TWI684454B - 富含血小板及／或生長因子且含有膠凝蛋白之血液組成物之調配物、及其製造方法 - Google Patents

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Abstract

一種之調配物，其包含、或衍生自初始血液組成物，其中該調配物富含血小板及/或生長因子及源自該初始血液組成物之蛋白質，且其中該蛋白質係於膠凝狀態。本發明亦有關用於製備該調配物之方法，其包含於特定溫度及時間下加熱且之後冷卻該初始血液組成物之步驟。在眾多益處之中，本發明之調配物為生物相容性及生物可降解性、呈現由血小板或生長因子存在所提供之理想的生物或醫學性質、及亦呈現隨時間之高形穩性。

Description

富含血小板及/或生長因子且含有膠凝蛋白之血液組成物之調配物、及其製造方法
本發明係有關具有理想的生物或醫學性質之調配物，其自初始富含血小板及/或富含生長因子之血液組成物獲得。本發明亦有關用於製備該調配物之方法。
先前技術已描述自人類或動物血液製備組成物，其中以得到呈現有益的生物及醫學性質之富含血小板的血漿(PRP)及/或富含生長因子的血漿(PRGF)之方式處理血液。該PRP或PRGF已成功用於離體(ex vivo)應用(例如作為細胞培養基)、以及體內應用(例如於病患進行骨再生處理或以浸潤法治療患有關節疼痛的病患)。在以該組成物用於體內應用以治療病患的情況中，用於製備PRP及PRGF調配物之技術朝著製備自體組成物(即，自病患(他/她)本身的血液所得之組成物)發展。這些類型之組成物及製備方法之實例可見於專利US6569204及ES2221770。
在過去幾年中，具有確保以蓋倫(galenic)組成物或醫藥調配物形式可得到富含血小板及/或生長因子之組成物之目的之技術亦持續發展。蓋倫組成物或醫藥調配物係理解為被藥物或主要活性物質(不論化學或生物來源(如PRP或PRGF中之蛋白質的情況))適配的個別化供給物以促進其投予之。藥物的蓋倫組成物或醫藥調配物因其決定藥物的功效及安全性而至關重要，由於其控制藥物分子對於組織的劑量及通過。此外，藥物的蓋倫組成物或醫藥調配物為一種確保控制且能以相對容易與重複方式實施藥物(其劑量及其投予係習知)之製備之決定性因素。簡言之，蓋倫組成物或醫藥調配物試圖促進用於治療目的之任何藥物或物質之操作(handling)、保存、運輸、用法(administration)、以及就整體而言為性質。
最廣為應用的PRP或PRGF之醫學調配物之一被稱為纖維蛋白凝膠或纖維蛋白網(fibrin mesh)，其為具有半固體稠度(其非常適用於特定應用)之調配物。用於製備纖維蛋白凝膠或網的流程通常從第一階段開始，其中PRP或PRGF係藉由適用的方法而得到，該方法例如將自病患抽取的血液離心直到血液分離成各部分(fraction)為止、並抽取頂部部分(即，富含血小板的血漿(PRP)或富含生長因子的血漿(PRGF)的部分)。接著，活化含於PRP或PRGF的血小板(活化係理解為引發血小板釋放含於其內部之特定生長因子的作用)，例如藉由加入氯化鈣。活化之結果為，且條件為允許經過足夠的時間， 自含於血漿之纖維蛋白原最終發生纖維蛋白的聚合反應，從而產生由纖維蛋白凝塊(其因其半固體稠度，亦稱作纖維蛋白凝膠或網，類似一種生物海綿)組成的之最終化合物。這是一種經常進行的步驟，為了自以抗凝血劑(如檸檬酸鈉)改良之血液取得纖維蛋白凝膠。血液之加工亦可不事先以抗凝血劑混合。在此情況中，當血液經離心時，血漿係自紅血球而分離，且纖維蛋白凝膠係在無需加入氯化鈣或任何其他血小板活化劑而獲得。纖維蛋白凝膠或網可用於例如下列應用：形成生物骨架以填補骨缺損；塗敷於傷口或受傷處以逐步釋放生長因子；作為培養幹細胞之基質；作為密封缺損或潰瘍之膜；以及以其用於製造組織，即所謂組織工程，其中除了細胞及生長因子之外，尤其重要的是具有基質或骨架，使細胞可生長於其上。
纖維蛋白凝膠或網有一些明顯侷限。纖維蛋白凝膠或網的主要侷限為不穩定且傾向於收縮(retract)。其結果為，纖維蛋白凝膠或網無法隨時間維持穩定的體積，或無法隨時間提供穩定的組織支撐。雖然在一些應用中可能需要此種收縮傾向，但其他應用卻不需要。舉例而言，在一種稱作上顎竇底撐高術(sinus floor elevation)的牙醫外科技術中，用於再生骨缺損的生物材料必須具有骨傳導性質(osteoconductive properties)，但是其亦必須能維持長時間的物理空間直到骨基質形成；否則，該空間會崩塌，其不良地影響齒槽骨的垂直再生。另一實例為乳房切除(乳房切除術)，期間用於填補乳房 空間的生物材料或膠凝必須提供適當的機械抗性，並長時間提供空間及體積以確保該空間不會崩塌。進一步之實例為填料或美容填充劑(如玻尿酸)的情況，其為廣泛地用於美學領域的填充材料(提供及維持體積)，以增加彎角及皺折之體積並矯正該缺損，其提供較年輕的外觀；經設計以作為填料或填充劑之任何試劑必須機械上穩定且抗壓縮，因此其能維持組織的體積。此外，纖維蛋白凝膠或網的收縮傾向會阻礙且甚而阻止凝膠或網作為用於釋放進一步外部藥劑、藥物、蛋白質等的藥劑之用途。
