ES2527967B1

ES2527967B1 - Formulación de una composición sanguínea rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, con proteínas gelificadas y método de preparación de la misma

Info

Publication number: ES2527967B1
Application number: ES201300718A
Authority: ES
Inventors: Eduardo Anitua Aldecoa
Original assignee: BTI Biotechnology Insttitute
Current assignee: BTI Biotechnology Insttitute
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2015-12-28
Anticipated expiration: 2033-08-01
Also published as: RU2016102768A; KR20160036557A; US20150037430A1; ES2527967R1; CA2919314A1; TWI684454B; EP3028710B1; MX2016001238A; JP2016528225A; RU2016102768A3; AR097176A1; PL3028710T3; CN105431155B; JP6466443B2; TW201536299A; PT3028710T; BR112015031733A2; CA2919314C; US9861684B2; WO2015015037A1

Abstract

Formulación que comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y proteínas provenientes de la propia composición sanguínea inicial, donde dichas proteínas se encuentran en estado gelificado. Se reivindica asimismo un método de preparación de dicha formulación, que comprende los pasos de calentar y posteriormente enfriar la composición sanguínea inicial a unas determinadas temperaturas y tiempos. Entre otras ventajas, la formulación según la invención es biocompatible y biodegradable, presenta las propiedades biológicas o médicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento, y además presenta una elevada estabilidad dimensional a lo largo del tiempo.

Description

FORMULACION DE UNA COMPOSICION SANGUINEA RICA EN PLAQUETAS Y/O FACTORES DE CRECIMIENTO. CON PROTEINAS GELIFICADAS. Y METODO DE PREPARACION DE LA MISMA

5 DESCRIPCION

Sector de la tecnica

La invencion se refiere a una formulacion con pnopiedades 10 biologicas o medicas deseables, obtenida de una composicidn sanguinea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento. La invencion se refiere asimismo a un metodo de preparacidn de dicha formulacion.

Estado de la tecnica

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En el estado de la tecnica se conoce la preparacion de composiciones a partir de la sangre humana o animal, donde la sangre es procesada de manera que se obtiene un plasma rico en plaquetas (PRP) y/o un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) que presentan 20 Citiles propiedades biologicas y medicas. Dichos PRP o PRGF vienen siendo utilizados con exito en aplicaciones ex vivo, por ejemplo como medio de cultivo celular, e in vivo, por ejemplo para realizar un proceso de regeneration osea en un paciente o para tratar a un paciente de una dolencia articular mediante infiltraciones. En el caso de que dichas 25 composiciones vayan a ser utilizadas en aplicaciones in vivo para tratar a un paciente, la tecnologia de preparacion de formulaciones PRP y PRGF ha ido evolucionando hacia la preparacion de composiciones autdlogas, es decir, obtenidas de la sangre del propio paciente. Ejemplos de este tipo de composiciones y mdtodos de preparacion pueden encontrarse en las 30 patentes US6569204 y ES2221770.

En los ultimos afios la tecnologia tambien esta evolucionando con el objetivo de conseguir que las composiciones ricas en plaquetas y/o en factores de crecimiento puedan obtenerse en forma de composiciones 35 galdnicas o formas farmaceuticas. Se entiende como composition galenica o forma farmaceutica a la disposicion individualizada a que se

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adaptan los farmacos o principios activos, ya sean de origen quimico o de origen biologico (como es el caso de las proteinas del PRP o PRGF), para facilitar su administracion. La composicion galenica o forma farmaceutica de un medicamento es clave porque determina la eficacia y seguridad del medicamento, ya que controla la dosis y la cesion de las moleculas del medicamento al tejido. Ademas, la composicion galenica o forma farmaceutica del medicamento es determinants para que la preparacion del medicamento, su dosificacion y su administracion sean conocidas, esten controladas y sean ejecutables con relativa facilidad y de manera repetible. En resumidas palabras, una composicion galenica o forma farmaceutica pretende facilitar la manipulation, conservation, transporte, administracion y en conjunto las propiedades de cualquier farmaco o sustancia con actividad terapeutica.

Una de las formulaciones de mayor aplicacion medica del PRP o PRGF es la conocida como gel de fibrina o malla de fibrina, que es una formulation cuya consistencia semisolida resulta muy conveniente para ciertas aplicaciones. El procedimiento de preparacion del gel o malla de fibrina generalmente comienza con una primera fase en la cual se obtiene el PRP o PRGF por un metodo aplicable, por ejemplo centrifugando sangre extraida de un paciente hasta que la sangre se separa en varias fracciones, y extrayendo la fraccion superior, es decir la fraccion de plasma rico en plaquetas (PRP) o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF). Posteriormente, se realiza la activacion de las plaquetas contenidas en el PRP o PRGF (entendiendose por activacion la action de provocar que las plaquetas liberen ciertos factores de crecimiento contenidos en su interior) por ejemplo mediante la adicion de cloruro calcico. Como consecuencia de la activacion, y si se espera un tiempo suficiente, se produce la eventual polimerizacion de fibrina a partir del fibrindgeno contenido en el plasma, obteniendose un compuesto final que es un coagulo de fibrina (tambien denominado gel o malla de fibrina por su consistencia semisolida, como una especie de esponja biologica). Este procedimiento es el que suele realizarse para obtener un gel de fibrina a partir de una sangre modificada con un anticoagulante, como por ejemplo con citrato sodico. Pero tambien se puede procesar la sangre sin mezclar esta previamente con anticoagulante; en este caso, al centrifugar la

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sangre se consigue tanto separar el plasma de los globulos rojos como, al mismo tiempo, obtenerse el gel de fibrina sin necesidad de anadir cloruro calcico u otro activador de las plaquetas. Algunos ejemplos de aplicacion del gel o malla de fibrina son: formar un andamiaje biologico para rellenar defectos oseos; ser aplicado sobre heridas o lesiones para la liberation progresiva de los factores de crecimiento: ser empleado como matriz para el cultivo de celulas madre; ser empleado como una membrana para poder cerrar defectos o ulceras; ser empleado en la fabrication de tejidos, lo que se conoce como ingenieria de tejidos, donde ademas de celulas y factores de crecimiento es de especial importancia contar con una matriz o andamiaje donde las celulas puedan crecer.

