KR20150016951A

KR20150016951A - 소수성 단백질의 새로운 방출 시스템

Info

Publication number: KR20150016951A
Application number: KR1020147033477A
Authority: KR
Inventors: 모니카 캄피시; 크리스티안 구아리스; 다비드 레니에르
Original assignee: 피디아 파마슈티치 에스.피.에이.
Priority date: 2012-05-31
Filing date: 2013-05-30
Publication date: 2015-02-13
Also published as: KR102090551B1; EA031390B1; IN2014KN02739A; JP2015518042A; ES2885764T3; CA2874958A1; US9731019B2; CN104349788A; ITPD20120173A1; MX357799B; US20150290326A1; EP2854830B1; MX2014014536A; EP2854830A1; CN104349788B; WO2013179258A1; JP6247687B2; EA201491991A1; CA2874958C; HK1206993A1

Abstract

본 발명의 목적은 주로 소수성 성질을 갖는 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질과 조합된 특정 히알루론산 아미드를 포함하는, 의약의 효능 및 환자의 순응도를 증가시키는 시간의 경과에 따라 서방성, 느린 방출용 신규한 방출 시스템이다.

Description

소수성 단백질의 새로운 방출 시스템{New release system of hydrophobic proteins}

본 발명은 치료적 및/또는 생물학적 활성인 주로 소수성 성질의 단백질과 조합된 특정 히알루론산 아미드를 포함하는, 서방성, 느린 단백질 방출 시스템의 제조를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

발명의 배경

살아있는 (박테리아) 시스템을 조작함으로써 수득된 최초의 의약은 1982년에 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된, 인슐린이었다. 인간 성장 호르몬은, 전에는 시신으로부터 추출되었지만, 또한 빠르게 조작되었다. 1986년에 FDA는 B형 간염에 대한 최초의 재조합 인간 백신을 승인하였다. 생물반응기(bioreactor)로서 살아있는 시스템을 이용한 의약의 산업적 생산은 그때부터 광범위하게 되었고, 지금은 특히 비교적 낮은 제조 비용때문에, 수많은 의약을 위해 선호되는 합성 방법이다.

에리트로포이에틴 (빈혈 치료용), 인터루킨 2 (신장 암종(renal carcinoma)의 치료용), IL-1Ra (IL-1 수용체 길항제), 글루카곤, 인터페론, 인간 DNase 효소, 칼시토닌, 기타 다수를 포함하는, 치료적 (및 비-치료적) 용도를 위해 고안된 많은 인간 단백질들이 생체 공학 기법에 의해 생산된다.

상기 의약들은 주로 단백질 또는 폴리펩티드 성질을 갖고, 경구 투여는 활성 성분의 빠른 분해를 야기할 것이기 때문에 일반적으로 비경구적으로 투여된다. 그러나, 비경구 투여는 치료 효능을 보장하기 위해 요구된 반복적 투여 때문에 환자 순응도의 문제를 야기할 수 있다. 이 단백질들은 일반적으로 매우 짧은 반감기를 갖는다; 예를 들어, 성장 호르몬 hGH (유전적으로 생산됨)은 일일 1회 투여(daily injection)를 요구한다. 그 결과, 투여 횟수를 줄이고 환자 순응도를 증가시키기 위해, 많은 실험들이 증가된 반감기를 갖는 단백질/의약의 방출용 시스템을 개발하기 위해 수행되었다.

상기 방출 시스템은 의약의 활성이 유지되는 것을 보증하여야 하고, 그러므로 그 단백질/의약의 3차 구조가 온전하게 유지되는 것을 보장하여야 한다; 그러나, 유기 용매의 존재 및/또는 온도 및 pH의 변화와 같이, 그것의 제조 동안 일어날 수 있는 스트레스 상황은 단백질 사슬의 탈아미드화(deamidation) 또는 산화를 야기하여, 변성 및 치료 활성의 상실로 이어질 수 있다.

예를 들어, PLGA (폴리락트산/글리콜산) 미소구(microsphere)의 이용은 탁월한 결과를 갖는, 저분자 펩티드를 위한 방출 시스템으로 알려져 있다 (Hutchinson F.G., Biochem. Soc. Trans., 1985, 13:520-523); 그러나, hGH의 방출에서 데포(depot)를 제제화되기 위한 그의 이용은 불가능하였는데, 그 이유는 그 단백질의 변성이 염증 문제를 발생시켰기 때문이다.

독성이 없지만 전달된 활성 성분의 변화되지 않은 효능을 갖는 단백질/의약 방출 시스템을 위한 부단한 연구는 (활성 성분의 조합 때문에) 그들이 조합된 의약의 동력학에 변형을 줄 수 있는 제제를 위한 천연 폴리머의 이용으로 이어졌다.

히알루론산(Hyaluronic acid; HA)는 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민의 번갈아 있는 잔기들로 구성된 헤테로폴리사카라이드이다. 이것은 수득된 원료 및 이용된 제조 방법에 따라, 50,000 내지 13 x 10⁶ Da 범위의 분자량을 갖는 천연 직쇄 폴리머이다.

이것은 자연에서 세포 주위의(pericellular) 겔, 척추동물의 결합 조직의 기질(ground substance)(주요 성분 중 하나임), 및 관절의 윤활액, 유리 체액(vitreous humour) 및 탯줄에 존재한다.

HA는 그러므로 피부, 힘줄, 근육 및 연골과 같은 많은 조직의 세포를 위한 기계적 지지를 제공함으로써 살아있는 생물체에 중요한 생물학적 부분을 담당한다.

이것의 특성 때문에, 히알루론산은 유리(free) 라디칼에 대해 조직을 보호하고 염증 과정을 조절하고 신생혈관생성을 자극하고, 및 상처-회복의 주요 단계 모두를 조정하는데 특히 효과적이라고 증명되었다 (EP 1196179).

다양한 종류의 의약의 운반체(carrier)로서 상기 폴리뉴클레오티드의 용도는 히알루론산과의 단순 조합 또는 염화(salified)로 알려져 있고, 그 이유는 생체친화성, 생분해성, 비-면역원성, 점도 및 수화가능도(hydratability)의 특정 특성이 그것을 국부 및 전신 수준 모두에서 의약 및 분자용 방출 시스템으로서 특히 적합하게 만들기 때문이다 (EP 197718, EP 445255). 상기 폴리사카라이드는 또한 IL-1Ra (US 6,096,728), 에리트로포이에틴 (Hahn SK. et al., Int J Pharm., 2006, 28, 322:44-51), 인슐린 (Nomura M. et al., J Pharm Pharmacol, 1994, 46:768-770), 성장 호르몬 (Kim SJ. et al., Journal of Controlled Release, 2005, 104:323-335), 인터페론 및 난포-자극 호르몬 (US 8,025,900)과 같은, 특정 단백질용 약물 전달로서 연구되었다.

이 모든 경우에서, 폴리사카라이드와 의약의 조합은 운반된 단백질의 "느린" 방출로 이어졌지만, 의약의 투여 횟수를 감소시킬 만큼 충분히 느리지 않았다.

HA는 인체에 존재하는 효소 (히알루로니다제)에 의해 빠르게 분해되어, 비교적 빠르게 조합된 의약을 방출시키는 완전히 천연 폴리사카라이드이다. 이런 이유로, HA의 카르복시기 및 히드록시기는 가교된 유도체를 생기게 하기 위해 화학적으로 변형되거나 (US 4,582,865; US 4,713,448; US 5,676,964; US 4,957,74; US 5,827,937), 기타 천연 또는 합성 폴리머, 또는 다양한 크기 및 물리화학적 특징의 분자로 유도체화되었다 (US 4,851,521); 그러나, 상기 유도체의 제조 과정은 전달된(conveyed) 약리학적 제제의 완전성(integrity)에 자주 해를 끼친다.

