CN105431155B - 富含血小板和/或生长因子并具有凝胶型蛋白质的血液组合物的制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

含有或衍生自初始血液组合物的制剂，所述初始血液组合物富含血小板和/或生长因子以及来源于实际的初始血液组合物的蛋白质，其中蛋白质是胶凝状态的。本发明还涉及制备所述制剂的方法，其包含在特定温度和特定时间加热并随后冷却初始血液组合物的步骤。除其它优点，根据本发明的制剂是生物相容和可生物降解的，呈现由血小板或生长因子存在提供的希望的生物学或医学性质，并还呈现随时间推移的高度的尺寸稳定性。

Description

富含血小板和/或生长因子并具有凝胶型蛋白质的血液组合 物的制剂及其制备方法
说明书
技术领域
本发明涉及具有希望的生物学或医学性质的制剂，该制剂获自富含血小板和/或富含生长因子的初始血液组合物。本发明还涉及制备所述制剂的方法。
现有技术
现有技术已描述来自人和动物血液的组合物的制备，其中将血液以得到呈现有用的生物学和医学性质的富含血小板的血浆(PRP)和/或富含生长因子的血浆(PRGF)的方式进行处理。已成功将所述PRP或PRGF用于离体应用，例如作为细胞培养基，以及体内应用，例如用于完成患者的骨再生过程或者通过渗入用于治疗患关节疼痛的患者。在将所述组合物要用于体内应用以治疗患者的情况中，制备PRP和PRGF制剂的技术已朝向自体组合物的制备即从患者自身的血液得到的组合物发展。所述类型组合物和制备方法的示例可见于专利US6569204和ES2221770中。
在最近几年，技术已经发展，目的在于保证可以以盖伦(galenic)组合物或药物制剂的形式得到富含血小板和/或生长因子的组合物。将盖伦组合物或药物制剂理解为使无论化学或生物来源(如采用PRP或PRGF中的蛋白质的情况)的药物或主要活性成分适合个体化供应，以便于其施用。药物的盖伦组合物或药物制剂是特别重要的，因为其决定药物的有效性和安全性，因为其控制药的剂量和药物分子向组织的递送。此外，药物的盖伦组合物或药物制剂是保证药物的制备、其剂量及其施用是已知的、受控的，并能相对容易和以可重复方式实行的决定性因素。简言之，盖伦组合物或药物制剂寻求便于处理、保存、运输、施用，并就整体而言，用于治疗目的的任何药物或物质的性质。
最广泛应用的PRP或PRGF药物制剂之一已知为纤维蛋白凝胶或纤维蛋白筛，其是在某些应用中非常有用的具有半固体状稠度的制剂。制备纤维蛋白凝胶或筛的方法通常开始于第一阶段，其中利用适用方法得到PRP或PRGF，例如通过将从患者提取的血液离心，直至血液分成不同级分(fraction)，并提取顶部级分即富含血小板的血浆(PRP)和富含生长因子的血浆(PRGF)的级分。然后，将PRP或PRGF中所含的血小板活化(活化应理解为使血小板释放其内部所含一些生长因子的行动)，例如通过加入氯化钙来活性。由于活化，并假如允许经过足够量的时间，来自血浆中包含的纤维蛋白原的纤维最终发生聚合，由此产生构成纤维蛋白凝块的最终化合物(其还称作纤维蛋白凝胶或筛，这是因为其半固体稠度，像一种类型的生物海绵)。为了从用抗凝剂例如用柠檬酸钠改性的血液中得到纤维蛋白凝胶，这是是通常完成的过程。还可以在不将其先与抗凝剂混合的情况下，将血液进行处理。在这一情况下，当将血液离心时，不需加入氯化钙或任何其他血小板活化剂，将血浆与血红细胞分离，并得到纤维蛋白凝胶。可将纤维蛋白凝胶或筛用于例如下述应用中：以形成填充骨质缺损的生物支架；以施用至伤口或外伤，用于逐步释放生长因子；以用作基质，用于干细胞的培养；以用作密封缺损或溃疡的膜；以及其用于组织的生产，这是组织工程学已知的，其中除细胞和生长因子之外，具有细胞可在其上面生长的基质或支架是尤其重要的。