El gel o malla de fibrina presenta algunas limitaciones importantes. La principal limitation del gel o malla de fibrina es que es inestable y tiende a retraerse; por ello, el gel o malla de fibrina no es capaz de mantener un volumen estable a lo largo del tiempo ni de proporcionar un soporte tisular estable a lo largo del tiempo. Si bien esta tendencia a retraerse puede ser positiva en algunas aplicaciones, resulta negativa en otras. Por ejemplo, en una tecnica de cirugia dental conocida como elevation del seno maxilar, el biomaterial que se emplea para regenerar el defecto oseo debe tener propiedades osteoconductoras pero ademas debe ser capaz de mantener el espacio flsico durante un largo periodo de tiempo hasta que la matriz osea se conforme, ya que en caso contrario habria un colapso del espacio que afectaria a la regeneration vertical del hueso alveolar. Otro ejemplo es el caso de una extirpation mamaria (mastectomla), durante la cual el biomaterial o gel que se emplee para rellenar el espacio mamario debe tener una resistencia mecanica adecuada y proporcionar un espacio y volumen a largo plazo de forma que no se colapse dicho espacio. Otro ejemplo aun es el caso de los fillers o agentes de relleno estetico (por ejemplo el acido hialuronico), que son materiales de relleno (por lo tanto dan y mantienen volumen) ampliamente usados en el campo de la estetica para aumentar el volumen en las comisuras y arrugas y corregir dichos defectos, dando un aspecto rejuvenecido; cualquier agente que este dirigido a funcionar como filler o agente de relleno debe ser mecanicamente estable y resistente a la compresion de forma que mantenga el volumen del tejido. Por otra parte,

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la tendencia del gel o malla de fibrina a retraerse dificulta e incluso impide el empleo del gel o malla como agente de liberacidn de agentes externos, farmacos, proteinas, etc.

Otro aspecto limitado del gel o malla de fibrina es su imposibilidad de poder ser infiltrado o canulado en su estado normal, semisolido, lo que impide su administration como relleno en la piel, en dermocosm6tica, en traumatologla y en otros campos de la biologla o medicina.

La presente invencion tiene como objetivo conseguir una formulacion con propiedades biologicas o medicas deseables, obtenida de una composicion sanguinea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, que no tienda a retraerse y por tanto permita mantener un volumen estable a lo largo del tiempo. Entre otras aplicaciones, se desea que la formulacion sirva como alternativa al gel o malla de fibrina en determinadas aplicaciones donde se requiere una composicion estable.

Description breve de la invencion

Es objeto de la invencion una formulacion con propiedades biologicas o medicas deseables, que comprende o se deriva de una composicion sanguinea inicial (de origen humano o animal; autologa, homologa u heterologa), rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y que comprende proteinas provenientes de la propia composicion sanguinea inicial, con la particularidad de que dichas proteinas se encuentran en estado gelificado por un tratamiento termico de calentamiento y enfriamiento. En particular, las proteinas gelificadas son preferentemente albumina, glicoprotelnas, globulinas y/o fibrinogeno. La formulacion de acuerdo con la invencion podrla calificarse como un “gel de proteinas” (usando una terminologla analoga a la utilizada para referirse al gel de fibrina) debido a que presenta una consistencia gelificada que viene dada por las proteinas en estado gelificado. Ademas, la formulacion es deformable. La composicion presenta una configuration morfologica y biomecanica nueva en comparacion con el resto de geles de relleno, composiciones sangulneas ricas en plaquetas y/o factores de crecimiento, y similares conocidos en el estado de la tecnica.

Se propone tambien un metodo de preparation de la formulacion anterior, que comprende los pasos de: disponer de una composition sanguinea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento cuya 5 formulation de base puede variar; calentar la composition sanguinea inicial a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto; enfriar la composition sanguinea inicial durante al menos 1 minuto. Este metodo de la invention, que puede considerarse como una secuencia termica, permite dar volumen y rigidez a una composition sanguinea rica 10 en plaquetas y/o factores de crecimiento en general, obteniendo un gel proteico o formulacion de consistencia de gel gracias al estado gelificado de ciertas proteinas comprendidas en la composition sanguinea inicial.

La formulacion de acuerdo con la invention es biocompatible, 15 biodegradable y presenta las propiedades biologicas o medicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento, a la vez que tiene una consistencia densa o viscosa debido al estado gelificado de ciertas proteinas contenidas en la composition sanguinea inicial, con la importante ventaja de que dicha consistencia densa o 20 viscosa es estable a lo largo del tiempo. La formulacion segun la invention es por tanto una alternativa ventajosa al gel o malla de fibrina, debido al hecho de que la formulacion no se retrae y permite por ello mantener relleno un espacio fisico. Ademas, la formulacion presenta una buena resistencia a la compresion, similar o mejor que la del acido 25 hialuronico (utilizado habitualmente como filler o agente de relleno), y soporta adecuadamente la resistencia que le puede ejercer un tejido; por tanto, la formulacion resulta muy apta para ser utilizada como filler o agente de relleno. Ademas, aun cuando tanto la malla de fibrina como la formulacion segun la invention tienen caracter semisolido, solamente la 30 segunda puede infiltrarse o inyectarse debido a que es deformable. Una ventaja adicional de la formulacion es que puede ser desecada para posteriormente re-hidratarse.

Description breve de las figuras

Los detalles de la invention se aprecian en las figuras que se

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acompanan, no pretendiendo estas ser limitativas del alcance de la invencion:

- La Figura 1 muestra dos imagenes de microscopia electronica de un ejemplo de formulacion segun la invencion.

- La Figura 2 muestra dos imagenes de microscopia electronica de otro ejemplo de formulacion segun la invencion.

- La Figura 3 muestra el factor de hinchamiento de varias

formulaciones segun la invencion preparadas a partir de

coagulo de fibrina tratado a diferentes temperaturas y tiempos.

- La Figura 4 muestra el factor de hinchamiento de varias

formulaciones segun la invencion preparadas a partir de

sobrenadante tratado a diferentes temperaturas y tiempos.

- La Figura 5 muestra unos resultados de citocompatabilidad de varias formulaciones segun la invencion, ensayada con la Ifnea celular osteoblastica MG 63.

- La Figura 6 muestra otros resultados de citocompatabilidad de varias formulaciones segun la invencion, ensayada con la linea celular osteoblastica MG 63.

- Las Figuras 7 y 8 muestran respectivamente el contenido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) y del factor de crecimiento transformante beta (TGF-P) en doce formulaciones de acuerdo con la invencion.

- La Figura 9 muestra la cinetica de liberacion del factor de crecimiento PDGF-AB en cuatro formulaciones de acuerdo con la invencion incubadas durante diferentes periodos de tiempo.

- La Figura 10 muestra la cinetica de liberacion del factor de crecimiento TGF-p en cuatro formulaciones de acuerdo con la invencion incubadas durante 2 dias.

- La Figura 11 muestra una fotografia de la espalda de una rata de laboratorio en la cual se han inyectado muestras de cuatro formulaciones segun la invencion.