纖維蛋白凝膠或網之進一步侷限為，無法於正常、半固體狀態下進行滲入或套管插入，使其無法於皮膚美容、創傷學、及其他領域(如生物學或醫學)作為填料投予於皮膚上。
本發明之目的為提供一種具有理想的生物或醫學性質之調配物，其取自富含血小板及/或生長因子之初始血液組成物，且其無收縮傾向，因此容許隨時間維持穩定的體積。在其他應用中，理想為本調配物於需要穩定組成物之特定應用中提供纖維蛋白凝膠或網的替代物。
發明之概述
本發明係有關具有理想的生物或醫學性質之調配物，其包含或衍生自富含血小板及/或生長因子之初始血液組成物(其係人來源或動物來源；自體性、同源 性、或異源性)，且其包含源自初始血液組成物之蛋白質。本調配物呈現「該蛋白質由於加熱及冷卻處理而呈膠凝狀態」之獨特特徵。具體而言，膠凝的蛋白較佳為白蛋白、醣蛋白、球蛋白、及/或纖維蛋白原。本發明之調配物可被描述為「蛋白凝膠(protein gel)」(使用類似用以指稱纖維蛋白凝膠(fibrin gel)之術語)，因為其呈現由膠凝狀態中蛋白質所供之膠凝狀稠度(gel-like consistency)。本調配物為可變形。相較於其他填充凝膠、其他富含血小板及/或生長因子之血液組成物、及其他本技術領域中習知的類似組成物，本組成物呈現新形態及生物機械構形。
亦提出用於製備前述調配物之方法，該方法包含下列步驟：取得富含血小板及/或生長因子之初始血液組成物，其基本調配物可變；於溫度介於60℃至100℃之間加熱初始血液組成物至少1分鐘；冷卻初始血液組成物至少1分鐘。此發明方法(其可視為一種熱的程列(thermal sequence))提供體積及剛性於富含血小板及/或生長因子之血液組成物，其產生具有凝膠的稠度之蛋白凝膠或調配物，由於特定蛋白質的膠凝狀態含於初始血液組成物中。
本發明之調配物具有生物相容性、生物可降解性，並呈現由血小板或生長因子存在所提供之理想的生物或醫學性質。此外，其亦具有稠密性或黏滯性稠度，由於含於初始血液組成物中之特定蛋白質之膠凝狀態，該稠密性或黏滯性稠度係隨時間穩定。因此，本發明之 調配物有利於替代纖維蛋白凝膠或網，由於該調配物不會收縮，因此容許物理空間保持填滿。此外，本調配物提供良好抗壓縮性，其類似或優於玻尿酸(常用的填料或填充劑)，並可發揮如組織般令人滿意的抗性維持。其結果為，本調配物高度適合作為填料或填充劑之用途。此外，即使當纖維蛋白網及本發明調配物兩者本質上為半固體，僅後者可滲入或注入，因其為可變形。本調配物之額外優勢為，可將其乾燥，之後進行再水合。
本發明之詳述可參見所附之非限制性圖式。
第1圖顯示本發明之一示例性調配物的二個電子顯微鏡圖像。
第2圖顯示本發明之另一示例性調配物的二個電子顯微鏡圖像。
第3圖顯示本發明之各調配物的膨脹因子(swelling factor)，該調配物係自於不同溫度及時間下處理之纖維蛋白凝塊所製備。
第4圖顯示本發明之各調配物之膨脹因子，該調配物係藉由於不同溫度及時間下處理上清液所製備。
第5圖顯示本發明之各調配物之細胞相容性(cytocompatibility)結果，該調配物係以MG 63造骨細胞樣細胞株(MG63 osteoblast-like cell line)進行測試。
第6圖顯示本發明之各調配物之其他細胞相容性結果，該調配物係以MG 63造骨細胞樣細胞株進行測試。
第7圖及第8圖分別顯示本發明之12個調配物的血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor；PDGF-AB)及β轉形生長因子(beta transforming growth factor；TGF-β)含量。
第9圖顯示培養於不同期間之本發明4個調配物的PDGF-AB生長因子釋放動力學。
第10圖顯示培養2天時本發明4個調配物的TGF-β生長因子釋放動力學。
第11圖顯示實驗室大鼠的背部照片，該大鼠已注射本發明之4個調配物之樣本。