본 발명의 목적은 주로 소수성 성질을 갖는 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질에 관련한 특정 히알루론산 아미드를 포함하는, 의약의 효능 및 환자의 순응도를 증가시키는 시간의 경과에 따라 서방성(sustained), 느린 방출용 신규한 방출 시스템이다.

본 발명에 따른, 주로 소수성 성질을 갖는 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질의 일부 예가 하기에 열거된다:

인슐린( Insulin )은 이자의 랑게르한스섬의 베타 세포에 의해 생산되는, 동화 작용(anabolic) 특성을 갖는 단백질 호르몬이다; 두개의 이황화 결합(sulphide bridge)에 의해 연결된 두개의 사슬로 이루어진다. 그의 가장 잘 알려진 기능은 혈당 수준의 조절이다. 그러므로 이 단백질은 인슐린 생산이 매우 적거나 없는 제1형 또는 제2형 당뇨를 치료하기 위해 이용된다. 그 호르몬은 피하 주사로 투여된다 (혈류로 직접 주사되는 경우, 의약의 흡수가 너무 빨라, 아마도 저혈당증으로 이어지기 때문임). 치료적 접근은 보정된 용량으로 인슐린의 결과적인(consequent) 투여로, 환자에게 수행된 혈당 검사의 다양한 일일 횟수에 기초한다(3회 이상).

성장 호르몬( Growth hormone ; GH )은 191개의 아미노산으로 이루어지고 22,005 Da인 뇌하수체 전엽의 펩티드 호르몬이다. 그의 주요 기능은 거의 모든 신체 조직의 세포의 성장 및 세포 분열을 촉진함으로써 인체의 발달 (및 많은 기타 척추동물의 발달)을 자극하는 것이다 (특히 이것은 뼈, 연골 및 결합 조직의 성장을 촉진함).

유아기 동안, GH의 과소분비(hyposecretion)는 뇌하수체성 왜소증(pituitary dwarfism)을 야기하고, 반면에 과다분비(hypersecretion)는 뇌하수체성 거인증(gigantism)을 야기한다. 과다분비가 성장이 끝난 후 시작하는 경우, 일반적으로 암 때문에, 얼굴, 손 및 발의 뼈가 상당히 커지는 것인 말단 비대증이 발달한다.

이것은 그러므로 뇌하수체성 종양을 앓고 있는 아직 성장기 및 성인의 환자에게 이용된다.

GH는 또한 GH의 결핍에 의해 야기되지 않은 질환, 예를 들어 터너 증후군, 만성 신장 질환, 특발성 저신장증(idiopathic short stature; ISS) 및 다발성 경화증을 치료하고, 비만 환자, 섬유근육통, 크론씨병 및 궤양성 대장염에서 체중 감소를 증가시키기 위해 이용된다.

hGH의 관절 내 투여는 골관절염(osteoarthritis; OA)의 치료에 탁월한 결과를 갖고, 또한 OA에 의해 야기된 연골 손상을 회복하는데 상기 호르몬의 효능을 입증하는 것으로 최근 검사되었다 (EP1153607; Kim SB et al., J Korean Med Sci., 2010, 25:776-80).

칼시토닌(Calcitonin; CT)은 인간에서, 갑상선의 여포곁 세포(parafollicular cell)(C 세포로도 알려짐)에 의해 생산되는 32개 아미노산의 폴리펩티드로 이루어진 호르몬이다. 칼시토닌의 주된 기능은 부갑상선 호르몬 파라토르몬(parathormone)의 효과를 상쇄함으로써 혈중 칼슘 농도를 낮추는 것이다. 이 칼슘 조절 메카니즘은 어류, 양서류, 조류 및 포유류에서 확인되었다. 호르몬 칼시토닌은 또한 칼슘의 관 제거(tubular elimination)을 자극하는, 신장 수준으로 작용한다. 연어 CT(salmon CT; sCT)는 일반적으로 골다공증, 고칼슘혈증(hypercalcaemia), 골 전이 및 파제트병(Paget's disease)를 치료하기 위해 이용된다.

다시 한번, 최근 실험 데이터는 골관절염의 치료에서 칼시토닌의 유효성을 입증하였다: 이것의 투여는 OA에 의해 야기된 침식에 대해 관절 표면을 보호하는 것으로 증명되었다 (Manicourt DH et al., J Musculoskelet Neuronal Interact, 2005, 5(3):285-293).

IL1 - Ra는 국부 및 전신성 염증 과정의 강력한 유도 물질인, 사이토카인 IL-1의 수용체 길항제이다. IL-1은 세균 자극 또는 다른 사이토카인에 의한 자극 후 B 및 T 림프구 및 대식세포에 의해 주로 생산된다; 이것은 또한 폐포 대식세포(alveolar macrophage), 내피, 상피 및 평활근 세포, 섬유아세포, 파골세포, 활막세포 및 많은 기타 세포 유형에 의해 분비된다. IL-1은 건선 및 패혈성 쇼크와 같은 특히 심각한 질환, 및 일부 유형의 종양의 발병기전에 관련된다. 다른 사이토카인과 조합하여, IL-1은 염증 과정의 주요 매개자 중 하나를 대표하고, 따라서 골다공증, 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis; RA), 건선성 관절염 및 골관절염(osteoarthritis; OA)과 같은 많은 질환에 관련된다: 사실, 대량의 IL-1이 류마티스성 관절염 및/또는 골관절염을 앓고 있는 환자의 윤활액에서 확인되었다.

IL-1이 연골 기질의 분해의 원인이 되는, 연골세포에 의해 생산된 프로테아제 효소인 메탈로프로테아제(metalloprotease; MMP)의 합성, 분비 및 활성화를 촉진하기 때문에, IL-1의 발현은 OA의 발병기전에 결정적이다.

OA 과정에 관련하는 모든 실험 데이터는 IL-1 및 TNFα가 관절 조직의 파괴에 관련된 주된 이화작용 시스템을 대표한다는 개념을 강하게 지지한다; 사실, IL-1의 생산 및/또는 활성화를 차단함으로써, 관절 기질의 파괴가 예방 및/또는 감소된다는 것이 입증되었다 (Caron J.P. et al., Arthritis Rheum, 1996, 39:1535-1544).

수용체 길항제 IL-1Ra를 함유하는 새로운 의약들이 현재 이 사이토카인의 효과를 상쇄하기 위해 이용되고, 그 이유는 그 수용체를 차단하는 것이 IL-1이 연관된(implicated) 질환을 치료하는 효과적인 방식이라는 것이 증명되었기 때문이다 (Burger D. et al., Cytokine Reference, Oppenheim JJ and Feldmann M, Eds. New York, London, Academic Press, 2000, p. 31-336; Jiang Y. et al., Arthritis Rheum, 2000, 43(5):1001-9).

IL-1Ra는 상기 인터루킨의 저해제로서 작용하는 단백질이다; 그러나, IL-1Ra를 함유하는 의약 (예를 들어, 인간 단백질 IL-1Ra의 재조합 비-글리코실화 형태인, 아나킨라(anakinra) 기초 키네렛(Kineret)®)은 매우 짧은 반감기를 갖고, 이것은 자주 임상적 결과에 해를 끼친다. 그러므로, 강화된(consolidated) 임상 결과를 보장하기 위해 더 긴 반감기를 보증하는, 서방성, 느린 방식으로 의약을 전달하기 위해 IL-1Ra를 함유하는 신규한 약학적 조성물을 제제화하는 것이 중요하다.

과립구- 콜로니 자극 인자( Granulocyte - colony stimulating factor ; G- CSF )는 혈류로 그 뒤에 방출되는 과립구 및 줄기 세포를 생산하도록 골수를 자극하는 174 내지 180개 아미노산의 당단백질이다. 이 성장 인자는 뉴로트로핀(neurotrophin)으로서 활성이 있다고 증명되었고, 그러므로 대뇌 허혈 및 근위축성 측색 경화증의 치료를 위해 현재 연구되고 있다. 이것은 항암화학요법과 연관된 호중구감소증(neutropenia)을 상쇄시키기 위해, 종양 환자에게 일반적으로 이용된다; 마지막으로, 최근 실험 연구들은 G-CSF으로 정맥 주사 치료가 손상된 심장 세포의 재생을 촉진한다는 것을 입증하였다.