- La Figura 12 muestra una grafica relacionada con el ensayo de la figura anterior, ilustrando el volumen de la hemielipsis tras inyectar las formulaciones a nivel intradermico y transcurridas dos semanas tras la inyeccion.

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Descripcion detallada de la invencion

Con el fin de superar problemas aun existentes en el estado de la tecnica relacionados con la falta de estabilidad de los geles o mallas de fibrina, se propone una formulacidn altemativa con propiedades biologicas o medicas deseables y con una estabilidad mejorada a lo largo del tiempo. Dicha formulacion comprende o se deriva de una composicion sangulnea inicial. Dicha composicion sanguinea es rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y ademas comprende diversas protelnas. Por tanto, la formulacion igualmente es rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y comprende diversas protelnas. De entre dichas protelnas, determinadas protelnas se encuentran en estado gelificado, es decir, desnaturalizadas y formando una red proteica ordenada, preferentemente debido a un tratamiento termico de calentamiento y enfriamiento. Las protelnas en estado gelificado son preferentemente albumina, glicoprotelnas, globulinas y/o fibrinogeno. Se ha comprobado que el gel proteico de acuerdo con la invencion no se retrae, puede canularse o infiltrarse facilmente y mantiene el volumen y espacio a diferencia de sus homonimos basados solo en la red de fibrina.

La composicion sangulnea inicial puede ser, por ejemplo, un plasma sangulneo rico en plaquetas, es decir, un plasma con una concentration elevada de plaquetas. Dicho plasma se ha obtenido generalmente mediante la tecnica de centrifugar sangre (para separarla en una fraccidn de fraccion de gldbulos rojos, una fraccion de globulos blancos y una fraccion de plasma rico en plaquetas (PRP)) y separar toda o parte de la fraccion de plasma rico en plaquetas (PRP).

La composicion sangulnea inicial puede tambien ser un sobrenadante de un plasma sangulneo rico en plaquetas (PRP). El sobrenadante es una sustancial llquida que aparece sobre el coagulo cuando se causa la coagulation de un plasma rico en plaquetas (PRP) y su posterior retraction.

La composicion sangulnea inicial puede ser un plasma sangulneo

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rico en factores de crecimiento (PRGF) liberados, es decir, un plasma sangulneo rico en plaquetas que ha sido activado (por ejemplo mediante la aportacion de cloruro de calcio, de trombina, de una combinacibn de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sbdico, de colageno, o de cualquier otro agente que actue activando las plaquetas e induciendo la formacion de fibrina) de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.

Analogamente, la composicion sanguinea inicial puede ser un sobrenadante de un plasma sangulneo rico en factores de crecimiento (PRGF) liberados, es decir, un sobrenadante obtenido tras la coagulacion y posterior retraccion de un plasma rico en plaquetas que ha sido previamente activado (por ejemplo mediante la aportacibn de cloruro de calcio, de trombina, de la combinacion de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sbdico, de colageno, o de cualquier otro agente que actue activando las plaquetas e induciendo la formacion de fibrina) de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.

La composicion sanguinea inicial puede contener o no leucocitos.

La composicion inicial tambibn puede ser un gel de fibrina obtenido directamente del procesado de sangre que no haya sido modificada con un anticoagulante.

Se propone asimismo un metodo de preparacion de una formulacion con propiedades biologicas o medicas deseables, donde dicho metodo comprende los pasos de:

a) disponer de una composicion sanguinea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, la cual es preferentemente un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos, o un gel de fibrina obtenido

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a partir de sangre no modificada con anticoagulante;

b) en caso de contar la composicion sanguinea con plaquetas, activar opcionalmente las plaquetas con algun agente activador como cloruro calcico, trombina, gluconato calcico, colageno o cualquier otro, o una combination de ellos., y esperar hasta que se forme una fibrina provisional;

c) calentar la composicion sanguinea inicial a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto;

d) enfriar o atemperar la composicion sanguinea inicial durante al menos 1 minuto.

El metodo anterior desarrolla un choque termico sobre la composicion sanguinea inicial de forma que se induce una gelificacion proteica de varias proteinas existentes en el plasma humano, entre ellas la albumina, las glicoproteinas, las globulinas y/o el fibrinogeno. A los efectos de la presente invencion, se denomina “gelificacion” al proceso sufrido por las moleculas en el cual se polimerizan o agregan para formar una red proteica ordenada. En resumen, como consecuencia del proceso de choque termico se logran nuevas formulaciones biocompatibles y biodegradables, dependiendo de cu£l sea la composicion sanguinea inicial, cuyo denominador comun es la gelificacion o polimerizacion proteica.

Ademas, se ha comprobado que la formulation segun la invencion, provista de proteinas gelificadas, mantiene sustancialmente los niveles de factores de crecimiento de la composicion sanguinea inicial. Es decir, el choque termico no provoca una destruction masiva de factores de crecimiento de dicha composicion sanguinea inicial.

Preferentemente, la composicion sanguinea inicial se calienta a una temperatura de entre 70 y 85°C.

La composicion sanguinea inicial rica en plaquetas y/o factores de

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crecimiento es de origen humano o animal. Ademas, puede ser autologa (perteneciente a un paciente al cual se desea tratar posteriormente con la formulacion final), homologa (perteneciente a un miembro de la misma especie que el paciente, los pacientes, las celulas u otra entidad biologica que vaya a ser tratada o procesada con la formulacion final) o heterologa (perteneciente a un miembro de diferente especie que el paciente, los pacientes, las celulas u otra entidad biologica que vaya a ser tratada o procesada con la formulacion final).

La invention contempla que la composition sangulnea inicial puede incorporar opcionalmente una o mas sustancias adicionales, anadidas de forma previa al tratamiento termico reivindicado. Dichas sustancias adicionales pueden ser:

- uno o mbs agentes bioactivos seleccionados entre proteinas, peptidos, acidos nucleicos, polisacaridos, lipidos, sustancias organicas no proteicas y sustancias inorgbnicas;

- uno o mas polimeros biodegradables seleccionados entre: acido hialuronico, sales de hialuronato, chondroitin 4 sulfato, chondroitin 6 sulfato, dextran, gel de sllice, alginato, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de chitln, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietileno glicblicos (PEG), polihidroxietilenometacrilato (HEMA), proteinas sinteticas o naturales, colagenos;

- uno o mas polimeros organicos seleccionados del grupo de policarpolactona, poliglicolico, polilactico, y sus co-polimeros;

- uno o mbs de entre los siguientes agentes: antibioticos, antimicrobianos, anticancerlgenos, analgesicos, factores de crecimiento, hormonas;

- uno o mas componentes inorg£nicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio.