第12圖顯示前面圖示之相關測試圖，其顯示於皮內層次注射本調配物後之半橢圓形之體積，其係於注射二週後測量。
發明之詳細說明
為了克服先前技術中有關纖維蛋白凝膠及網缺乏安定性的既存問題，提出一種替代調配物，其具有理想的生物或醫學性質及隨時間增強之安定性。本調配物包含或衍生自初始血液組成物。血液組成物係富含血小板及/或生長因子且亦包含各種蛋白質。因此，本調配物亦富含血小板及/或生長因子且包含各種蛋白質。在該蛋白質中，有某些蛋白質為膠凝狀態，意指其係經變性，並形成有組織的蛋白質網絡，較佳為因加熱及冷卻處理。膠凝狀態之蛋白質較佳為白蛋白、醣蛋白、球蛋白、及/或纖維蛋白原。現已證實，不同於其他僅以纖維蛋白 網絡為主之凝膠，本發明之蛋白凝膠不會收縮、可易於套管插入或滲入、及維持體積與空間。
初始血液組成物可為如富含血小板的血漿，即具有高濃度血小板之血漿。該血漿通常由血液離心技術取得(以將血液分離成紅血球部分、白血球部分、及富含血小板的血漿(PRP)部分)，接著為分離所有或部分之富含血小板的血漿(PRP)部分之步驟。
初始血液組成物亦可為富含血小板的血漿(PRP)之上清液。上清液為實質性液體，其於富含血小板的血漿(PRP)凝固且之後致使收縮時出現於凝塊上。
初始血液組成物可為富含釋放性生長因子之血漿(PRGF)，即富含血小板的血漿，其係經活化(如藉由加入氯化鈣、凝血酶、氯化鈣及凝血酶之結合物、葡萄糖酸鈉、膠原蛋白、或任何其他作用為藉由活化血小板及誘發形成纖維蛋白的藥劑)以使血小板於其內部釋放特定生長因子。
同樣地，初始血液組成物可為富含釋放性生長因子之血漿(PRGF)的上清液，即先前經活化(如藉由加入氯化鈣、凝血酶、氯化鈣及凝血酶之結合物、葡萄糖酸鈉、膠原蛋白、或任何其他作用為藉由活化血小板及誘發形成纖維蛋白的藥劑)之富含血小板的血漿於凝固且之後收縮後取得的上清液。活化作用致使血小板於其內部釋放特定生長因子。
初始血液組成物可或可不含有白血球。
初始組成物亦可為直接取自未以抗凝血劑改良之處理血液之纖維蛋白凝膠。
亦提出用於製備具有理想的生物或醫學性質之調配物的方法，其中該方法包含下列步驟：a)提供富含血小板及/或生長因子之初始血液組成物，其較佳為具有或不具有白血球之富含血小板的血漿、富含具有或不具有白血球之生長因子的血漿、具有或不具有白血球之富含血小板的血漿之上清液、富含具有或不具有白血球之生長因子的血漿之上清液、或取自未以抗凝血劑改良之血液之纖維蛋白凝膠；b)在血液組成物具有血小板的情況中，任意地以活化劑如氯化鈣、凝血酶、葡萄糖酸鈣、膠原蛋白、或任何其他活化劑、或其結合物活化血小板，且等待直到形成臨時纖維蛋白為止；c)於溫度介於60℃至100℃之間加熱初始血液組成物至少1分鐘；d)冷卻或回火(tempering)初始血液組成物至少1分鐘。
前述方法於初始血液組成物產生熱衝擊(thermal shock)，其結果為於人類血漿中誘發數個蛋白質之蛋白膠凝化(protein gelation)；這些蛋白質為白蛋白、醣蛋白、球蛋白、及/或纖維蛋白原。針對本發明之目的，「膠凝化」是指分子進行之過程，其中其聚合化或相連接以形成有組織蛋白網絡。綜上所述，由於熱衝擊過程的結果，產生新穎的生物相容性及生物可降解調配物， 其取決於初始血液組成物，其中共同點為膠凝化或蛋白聚合化。
此外，現已顯示，本發明之調配物(其係以膠凝蛋白提供)大大地維持初始血液組成物之生長因子之濃度。換言之，熱衝擊不會使該初始血液組成物之生長因子大量破壞。
較佳地，於溫度介於70℃至85℃之間加熱初始血液組成物。
富含血小板及/或生長因子之初始血液組成物係為人來源或動物來源。其亦可為自體性(屬於以最終調配物治療之後面階段之病患)、同源性(屬於以最終調配物治療或處理之病患、患者、細胞、或另一生物實體之相同物種之成員)、或異源性(屬於以最終調配物治療或處理之病患、患者、細胞、或另一生物實體之不同物種之成員)。
本發明考慮到初始血液組成物可任意地包括一或多個額外物質，其於所要求之熱處理前加入。該額外物質可為：-一或多個生物活性劑，其選自於蛋白質、胜肽、核酸、多醣、脂質、非蛋白質有機物質、及無機物質；-一或多個生物可降解聚合物，其選自：玻尿酸、玻尿酸鹽、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、聚葡萄糖、矽膠、藻酸鹽、羥丙基甲基纖維素、幾丁質衍生物(較佳為幾丁聚醣)、黃原膠、瓊脂糖、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羥基乙酯(PHEMA)合成或天然蛋白質、及膠原蛋白； -一或多個有機聚合物，其選自於由聚己內酯、聚乙交酯、聚乳酸、及其共聚合物組成之群組；-一或多個下列藥劑：抗生素、抗微生物劑、抗致癌物、止痛劑、生長因子、激素；-一或多個無機組分，其選自於鈣鹽、鎂鹽、及/或鍶鹽之群組。