纤维蛋白凝胶或筛具有一些显著的局限。纤维蛋白凝胶或筛的主要限制是其是不稳定的并趋向于收缩的事实。因此，纤维蛋白凝胶或筛不能随时间推移维持稳定体积或者不能随时间推移提供稳定的组织支持。尽管在一些应用中，所述收缩的趋向性可能是需要的，但是在其他应用中，是不需要的。例如，作为窦底提升已知的牙外科技术中，用于再生骨质缺损的生物材料必须具有骨传导性，并且其还必须能长期维持物理空间，直到骨基质形成；否则，空间会倒塌，不利地影响牙槽骨的垂直再生。另一个示例是胸腺切除(乳房切除术)的实例，其中用于填充乳腺空间的生物材料或凝胶必须提供适当的机械阻力，并长期提供空间和体积，以保证所述空间不塌陷。另一个示例是填充剂或化妆品填充剂(例如透明质酸)的实例，其是广泛用于美学领域的填充物质(提供和维持体积)，以增加角落和皱折的体积，并矫正所述缺陷，提供更年轻的外观；设计为作为填充剂或填充物质的任何物质必须是机械稳定的，并抵抗压缩，以便其能维持组织的体积。此外，纤维蛋白凝胶或筛的收缩趋势阻碍并甚至阻止凝胶或筛作为释放另外的外部物质、药物、蛋白质等物质的应用。
纤维蛋白凝胶或筛的另外限制是其不能以其正常、半固体状态渗入或插管引入，这阻止其作为填充剂施用在皮肤上、用于皮肤-化妆品、创伤学和其他领域例如生物学或药物领域。
本发明的目的是提供具有希望的生物学或医学性质、自富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物得到的制剂，且该制剂不趋向于收缩，由此随时间推移维持稳定体积。其他应用中，在其中稳定组合物是需要的一些应用中，所述制剂提供纤维蛋白凝胶或筛的替代是合乎需要的。
发明简述
本发明涉及具有希望的生物学或医学性质的制剂，其包含或衍生自富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物(人或动物来源的；自体的、同源的或异源的)，且其包含来源于初始血液组合物的蛋白质。该制剂提供所述蛋白质由于加热和冷却处理导致的胶凝状态的独特性质。具体地讲，胶凝蛋白质优选是白蛋白、糖蛋白、球蛋白和/或纤维蛋白原。本发明的制剂可描述为“蛋白质凝胶”(使用用于指纤维蛋白凝胶的类似术语)，因为其提供胶凝状态蛋白质提供的凝胶样稠度。所述制剂是可变形的。与其它填充凝胶、其它富含血小板和/或生长因子的血液组合物，以及现有技术已知的其它类似组合物相比，本组合物提供新的形态学和生物力学结构。
还提供用于制备上述制剂的方法，该方法包含下述步骤：得到富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物，其基础配方可以变化；将所述初始血液组合物在60℃-100℃的温度下加热至少一分钟；将初始血液组合物冷却至少一分钟。可视作热序列的本发明方法为富含血小板和/或生长因子的血液组合物提供体积和刚性，产生蛋白质凝胶或具有凝胶稠度的制剂，其归因于初始血液组合物中所含的一些蛋白质的胶凝状态。
本发明的制剂是生物相容的、可生物降解的，并呈现由存在的血小板或生长因子提供的希望的生物学或医学性质。此外，由于初始血液组合物中所含的一些蛋白质的胶凝状态，其还具有稠密或粘稠的稠度，所述稠密或粘稠的稠度随时间推移是稳定的。因此，本发明制剂是纤维蛋白凝胶或筛的有利替代物，这是由于该制剂不收缩并由此保持物理空间被填充的事实。此外，所述制剂提供对压缩的良好耐受，与透明质酸(通常用作填充剂或填充物质)类似或比透明质酸更好，并令人满意地经受住组织可能施加的抵抗力。因此，所述制剂是高度适合于用作填充剂或填充物质的。此外，即使当纤维蛋白筛和本发明制剂本质上都是半固体时，仅后者可以是被渗入或被注入的，这归因于其可变形的事实。本制剂的另一个优点是可将其干燥，并在以后再水合。
附图简述
本发明的详述可见于所附的非限制性附图：
-图1显示根据本发明的示例性制剂的两个电子显微图像。
-图2显示根据本发明的另一个示例性制剂的两个电子显微图像。
-图3显示由以不同温度和时间处理的纤维蛋白凝块制备的根据本发明的各制剂的溶胀因子。
-图4显示通过在不同温度和时间处理上清液而制备的根据本发明的各制剂的溶胀因子。
-图5显示根据本发明的各制剂的骨细胞相容性结果，其是用MG 63成骨细胞样细胞系测试的。
-图6显示根据本发明的各制剂的其它骨细胞相容性结果，其是用MG63成骨细胞样细胞系测试的。
-图7和8分别显示根据本发明的12种制剂中血小板-衍生生长因子(PDGF-AB)和β转化生长因子(TGF-β)的含量。
-图9显示在孵育不同时间的四种本发明制剂中PDGF-AB生长因子的释放动力学。
-图10显示当孵育两天时，根据本发明的四种制剂的TGF-β生长因子的释放动力学。