La invencibn contempla tambibn que cualquiera de las sustancias anteriores puedan ser anadidas a la formulacion despues de realizado el tratamiento termico.

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La formulacion segun la invencion contempla modos de realizacion diversos en los que la formulacion pueda comprender, ademas de los aspectos tecnicos reivindicados, otros compuestos, componentes, moleculas, etc. que resulten convenientes para la aplicacidn concreta a la que vaya a estar destinada la formulacidn. En otras palabras, la invencion se plantea como una familia de nuevas formulaciones basadas en geles de protelnas, estando formada dicha familia por diferentes formulaciones que tienen en comun la presencia de proteinas gelificadas y que pueden diferir en su composicion adicional.

Ademas, es posible realizar pasos adicionales sobre la formulacion con proteinas gelificadas que incluyen desecados de las matrices para aumentar su versatilidad. Es decir, las formulaciones de proteinas gelificadas de acuerdo con la invencion pueden ser desecadas (calor seco) o liofilizadas para formar una membrana. Esta membrana puede ser posteriormente rehidrata mediante diferentes altemativas tales como anadir una solucion salina, un plasma rico en plaquetas, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas, un plasma rico en factores de crecimiento, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento, o cualquier otra solucion que permita hidratar la membrana.

Ejemplos

Eiemolo 1

Se parte de una muestra de 9 ml de sangre extraida de un paciente y almacenada en un tubo con cierre herm6tico y que no contiene anticoagulante citrato. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugacidn, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fraccidn superior, o fraccidn de plasma rico en plaquetas (PRP), incluyendo tambien los globulos blancos, a una jeringa de 5 ml. Debido a que el tubo inicial no se encontraba citratado, el PRP ha comenzado a coagular. Se calienta el contenido de la jeringa a una temperatura de 70°C durante 10 minutos. Posteriormente, se enfria el segundo contenedor a una temperatura de 4°C durante

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2 minutos. Como consecuencia de esta secuencia tdrmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisolida, con consistencia de gel. Por tanto, se obtiene una formulacion activada, con consistencia de gel tanto por la fibrina generada como consecuencia de la coagulacion como por la gelificacion de las protefnas producida por el tratamiento tdrmico, y libre de citrato y calcio. La presencia de fibrina otorga a la formulacion una consistencia mayor firmeza y resistencia, mientras que las protefnas gelificadas aportan estabilidad y volumen constante. Gracias a sus propiedades y resistencia mecanica, una sustancia de este tipo puede ser util por ejemplo para corregir defectos verticales en los tejidos faciales.

Eiemplo 2

Se parte de una muestra de 9 ml de sangre extrafda de un paciente y almacenada en un tubo de extraction con cierre hermdtico que contiene anticoagulante citrato al 3,8% en una cantidad de 0,1 ml. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugation, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fraccion superior o fraccion de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir los globulos blancos, a una jeringa de 5 ml. Se calienta la jeringa a una temperatura de 80°C durante 3 minutos. Posteriormente, se enfrfa la jeringa a una temperatura de 20°C durante 10 minutos. Como consecuencia de esta secuencia tdrmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior del segundo contenedor una sustancia semisdlida, con consistencia de gel, cuyas plaquetas se encuentran pendientes de activar, y que no comprende fibrina por no haber sido previamente coagulada. Una sustancia de este tipo puede ser util para su aplicacion por ejemplo como relleno en la cirugfa estdtica y conseguir un rejuvenecimiento eliminando o minimizando la presencia de arrugas gracias a la inyectabilidad del bio-gel a travds de aguja (menor o igual de 25 G) y su consistencia capaz de elevar la piel. Este bio-gel es estable en el tiempo y ademas libera factores de crecimiento que estimulan el crecimiento y la proliferation celular, resultando por tanto muy ventajoso en comparacion con sustancias convencionales tales como el acido

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hialuronico. El acido hialuronico, que es el material de relleno mas utilizado en la actualidad, precisamente carece de bioactividad y por lo tanto no promueve la formacion de tejidos ni consigue la persistencia de mejoras a lo largo del tiempo, lo cual hace necesario que deba ser administrado periodicamente, generalmente cada 3-4 meses.

Eiemplo 3

Se parte de una muestra de 9 ml de sangre extralda de un paciente y almacenada en un tubo de extraction con cierre hermetico que contiene anticoagulante citrato al 3,8% en una cantidad de 0,1 ml. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugation, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fraccion superior o fraccion de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir los globulos blancos, a una jeringa de 5 ml. Se ahade cloruro de calcio al 10% en una relation de 50 pi por cada 1 ml de plasma, causando la activation de las plaquetas, es decir, la liberacion de factores de crecimiento, y la coagulacion del plasma. Entonces, se calienta la jeringa a una temperatura de 75°C durante 5 minutos. Posteriormente, se enfria la jeringa a una temperatura ambiente durante 10 minutos. Como consecuencia de esta secuencia termica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisolida, con consistencia de gel tanto por la fibrina generada como consecuencia de la coagulacion como por la gelificacidn de las protefnas producida por el tratamiento termico, provista de citrato, calcio y factores de crecimiento liberados. Una sustancia de este tipo puede ser util para rellenar un defecto 6seo, como por ejemplo el alveolo que queda tras extraer una pieza dental, para fomentar la regeneration del alveolo. Gracias a la liberacion de factores de crecimiento y la capacidad del gel para actuar como soporte del crecimiento celular, el gel favorece el que se pnoduzca el relleno del alveolo con tejido oseo, acortando as! los tiempos de espera para colocar, por ejemplo, un implante dental en el alveolo que sustituya al diente extraido.

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Eiemplo 4

Se parte de una muestra de 9 ml de sangre extraida de un paciente y almacenada en un tubo de extraction con cierre hermetico que contiene 0,1 ml de una solucion de citrato sodico con una concentracion de 3,8% (peso/volumen) que actua como anticoagulante. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugation, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fraccion superior o fraccion de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir los globulos blancos, a un tubo de fraccionamiento de 9 ml. Se afiade una solucion de cloruro de calcio (con una concentracion de 10% en peso/volumen) en una relation de 50 pi por cada 1 ml de plasma y se introduce el tubo en un horno a 37°C. El cloruro de calcio causa la activation de las plaquetas, es decir, la liberation de factores de crecimiento, la coagulation del plasma y la formacion de fibrina (vtendose dicha formacion acelerada por encontrarse el tubo en las condiciones de temperatura proporcionadas por el homo). Seguidamente, por la retraction del coagulo se obtienen dos fases: una fase solida, que es una estructura tridimensional de fibrina, y una fase liquida sobrenadante, que contiene proteinas y factores de crecimiento plaquetarios y plasmaticos. Se separa la fase liquida o sobrenadante a una jeringa de 3 ml. Entonces, se calienta la jeringa a una temperatura de 80°C durante 10 minutos. Posteriormente, se enfria la jeringa a una temperatura de 22°C durante 5 minutos. Como consecuencia de esta secuencia termica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisolida, aunque con una consistencia menos solida que las formulaciones de acuendo con la invention que si comprenden fibrina. Debido a su consistencia menos solida, una sustancia de este tipo puede ser util por ejemplo para rellenar defectos periodontales intra-oseos con el objetivo de promover la regeneration del tejido periodontal, o regenerar hueso infiltrandolo subperiostico o supraperiostico.