本發明亦考慮到，於進行熱處理後，可將前述物質之任一者加入調配物中。
本發明之調配物可呈現多種具體實施例，其中除了所要求之技術態樣之外，本調配物可進一步包含化合物、組分、及分子等，其適用於使用本調配物之特定應用。亦即，本發明可視為以蛋白凝膠為主之新穎調配物家族，該家族係由不同的調配物所形成，其中存在膠凝蛋白且其可在其額外組成物上不同。
此外，具有膠凝蛋白之調配物可進行額外的步驟，包括將基質乾燥以使其更通用。換言之，可乾燥(乾熱)或凍乾本發明之膠凝蛋白之調配物以形成膜。此膜可隨即以多種替代方案進行再水合，如加入食鹽溶液、富含血小板的血漿、富含血小板的血漿之上清液、富含生長因子的血漿、富含生長因子的血漿之上清液、或任何其他使膜水合之溶液。
實施例 實施例1
本方法始於9ml之抽取自病患並保存於不含檸檬酸鹽抗凝血劑的密封管之血液的樣本。於環境溫度 下，以轉速580g離心血液8分鐘。離心之結果為，將含於試管中之血液分成各個部分。將頂端部分或富含血小板的血漿(PRP)之部分(其包括白血球)抽取至5ml注射器。由於初步試管未經檸檬酸化，PRP開始凝固。於溫度70℃下將注射器之內容物加熱10分鐘。接著，容器於4℃溫度下冷卻2分鐘。此熱加熱-冷卻順序(thermal heating-cooling sequence)之結果為，於注射器內形成具有凝膠的稠度之半固體物質。因此，取得經活化之調配物，經活化之調配物呈現凝膠狀稠度(由於凝固產生之纖維蛋白的結果及由於熱處理產生之蛋白質之膠凝化的結果)且缺乏檸檬酸鹽及鈣。纖維蛋白之存在提供具有更大稠度及抗性之本調配物，同時膠凝蛋白提供恆定的安定性及體積。由於其性質及機械抗性，此類物質可用於如矯正臉部組織之垂直缺損(vertical defects)。
實施例2
本方法始於9ml之抽取自病患並保存於含有0.1ml量的3.8%檸檬酸鹽抗凝血劑之緊密封抽取管之血液的樣本。於環境溫度下，以轉速580g離心血液8分鐘。離心之結果為，將含於試管中之血液分成各個部分。將頂端部分或富含血小板的血漿(PRP)之部分抽取至5ml注射器(其不包括白血球)。於溫度80℃下將注射器加熱3分鐘。接著，注射器於20℃溫度下冷卻10分鐘。此熱的加熱-冷卻程序之結果為，於第二容器內形成半固體物質。此物質具有凝膠狀稠度，且其血小板尚未經活化。此物質因其未事先凝固而未含纖維蛋白。此類的物質可 作為如美容手術中之填料，以藉由消除或減少皺紋之存在而達到更年輕的外貌；由於其可被注射(使用小於或等於25G的針頭)及其稠度之能力而可使用此物質，其能抬升肌膚。此生物凝膠係隨時間穩定且亦釋放刺激細胞生長及分化的生長因子，因此使其相較於常規物質(如玻尿酸)非常有利。玻尿酸(其為現今最廣為使用的填充材料)缺乏生物活性，因此其不會促使組織形成或達到隨時間持續改進，這意味著其必須週期性投予，通常為每隔3至4個月。
實施例3
藉由自病患抽取9ml血液樣本，並將血液保存於含有0.1ml的3.8%檸檬酸鹽抗凝血劑的緊密封抽取管而開始本方法。於環境溫度下，以轉速580g離心血液8分鐘。離心之結果為，將含於試管中之血液分成各個部分。將頂端部分或富含血小板的血漿(PRP)之部分抽取至5ml注射器(其不包括白血球)。接著，以每1ml血漿50μl之比例將10%氯化鈣加入，其致使血小板活化，即生長因子釋放且血漿凝固。接著，注射器於75℃溫度下加熱5分鐘。接著，注射器於環境溫度下冷卻10分鐘。此熱的加熱-冷卻程序之結果為，於注射器內形成半固體物質。此物質由於因凝固產生之纖維蛋白及以熱處理產生之蛋白質之膠凝化而具有凝膠狀稠度。此物質包括檸檬酸鹽、鈣、及釋放性生長因子。此類物質可用於填補骨缺損，如拔牙後之牙槽，以促進牙槽再生。由於生長因子之釋放及凝膠作為細胞生長支撐之能力，該 凝膠促使骨組織填補於牙槽，從而免除進一步癒合之等待時間，如牙科植牙以替換拔除之牙齒。
實施例4