혈소판-유래 성장 인자( Platelet - derived growth factor ; PDGF )는 A 및 B로 표기되는, 이황화 결합에 의해 연결된 두개의 폴리펩티드로 구성된 이량체로 이루진 생물학적 활성 단백질이다. 이것은 주로 거대핵세포(megakaryocyte)에서 합성되고, 인간에서 중간엽 기원의 세포에 대한 주된 혈청 세포분열제(mitogenic agent)를 대표한다. 이것은 기질 결합 조직(stromal connective tissue) 형성의 매개자이기 때문에 이것은 상처/궤양의 치유를 촉진하기 위해 이용되고, 이 모든 이유로, 또한 새로운 골 조직의 형성을 촉진하기 위해 현재 이용된다.

형질전환 성장 인자-β(Transforming growth factor -β; TGF β)는 면역계를 조절하고, 및 조직 재생, 세포 분화 및 배발생(embryogenesis)에 결정적인 역할을 수행하는 펩티드이다. 이것은 피부 상처/궤양의 치유를 증가시키고 골절의 폐쇄(closure)를 촉진하기 때문에 주로 상처-치유제로서 이용된다; 이런 이유로 또한 골다공증 및 OA 의 치료에도 이용된다. 마지막으로, 실험 결과는 TGFβ가 또한 심장에서 허혈성 손상 후 심장보호 특성을 갖는다는 것을 입증한다.

상피세포 성장 인자( Epidermal growth factor ; EGF )는 성장 조절, 및 세포 증식 및 분화에 중요한 부분을 담당하는 성장 인자이다. 인간 EGF는 53개 아미노산 잔기 및 3개의 분자내 이황화 결합으로 이루어진, 6045 달톤의 단백질이다. 이것은 혈소판, 대식세포, 소변, 침, 젖(milk) 및 혈장에서 확인된다.

이것은 위장관 점액 세포의 증식을 자극하기 때문에 위장보호제로서 이용되는 단백질이다; 이것은 피부, 정맥 및 기타 유형의 상처/궤양의 치료에서 새로운 육아 조직(granulation tissue)의 형성을 자극하기 때문에 피부 조직 재생을 촉진하기 위해 이용된다. 마지막으로, EGF의 국부 적용은 예를 들어 각막 수술 후 또는 각막염과 같은 퇴행성 질환의 경우에, 손상된 각막 조직의 재생에 탁월한 결과를 제공하였다.

혈관 내피 성장 인자( Vascular endothelium growth factor -B; VEGF -B)는 맥관형성(vasculogenesis)(즉, 배아기에서 순환계의 새로운 것으로부터 발생(ex novo genesis)), 신경형성(neurogenesis) 및 신생혈관형성(angiogenesis)의 모두에 관련된 단백질 성장 인자이다. 이것은 또한 NMDA-매개 허혈성 손상에 대해 신경 세포를 보호하는 신경보호제이다.

에리트로포이에틴( Erythropoietin ; EPO )은 인간에서 신장, 및, 더 적은 정도로, 간 및 뇌에 의해 생산된 당단백질 호르몬이고, 그 주된 기능은 적혈구생성(erythropoiesis)(골수에 의한 적혈구의 생산)을 조절하는 것이다.

EPO는 또한 실험실에서 생산되고 신장 질병 또는 혈액 질환을 앓고 있는 환자에서 빈혈을 치료하거나, 또는 암 환자에서 항암화학요법의 투여 후 회복을 가속화시키기 위한 의약으로서 이용된다. 최근 연구에서, EPO는 항-염증제로서 신경보호 역할을 담당하는 것이 관찰되었다.

에리트로포이에틴은 약 30000 D의 당단백질 분자이다. 마지막으로, 1989년 이래로, EPO는 투석을 하는 빈혈 환자를 위한 의약으로서 이용가능하게 되었다. 그 뒤에, 그의 용도는 또한 삶의 질을 향상시키는데 도움이 되는, 보수적 치료를 하는 만성 신부전을 갖는 환자에게 확대되었다. 에리트로포이에틴의 약학적 생산은 재조합 DNA 방법에 의해 수행된다.

신경 성장 인자( Nerve growth factor ; NGF )는 갑상선 및 뇌하수체에 의해, 시상하부에서 분비되는 단백질이다; 또한 평활근 세포 및 섬유아세포에 의해 생산된다. 활성 형태는 두개의 118 개의 아미노산 단백질 사슬을 결합하는 두개의 이황화 결합을 갖는 동질이량체(homodimer)인, 26 KDa의 NGFβ이다. 말초 NS의 신경 세포 및 CNS의 콜린성 신경 세포의 분화 및 기능성에 기여한다. 이것은 그러므로 치매와 같은 퇴행성 신경 질환을 치료하기 위해 이용된다; NGF는 또한 녹내장을 치료하는데 유용하다고 증명되었다.

트랜스페린(Transferrin)은 혈류에서 주된 철 운반 단백질이다. 트랜스페린은 간 및 단핵구-대식세포계에 의해 합성되고, 장 수준에서 흡수되고 적혈구의 분해로부터 기원하는 철분에 매우 안정하지만 가역적인 방식으로 결합하고, 그것을 이용 (특히 골수) 및 저장 (특히 간)의 부위에 운반한다.

구조적 관점으로 이것은 약 80 KD의 분자량을 갖는 679개의 아미노산 폴리펩티드에 의해 형성된 당단백질이고, 제2 철 이온(Fe³ ⁺)에 대해 2 개의 결합 부위를 갖지만 제1 철 이온(Fe² ⁺)에 대해서는 친화도를 갖지 않는다; 이것의 반감기는 약 8 일이다.

트랜스페린은 주로 간에서 합성되고, 혈액에서 그의 기준값(reference value)은 200-360 mg/dL이다. 트랜스페린 수준은 피임약의 사용 동안, 임신 동안, 및 철분 결핍의 경우에 증가한다. 역으로, 그들은 신증후군, 간 질병, 영양실조, 만성 염증성 질환, 종양, 및 철분 또는 코르티손으로의 치료의 경우에 떨어진다. 생리적 감소는 신생아기 또는 노년기에 일어날 수 있다.

TIMP는 메탈로프로테아제를 저해하는 단백질, 즉 연골 기질의 분해에 관련된 효소이다; TIMP 패밀리는 연골세포, 섬유아세포, 윤활막세포, 골아세포, 신경 세포, 대식세포, 평활근 세포, 간세포 등에 의해 생산된 형태 TIMP-2, TIMP-3 및 TIMP-4를 포함한다.

그들은 그 결과 연골세포 및 OA에 의해 야기된 연골 침식에 대한 보호 기능을 담당한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 치료적 및/또는 생물학적 활성인, 주로 소수성 성질의 단백질과 조합된 (즉 화학적으로 결합되지 않은) 특정 히알루론산 아미드를 포함하는, 서방성, 느린 단백질 방출 시스템의 제조를 위한 신규한 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 시스템은 하기를 야기한다:

·긴 시간 동안 ("있는 그대로(as is)" 투여된 동일한 단백질과 비교함), 상기 단백질의 서방성 방출. 이 지속적인 방출은 (일반적으로 "있는 그대로" 투여된 의약의 경우인 경우와 같이) 그 투약 바로 다음의 기간에 대량으로 방출되지 않기 때문에, 의약의 치료적 창(therapeutic window)을 증가시킨다. 특정 HA 아미드와 조합된 방출 시스템으로서 투여는 방출된 양 (시간에 관함) 및 의약의 방출의 기간 (그러므로 시간의 경과에 따라 방출된 단백질의 양의 점진적인 증가가 수득되고, 그것이 "있는 그대로" 투여된 경우 일어나는 것을 초과하는 최종 방출 기간으로 이어짐)을 조정한다; 결론으로, 그의 치료적 효능 프로파일처럼, 그 단백질의 동역학적 방출 프로파일 유의하게 변형된다.