-图11显示已注射根据本发明的四种制剂样品的实验室大鼠的背部照片。
-图12显示与前一附图的测试相关的图片，其显示注射后两周测量的在真皮内水平注射制剂后半椭球的体积。
本发明详述
为了克服与纤维蛋白凝胶和筛状物缺乏稳定性相关的现有技术中存在的问题，提出具有希望的生物或医学性质且具有随时间推移的提高的稳定性的替代制剂。所述制剂包含或衍生自初始血液组合物。血液组合物富含血小板和/或生长因子，并还包含各种蛋白质。因此，所述制剂还富含血小板和/或生长因子，并包含各种蛋白质。所述蛋白质中，存在一些胶凝状态的蛋白质，这旨在说所述蛋白质是变性的，并形成组织化的蛋白质的网状系统，这优选归因于热处理和冷却处理。胶凝状态的蛋白质优选是白蛋白、糖蛋白、球蛋白和/或纤维蛋白原。还已证实根据本发明的蛋白质凝胶不收缩，可容易地插管引入或渗入，并保持体积和空间，不同于仅基于纤维蛋白网状系统的其它凝胶。
初始血液组合物可例如是富含血小板的血浆，即具有高浓度血小板的血浆。通常，利用血液离心技术(以将血液分成血红细胞级分、白血细胞级分和富含血小板的血浆(PRP)的级分)，得到所述血浆，随后进行分离全部或部分富含血小板的血浆(PRP)的级分的步骤。
初始血液组合物还可以是富含血小板的血浆(PRP)的上清液。上清液是当引发富含血小板的血浆(PRP)凝结及其随后的收缩后，出现在凝块上的大量液体。
初始血液组合物可以是富含释放的生长因子的血浆(PRGF)，即由于血小板释放其内部的一些生长因子而被活化的(例如通过加入氯化钙、凝血酶、氯化钙和凝血酶的组合、葡萄糖酸钠、胶原或者可通过活化血小板并诱导纤维蛋白形成而起作用的任何其它物质)富含血小板的血浆。
类似地，初始血液组合物可以是富含释放的生长因子的血浆(PRGF)的上清液，即先前已活化的(例如通过加入氯化钙、凝血酶、氯化钙和凝血酶的组合、葡萄糖酸钠、胶原或者可通过活化血小板并诱导纤维蛋白形成而起作用的任何其它物质)富含血小板的血浆凝结并随后收缩而得到的上清液。活化致使血小板释放其内部的一些生长因子。
初始血液组合物可以含有或可以不含有白细胞。
起始组合物还可以是从还未用抗凝剂改性的处理血液直接得到的纤维蛋白凝胶。
还提供制备具有希望的生物学或医学性质的制剂的方法，其中所述方法包含下述步骤：
a)提供富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物，其优选是含有或不含白细胞的富含血小板的血浆，含有或不含白细胞的富含生长因子的血浆，含有或不含白细胞的富含血小板的血浆的上清液，含有或不含白细胞的富含生长因子的血浆的上清液或者自未用抗凝剂改性的血液得到的纤维蛋白凝胶；
b)在血液组合物含有血小板的情况下，任选地用活化剂例如氯化钙、凝血酶、葡萄糖酸钙、胶原或者任何其它活化剂或其组合活化血小板，并直到形成暂时的纤维蛋白；
c)将初始血液组合物在60℃-100℃的温度下加热至少1分钟；
d)将初始血液组合物冷却或淬火至少1分钟。
由于诱导人血浆中的数种蛋白质的蛋白质胶凝化，上述方法使得初始血液组合物热休克；其中，所述蛋白质尤其是白蛋白、糖蛋白、球蛋白和/或纤维蛋白原。对于本发明，“胶凝化”是赋予分子经历的过程的名称，且在所述过程中分子聚合或连接在一起，形成组织化的蛋白质网状系统。总的来说，由于所述热休克处理，形成新的生物相容的和可生物降解的制剂，这取决于初始血液组合物，其共同点是胶凝化或蛋白质聚合。
此外，还已显示提供有胶凝蛋白质的根据本发明的制剂很在程度地维持初始血液组合物中生长因子的水平。换言之，热休克不引起所述初始血液组合物中生长因子的大量破坏。
优选地，将初始血液组合物在70℃-85℃的温度下加热。
富含血小板和/或生长因子的初始血液组合物是人或动物来源的。其还可以是自体的(属于在以后阶段要用所述最终制剂治疗的患者)、同源的(属于与要用最终制剂治疗或处理的患者、细胞或其它生物实体相同种类的成员)或异源的(属于与要用最终制剂治疗或处理的患者、细胞或其它生物实体不同种类的成员)。
本发明认为初始血液组合物可任选地包括在所述的热处理之前加入的一种或多种其它物质。所述其它物质可以是：
-一种或多种生物活性物质，其选自蛋白质、肽、核酸、多糖、脂质、非蛋白质有机物质和无机物质；