以自病患抽取9ml血液樣本，並將其保存於含有0.1ml的具濃度3.8%(重量/體積)之檸檬酸鈉溶液(其作為抗凝血劑)的緊密封抽取管而開始本方法。於環境溫度下，以轉速580g離心血液8分鐘。離心之結果為，將含於試管中之血液分成各個部分。將頂端部分或富含血小板的血漿(PRP)之部分抽取至9ml分餾管(其不包括白血球)。以每1ml血漿50μl之比例將氯化鈣溶液(具有10%重量/體積之濃度)加入。接著，於37℃下將試管插入烘箱。氯化鈣致使血小板活化(生長因子釋放)、血漿凝固、及纖維蛋白形成，該形成可藉由將試管置於烘箱溫度條件而加速。凝塊收縮之結果為隨即取得二相：固相，其為三維纖維蛋白結構；及液體上清液相，其含有蛋白質、血小板生長因子、及血漿生長因子。將液相或上清液分離至3ml注射器。接著，注射器於80℃溫度下加熱10分鐘。接著，注射器於22℃溫度下冷卻5分鐘。此熱的加熱-冷卻程序之結果為，於注射器內形成半固體物質。此半固體物質具有比含纖維蛋白之本發明調配物更低的固體稠度。由於其較低之固體稠度，此類物質可用於填補牙周骨內缺損，以促進牙周組織再生。其亦可藉由進行物質的骨膜下或骨膜上滲入而用於骨再生。
實施例5
在另一實例中，本方法始於纖維蛋白凝塊(此物質係在於20℃溫度下以轉速580g離心血液以取得富含血小板的血漿、以每1ml血漿50μl氯化鈣之比例加入氯化鈣、及等待10至20分鐘直到纖維蛋白聚合化之後製備)。凝塊於70℃下加熱10分鐘，接著於20℃下冷卻10分鐘，從而取得蛋白凝膠。第1圖顯示前述之蛋白凝膠的二個電子顯微鏡圖像。左邊圖像顯示存在代表變性的白蛋白之形結構、以及為纖維蛋白的纖維之線狀結構。右邊圖像顯示凝膠的緻密(外)表面。
實施例6
在另一實例中，本方法始於富含生長因子的血漿(PRGF)(此物質係在於20℃溫度下以轉速580g離心血液以取得各個部分、分離富含血小板的血漿(PRP)之部分、及以每1ml血漿50μl氯化鈣之比例加入氯化鈣(為了引起生長因子釋放且開始血漿凝固)後製備)。凝塊之收縮容許取得上清液。接著，於70℃下將該上清液加熱10分鐘，隨後於20℃下冷卻10分鐘，從而取得蛋白凝膠。第2圖顯示前述蛋白凝膠的二個電子顯微鏡圖像。左邊圖像顯示凝膠之內部、以及代表變性的白蛋白之圓形結構的存在。右邊圖像顯示凝膠的緻密(外)表面。
實施例7
在另一實例中，於不同溫度及時間下處理纖維蛋白凝塊(其如實施例5所述製備)以製備各種蛋白凝膠。製備條件如下：於70℃下加熱凝塊15分鐘(正方 形)、於70℃下加熱凝塊30分鐘(圓形)、於80℃下加熱凝塊15分鐘(三角形)；以及於4℃下將其全部冷卻10分鐘。在以蒸餾水培養之前，這些凝膠於37℃下乾燥24小時。每隔24小時將凝膠秤重，以計算膨脹程度，其定義為：膨脹重量/初始重量。第3圖顯示於不同溫度及時間下製備之蛋白凝膠的程度或膨脹因子。如所見，凝膠由於吸收水分且其滯留於內部結構中，使其初始重量增加2與3倍之間。亦可見的是，於70℃、15分鐘製備之凝膠(正方形)於24小時膨脹，且其膨脹因子不會明顯隨著較長的培養時間而改變。然而，於70℃、30分鐘製備的凝膠(圓形)於24小時後膨脹為其初始重量的約3倍，不過隨著培養時間增加，觀察到膨脹因子略有下降。同時，於80℃、15分鐘製備的凝膠(三角形)花費比前述二者更長的時間以達到最大膨脹，具體而言48小時。在任何情況中，凝膠的膨脹能力是指其可作為用以局部釋放生物活性物質(蛋白質或主要活性物質)之基質。此用途通常藉由將含有該生物活性物質之溶液施用於脫水的凝膠上進行，使得凝膠水合且因此併入生物活性物質。
實施例8
在另一實例中，於不同溫度及時間下處理上清液(其依據實施例6製備)以製備各種蛋白凝膠。製備條件如下：於70℃下加熱上清液15分鐘(正方形)、於70℃下加熱上清液30分鐘(圓形)、於80℃下加熱上清液15分鐘(三角形)；以及於4℃下將其全部冷卻10分鐘。在以蒸餾水培養之前，這些凝膠於37℃下乾燥24 小時。每隔24小時將凝膠秤重，以計算膨脹程度，其定義為：膨脹重量/初始重量。初始重量為乾燥凝膠培養於水之前的重量。第4圖顯示於不同溫度及時間下製備之蛋白凝膠的膨脹程度。如所見，凝膠由於吸收水分且其滯留於內部結構中，使其初始重量增加約3倍。亦可見的是，於70℃、15分鐘下製備之凝膠(正方形)於24小時膨脹，且其膨脹因子不會明顯隨著較長的培養時間而改變。相反地，於70℃、30分鐘下製備之凝膠(圓形)於48小時後膨脹為其初始重量的3倍，不過在較長培養時間，觀察到膨脹因子略有下降。同時，於80℃、15分鐘製備的凝膠(三角形)於24小時培養後該膨脹因子達到約等於3。在任何情況中，凝膠的膨脹能力容許其作為用以局部釋放生物活性物質(蛋白質或活性成分)之基質。此用途通常藉由將含有該生物活性物質之溶液施用於脫水的凝膠上進行，使得凝膠水合且因此將生物活性物質併入其內部。
實施例9