·신규한 방출 시스템은 생체친화성 및 생분해성이기 때문에 비-독성이고, 치료적 활성의 유지를 보증하는, 운반된 단백질/의약의 느린 방출을 결정한다; 어떤 변성을 거치지 않은, 그 활성 성분의 3차 구조의 완전성(integrity)이 그러므로 보장된다.

·본 발명에 따른 방출 시스템은 특정 HA 아미드 및 그들과 조합/혼합된 전달된 단백질의 조합에 의해 형성되기 때문에 전달된 단백질의 화학적 변형을 야기하지 않는다. 그러므로 공유 화학 결합이 운반체와 의약 간에 확립되지 않고, 따라서 단백질/의약의 구조적 완전성을 보증한다.

·이러한 신규한 특징은 상당히 환자 순응도를 증가시키고, 그 이유는 그 의약이 신규한 약물동력학에 따라, 및 그 결과 상이한 용량으로 투여될 수 있기 때문이다: 더 큰 효능 및 더 적은 부작용으로 이어지는, 투여 간에 더 긴 간격 및 투여된 의약의 양의 변화.

본 발명의 목적을 형성하는 약리학적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 소수성의 총 평균(Grand Average of Hydropathy; GRAVY) 지수에 따라 측정된 주로 소수성 특징을 가져야 한다; 펩티드 또는 단백질의 GRAVY 값은 그 단백질에 존재하는 모든 아미노산의 소수성 값의 합을 그 단백질 서열에서 그의 잔기의 수로 나누어 산출된다. 모든 아미노산은 이소류신(분자에 명확한 비-극성, 및 그 결과 소수성 성질을 주는 방향족 탄화수소 라디칼에 의해 형성된 잔기를 갖는 아미노산)에 대한 4.5 내지 양으로 하전된 잔기를 갖는 아미노산인 아르기닌에 대한 -4.5의 범위인, 정해진 소수성 지수를 갖는다 (Kyte J. et al., J. Mol. Biol., 1982, 157:105-132). 이 눈금은 더 높은 소수성 지수일수록, 분석된 아미노산이 더 큰 소수성이라는 것을 표시한다 (도 1). 분석된 단백질의 GRAVY 값을 쉽게 결정하기 위해, ProtParam (Gasteiger E. et al., Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server , JM Walker ed., The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press, 2005, 571-607) 프로그램이 일반적으로 이용되고, 이것은 그의 서열을 분석함으로서 연구된 단백질의 다양한 물리화학적 특성을 제공한다; 상기 단백질 서열이 입력되는 경우, 그 프로그램은 소수성의 정도가 측정된 단백질의 GRAVY 값을 산출한다.

본 발명에 따른, "주로 소수성 성질을 갖는 단백질(proteins with a mainly hydrophobic nature)"은 적어도 -0.5 내지 양의 값의 범위인 GRAVY 지수를 갖는 것을 의미한다: 다시 말하면, GRAVY 지수가 높을수록, 분석된 단백질의 소수성은 커진다.

본 발명이 관련한 주로 소수성 성질을 갖는 단백질의 일부 예가 하기 열거된다:

·인슐린: GRAVY 지수 = 0.2

·인간 성장 호르몬, hGH: GRAVY 지수 = -0.3

·칼시토닌, sCT (연어 CT(salmon CT)): GRAVY 지수 = -0.5

·IL-1, IL-1Ra 수용체 길항제: GRAVY 지수 = -0.4

·과립구-콜로니 자극 인자, G-CSF: GRAVY 지수 = 0.2

·혈소판-유래 성장 인자, PDGF: GRAVY 지수 = -0.5, PDGF-BB = -0.1이 바람

직함.

·형질전환 성장 인자 TGF-β: GRAVY 지수 = -0.3

·상피세포 성장 인자, EGF: GRAVY 지수 = -0.5

·혈관 내피 성자 인자 B, VEGF-B: GRAVY 지수 = -0.2

·에리트로포이에틴 (인간) 또는 EPO: GRAVY 지수 = -0.03

·신경 성장 인자 또는 NGFβ: GRAVY 지수 = -0.3

·트랜스페린 (인간): GRAVY 지수 = -0.2

·메탈로프로테아제-2의 조직 저해제 (인간), TIMP-2: GRAVY 지수 = -0.2

·메탈로프로테아제-3의 조직 저해제 (인간), TIMP-3: GRAVY 지수 = -0.3

·메탈로프로테아제-4의 조직 저해제 (인간), TIMP-4: GRAVY 지수 = -0.18.

출원인은 하기 열거된, 본 발명의 목적을 형성하는 히알루론산 아미드가 그것에 함유된 소수성 성질을 갖는 단백질의 서방성, 느린 방출을 결정하는 방출 시스템을 형성하고, 반면에 동일한 아미드와 조합된, 주로 친수성 성질을 갖는 단백질은 시간의 경과에 따라 서방성, 느린 방출에 적합한 방출 시스템을 형성하지 않는다는 것을 입증하였다.

본 발명의 목적을 형성하는 상기 방출 시스템을 형성하는데 적합한 HA 아미드는 하기이다:

·HA 헥사데실아미드: 7 내지 14%, 바람직하게는 8 내지 9%의 범위인 몰 아미드화 백분율(molar amidation percentage)(1H-NMR에 의해 결정됨)을 갖는, 헥사데실아민에 의한 HA 아미드;

·HA 옥틸아미드: 10 내지 15%, 바람직하게는 10 내지 11%의 범위인 몰 아미드화 백분율(1H-NMR에 의해 결정됨)을 갖는, 옥틸아민에 의한 HA 아미드;

·HA 도데실아미드: 10 내지 15%, 바람직하게는 10 내지 11%의 범위인 몰 아미드화 백분율(1H-NMR에 의해 결정됨)을 갖는, 도데실아민에 의한 HA 아미드;

·HA 터트 - 부틸아미드: 7 내지 12%, 바람직하게는 7 내지 8%의 범위인 몰 아미드화 백분율(1H-NMR에 의해 결정됨)을 갖는, 터트-부틸아민에 의한 HA 아미드;

·HA 벤질아미드: 7 내지 15%, 바람직하게는 8 내지 9%의 몰 아미드화 백분율(1H-NMR에 의해 결정됨)을 갖는, 벤질아민에 의한 HA 아미드.

상기 아미드의 제조를 위해 본 발명에 이용된 HA는 닭볏(cockscombs)(EP 138572)으로부터 추출 또는 발효 (예를 들어 당업자에게 알려진 바와 같이 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi)로부터)와 같은 임의의 원료로부터, 또는 기술적 방법 (예를 들어 바실러스로부터, WO 2012/032154)에 의해 유래될 수 있고, 400 내지 3x10⁶Da, 바람직하게는 50 내지 730 KDa, 750 내지 1230 KDa 또는 1500 내지 2500 KDa, 및 보다 바람직하게는 150 내지 250 KDa 및/또는 500 내지 730 KDa의 중량-평균 분자량(한계 점도수(limiting viscosity number)에 의해 결정됨: Terbojevich et al., Carbohydrate Research, 1986, 149:363-377 방법)을 가질 수 있다.

150 내지 250 KDa 또는 500 내지 730 KDa의 중량-평균 분자량을 갖는 HA 헥사데실아미드가 바람직하다.