-一种或多种可生物降解的聚合物，其选自透明质酸、透明质酸盐、软骨素4-硫酸盐、软骨素6-硫酸盐、葡聚糖、硅胶、藻酸盐、羟丙基甲基纤维素、壳多糖衍生物–优选壳聚糖-、黄原胶、琼脂糖、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羟乙基酯(PHEMA)合成的或天然的蛋白质和胶原；
-一种或多种有机聚合物，其选自聚己酸内酯、聚乙醇酸交酯、聚交酯及其共聚物；
-一种或多种下述物质：抗生素、抗微生物剂、抗癌药、镇痛药、生长因子、激素；
-一种或多种无机成分，其选自钙盐、镁盐和/或锶盐。
本发明还认为，在完成热处理后，可将任何上述物质加入到制剂中。
根据本发明的制剂可提供各种实施方案，其中除所述及的技术方面之外，本制剂还可包含适合于制剂将要应用于其的特定应用的化合物、成分和分子等，即将本发明认为是基于蛋白质凝胶的新制剂家族，该家族是由不同制剂形成的，在所述制剂中存在胶凝的蛋白质，且所述制剂在其另外的组成上可以是不同的。
此外，可以对含有胶凝蛋白质的制剂进行另外的步骤，包括干燥基质，作为使它们更加通用的手段。换言之，可将本发明的胶凝蛋白质的制剂干燥(干热)或冻干，以形成膜。随后，可利用各种供选方案例如加入盐水溶液、富含血小板的血浆、富含血小板的血浆的上清液、富含生长因子的血浆、富含生长因子的血浆的上清液或者保证膜可被水合的任何其它溶液，将膜再水合。
实施例
实施例1
本方法开始于从患者提取的并贮存于不含柠檬酸盐抗凝剂的密封管中的9ml血液样品。将血液在580g的速度下并于环境温度下离心8分钟。由于离心，将管中所含的血液分成不同级分。将顶部级分或者富含血小板的血浆(PRP)级分(其包含白血细胞)提取到5ml注射器中。因为开始的管无柠檬酸盐，PRP开始凝固。将注射器的内含物在70℃的温度下，加热10分钟。然后，将容器在4℃的温度下冷却2分钟。由于所述加热-冷却序列，在注射器内形成具有凝胶稠度的半固体物质。由此，得到活化的制剂，活化制剂提供凝胶样稠度(由于凝固形成的纤维蛋白和热处理产生的蛋白质的胶凝)，并且无柠檬酸盐和钙。纤维蛋白的出现为制剂提供更大的稠度和抵抗力，并且胶凝的蛋白质提供恒定的稳定性和体积。由于其性质和机械抵抗力，这种类型的物质可用于例如校正面部组织的垂直缺陷。
实施例2
本方法开始于从患者提取的并贮存于密封提取管中的9ml血液样品，所述密封管中包含0.1ml的量的3.8％柠檬酸盐抗凝剂。将血液在580g的速度下并于环境温度下离心8分钟。由于离心，管中所含的血液分成不同级分。将顶部级分或者富含血小板的血浆(PRP)级分提取到5ml注射器中，不包含白细胞。将注射器在80℃的温度下，加热3分钟。然后，将注射器在20℃的温度下冷却10分钟。由于所述加热-冷却序列，在第二个容器内部形成半固体物质。该物质具有凝胶样稠度，且其血小板还未被活化。该物质不含纤维蛋白，因为未将其预先凝固。可将这种类型的物质用于例如作为整容手术的填充剂，以通过清除或减少皱纹的出现而获得更年青的外表；可使用该物质，归因其被注射的稳定性(利用比25G小或等于25G的针)以及其稠度，其能使皮肤除皱。该生物凝胶随时间推移是稳定的，且其还释放刺激细胞生长和增殖的生长因子，因此，与常规物质例如透明质酸相比，其非常有利。透明质酸是现在最广泛使用的填充材料，其缺乏生物活性，并由此不促进组织的形成或者不实现随时间推移的持续改善，这意味着必须定期(通常每3-4个月)施用透明质酸。
实施例3
本方法如下开始：从患者提取9ml血液样品并将血液贮存于密封提取管中，所述密封管包含0.1ml的3.8％柠檬酸盐抗凝剂。将血液在580g的速度下，并于环境温度下离心8分钟。由于离心，管中所含的血液分成不同级分。将顶部级分或者富含血小板的血浆(PRP)级分提取到5ml注射器中不包含白血细胞。然后，以每1ml血浆50μl的比率，加入10％氯化钙，使血小板活化，即生长因子释放和血浆凝固。然后，将注射器在75℃的温度下，加热5分钟。然后，将注射器在环境温度冷却10分钟。由于所述加热-冷却序列，在注射器内部形成半固体物质。由于因凝固产生的纤维蛋白和热处理产生的蛋白质的胶凝化，该物质具有凝胶样稠度。该物质包含柠檬酸盐、钙和释放的生长因子。可将这种类型的物质用于填充骨质缺损，例如牙科机头拔掉后留下的齿槽，以促进齿槽的修复。由于生长因子的释放和凝胶作为细胞生长的支持物的能力，凝胶促进骨组织填充齿槽，由此减少例如替代拔掉的牙的齿槽中的牙植入物的进一步填充的等待时间。