在另一實例中，依據本發明自以下製備4個蛋白凝膠或調配物：上清液(在本實施例末引用之圖中，以「SN」表示)、纖維蛋白凝塊(「纖維蛋白」)、非活化性富含血小板的血漿(「非活化性」)、及以10% CaCl2活化而不凝結的富含血小板的血漿(「活化而不凝結」)，並進行前述之初始物質之熱處理，包括於其包括於70℃下將物質加熱15分鐘並於21℃下將其冷卻10分鐘。用於製備這些初始物質之方法係說明於實施例2、3、及6。 將熱處理後取得的這4個調配物之每一者培養於不含胎牛血清之DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培養基48小時。此外，本方法亦包括第五物質或對照組物質，其由不含胎牛血清之DMEM所構成。第五培養基係用於培養MG 63細胞，其係每隔2天(正方形)、4天(圓形)、及7天(三角形)更換。在這些時間週期之每一者之後，以比色劑WST-1及盤讀儀評估細胞增生。以下列公式計算增生之百分比：增生%=(凝膠之WST-1吸光度/對照組物質之WST-1吸光度)×100。第5圖顯示以MG 63造骨細胞樣細胞株測試蛋白凝膠之細胞相容性結果。如所見，凝膠無毒性，如相對於對照組樣本之細胞增生增加所示。在2天的增生(正方形)之後，由非活化性富含血小板的血漿製備之凝膠造成更多的細胞增生。然而，這些差異不會在更長的增生時間下增加(圓形、三角形)。因此，此實例證實，本發明之調配物呈現刺激細胞生長之適當行為且具有生物相容性，使其朝向臨床用途發展。
實施例10
如同前述實例，依據本發明自以下製備4個蛋白凝膠或調配物：上清液(正方形)、纖維蛋白凝塊(圓形)、非活化性富含血小板的血漿(中央頂點朝上之三角形)、及以10% CaCl2活化而不凝結的富含血小板的血漿(中央頂點朝下之三角形)。將所有的物質進行熱處理，包括於70℃下加熱物質15分鐘及於21℃下將其冷卻10分鐘。用於製備初始物質之方法係說明於實施例2、 3、及6。將所得的4個調配物培養於培養基2、4、7、及9天。在各時間週期結束時，收集培養基並將新的培養基加入凝膠。將收集的培養基保存，以用於培養MG 63細胞。容許細胞於此培養基中生長48小時。接著，以比色劑WST-1及盤讀儀評估細胞增生。以下列公式計算增生之百分比：增生%=(凝膠之WST-1吸光度/對照組物質之WST-1吸光度)×100，其中以無血清之DMEM作為對照組物質。第6圖顯示於培養基中各培養時間間隔之細胞增生。如所見，於培養2天之後達到更多的細胞增生。在更長的培養時間下，培養基有較少的細胞增生，這似乎暗示，於培養2天之後釋放更多生長因子，且此生長因子的含量小於更長培養時間(4、7、及9天)之培養基的含量。因此，這些結果顯示，細胞增生刺激物質於凝膠中之釋放隨時間減少，其遵循著與其他類型凝膠類似的釋放輪廓，其特徵為於前幾小時的培養期間會釋放大量的生物活性物質(「爆發(burst)」效應)，且釋放量隨時間明顯減少。
實施例11
在另一實例中，本方法始於二個初始物質。第一個物質為在以每1ml血漿50μl氯化鈣之比例活化富含血小板的血漿後取得的纖維蛋白凝膠(如同實施例6)。第二個物質為纖維蛋白凝膠收縮後取得的上清液(如同實施例6)。將兩物質進行三種不同的熱處理：於70℃下加熱15分鐘、於70℃下加熱30分鐘、及於80℃下加熱15分鐘。在所有情況中，加熱後接著於4℃溫度下 或於20℃溫度下冷卻10分鐘。得到12個蛋白凝膠。接著，於14,800rpm下將12個凝膠離心20分鐘。接著，測定血小板衍生的生長因子(PDGF-AB)及β轉形生長因子(TGF-β)之含量。第7及8圖顯示這些測定的結果，其中將12個凝膠分成6組且每組2個，各組被命名為「1」(於70℃下15分鐘之纖維蛋白凝膠)、「2」(於70℃下30分鐘之纖維蛋白凝膠)、「3」(於80℃下15分鐘之纖維蛋白凝膠)、「4」(於70℃下15分鐘之上清液凝膠)、「5」(於70℃下30分鐘之上清液凝膠)、及「6」(於80℃下15分鐘之上清液凝膠)，且其中於各組中，以黑色條帶表示4℃下冷卻之凝膠並以白色條帶表示20℃下冷卻之凝膠。第7圖顯示觀察到的PDGF-AB生長因子含量。可得出結論：於20℃冷卻的凝膠(白色條帶)之此生長因子的含量通常大於4℃冷卻的凝膠(黑色條帶)，除了於70℃下30分鐘(「5」)及於80℃下(「6」)所製備之上清液凝膠以外，其中PDGF-AB之含量幾乎未觀察到有任何冷卻溫度依賴性之差異。第8圖顯示TGF-β生長因子之觀察的含量。可得出結論：關於自纖維蛋白(組別「1」、「2」、「3」)製備之凝膠，於20℃下進行冷卻之情況中(白色條帶)，三組(即不同之熱處理以製備凝膠)的TGF-β因子含量類似，而於4℃下進行冷卻之情況中(黑色條帶)，於70℃下15分鐘所製備之凝膠的TGF-β因子的含量較大(組別「1」)。