Eiemplo 5

En otro ejemplo, se partio de un coagulo de fibrina (sustancia

preparada tras centrifugar sangre a una velocidad de 580 g y una temperatura de 20°C para obtener plasma rico en plaquetas, anadir cloruro calcico en una proportion de 50 pi de cloruro calcico por cada 1 ml de plasma, y esperar 10-20 minutos hasta la polimerizacion de la fibrina) y 5 se sometid al mismo a un calentamiento a 70°C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 20°C durante 10 minutos, obtenidndose un gel proteico. La Figura 1 muestra dos imagenes de microscopia electronica del citado gel proteico. En la imagen de la izquierda se puede observar la presencia de estructuras redondas que representan la 10 albumina desnaturalizada y otras estructuras lineales que son fibras de fibrina. En la imagen de la derecha se puede observar la superficie compacta (exterior) del gel.

Eiemplo 6 15

En otro ejemplo, se partio de un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) (sustancia preparada tras centrifugar sangre a una velocidad de 580 g y una temperatura de 20°C para diversas fracciones, separar una fraccidn de plasma rico en plaquetas (PRP), anadir cloruro 20 calcico en una proporcidn de 50 pi de cloruro calcico por cada 1 ml de plasma, con el fin de provocar la liberation de factores de crecimiento e iniciar la coagulation del plasma. La retraction del coagulo permitio obtener un sobrenadante. Entonces, dicho sobrenadante se sometid a un calentamiento a 70°C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 25 20°C durante 10 minutos, obteniendose un gel proteico. La Figura 2

muestra dos imagenes de microscopia electronica del citado gel proteico. En la imagen de la izquierda se puede observar el interior del gel y la presencia de estructuras redondas que representan la albumina desnaturalizada. En la imagen de la derecha se puede observar la 30 superficie compacta (exterior) del gel.

Eiemplo 7

En otro ejemplo, se prepararon varios geles proteicos sometiendo 35 un coagulo de fibrina (preparado segun lo descrito en el Ejemplo 5) a diferentes temperatures y tiempos. Las condiciones de preparation

fueron: calentar el coagulo a 70°C durante 15 minutos (cuadrado), calentar el coagulo a 70°C durante 30 minutos (cfrculo), calentar el coagulo a 80°C durante 15 minutos (triangulo); y enfriar todos ellos a una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Estos geles fueron desecados a 5 37°C durante 24 horas y despues fueron incubados en agua destilada. En

intervalos de 24 horas los geles fueron pesados para calcular el grado de hinchamiento, definido como: peso hinchado / peso inicial. La Figura 3 representa el grado o factor de hinchamiento de los geles proteicos preparados a diferentes temperaturas y tiempos. Como puede 10 observarse, los geles aumentan entre 2 y 3 veces su peso inicial debido a la absorcion del agua y la retention de la misma dentro de su estructura. Tambien se puede observar que los geles preparados a 70°C durante 15 minutos (cuadrado) se hinchan en 24 horas y su factor de hinchamiento no se ve modificado significativamente a mayores tiempos de incubacidn. 15 Los geles preparados a 70°C durante, en cambio, 30 minutos (circulo) se hinchan aproximadamente 3 veces su peso inicial tras 24 horas pero al incrementarse el tiempo de incubation se observa un descenso ligero del factor de hinchamiento. Mientras, los geles preparados a 80°C durante 15 minutos (triangulo) tardan mas que los dos anteriores, concretamente 20 48 h, en alcanzar un hinchamiento maximo. En cualquier caso, la

capacidad de hinchamiento de los geles permite que los geles puedan ser utilizados, por ejemplo, como matrices para la liberation local de sustancias bioactivas (proteinas o principios activos). Este uso se llevaria a cabo normalmente aplicando una solution que contenga dichas 25 sustancias bioactivas sobre los geles deshidratados, produciendose la consiguiente hidratacion de los geles, los cuales entonces incorporanan las sustancias bioactivas en su interior.

Eiemplo 8 30

En otro ejemplo, se prepararon varios geles proteicos sometiendo un sobrenadante (preparado segun el Ejemplo 6) a diferentes temperaturas y tiempos. Las condiciones de preparation fueron: calentar el sobrenadante a 70°C durante 15 minutos (cuadrado), calentar el 35 sobrenadante a 70°C durante 30 minutos (circulo), calentar el sobrenadante a 80°C durante 15 minutos (triangulo); y enfriar todos ellos

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a una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Estos geles fueron desecados a 37°C durante 24 horas y despues fueron incubados en agua destilada. En intervalos de 24 horas los geles fueron pesados para calcular el grado de hinchamiento, definido como: peso hinchado / peso inicial. El peso inicial es el peso del gel seco antes de su incubacion en agua. La Figure 4 represents el grado de hinchamiento de los geles de proteinas preparados a diferentes temperaturas y tiempos. Como puede observarse, los geles han aumentado aproximadamente 3 veces su peso inicial debido a la absorcion del agua y la retencion de la misma dentro de su estructura. Tambien se puede observar que los geles preparados a 70°C durante 15 minutos (cuadrado) se hinchan en 24 horas y su factor de hinchamiento no se ve modificado significativamente a mayores tiempos de incubacion. En cambio, los geles preparados a 70°C durante 30 minutos (circulo) se hinchan 3 veces su peso inicial tras 48 horas pero a mayor tiempo de incubacion se observa un descenso ligero del factor de hinchamiento. Mientras, los geles preparados a 80°C durante 15 minutos (triangulo) alcanzan dicho factor de hinchamiento aproximadamente igual a 3 tras 24 horas de incubacibn. En cualquier caso, la capacidad de hinchamiento de los geles permite que los geles puedan ser utilizados, por ejemplo, como matrices para la liberation local de sustancias bioactivas (proteinas o principios activos). Este uso se llevaria a cabo normalmente aplicando una solution que contenga dichas sustancias bioactivas sobre los geles deshidratados, produciendose la consiguiente hidratacion de los geles, los cuales entonces incorporarian las sustancias bioactivas en su interior.