实施例4
本方法如下开始：从患者提取9ml血液样品并将其贮存于密封提取管中，所述密封管包含0.1ml的浓度3.8％(重量/体积)的作为抗凝剂的柠檬酸钠溶液。将血液在580g的速度下，并于环境温度下离心8分钟。由于离心，管中所含的血液分成不同级分。将顶部级分或者富含血小板的血浆(PRP)级分提取到9ml分级管中，无白细胞。以每1ml血浆50μl的比率，加入氯化钙溶液(具有10％重量/体积的浓度)。然后将管插入在37℃的恒温器中。氯化钙使血小板活化(生长因子释放)、血浆凝固并形成纤维蛋白，所述形成被下述事实加速：将管置于恒温器的温度条件下。然后，由于凝结收缩，得到两相：固相，其是三维纤维蛋白结构，以及液体上清液相，其含有蛋白质、血小板生长因子和血浆生长因子。将液体相或上清液分到3ml注射器中。然后，将注射器在80℃的温度下加热10分钟然。然后，将注射器在22℃的温度下冷却5分钟。由于所述加热-冷却序列，在注射器内部形成半固体物质。该半固体物质具有比确实含有纤维蛋白的根据本发明的制剂更低的固体稠度。由于其更低的固体稠度，可将这种类型的物质用于例如填充牙周的内部-骨质缺损，用于促进牙周组织的再生。通过进行该物质的骨膜下或骨膜上的渗入，还可将其用于再生骨。
实施例5
在另一实施例中，方法开始于纤维蛋白凝块(将血液在580g速度和20℃温度下离心，以得到富含血小板的血浆，以每1ml血浆50μl氯化钙的比率，加入氯化钙，并等待10-20分钟，直到纤维蛋白聚合后，制备的物质)。将凝块在70℃加热10分钟，随后在20℃冷却10分钟，由此得到蛋白质凝胶。图1显示上述蛋白质凝胶的两个电子显微图像。左侧的图像显示圆形结构的出现，其代表变性白蛋白，以及线性结构，其是纤维蛋白的纤维。右侧的图像显示凝胶的致密(外部)表面。
实施例6
在另一实施例中，方法开始于富含生长因子的血浆(PRGF)(将血液在580g速度和20℃温度下离心，以得到不同级分，分离富含血小板的血浆(PRP)级分，并以每1ml血浆50μl氯化钙的比率，加入氯化钙，用于引起生长因子释放，并启动血浆凝固后，制备的物质)。凝块收缩使得能够得到上清液。然后，将所述上清液在70℃加热10分钟，随后在20℃冷却10分钟，得到蛋白质凝胶。图2显示上述蛋白质凝胶的两个电子显微图像。左侧的图像显示凝胶的内部和代表变性白蛋白的圆形结构的出现。右侧的图像显示凝胶的致密(外部)表面。
实施例7
在另一实施例中，通过将纤维蛋白凝块(根据实施例5中所述制备的)置于不同的温度和时间，制备各种蛋白质凝胶。制备条件如下：将凝块在70℃加热15分钟(正方形)，将凝块在70℃加热30分钟(圆形)，将凝块在80℃加热15分钟(三角形)；并将其全部在4℃温度下冷却10分钟。将这些凝胶在37℃干燥24小时，然后在蒸馏水中温孵。将凝胶以24小时的间隔称重，以计算溶胀度，其定义为：溶胀重量/起始重量。图3显示在不同温度和时间制备的蛋白质凝胶的度或溶胀因子。正如所见，由于水的吸收，以及水分在结构内部的保留，凝胶比其起始重量增加2-3倍。还可以发现：在70℃保持15分钟制备的凝胶(正方形)在24小时内溶胀，且历经更长的温孵时间，其溶胀因子不显著变化。然而，在70℃保持30分钟制备的凝胶(圆形)，24小时后溶胀至其起始重量的大约3倍，但是随着温孵时间延长，观察到溶胀因子的轻微下降。同时，在80℃保持15分钟制备的凝胶(三角形)比前两种需要更长的时间达到最大溶胀，具体地为48小时。在任何情况下，凝胶的溶胀性意味着可将其用作例如用于生物活性物质(蛋白质或主要活性物质)的局部释放的基质。通过将含有所述生物活性物质的溶液施用在脱水的凝胶上，由此引起凝胶水合，并因此引入生物活性物质，正常地实现所述应用。
实施例8