相對於此，針對自上清液製備之凝膠(組別「4」、「5」、「6」)，可發現：僅於70℃下自上清液製備15分鐘之蛋白凝膠(組別「1」)釋放TGF-β，其中該 因子未於自上清液製備之其他凝膠中檢測出。因此，可得到結論：溫度超過70℃時，纖維蛋白凝膠較上清液維持更高的生長因子含量，且加熱溫度及冷卻溫度因此影響此生長因子含量，該含量於較低的加熱溫度及於冷卻溫度21℃時較大。亦可得到結論：於高溫時PDGF-AB比TGF-β更穩定，且以纖維蛋白為主之蛋白凝膠較以上清液為主之蛋白凝膠含有更大量的TGF-β。
實施例12
在另一實例中，依據本發明製備4種蛋白凝膠或調配物，其係藉由施用熱處理，其包括使下列初始物質於70℃下加熱15分鐘並使其於21℃下冷卻10分鐘：上清液(SN)、纖維蛋白凝塊(纖維蛋白)、非活化性富含血小板的血漿(未活化)、及以10% CaCl2活化而不凝結的富含血小板的血漿(活化而不凝結)。這些初始物質之製備如實施例2、3、及6之說明。四種蛋白凝膠係於DMEM中培養不同週期時間(2、4、及7天)。在各培養時間中，擷取中位數時間以確定PDGF-AB及TGF-β之含量，其旨在確定4種蛋白凝膠之這些生長因子之釋放動力學。第9圖顯示PDGF-AB於DMEM培養基之釋放動力學，其相當於2、4、及7天之培養時間週期之測定(以黑色、白色、及條紋條帶表示)。可發現：於2及4天培養期間，自上清液製備之蛋白凝膠的PDGF-AB釋放較大。其他凝膠的三個培養時間之間未顯示任何顯著差異。反而是，第10圖顯示於培養2天後TGF-β於DMEM培養基之釋放動力學。可發現，此因子僅存在於自上清 液及纖維蛋白製備之蛋白凝膠，自上清液之蛋白凝膠中的TGF-β之釋放較大。因此，可得到結論：自以上清液為主之蛋白凝膠較快釋放生長因子。
實施例13
在另一實例中，以實驗室大鼠測試本發明之蛋白凝膠或調配物之填充作用。針對此目的，製備4種本發明調配物。該4種調配物之製備始於下列步驟。首先，將病患血液抽取至不含抗凝血劑之9ml試管。試管於850g離心8分鐘以自紅血球分離血漿。接著，將位於紅血球部分上方的整列血漿(其不含白血球)抽取至新的9ml試管。使用此血漿以製備如下者：血漿液體本身(B)；纖維蛋白凝塊(C)，其目的為以每1ml血漿50μl之比例將10%氯化鈣加入，致使活化血漿及形成凝塊；以及上清液(A)，其目的為製備與前述之一者相同特性之纖維蛋白凝塊，並容許於37℃下維持60分鐘，使得纖維蛋白收縮並取得上清液。亦將病患血液抽取至含有0.1ml之作為抗凝血劑之3.8%檸檬酸鈉之9ml抽取管。血液於850g離心8分鐘，取得2ml之位於白血球-血小板層正上方的血漿，並以每1ml血漿50μl之比例之10%氯化鈣活化，以得到纖維蛋白凝塊(D)。這4種初始物質(A、B、C、D)係於70℃下處理10分鐘並於20℃下冷卻10分鐘以得到凝膠。將0.6ml劑量之各凝膠調配物投予至每隻大鼠。在第11圖所示之照片顯示：以蛋白凝膠所支撐的體積增加之形成表示其機械性質改善。
此外，藉由將血液抽取至含有0.1ml之3.8%檸檬酸鈉之9ml試管、以850g離心血液8分鐘、分離富含血小板的血漿之部分(2ml之血漿列係位於紅血球部分上方，其不含白血球)、及於注射大鼠前，藉由每1ml加入50μl氯化鈣活化血漿(使得血小板之生長因子的釋放)而製備富含生長因子的血漿(其將稱作「PRGF-Endoret」)。
第12圖顯示大鼠注射蛋白凝膠2週後之體積變化，並以玻尿酸及前述富含生長因子的PRGF-Endoret血漿作為對照組。可得到結論：蛋白凝膠於維持半橢圓形體積之功效如同玻尿酸，而富含生長因子的PRGF-Endoret血漿無法用於維持半橢圓形體積。
應補充的是，於測試期間，亦企圖注射常規之纖維蛋白凝膠(凝塊)，目的在於比較本發明之蛋白凝膠之安定性與纖維蛋白凝膠之安定性。其結果為，無法注射該纖維蛋白凝膠，因發生相分離(具有分離自上清液之纖維蛋白)，使得無法投予纖維蛋白凝膠。
實施例14
富含血小板的血漿之製備係如實施例2所述。接著，加入第I型膠原蛋白。接著，將混合物於溫度75℃下加熱10分鐘，之後於溫度20℃下冷卻3分鐘。此製備之結果為顯示較大的稠度之蛋白凝膠。此類凝膠可作為治療皺紋的填料，因其顯示比不含膠原蛋白時更大的安定性及更慢的降解速率。因此，此改良有助於進一步減緩調配物的降解。臨床上，此安定性之改進可延 長凝膠之第一次投予與第二次投予間之時間。此表示解決以玻尿酸治療皺紋之缺點的方法，其涉及每隔3至4個月(換言之，於短時間週期內)重複投予。