Eiemplo 9

En otro ejemplo, prepararon cuatro geles proteicos o formulaciones de acuerdo con la invention a partir de un sobrenadante (indicado como “SN” en la grafica a la que se hara referencia al final de este ejemplo), un coagulo de fibrina (“Fibrina”), un plasma rico en plaquetas sin activar (“Sin activar”) y un plasma rico en plaquetas activado con 10% CaCI2 sin coagular (“activ-sin coagular”), realizando un tratamiento termico consistente en calentar las sustancias iniciales anteriores a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21°C durante 10 minutos. Los metodos de

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preparation de estas sustancias initiates estan explicados en los Ejemplos 2, 3 y 6. Cada una de estas cuatro formulaciones obtenidas tras el tratamiento termico se incubo en medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) sin suero bovino fetal durante 48 horas. Por otra parte, se partio asimismo de una quinta sustancia o sustancia de control, consistente en el propio DMEM sin suero bovino fetal. Los cinco medios de cultivo fueron empleados para cultivar celulas MG 63, renovandose a los 2 (cuadrado), 4 (circulo) y 7 dias (triangulo). Despues de cada uno de estos periodos de tiempo se evaluo la proliferation celular utilizando el reactivo colorimetrico WST-1 y un lector de placa. El porcentaje de proliferation se calculo con la siguiente funcion: % proliferation = (absorbancia del WST-1 para los geles / absorbancia del WST-1 para control) * 100. La Figura 5 muestra los resultados de citocompatabilidad de los geles proteicos ensayados con la linea celular osteoblastica MG 63. Como puede observarse, los geles no son toxicos como muestra el aumento en la proliferation celular con respecto a la muestra de control. A los 2 dias de proliferation (cuadrado) el gel preparado a partir del plasma rico en plaquetas sin activar resulto en mayor proliferation celular. Sin embargo, estas diferencias son ausentes a mayores tiempos de proliferation (circulo, triangulo). Por tanto, este ejemplo sirve para demostrar que las formulaciones segun la invention presentan un comportamiento adecuado para estimular el crecimiento celular y tambien son biocompatibles, lo que permite su desarrollo dirigido hacia su uso clinico.

Eiemplo 10

Al igual que en el ejemplo anterior, se prepararon cuatro geles proteicos o formulaciones de acuerdo con la invention a partir de un sobrenadante (cuadro), un coagulo de fibrina (circulo), un plasma rico en plaquetas sin activar (triangulo con vertice central hacia arriba) y un plasma rico en plaquetas activado con 10% CaCI2 sin coagular (triangulo con vertice central hacia abajo), realizando un tratamiento termico consistente en calentar las sustancias iniciales anteriores a 70°C durante 15minutos y enfriar a 21°C durante 10minutos. Los metodos de preparation de estas sustancias iniciales estan explicados en los

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Ejemplos 2, 3 y 6. Las cuatro formulaciones obtenidas fueron incubadas en medio de cultivo durante 2, 4, 7 y 9 dias. Despues de cada tiempo, los medios fueron recogidos y se anadio nuevo medio a los geles. Los medios recogidos se guardaron para usarlos para cultivar las celulas MG 63. Las celulas se dejaron crecer con este medio durante 48 horas, tras las cuales fue evaluada la proliferacion celular utilizando el reactivo colorimetrico WST-1 y un lector de placa. El porcentaje de proliferacion fue calculada con la siguiente funcion: % proliferacion = (absorbancia del WST-1 para los geles / absorbancia del WST-1 para control) * 100, donde como sustancia de control se utilizo un DMEM sin suero. La Figura 6 muestra la proliferacion celular en cada medio de cultivo y en cada intervalo de tiempo de incubacion. Como puede observarse, la mayor proliferacion celular fue conseguida tras 2 dias de incubacidn. A mayores tiempos de incubacion, los medios de cultivo promovieron una menor proliferacion celular, lo que podria indicar que la liberation de los factores de crecimiento fue mayor tras 2 dias de incubacion y este contenido en factores de crecimiento fue menor en los medios de mayor tiempo de incubacion (4, 7 y 9 dias). Asl, estos resultados muestran que la liberacion en los geles de sustancias bioactivas que estimulan la proliferacion celular va disminuyendo en funcion del tiempo siguiendo un perfil de liberacidn parecido a otros tipos de geles que se caracterizan por liberar grandes cantidades de sustancias bioactivas durante las primeras horas de incubacion (efecto “burst”), y que con el paso de tiempo se disminuye notablemente la cantidad liberada.

Eiemplo 11

En otro ejemplo, se partid de dos sustancias iniciales. La primera sustancia era un gel de fibrina obtenido tras activar un plasma rico en plaquetas con cloruro calcico en una relacidn de 50 pi por cada 1 ml de plasma (como en el Ejemplo 6). La segunda sustancia era un sobrenadante obtenido tras la retraccidn de un gel de fibrina (como en el Ejemplo 6). Ambas sustancias fueron sometidas a tres tratamientos termicos diferentes: un calentamiento a 70°C durante 15minutos, un calentamiento a 70°C durante 30 minutos y un calentamiento a 80°C durante 15 minutos. En todos los casos, los calentamientos fueron

