-03-16 | 法商昂席歐公司 | 用於治療癌症之dbait分子與kras抑制劑的組合 |
AR122644A1 (es) | 2020-06-19 | 2022-09-28 | Onxeo | Nuevas moléculas de ácido nucleico conjugado y sus usos |
AU2022409713A1 (en) | 2021-12-16 | 2024-06-20 | Valerio Therapeutics | New conjugated nucleic acid molecules and their uses |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1871350A (zh) * | 2003-10-24 | 2006-11-29 | 法国居里学院 | 用于引发肿瘤细胞致死的核酸 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005247807A (ja) * | 2004-03-08 | 2005-09-15 | Japan Science & Technology Agency | Nsaidを利用した癌治療用組成物 |
US20060276423A1 (en) * | 2005-04-18 | 2006-12-07 | Rachel Altura | Survivin-directed RNA interference-compositions and methods |
-
2007
- 2007-01-12 EP EP07300728A patent/EP1944369A1/en not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-01-11 WO PCT/EP2008/050265 patent/WO2008084087A2/en active Application Filing
- 2008-01-11 JP JP2009545182A patent/JP5462632B2/ja active Active
- 2008-01-11 CA CA2673972A patent/CA2673972C/en active Active
- 2008-01-11 AU AU2008204486A patent/AU2008204486C1/en active Active
- 2008-01-11 EP EP08701411.4A patent/EP2102343B1/en active Active
- 2008-01-11 EA EA200900989A patent/EA016053B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-01-11 US US12/520,961 patent/US8093366B2/en active Active
- 2008-01-11 CN CN200880002041.7A patent/CN101622351B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1871350A (zh) * | 2003-10-24 | 2006-11-29 | 法国居里学院 | 用于引发肿瘤细胞致死的核酸 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Li zhang, 等.Targeting Ku protein for sensitizing of breast cancer cells to DNA-damage.《International Journal of molecular medicine》.2004,(第14期),153-159. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20100022622A1 (en) | 2010-01-28 |
AU2008204486C1 (en) | 2013-05-16 |
CN101622351A (zh) | 2010-01-06 |
EP1944369A9 (en) | 2008-10-15 |
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AU2008204486A1 (en) | 2008-07-17 |
WO2008084087A2 (en) | 2008-07-17 |
AU2008204486B2 (en) | 2012-11-29 |
EP2102343A2 (en) | 2009-09-23 |
US8093366B2 (en) | 2012-01-10 |
EA200900989A1 (ru) | 2009-12-30 |
EA016053B1 (ru) | 2012-01-30 |
EP1944369A1 (en) | 2008-07-16 |
JP2010515707A (ja) | 2010-05-13 |
CA2673972A1 (en) | 2008-07-17 |
CA2673972C (en) | 2016-03-22 |
JP5462632B2 (ja) | 2014-04-02 |
WO2008084087A3 (en) | 2009-01-08 |
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