在另一实施例中，通过将上清液(根据实施例6制备的)置于不同的温度和时间，制备各种蛋白质凝胶。制备条件如下：将上清液在70℃加热15分钟(正方形)，将上清液在70℃加热30分钟(圆形)，将上清液在80℃加热15分钟(三角形)；并将其全部在4℃温度下冷却10分钟。将这些凝胶在37℃干燥24小时，然后在蒸馏水中温孵。将凝胶以24小时的间隔称重，以计算溶胀度，其定义为：溶胀重量/起始重量。起始重量是在水中温孵之前的干凝胶的重量。图4表示在不同温度和时间制备的蛋白质凝胶的溶胀度。正如所见，由于水的吸收，以及水分在结构内部的保留，凝胶的起始重量已增加大约3倍。还可以发现：在70℃保持15分钟制备的凝胶(正方形)在24小时内溶胀，且在更长的温孵时间，其溶胀因子不显著变化。相反，在70℃保持30分钟制备的凝胶(圆形)，48小时后溶胀至其起始重量的3倍，但是在更长的温孵时间，观察到溶胀因子的轻微下降。同时，在80℃保持15分钟制备的凝胶(三角形)24小时温孵后，达到所述大约等于3的溶胀因子。在任何情况下，凝胶的溶胀性保证可将其用作例如用于局部释放生物活性物质(蛋白质或活性成分)的基质。通过将含有所述生物活性物质的溶液施用在脱水的凝胶上，由此引起凝胶水合，并因此将生物活性物质引入其内部，正常地实现所述应用。
实施例9
在另一实施例中，由下述根据本发明制备四种蛋白质凝胶或制剂：上清液(在本实施例的末尾提及的图中表示为“SN”)、纤维蛋白凝块(“纤维蛋白”)、非活化的富含血小板的血浆(“非活化的”)和用10％CaCl2活化而未凝固的富含血小板的血浆(“活化的-未凝固的”)，并进行上述起始物质的热处理，其由以下构成：将物质在70℃加热15分钟，并将其在21℃冷却10分钟。制备这些起始物质的方法解释在实施例2、3和6中。将热处理后得到的这四种制剂的每一种在无胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中温孵48小时。此外，本方法还配有第5种物质或对照物质，其由无胎牛血清的DMEM构成。将5种培养基用于孵育MG 63细胞，并每2天(正方形)、4天(圆形)和7天(三角形)更新。每个所述间隔后，利用色度法试剂WST-1和读板仪，评价细胞增殖。利用下述函数计算增殖百分数：％增殖＝(WST-1的凝胶吸光度/WST-1对照物质的吸光度)x 100。图5显示用MG 63成骨细胞样细胞系测试的蛋白质凝胶的骨细胞相容性结果。可见，如相对于对照样品，细胞增殖的增加所示，所述凝胶是无毒的。增殖两天后(正方形)，由非活化富含血小板的血浆制备的凝胶产生更大的细胞增殖。然而，这些差异在更长的增殖时间(圆形、三角形)没有增加。因此，该实施例证实根据本发明的制剂提供刺激细胞生长的适当行为，并且是生物相容的，保证将它们向临床应用发展。
实施例10
如上述实施例中，根据本发明由下述物质制备四种蛋白质凝胶或制剂：上清液(正方形)、纤维蛋白凝块(圆形)、非活化的富含血小板的血浆(三角形，中央顶点指向上)和用10％CaCl2活化而未凝固的富含血小板的血浆(三角形，中央顶点指向下)。将所有物质进行热处理，所述热处理由下述构成：将物质在70℃加热15分钟，并将其在21℃冷却10分钟。制备这些起始物质的方法解释在实施例2、3和6中。将得到的四种制剂在培养基中孵育2天、4天、7天和9天。在每个间隔末，收集培养基，并向凝胶中加入新的培养基。贮存收集的培养基，以便将其用于培养MG 63细胞。使细胞在所述培养基中生长48小时。然后，利用色度法试剂WST-1和读板仪，评价细胞增殖。利用下述函数计算增殖百分数：％增殖＝(WST-1的凝胶吸光度/WST-1对照物质的吸光度)x 100，其中将无血清的DMEM用作对照物质。图6显示培养基中以及在各个孵育时间间隔的细胞增殖。正如所见，2天培养后，达到较大的细胞增殖。在更长的培养时间，培养基刺激较低的细胞增殖，所述看起来表明培养2天后，生长因子的释放是更大的，该生长因子含量在采用更长的培养时间(4、7和9天)的培养基中更少。因此，这些结果显示随时间推移凝胶中刺激细胞增殖的物质的释放降低，遵循与其它类型凝胶类似的释放模式，其特征在于培养的前几小时期间，释放大量的生物活性物质(“突释”效应)，并且随着时间流失，释放量显著降低。
实施例11