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seguidos de un enfriamiento a temperatura de 4°C o a una temperatura de 20°C, durante 10minutos. Se obtuvieron doce geles proteicos. Seguidamente, se centrifuganon los doce geles a 14800 rpm durante 20 minutos y se midio el contenido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) y del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-P). Los resultados de estas medidas se muestran en las Figuras 7 y 8, donde se visualizan los doce geles en seis grupos de dos, indiccindose los grupos como “1” (gel de fibrina a 70°c, 15 minutos), “2” (gel de fibrina a 70°c, 30 minutos), “3” (gel de fibrina a 80°c, 15 min), “4” (gel de sobrenadante a 70°C, 15 min), “5” (gel de sobrenadante a 70°C, 30 min) y “6” (gel de sobrenadante a 80°C, 15 min), y donde dentro de cada grupo se indica con una barra negra el gel enfriado a 4°C y con una barra blanca el gel enfriado a 20°C. La Figura 7 muestra los contenidos del factor de crecimiento PDGF-AB observados. Puede concluirse que el contenido de este factor de crecimiento fue en general mayor en los geles enfriados a 20°C (barras blancas) que los geles enfriados a 4°C (barras negras), exceptuando los geles de sobrenadante preparado a 70°C durante 30 minutos (“5”) y a 80°C (“6”), donde no se observaron apenas diferencias en el contenido de PDGF-AB en funcion de la temperatura de enfriamiento. La Figura 8 muestra los contenidos del factor de crecimiento TGF-P observados. Puede concluirse que, en lo que respecta a los geles preparados a partir de fibrina (grupos “1”, “2”, “3”), en el caso de realizarse el enfriamiento a 20°C (barras blancas) el contenido del factor TGF-P fue similar en los tres grupos, es decir, para diferentes tratamientos termicos de preparacion de los geles, mientras que en el caso de realizarse el enfriamiento a 4°C (barras negras) el contenido del factor TGF-3 fue mayor en el gel preparado a 70°C durante 15 minutos (grupo “1”). En cambio, en lo que respecta a los geles preparados a partir de sobrenadante (grupos “4”, “5”, “6”), puede observarse que solamente el gel proteico preparado a partir del sobrenadante a 70°C durante 15 minutos (grupo “1”) libero el TGF-(3, no siendo detectado dicho factor en los demas geles preparados a partir del sobrenadante. Asi, es posible concluir que el gel de fibrina mantiene mas contenido de factores de crecimiento que el sobrenadante a temperaturas superiores a 70°C y que tanto la temperatura de calentamiento como la temperatura de enfriamiento afectan a este contenido de factores de crecimiento, siendo

mayor el contenido a temperaturas de calentamiento mas bajas y a una temperatura de enfriamiento de 21 °C. Tambien puede concluirse que el PDGF-AB es mas estable que el TGF-p a temperaturas altas y que el gel proteico basado en fibrina contiene mas cantidad de TGF-p que el gel 5 proteico basado en el sobrenadante.

Eiemplo 12

En otro ejemplo, se prepararon cuatro geles proteicos o 10 formulaciones de acuerdo con la invencion, aplicando un tratamiento termico consistente en calentar a 70°C durante 15minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos las siguientes sustancias iniciales: un sobrenadante (SN), un coagulo de fibrina (fibrina), un plasma rico en plaquetas sin activar (sin activar) y un plasma rico en plaquetas activado 15 con 10%CaCI2 sin coagular (activado sin coagular). La preparation de estas sustancias iniciales esta explicada en los Ejemplos 2, 3 y 6. Los cuatro geles proteicos fueron incubados en DMEM durante distintos periodos de tiempo (2, 4 y 7dias). Los medios de cada tiempo de incubacion fueron extraidos para determinar el contenido del PDGF-AB y 20 el TGF-P con el objetivo de determinar la cinetica de liberacion de estos factores de crecimiento de los cuatro geles proteicos. La Figura 9 muestra la cinetica de liberacion del PDGF-AB en medio de DMEM, indicandose con barras negras, blancas y rayadas las medidas correspondientes a los periodos de tiempo de incubacion de 2, 4 y 7 dlas. Puede observarse que 25 la liberacion del PDGF-AB fue mayor durante 2 y 4 dias de incubacion para el gel proteico preparado desde el sobrenadante. Los demas geles no muestran diferencias significativas entre los tres tiempos de incubacion. Por su parte, la Figura 10 muestra la cinetica de liberacion del TGF-P en medio de DMEM despues de 2 dias de incubacion. Puede 30 observarse que este factor fue presente solo en los geles proteicos preparados a partir del sobrenadante y la fibrina, siendo mayor la liberacion del TGF-p del gel proteico a partir del sobrenadante. Asi, se puede concluir que la liberacion de los factores de crecimiento es mas rapida desde los geles proteicos basados en el sobrenadante.

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Eiemplo 13

En otro ejemplo, se ensayo el efecto de relleno de los geles de proteinas o formulaciones de acuerdo con la invencion en ratas de laboratorio. Para ello se prepararon cuatro formulaciones segun la invencion. La preparation de las cuatro formulaciones comenzo con la realization de los pasos siguientes. En primer lugar, se extrajo sangre de unos pacientes a tubos de 9 ml sin anti-coagulante; se centrifugaron los tubos a 850 g durante 8 minutos para separar el plasma de los globulos rojos. Entonces, se extrajo a tubos nuevos de 9 ml toda la columna de plasma situada encima de la fraccion de globulos rojos, excluyendo los leucocitos. Este plasma fue empleado para preparar: por una parte, el propio plasma llquido (B); por otra parte, un coagulo de fibrina (C), para lo cual se anadio 10% cloruro calcico en una relacion de 50 pi por cada 1 ml de plasma, produciendose la activation del plasma y la formacion del coagulo; y por otra parte, un sobrenadante (A), para lo cual se prepare un coagulo de fibrina igual que el anterior, y se espero 60 minutos a 37°C para permitir la retraction de la fibrina y la obtencion del sobrenadante. Tambien se extrajo la sangre de los pacientes en tubos de extraction de 9 ml con 0.1 ml de 3.8% de citrato sodico como anti-coagulante. La sangre fue centrifugada a 850g durante 8 minutos, seguidamente los 2 ml de plasma justo encima de la capa leuco-plaquetaria fue obtenida y activada con 10% cloruro calcico en una relacion de 50 pi por cada 1 ml de plasma para obtener el coagulo de fibrina (D). Estas cuatro sustancias iniciales (A, B, C, D) fueron tratadas a 70°C durante 10 minutos y enfriadas a 20°C durante 10 minutos para obtener los geles. Se administro una dosis de 0,6 ml de cada una de las formulaciones de los geles a cada rata. La fotografia visible en la Figura 11 muestra la formacion de aumento en volumen sostenido por los geles proteicos indicando una mejora en sus propiedades mecanicos.

Ademas, se prepare un plasma rico en factores de crecimiento (al que se hara referenda como “PRGF-Endoret”) siguiendo los pasos de extraer sangre en tubos de 9 ml con 0,1 ml de 3.8% de citrato sodico, centrifugar la sangre a 850 g durante 8 minutos, separar la fraccion de plasma rica en plaquetas (los 2 ml de la columna de plasma justo encima

de la fraccion de globulos rojos, sin incluir los leucocitos) y, en el momento antes de inyectarlo en la rata, activar el plasma (causar la liberation de factores de crecimiento de las plaquetas) anadiendo 50 pi de cloruro calcico por cada 1 ml.

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La Figura 12 muestra los cambios en volumen tras 2 semanas de inyectar los geles proteicos en ratas y empleando como controles acido hialuronico y el plasma rico en factores de crecimiento “PRGF-Endoret” descrito anteriormente. Se puede concluir que los geles proteicos son tan 10 eficaces en mantener el volumen de la hemielipsis como el acido hialuronico, mientras que el plasma rico en factores de crecimiento “PRGF-Endoret” no fue util para mantener el volumen de la hemielipsis.