본 발명의 목적을 형성하는, 상기 열거된 HA 아미드는 EP 1095064에 기재된 바와 같이 제조될 수 있고, 또한 이것은 약리학적 활성 물질을 위한 방출 시스템의 형성을 포함하지만, 이용된 의약의 화학적 종류 및 선택된 아미드의 유형 간의 구별을 만드는 것 없이, 그리고 무엇보다, 수득된 효과를 기재함 없이, 그의 상이한 용도를 기재한다. 그러나, 치료적 및/또는 생물학적 할성인 주로 소수성 성질 (및 그러므로 -0.5을 초과하는 GRAVY 지수)을 갖는 단백질과 조합된, 특정 아미화 백분율 및 선택된 MW 간격을 갖는 특정 HA 아미드, 예를 들어 헥사데실아미드, 옥틸아미드, 도데실아미드, 터트-부틸아미드 및 벤질아미드는 상기 단백질을 위한 신규한 서방성, 느린 방출 시스템의 제조에 유용하다는 것이 지금 확인되었다.

하기 단백질들이 바람직하다:

·인슐린

·hGH

·sCT

·IL-1Ra

·G-CSF

·PDGF, 바람직하게는 PDGF-BB

·TGF-β

·EGF

·VEGF-B

·EPO

·NGFβ

·트랜스페린

·TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4.

상기 단백질들은 재조합 DNA 기법 또는 조직으로부터 추출에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 추가적인 목적은 하기를 포함하는 신규한 방출 시스템이다:

(필요한 경우) 안정화제 및 부형제와 아마도 조합된,

1. HA 헥사데실아미드, 옥틸아미드, 도데실아미드, 터트-부틸아미드 또는 벤질아미드, 와 조합된

2. 인슐린, hGH, sCT, IL-1Ra, G-CSF, PDGF, 바람직하게는 PDGF-BB, TGF-β, EGF VEGF-B, EPO, NGFβ, 트랜스페린, TIMP-2, TIMP-3 및 TIMP-4.

특히, 본 발명의 목적은 하기를 포함하는 시스템이다:

1. HA 헥사데실아미드, 바람직하게는 150 내지 250 KDa, 또는 500 내지 730 KDa의 중량-평균 분자량을 갖는 HA 헥사데실아미드.

2. hGH 또는 sCT,

3. 아마도 안정화제 및 부형제와 조합됨.

신규한 시스템은 그들이 그들과 조합된 단백질/의약의 치료적 창을 변경하기 때문에 그들이 함유한 활성제의 서방성, 느린 방출에 이용가능하다: 그러므로 더 나은 환자 순응도로 이어지는, 상이한 투여 요법(dosage regimen)이 가능하다.

방출 시스템에 존재하는 단백질은 시스템의 이용을 결정할 것이다. 예를 들어, hGH 또는 sCT를 갖는 HA 헥사데실아미드를 포함하는 방출 시스템은 바람직하게는 OA, 류마티스성 및 건선성 관절염, 및 골다공증을 치료하기 위한 관절 내 투여에 의해 이용될 것이다.

출원인은 이 신규한 방출 시스템이 더 큰 치료 효과로 이루어지지만, 활성제가 혈장으로 통과하게 하지 않는(그럼으로써 관절 내 그 농도가 감소함), 치료된 관절의 윤활액에서 hGH의 지속적인 방출을 결정하고, 따라서 그 의약의 전신성 부작용을 예방한다는 것을 입증하였다.

본 발명의 목적은 또한 하기를 포함하는 시스템이다:

· 인슐린과, 앞서 열거되고 기재된 하나 이상의 HA 아미드; 이 신규한 시스템은 의약의 더 낮은 투여를 요구하는 당뇨 질환의 치료를 위해 인슐린의 느린 방출에의 신규한 데포(depot)로서 출원인에 의해 기재된다.

본 발명의 목적은 또한 하기를 포함하는 시스템이다:

· 앞서 열거되고 기재된 하나 이상의 HA 아미드; 바람직하게는 PDGF (바람직하게는 PDGF-BB), TGF-β, EGF 또는 VEGF-B와 같은 단백질과 조합된, 주사, 관절 내 또는 국부 투여 또는 경구 투여용 헥사데실아미드.

상기 기재된 단백질 인자(PDGF, TGF-β, EGF 및 VEGF-B)는 그 존재가 공지된 성장 인자이고, 특히 인간 혈소판-풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP)에 농축된다. 이들을 함유하는 신규한 방출 시스템은 바람직하게는 OA에 의해 야기된 관절 손상, 건염(tendinitis)을 치료하기 위해, 심장 근육 손상을 회복시키기 위해, 새로운 골 조직의 형성을 촉진시켜 골 열상(laceration)/골절/골강을 회복시키기 위해, 및 마지막으로, 새로운 결합 조직을 형성을 촉진하여 피부 궤양/상처/열상의 치유에 이용가능할 것이다.

본 발명의 다른 목적은 또한 하기를 포함하는 시스템이다:

·앞서 열거되고 기재된 하나 이상의 HA 아미드, 바람직하게는 메탈로프로테아제 저해제 TIMP-2, TIMP-3 또는 TIMP-4와 조합된, 주사, 바람직하게는 관절 내 투여용 헥사데실아미드.

신규한 방출 시스템은 바람직하게는 OA에 의해 야기된 관절 연골 손상을 치료하고 골연골 침식을 회복시기기 위해 이용가능할 것이다.

신규한 방출 시스템의 제조예 및 본 발명에 따른 상기 시스템의 효능을 입증하기 위해 출원인이 수행한 실험이 하기 기재된다.

실시예 1: 8 내지 9%의 몰 아미드화 백분율을 갖는, 500 내지 730 kDa 의 중량-평균 MW 을 갖는 HA 의 헥사데실아미드 유도체, Hyadd4 의 합성

500 내지 730k Da의 MW을 갖는 발효 기원의 5.00 g의 히알루론산 소듐 염을 250 ml의 물에 용해시키고, 얻어진 용액을 테트라부틸암모늄의 형태로 100 ml의 Dowex 레진에 미리-충진된(pre-packed) 유리 컬럼을 통해 스미게 하였다(percolated). HA 용액을 TBA 염의 형태로, 용출시키고, 수집하고 동결-건조시켰다.

이렇게 수득된 2 g의 생성물을 200 ml의 디메틸 술폭시드(dimethyl sulphoxide; DMSO)에 용해시키고, 64 ㎕의 메탄술폰산을 첨가하였다; 53 mg의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 약한 교반 하에 두었다. 998 mg의 헥사데실아민을 그 후에 첨가하고, 아미드화 반응을 42℃에서 24 시간 동안 수행하였다.

5 ml의 NaCl 포화 수성 용액을 첨가하여 반응을 중단시키고, 30 분 후, 1.5 부피의 무수 에탄올(absolute ethanol)을 첨가하여 수득된 유도체를 분리하였다. 침전물을 에탄올/H2O 80:20 및 마지막으로 무수 에탄올로 세척한 후, 40℃에서 고진공(high vacuum) 하에서 건조시켰다.

1.3 g의 유도체를 수득하였고, 이것의 아미드화 정도를 1H-NMR에 의해 결정하였다.

실시예 2: 10 내지 11%의 몰 아미드화 백분율을 갖는, 500 내지 730 kDa 의 중량-평균 MW을 갖는 HA 의 옥틸아미드 유도체, Hyadd2 의 합성

500 내지 730k Da의 MW을 갖는 발효 기원의 5.00 g의 히알루론산 소듐 염을 250 ml의 물에 용해시키고, 얻어진 용액을 테트라부틸암모늄의 형태로 100 ml의 Dowex 레진에 미리-충진된 유리 컬럼을 통해 스미게 하였다. HA 용액을 TBA 염의 형태로, 용출시키고, 수집하고 동결-건조시켰다.

이렇게 수득된 2 g의 생성물을 200 ml의 디메틸 술폭시드(DMSO)에 용해시키고, 64 ㎕의 메탄술폰산을 첨가하였다; 61.4 mg의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 약한 교반 하에 두었다. 330 mg의 옥틸아민을 그 후에 첨가하고, 아미드화 반응을 42℃에서 24 시간 동안 수행하였다.