實施例15
富含血小板的血漿之製備係如實施例2所述。接著，加入磷酸鈣(例如顆粒型式)。接著，將混合物於溫度80℃下加熱10分鐘，並於溫度20℃下冷卻3分鐘。此製備所產生的混成材料(hybrid material)較未經磷酸鈣改良之凝膠顯示更好的機械性質。以磷酸鈣改良的凝膠可增加凝膠對壓縮力及張力的抗性。此類材料可用於再生骨缺損，其由於該缺損缺乏一或多個壁(walls)而需要具有更大機械安定性之填料。
實施例16
以前述實例之任一者所述之製備方法製備本發明之蛋白凝膠。接著，將凝膠與玻尿酸結合，以產生混成材料。此材料顯示更好的黏彈(viscoelastic)性，其增進其於投予區域之安定性，從而防止其移位。此混成材料適合用於對於如窄牙槽突(narrow alveolar process)的前庭壁(vestibular wall)之表面之應用，以使橫向骨生長，從而增加牙槽突的厚度，以使牙科植入物以足夠的骨覆蓋物(bone covering)插入。
實施例17
在製備及乾燥實施例8所述之凝膠後(其中所述之蛋白凝膠之任何實例皆有效)，該乾燥材料係於閉光下培養於含有濃度為15mg/ml之鹽酸去氧羥四環素 (doxycycline hyclate)抗生素中24小時。此結果為凝膠膨脹，該凝膠的結構包括抗生素，以隨後於施加區域內釋放。因此，此凝膠現可用於抗生素之控制釋放，以治療血液較低量供給之區域(如骨)的感染，並避免全身性投予抗生素。此流程可以其他抗生素及其他藥物重複進行，以確保其局部釋放。

Claims (16)

  1. 一種用於製備具有理想的生物或醫學性質之血液組成物的方法，其特徵為其包含下列步驟：a)提供富含血小板及/或生長因子之人或動物來源之初始血液組成物；b)於溫度介於60℃至100℃之間加熱該初始血液組成物至少1分鐘；c)於4℃至環境溫度冷卻該初始血液組成物至少1分鐘；其中該初始血液組成物為富含血小板的血漿、富含血小板的血漿的上清液、富含釋放性生長因子之血漿、或富含釋放性生長因子之血漿的上清液。
  2. 如請求項1之方法，其中於溫度介於70℃至85℃之間加熱該初始血液組成物。
  3. 如請求項1之方法，其中該初始血液組成物為富含血小板的血漿。
  4. 如請求項1之方法，其中該初始血液組成物為富含血小板的血漿的上清液。
  5. 如請求項1之方法，其中該初始血液組成物為富含釋放性生長因子之血漿。
  6. 如請求項1之方法，其中該初始血液組成物為富含釋放性生長因子之血漿的上清液。
  7. 如請求項1之方法，其中該初始血液組成物亦為纖維蛋白凝膠。
  8. 如請求項1之方法，其中該初始血液組成物包含血小 板，且其中該方法包含於加熱之前活化該血小板且等待直到臨時纖維蛋白形成的步驟。
  9. 一種調配物，其特徵為包含由如請求項1至8中任一項之方法得到之血液組成物，該血液組成物為人或動物來源且富含血小板及/或釋放性生長因子，其中含於該血液組成物之蛋白質係於膠凝狀態；以及該蛋白質為白蛋白、醣蛋白、球蛋白、及/或纖維蛋白原(fibrinogen)。
  10. 如請求項9之調配物，其中由於加熱及冷卻處理，該蛋白質係於膠凝狀態。
  11. 如請求項9之調配物，其中其進一步包含一種以上選自於蛋白質、胜肽、核酸、多醣、脂質、非蛋白質有機物質及無機物質中之生物活性劑。
  12. 如請求項9之調配物，其中其進一步包含一種以上選自於玻尿酸、玻尿酸鹽、4-硫酸軟骨素、6-硫酸軟骨素、聚葡萄糖、矽膠、藻酸鹽、羥丙基甲基纖維素、幾丁質衍生物、黃原膠、瓊脂糖、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羥基乙酯(polyhydroxyethyl methacrylate；PHEMA)、合成或天然蛋白質、膠原蛋白中之生物可降解聚合物。
  13. 如請求項12之調配物，其中該幾丁質衍生物為幾丁聚醣。
  14. 如請求項9之調配物，其中其進一步包含一種以上選自於由聚己內酯、聚乙交酯、聚乳酸、及其共聚合物所組成之群組中之有機聚合物。
  15. 如請求項9之調配物，其中其進一步包含一種以上的下列藥劑：抗生素、抗微生物劑、抗致癌物、止痛劑、生長因子、及激素。
  16. 如請求項9之調配物，其中其進一步包含一種以上選自於鈣鹽、鎂鹽、及/或鍶鹽之群組中之無機組分。
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