在另一实施例中，方法开始于两种起始物质。第一种物质是以每1ml血浆50μl氯化钙的比率用氯化钙活化富含血小板的血浆后得到的纤维蛋白凝胶(根据实施例6)。第二种物质是纤维蛋白凝胶收缩后得到的上清液(根据实施例6)。将两种物质都进行三种不同的热处理：在70℃加热15分钟，在70℃加热30分钟，和在80℃加热15分钟。在所有情况下，加热后，在4℃温度或者在20℃温度下冷却10分钟。得到12种蛋白质凝胶。然后，将这12种凝胶在14800rpm离心20分钟。然后，测量血小板衍生生长因子(PDGF-AB)和β转化生长因子(TGF-β)的含量。图7和8中显示所述测量的结果，其中将12种凝胶用两个6组显示，将组命名为“1”(70℃、15分钟的纤维蛋白凝胶)、“2”(70℃、30分钟的纤维蛋白凝胶)、“3”(80℃、15分钟的纤维蛋白凝胶)、“4”(70℃、15分钟的上清液凝胶)、“5”(70℃、30分钟的上清液凝胶)和“6”(80℃、15分钟的上清液凝胶)，并且其中，在各组中，用黑棒表示在4℃冷却的凝胶，且用白棒表示在20℃冷却的凝胶。图7显示观察到的PDGF-AB生长因子含量。可以得出结论：所述生长因子的含量在20℃冷却的凝胶中(白棒)比在4℃冷却的凝胶中(黑棒)通常更大，在70℃保持30分钟(“5”)和在80℃(“6”)制备的上清液凝胶除外，其中几乎未观察到PDGF-AB含量的依据冷却温度的任何差异。图8显示观察到的TGF-β生长因子的含量。可以得出结论：对于从纤维蛋白制备的凝胶(组“1”、“2”、“3”)，在20℃进行冷却的情况下(白棒)，TGF-β的因子的含量在这三组中类似，即对于用于制备凝胶的不同热处理，而在4℃进行冷却的情况下(黑棒)，TGF-β因子的含量在70℃保持15分钟制备的凝胶中更大(组“1”)。相反地，对于从上清液制备的凝胶(组“4”、“5”、“6”)，可以发现仅在70℃保持15分钟的上清液制备的蛋白质凝胶(组“1”)释放TGF-β，在从上清液制备的其它凝胶中，未检测到所述因子。因此，可得出结论：在超过70℃的温度下，纤维蛋白凝胶比上清液保持更高的生长因子含量，因此加热温度和冷却温度影响所述生长因子的含量，在较低的加热温度和在21℃的冷却温度下，含量是更大。还可以得出结论在高温度下，PDGF-AB比TGF-β更稳定，并且基于纤维蛋白的蛋白质凝胶比基于上清液的蛋白质凝胶含有更大量的TGF-β。
实施例12
在另一实施例中，通过施用热处理根据本发明制备四种蛋白质凝胶或制剂，所述热处理由将下述起始物质在70℃加热15分钟，并将其在21℃冷却10分钟构成：上清液(SN)、纤维蛋白凝块(纤维蛋白)、非活化的富含血小板的血浆(非活化的)，以及用10％CaCl2活化而未凝固的富含血小板的血浆(活化的、未凝固的)。所述起始物质的制备解释在实施例2、3和6中。将这四种蛋白质凝胶在DMEM中温孵不同的时间段(2天、4天和7天)。在各温孵时间，提取培养基，以测定PDGF-AB和TGF-β的含量，用于测定四种蛋白质凝胶的所述生长因子的释放动力学。图9显示DMEM培养基中PDGF-AB的释放动力学，用黑色、白色和条纹棒表示相应于2天、4天和7天的温孵时间段的测量。可以发现对于自上清液制备的蛋白质凝胶，温孵2天和4天期间，PDGF-AB的释放是更大的。其它凝胶未显示三种温孵时间段间的任何显著差异。接着，图10显示在DMEM培养基中温孵2天后，TGF-β的释放动力学。可以发现所述因子仅存在于自上清液和纤维蛋白制备的蛋白质凝胶中，来自上清液的蛋白质凝胶中TGF-β的释放是更大的。因此，可以得出结论生长因子从基于上清液的蛋白质凝胶更快地释放。
实施例13
在另一实施例中，在实验室大鼠上，测试根据本发明的蛋白质凝胶或制剂的填充作用。制备四种本发明制剂，用于所述目的。四种制剂的制备以下述步骤开始。首先，将患者血液提取至无抗凝剂的9ml管中。将管在850g离心8分钟，以将血浆与血红细胞分离。然后，将位于血红细胞级分上方的完整血浆柱(不包括白细胞)提取到新的9ml管中。将所述血浆用于制备下述的：血浆液体本身(B)；纤维蛋白凝块(C)，为此目的以每1ml血浆50μl的比率，加入10％氯化钙，引起血浆活化和凝块形成；以及上清液(A)，为此目的，制备与上述凝块具有相同特征的纤维蛋白凝块，并在37℃保持60分钟的一段时间，使纤维蛋白收缩，并得到上清液。还从患者提取血液至9ml提取管中，管中有0.1ml作为抗凝剂的3.8％的柠檬酸钠。将血液在850g离心8分钟，得到恰好在白细胞-血小板层上方的2ml血浆，并以每1ml血浆50μl的比率，用10％氯化钙活化，得到纤维蛋白凝块(D)。将所述四种起始物质(A、B、C、D)在70℃处理10分钟，并在20℃冷却10分钟，以得到凝胶。将0.6ml剂量的每种凝胶制剂施用至各只大鼠。图11中所示的照片显示蛋白质凝胶持续的体积增加的形成，表明它们的机械性质的改善。