5 ml의 NaCl 포화 수성 용액을 첨가하여 반응을 중단시키고, 30 분 후, 1.5 부피의 무수 에탄올을 첨가하여 수득된 유도체를 분리하였다. 침전물을 에탄올/H2O 80:20 및 마지막으로 무수 에탄올로 세척한 후, 40℃에서 고진공 하에서 건조시켰다.

1.2 g의 유도체를 수득하였고, 이것의 아미드화 정도를 1H-NMR에 의해 결정하였다.

실시예 3: 10 내지 11%의 몰 아미드화 백분율을 갖는, 500 내지 730 kDa 의 중량-평균 MW을 갖는 HA 의 도데실아미드 유도체, Hyadd3 의 합성

이렇게 수득된 2 g의 생성물을 200 ml의 디메틸 술폭시드(DMSO)에 용해시키고, 64 ㎕의 메탄술폰산을 첨가하였다; 54.2 mg의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 약한 교반 하에 두었다. 448 mg의 도데실아민을 그 후에 첨가하고, 아미드화 반응을 42℃에서 24 시간 동안 수행하였다.

1.25 g의 유도체를 수득하였고, 이것의 아미드화 정도를 1H-NMR에 의해 결정하였다.

실시예 4: 7 내지 8%의 몰 아미드화 백분율을 갖는, 500 내지 730 kDa 의 중량-평균 MW 을 갖는 HA 의 터트 - 부틸아미드 유도체, Hyadd6 의 합성

이렇게 수득된 2 g의 생성물을 200 ml의 디메틸 술폭시드(DMSO)에 용해시키고, 64 ㎕의 메탄술폰산을 첨가하였다; 53 mg의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 약한 교반 하에 두었다. 178 mg의 터트-부틸아민을 그 후에 첨가하고, 아미드화 반응을 42℃에서 24 시간 동안 수행하였다.

실시예 5: 8 내지 9%의 몰 아미드화 백분율을 갖는, 500 내지 730 kDa 의 중량-평균 MW 을 갖는 HA 의 벤질아미드 유도체, Hyadd1 의 합성

이렇게 수득된 2 g의 생성물을 200 ml의 디메틸 술폭시드(DMSO)에 용해시키고, 64 ㎕의 메탄술폰산을 첨가하였다; 54.0 mg의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 약한 교반 하에 두었다. 260 mg의 벤질아민을 그 후에 첨가하고, 아미드화 반응을 42℃에서 24 시간 동안 수행하였다.

실시예 6: 10:1 및 20:1 w/w의 비율로 HA 및 hGH 를 함유하는 제제의 제조

150 내지 250 KDa (LMW), 및 500 내지 730k Da (MMW)의 MW을 갖는 발효 기원의 8 mg의 히알루론산 소듐 염을 1 ml의 pH=7.4인 인산염 완충액에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 0.8 mg의 hGH를 10:1의 폴리사카라이드/단백질 중량비를 수득하기 위해 첨가하고, 0.4 mg의 hGH를 20:1의 폴리사카라이드/단백질 중량비를 수득하기 위해 첨가하였다. 조성물이 균일하도록 두가지 성분을 적절하게 혼합하였다. 충진(loading)은 혼합물을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선(calibration curve)을 이용하여, GH 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출하였다.

실시예 7: 10:1 w/w의 비율로 HA 의 헥사데실아미드 및 hGH 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 HA의 헥사데실아미드 유도체, Hyadd4를 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 수성 용액에 미리 용해된(pre-dissolved) 0.8 mg의 hGH를 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, GH 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 8: 10:1 w/w인, HA 의 터트 - 부틸아미드 및 hGH 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 4에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd6을 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다(8 mg/ml). 용해가 완료되면, 수성 용액에 미리 용해된 0.8 mg의 hGH를 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, GH 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 9: 10:1 w/w인, HA 의 옥틸아미드 및 hGH 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 2에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd2를 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다(8 mg/ml). 용해가 완료되면, 수성 용액에 미리 용해된 0.8 mg의 hGH를 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, GH 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 10: 10:1 w/w인, HA 의 도데실아미드 및 hGH 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd3을 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다(8 mg/ml). 용해가 완료되면, 수성 용액에 미리 용해된 0.8 mg의 hGH를 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, GH 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 11: 10:1 w/w인, HA 의 벤질아미드 및 hGH 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd1을 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다(8 mg/ml). 용해가 완료되면, 수성 용액에 미리 용해된 0.8 mg의 hGH를 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, GH 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 12: 10:1 w/w의 비율로 HA 의 헥사데실아미드 및 sCT 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd4를 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 인산염 완충액에 미리 용해된 0.8 mg의 연어 칼시토닌(salmon calcitonin; sCT)을 10:1의 w/w 비율을 수득하기 위해 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, 칼시토닌 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 13: 10:1 w/w인, HA 의 헥사데실아미드 및 IL -1 Ra 에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd4를 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 수성 용액에 미리 용해된 0.8 mg의 IL-1Ra을 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, IL-1Ra 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 14: 10/1 w/w인, HA 의 헥사데실아미드 및 RNase 에 기초한 제제의 제조

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd4를 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 인산염 완충액에 미리 용해된 0.8 mg의 RNase를 첨가하고, 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, RNase 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 15: 10:1 w/w인, HA 의 헥사데실아미드 및 인슐린에 의해 형성된 방출 시스템을 함유하는 제제의 제조

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd4를 1 ml의 pH=6.9인 인산염 완충액에 용해시켰다. 용해가 완료되면, 인산염 완충액에 미리 용해된, 0.8 mg의 인슐린을 첨가하고, 단백질에 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다. 겔의 충진은 그것을 완충액 중 1:10으로 희석하고, 검정 곡선을 이용하여, 인슐린 농도 값을 제공하는 280 nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 산출되었다.

실시예 16: HA 또는 HA 아미드로 제제화된 hGH 의 방출의 연구

실시예 6 내지 11에 기재된 바와 같이 제조된, 제제를 공여체 구획(donor compartment)으로부터 그의 방출을 모니터링하기 위해 100 kDa의 컷-오프(cut-off)를 갖는 투석 튜브로 도입하고 약한 교반 하에서 pH 7의 인산염 완충액에 담갔다. 비교 목적을 위해, 0.8 mg의 hGH를 1 ml의 인산염 완충액(PBS)과 혼합하고, 제제를 투석 튜브로 도입하였다.

가라앉는 조건을 모든 실험에서 유지하였다. 미리-설정된 시간에, 50 ㎕ 분액(aliquot)을 공여체 구획으로부터 얻고 시간의 경과에 따라 단백질 함량을 결정하기 위해 1:10으로 희석하였다. 분석은 남아있는 단백질 및, 만약에 있다면, 그의 분해의 양을 결정하기 위해 280 nm에서 UV 판독(reading) 및 220 nm에서 RP-HPLC에 의해 병렬적으로 수행하였다. 산란 측정(Scattering measurement)을 또한 제제화된 단백질의 응집을 연구하기 위해 얻었다. 마지막으로, 방출된 단백질의 양이 공여체 구획으로부터 사라진 양에 상응하는지를 체크하기 위해 공여체 구획으로부터 시료를 얻었고, 방출된 GH가 어떤 구조적 분해를 거치지 않는다는 것을 확인하기 위해 질량 분광광도 측정(Esi-Tof)을 얻었다. 방출 곡선은 시간의 경과에 따라 방출된 단백질의 백분율을 나타냄으로써 구성되었다. 도 2, 3, 4 및 5.

결과

도 2는 Hyadd4 및 hGH에 의해 형성된 시스템 대 PBS에서 제조된 동일한 단백질에 해당되는 대조군에 의해 결정된 hGH의 방출 프로파일을 나타낸다.

도 3은 LMW-HA 및 MMW-HA와 조합하여 제제화된 hGH 단백질의 방출 프로파일을 나타낸다: 모든 경우에서 HA 대 hGH의 두가지 상이한 중량비(10:1 및 20:1)가 시험되었고, 그 이유는 이 실험에서, 출원인은 심지어 상이한 MW을 갖는 대량의 HA와, 소수성 성질을 갖는 단백질의 조합이 단백질의 방출 프로파일 대 PBS, 즉 수성 용매에서 그것을 제조함으로써 수득된 프로파일에 어떠한 변화를 이끌어내지 않는다는 것을 입증하는 것을 의도하기 때문이다.