Es interesante anadir que, durante la realization de este ensayo, 15 se intento asimismo inyectar gel (coagulo) de fibrina convencional, con el fin de comparar la estabilidad de los geles proteicos segun la invention con la estabilidad del gel de fibrina. El resultado fue que no resulto posible inyectar dicho gel de fibrina porque se producia una separation de fase (se separaba la fibrina del sobrenadante), impidiendo la administracion del 20 gel de fibrina como tal.

Eiemplo 14

Se prepara el plasma rico en plaquetas como se ha descrito en el 25 Ejemplo 2. A continuation se le anade un colageno tipo I. Seguidamente, se calienta la mezcla a una temperatura de 75°C durante 10 minutos y se enfria posteriormente hasta una temperatura de 20°C durante 3 minutos. El resultado de esta preparation es un gel de proteinas que muestra mayor consistencia. Este tipo de gel se puede emplear como “filler” 30 (relleno) para el tratamiento de arrugas ya que muestra mayor estabilidad y una tasa de degradacion mas lenta que sin el colageno. Asi, esta modification contribuye a ralentizar en mayor medida aun la degradacion de la formulation. Clmicamente, esta mejora en la estabilidad aumenta el periodo entre una primera y una segunda administracion del gel. Esto 35 supone una solution a la desventaja del tratamiento de arrugas con el acido hialuronico, que requiere repetir su administracion cada 3-4 meses,

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es decir, en un corto periodo de tiempo.

Eiemplo 15

Se prepara el plasma rico en plaquetas como se ha descrito en el Ejemplo 2. A continuacidn se le afiade un fosfato calcico, por ejemplo granulado. Seguidamente, se calienta la mezcla a una temperatura de 80°C durante 10minutos y se enfria hasta una temperatura de 20°C durante 3 minutos. El material hibrido resultado de esta preparacion muestra mejores propiedades mecanicas que el gel sin modificar con fosfato calcico. Asi, la modification de gel con fosfato calcico aumenta la resistencia del gel a fuerzas de compresion y de tension. Este tipo de material se puede emplear para la regeneration de defectos oseos que requieran una mayor estabilidad mecanica del material de relleno a causa de la falta de una o mas paredes en el defecto.

Eiemplo 16

Se prepara el gel de proteinas segun la invention, segun el metodo de preparacion descrito en cualquiera de los ejemplos anteriores. Entonces, el gel se combina con acido hialuronico para producir un material hibrido. Este material muestra mejores propiedades visco- elasticas, lo que aumenta su estabilidad en la zona de administration evitando asi su migration. Este material hibrido es util para su aplicacion en superficies como puede ser la pared vestibular del proceso alveolar estrecho para provocar un crecimiento 6seo horizontal y asi aumentar el grosor del proceso alveolar para permitir la insertion de implantes dentales con suficiente cobertura osea.

Eiemplo 17

Despues de preparar el gel y desecarlo como se ha descrito en el Ejemplo 8 (cualquiera de los ejemplos de gel de proteinas descrito en el mismo es valido), el material seco se incuba, durante 24 horas y en oscuridad, en un liquido que contiene un antibiotico de doxiciclina hyclata en una concentration de 15 mg/ml. El resultado es el hinchamiento del gel

incluyendo en su estructura el antibiotico para su posterior liberacion en la zona de aplicacion. Asi, este gel sirve ahora para la liberacion controlada del antibiotico para el tratamiento de una infeccion en zona donde hay menor suministro sanguineo como por ejemplo el hueso y evita la 5 administration sistemica del antibiotico. Este procedimiento puede repetirse con otros antibioticos y otros farmacos para garantizar la liberacion local de los mismos.

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REIVINDICACIONES

1. Formulacion, que se caracteriza por que comprende un plasma sanguineo, un coagulo de fibrina obtenido a partir de un plasma sanguineo o un sobrenadante obtenido tras la retraccion de un coagulo de fibrina obtenido a partir de un plasma sanguineo, siendo dicho plasma, coagulo o sobrenadante de origen humano o animal y rico en plaquetas y/o factores de crecimiento liberados, y por que comprende ademas proteinas en estado gelificado.
2. Formulacion, segun la reivindicacion 1, que se caracteriza por que las proteinas son albumina, glicoproteinas, globulinas y/o fibrinogeno.
3. Formulacion segun la reivindicacion 1, que se caracteriza por que comprende uno o mas agentes bioactivos seleccionados entre proteinas, peptidos, acidos nucleicos, polisacaridos, lipidos, sustancias organicas no proteicas y sustancias inorganicas.
4. Formulacion segun la reivindicacion 1, que se caracteriza por que comprende uno o mas polimeros biodegradables seleccionados entre: acido hialuronico, sales de hialuronato, chondroitin 4 sulfato, chondroitin 6 sulfato, dextran, gel de silice, alginato, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de chitin, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietileno glicolicos (PEG), polihidroxietilenometacrilato (FIEMA), proteinas sinteticas o naturales, colagenos.
5. Formulacion segun la reivindicacion 1, que se caracteriza por que comprende uno o mas polimeros organicos seleccionados del grupo de policarpolactona, poliglicolico, polilactico, y sus co-polimeros.
6. Formulacion segun la reivindicacion 1, que se caracteriza por que comprende uno o mas de entre los siguientes agentes: antibioticos, antimicrobianos, anticancerigenos, analgesicos, factores de crecimiento, hormonas.

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7. Formulacion segun la reivindicacion 1, que se caracteriza por que comprende uno o mas componentes inorganicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio.
8. Metodo de preparation de una formulacion con propiedades biologicas o medicas deseables, caracterizado por que comprende los pasos de:

a) disponer de un plasma sangulneo, un coagulo de fibrina obtenido a partir de un plasma sangulneo o un sobrenadante obtenido tras la retraccion de un coagulo de fibrina obtenido a partir de un plasma sangulneo, siendo dicho plasma, coagulo o sobrenadante de origen humano o animal y rico en plaquetas y/o factores de crecimiento liberados;

b) calentar dicho plasma, dicho coagulo o dicho sobrenadante a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto;

c) enfriar el plasma, el coagulo o el sobrenadante durante al menos 1 minuto.
9. Metodo segun la reivindicacion 8, que se caracteriza por que la composicion sanguinea inicial se calienta a una temperatura de entre 70 y 85°C.
10. Metodo segun la reivindicacion 8, que se caracteriza por que el metodo comprende el paso de, antes de calentar, activar las plaquetas y esperar hasta que se forme una fibrina provisional.