此外，通过下述制备富含生长因子的血浆(其将被称为“PRGF-Endoret”)：将血液提取在含有0.1ml 3.8％的柠檬酸钠的9ml管中，将血液在850g离心8分钟，分离富含血小板的血浆级分(恰好在红细胞级分上方的2ml血浆柱，不包括白细胞)，并在注射进大鼠中之前，通过每1ml加入50μl氯化钙，活化血浆(引起血小板生长因子的释放)。
图12显示在大鼠中注射蛋白质凝胶2周后，体积的变化，并采用透明质酸和上述富含生长因子的PRGF-Endoret血浆作为对照。可得出结论蛋白质凝胶在维持半椭球体体积方面与透明质酸一样有效，而富含生长因子的PRGF-Endoret血浆不可用于维持半椭球体体积。
应该补充的是，测试期间，还进行了注射常规纤维蛋白凝胶(凝块)的尝试，以将根据本发明的蛋白凝胶的稳定性与该纤维蛋白凝胶的稳定性进行比较。结果是注射所述纤维蛋白凝胶是不可行的，因为发生相分离(纤维蛋白与上清液分离)，阻止所述纤维蛋白凝胶被施用。
实施例14
根据实施例2中所述，制备富含血小板的血浆，然后，加入I型胶原。然后，将混合物在75℃温度下加热10分钟，并随后在20℃温度下冷却3分钟。所述制备的结果是显示更大稠度的蛋白质凝胶。可将这种类型的凝胶用作填充剂，用于治疗皱纹，因为其比无胶原的显示更高的稳定性和更慢的降解速率。因此，所述修改帮助甚至进一步延缓制剂的降解。在临床上，所述稳定性的改善增加凝胶第一次施用和第二次施用之间的间隔期。这提供用透明质酸治疗皱纹的缺点(其涉及每3-4个月(换句话讲，在短时间内)重复施用)的解决方法。
实施例15
根据实施例2中所述，制备富含血小板的血浆。然后，加入磷酸钙，例如颗粒形式的。然后，将混合物在80℃温度下加热10分钟，并在20℃温度下冷却3分钟。由所述制备产生的杂化材料显示比未用磷酸钙改性的凝胶更好的机械性能。用磷酸钙的凝胶改性增加凝胶对压缩和张力的抵抗。可将这种类型的材料用于再生骨质缺损，因为在所述缺损中一种或多种壁的缺乏，其需要填充材料具有更大的机械稳定性。
实施例16
利用上述实施例中任何一个所述的制备方法，制备根据本发明的蛋白质凝胶。然后，将凝胶与透明质酸组合，以产生杂化材料。所述材料显示更好的粘弹性，这提供其在施用区域的稳定性，从而防止其迁移。该杂化材料可用于在表面施用，例如狭窄牙槽突的前庭壁，以引起横骨生长，并由此增加牙槽突的厚度，以使牙移植物的插入具有足够的骨覆盖。
实施例17
根据实施例8中所述制备和干燥凝胶后(其中所述的蛋白凝胶的任何一个实例是有效的)，在黑暗中、在以15mg/ml浓度含有盐酸多西环素抗生素的液体中，将所述干燥材料温孵24小时。结果是凝胶溶胀，凝胶结构包含抗生素，用于在施用区域的随后释放。现在，因此可将所述凝胶用于抗生素的控释，以在其中存在较低的血液供应的区域(例如骨)治疗感染，并阻止抗生素的全身施用。可用其它抗生素和其它药物重复所述方法，以保证它们的局部释放。

Claims (7)

1.制备富含释放的生长因子和血小板的胶凝的人血液组合物的方法，其基本上由下述步骤组成：
a)使富含血小板和/或生长因子的人初始血液组合物与透明质酸和柠檬酸钠混合，形成混合物；
b)将所述混合物在70℃-85℃的温度下加热至少1分钟；
c)将所述加热的混合物冷却至4℃至20℃至少一分钟，得到富含释放的生长因子和血小板的胶凝的人血液组合物。
2.根据权利要求1的方法，其中人初始血液组合物是富含血小板的血浆。
3.根据权利要求1的方法，其中人初始血液组合物是富含血小板的血浆的上清液。
4.根据权利要求1的方法，其中人初始血液组合物是富含释放的生长因子的血浆。
5.根据权利要求1的方法，其中人初始血液组合物是富含释放的生长因子的血浆的上清液。
6.根据权利要求1的方法，其中人初始血液组合物还是纤维蛋白凝胶。
7.根据权利要求1的方法，其中在加热之前，进行活化血小板并等待直到形成暂时的纤维蛋白的步骤。
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