도 4는 본 발명에 따른 아미드에 의해 형성된 방출 시스템으로부터 hGH와 PBS 중 hGH에 해당되는 대조군으로 hGH의 방출 프로파일을 비교한다.

도 5는 앞서 언급된 대조군에 비해 다시, 본 발명에 따른 아미드에 의해 형성된 방출 시스템으로부터 50%의 hGH의 방출 시간을 나타낸다.

도 3이 도 2 및 도 4와 비교된다면, 주로 소수성 성질을 갖는 단백질(이 경우 hGH)을 갖는 HA 아미드(상기 기재되고 청구됨)에 의해 형성된 방출 시스템이 PBS에서 분석된 단백질에 해당되는 대조군에 비해, 및 상이한 MW 및 상이한 중량비를 갖는 HA에서 제제화된 단백질에 비해, 명확하게 유의한 방식으로 단백질의 시간의 경과에 따라 서방성, 느린 방출을 야기한다는 것이 보일 것이다. 그러므로 연구된 소수성 단백질의 방출 프로파일에서 변형을 결정하는 것은 폴리사카라이드의 농도 및/또는 MW이 아니라, 폴리머의 화학적 성질이다. 이 모든 것은 50%의 hGH의 방출 시간을 비교하는 도 5에서 훨씬 더 명확하다: 그 도는 본 발명이 관련된 신규한 방출 시스템이 대조군(PBS 중 hGH)에 비해 3 배까지 방출 시간이 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 17: sCT , IL1 - Ra 및 인슐린의 방출 대 친수성 단백질 RNase A의 방출 프로파일의 연구

실시예 12 내지 15에 기재된 바와 같이 제조된 각각의 제제를 100 kDa의 컷-오프를 갖는 투석 튜브로 도입하고 약한 교반 하에서 pH 7의 인산염 완충액에 담갔다. 비교 방법으로서, 0.8 mg의 칼시토닌, IL-1Ra, 인슐린 또는 RNase를 1 ml의 인산염 완충액과 혼합하고, 제제를 시간의 경과에 따라 공여체 구획으로부터 그의 방출을 모니터링하기 위해 투석 튜브로 도입하였다.

가라앉는 조건을 모든 실험에서 유지하였다. 미리-설정된 시간에, 10 ㎕ 분액을 공여체 구획으로부터 얻고 시간의 경과에 따라 단백질 함량을 결정하기 위해 1:10으로 희석하였다. 분석은 남아있는 단백질의 양을 결정하기 위해 280 nm에서 UV 판독에 의해 병렬적으로 수행하였다. 산란 측정을 또한 제제화된 단백질의 응집을 연구하기 위해 얻었다. 마지막으로, 방출된 단백질의 양이 공여체 구획으로부터 사라진 양에 상응하는지를 체크하기 위해 공여체 구획으로부터 시료를 얻었다. 시간의 경과에 따라 방출된 단백질의 백분율 대 그의 대조군을 나타내는, 방출 곡선이 구성되었다.

단백질 RNase A는 GRAVY 지수 = -0.67를 갖고 그 결과 주로 소수성 단백질이 아니라, 친수성 단백질로 분류될 수 있다. 그의 방출 프로파일을 주로 소수성 성질을 갖는 단백질과 조합된 Hyadd 방출 시스템으로부터 기인한 것과 비교하여, 그 차이를 입증하기 위해, 하기에 기재된다.

결과

도 6 내지 8은 분석된 주로 소수성 성질의 3 종의 단백질의 방출 프로파일을 나타낸다: 세 경우 모두에서 상기 단백질과 조합된, HA 헥사데실아미드에 의해 형성된 시스템은 대조군 보다 훨씬 더 긴 시간 동안 그의 서방성, 느린 방출을 결정한다.

역으로, 도 9는 주로 친수성 성질 및 GRAVY 지수 = -0.67을 갖는 단백질 RNase와 동일한 중량비 (10:1 w/w)로 같은 헥사데실아미드의 조합은 PBS에서 제제화된 경우 같은 단백질에 의해 생산된 것과 동일한 방출 프로파일을 결정한다는 것을 입증한다.

실시예 18: 골관절염을 갖는 환자로부터 유래하는 인간 윤활액( LS )으로 hGH 방출의 연구

호르몬 hGH을 다른 윤활 단백질의 존재에서 명확하게 인식될 수 있도록 우선 형광 프로브(Cy5.5)에 공유 결합시켰다. 이러한 목적으로, 1.5 mg의 hGH을 2 ml의 pH 8의 붕산염 완충액에 용해시키고, 여기에 60 ㎕의 DMSO에 미리 용해된 2 mg의 Cy5.5를 첨가하였다. 표지 반응을 빛을 차단하고, 약한 교반 하에서, 18 시간 동안 수행하였다. 그 후 정제를 인산염 완충액에 대해 4 일 동안 및 MilliQ 물에 대해 1일 동안 투석하여 수행하였다. 표지된 단백질을 그 후 그 순도를 확인하기 위해 겔 여과로 분석하였다.

Hyadd4 및 hGH-Cy5.5에 기초한 제제를 10:1의 중량비를 갖는 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다. 조성물이 균일하고 단백질에 겔에 가두어지도록 두 성분을 적절하게 혼합하였다. 이렇게 수득된 겔을 100 kDa의 컷-오프를 갖는 투석 튜브로 도입하고, PBS 및 골관절염을 갖는 환자로부터 유래하는 윤활액으로 이루어진 매질(medium)(v/v 1:1)에 담그고, 약한 교반 하에서 유지하였다.

수용체 구획으로의 시간의 경과에 따라 방출된 단백질의 양을 미리-설정한 시간에 결정하였다. 분석은 hGH 함량을 결정하는 것뿐만 아니라 단백질이 분해되지 않았다는 것을 체크하기 위해, 형광 검출기가 달린 RP-HPLC으로 수행하였다. 48 시간까지 시간의 경과에 따라 방출된 단백질의 백분율을 나타내는, 방출 곡선이 구성되었다.

결과

도 10은 수득된 결과를 나타낸다: 연구된 단백질과 조합된 Hyadd4에 의해 형성된 시스템으로부터 hGH의 LS에의 방출은 도 2에서 앞서 입증된 서방성, 느린 방출 프로파일이 변하지 않고 유지되었다는 것을 입증한다. 그러므로 Hyadd 시스템에 포함된 단백질/의약이 보호되고 효소, 단백질, 알려지지 않은 성질의 일부, 및 전-염증성(pro-inflammatory) 분자가 풍부한 방출 매질, 예를 들어 OA의 환자의 윤활액에서 분해되지 않는다고 말할 수 있다.

실시예 19: 래트에서 관절 내 투여 후, Hyadd4 및 hGH 에 의해 형성된 시스템의 약물동력학의 연구

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된, 8 mg의 Hyadd4를 1 ml의 pH=6.9의 인산염 완충액에 용해시키고 121℃에서 고온고습(damp heat)으로 멸균시겼다. 그 다음에, 수성 용액에 미리 용해시키고 0.2 미크론의 재생된 셀룰로스 필터를 통해 여과시켜 멸균시킨, 0.8 mg의 hGH를 무균성 환경에서 첨가하였고, 조성물이 균일하고 단백질이 겔에 가두어지도록 적절하게 혼합하였다.

생체 내(in vivo) 연구를 위해, 100 ㎍의 단백질/동물에 상당하는 제제의 양을 래트의 무릎으로 주사하였다. 미리 설정된 시간에(0.15, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24 및 48 h), 혈장 시료를 얻고 관절 내(i.a.) 투여 후 혈장으로 통과된 hGH의 농도를 평가하기 위해 ELISA 시험을 하였다. 실험을 3회 반복하여 수행하였다.

비교 목적으로, 일 군의 동물을 유리(free) hGH (100 ㎍)에 상당하는 양을, 다시 관절 내 투여로 처리하였다. 약물동력학 곡선을 48 시간까지, 시간의 함수로서 혈장에서 확인되는 hGH의 농도를 ng/ml로 표시하여 수득하였다.

결과

도 11에 나타난 바와 같이, 주사된 단백질은 관절 내 주사 후 즉시 혈장에서 확인될 수 있다.

그러나, Hyadd 시스템에 의해 유도된 단백질의 서방성 방출 때문에, 이것은 제자리(in situ), 즉 관절강에 남아있고, 혈류로 통과되지 않고, 그 결과 그의 효과 전체는 주사 부위에서 일어난다.

Claims

a) 주로 소수성 성질을 갖는 단백질, 및
b) 히알루론산(hyaluronic acid; HA) 아미드를 포함하고,
상기 주로 소수성 성질을 갖는 단백질은 -0.5를 초과하는 GRAVY 지수를 갖고 상기 HA 아미드는
·HA 헥사데실아미드: 7 내지 14%, 바람직하게는 8 내지 9%의 범위인 몰 아미드화 백분율(molar amidation percentage)을 갖는, 헥사데실아민에 의한 HA 아미드;
·HA 옥틸아미드: 10 내지 15%, 바람직하게는 10 내지 11%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 옥틸아민에 의한 HA 아미드;
·HA 도데실아미드: 10 내지 15%, 바람직하게는 10 내지 11%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 도데실아민에 의한 HA 아미드;
·HA 터트-부틸아미드: 7 내지 12%, 바람직하게는 7 내지 8%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 터트-부틸아민에 의한 HA 아미드;
·HA 벤질아미드: 7 내지 15%, 바람직하게는 8 내지 9%의 몰 아미드화 함량을 갖는, 벤질아민에 의한 HA 아미드로부터 선택된 것인, 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질의 서방성(sustained) 방출용 시스템.
청구항 1에 있어서, 상기 아미드의 제조를 위해 이용된 HA는 400 내지 3-10⁶Da, 특히 50 내지 730 KDa, 750 내지 1230 KDa 또는 1500 내지 2500 KDa, 및 보다 특히 150 내지 250 KDa 또는 500 내지 730 KDa의 범위인 중량-평균 분자량(weight-average molecular weight)을 갖는 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 1 내지 2에 있어서, 상기 주로 소수성 성질을 갖는 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 인슐린, hGH, sCT, IL-1Ra, G-CSF, PDGF, 바람직하게는 PDGF-BB, TGF-β, EGF, VEGF-B, EPO, NGFβ, 트랜스페린, TIMP-2, TIMP-3, 및 TIMP-4인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 1 내지 3에 있어서, 상기 HA 아미드는 헥사데실아미드이고 상기 아미드의 제조를 위해 이용된 HA는 150 내지 250 KDa 또는 500 내지 730 KDa의 범위인 중량-평균 분자량을 갖는 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 4에 있어서, 상기 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 선택적으로 안정화제 및 부형제와 조합된, hGH 또는 sCT인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 3에 있어서, 상기 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 선택적으로 안정화제 및 부형제와 조합된, 인슐린인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 4에 있어서, 상기 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 선택적으로 안정화제 및 부형제와 조합된, PDGF, 바람직하게는 PDGF-BB, TGF-β, EGF 또는 VEGF-B인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 4에 있어서, 상기 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 선택적으로 안정화제 및 부형제와 조합된, 메탈로프로테아제 저해제 TIMP-2, TIMP-3 또는 TIMP-4인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 골관절염에 의해 야기된 관절 손상의 치료, 건염의 치료, 심장 근육 손상의 회복(repair), 골절/골강의 회복 또는 피부 궤양/상처/열상의 치유에서 주사, 관절 내 또는 국부 투여용, 또는 경구 투여용인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 5에 있어서, 골관절염, 류마티스성 또는 건선성 관절염 및/또는 골다공증의 치료에서 관절 내 투여용(intra-articular use)인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 3에 있어서, 골관절염에 의해 야기된 관절 손상의 치료, 건염의 치료, 심장 근육 손상의 회복, 골절/골강의 회복 또는 피부 궤양/상처/열상의 치유에서 주사, 관절 내 또는 국부 투여용, 또는 경구 투여용인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 7에 있어서, 골관절염에 의해 야기된 관절 손상의 치료, 건염의 치료, 심장 근육 손상의 회복, 골절/골강의 회복, 또는 피부 궤양/상처/열상의 치유에서 주사, 관절 내 또는 국부 투여용, 또는 경구 투여용인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
청구항 8에 있어서, 골관절염에 의해 야기된 관절 연골 손상의 치료 및/또는 골연골 침식의 회복에서 주사 또는 관절 내 투여용인 것인 단백질의 서방성 방출용 시스템.
치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질의 서방성 방출용 시스템을 형성하기 위한 히알루론산(HA) 아미드 및 주로 소수성 성질을 갖는 단백질의 용도로서, 상기 주로 소수성 성질을 갖는 단백질은 -0.5를 초과하는 GRAVY 지수를 갖고 상기 HA 아미드는
a) HA 헥사데실아미드: 7 내지 14%, 바람직하게는 8 내지 9%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 헥사데실아민에 의한 HA 아미드;
b) HA 옥틸아미드: 10 내지 15%, 바람직하게는 10 내지 11%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 옥틸아민에 의한 HA 아미드;
c) HA 도데실아미드: 10 내지 15%, 바람직하게는 10 내지 11%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 도데실아민에 의한 HA 아미드;
d) HA 터트-부틸아미드: 7 내지 12%, 바람직하게는 7 내지 8%의 범위인 몰 아미드화 백분율을 갖는, 터트-부틸아민에 의한 HA 아미드;
e) HA 벤질아미드: 7 내지 15%, 바람직하게는 8 내지 9%의 범위인 몰 아미드화 함량을 갖는, 벤질아민에 의한 HA 아미드로부터 선택되고,
상기 아미드의 제조를 위해 이용된 HA는 400 내지 3x10⁶Da, 특히 50 내지 730 KDa, 750 내지 1230 KDa, 또는 1500 내지 2500 KDa, 및 보다 특히 150 내지 250 KDa 또는 500 내지 730 KDa의 중량-평균 분자량을 갖는 것인 용도.
청구항 14에 있어서, 상기 주로 소수성 성질을 갖는 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 인슐린, hGH, sCT, IL-1Ra, G-CSF, PDGF, 바람직하게는 PDGF-BB, TGF-β, EGF, VEGF-B, EPO, NGFβ, 트랜스페린, TIMP-2, TIMP-3 및 TIMP-4인 것인 용도.
청구항 15에 있어서, 상기 HA 아미드는 헥사데실아미드인 것인 용도.
청구항 16에 있어서, 상기 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 선택적으로 안정화제 및 부형제와 조합된, hGH 또는 sCT인 것인 용도.
청구항 17에 있어서, 골관절염, 류마티스성 또는 건선성 관절염 및/또는 골다공증의 관절 내 치료를 위한 것인 용도.
청구항 15에 있어서, 골관절염에 의해 야기된 관절 손상의 치료, 건염의 치료, 심장 근육 손상의 회복, 골절/골강의 회복 또는 피부 궤양/상처/열상의 치유에서 주사, 관절 내 또는 국부 투여, 또는 구강 투여를 위한 것인 용도.
청구항 16에 있어서, 상기 치료적 및/또는 생물학적 활성 단백질은 골관절염에 의해 야기된 관절 연골 손상의 치료 및/또는 골연골 침식의 회복에서 주사 또는 관절 내 치료를 위한, 선택적으로 안정화제 및 부형제와 조합된, 메탈로프로테아제 저해제 TIMP-2, TIMP-3 또는 TIMP-4인 것인 용도.