WO2015015037A1 - Formulación de una composición sanguínea rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, con proteínas gelificadas, y método de preparación de la misma - Google Patents

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Eduardo Anitua Aldecoa
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Definitions

  • the invention relates to a formulation with desirable biological or medical properties, obtained from an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors.
  • the invention also relates to a method of preparing said formulation.
  • compositions from human or animal blood is known in the state of the art, where the blood is processed so that a platelet rich plasma (PRP) and / or a plasma rich in growth factors ( PRGF) that have useful biological and medical properties.
  • PRP platelet rich plasma
  • PRGF plasma rich in growth factors
  • Such PRP or PRGF have been used successfully in ex vivo applications, for example as a cell culture medium, and in vivo, for example to perform a bone regeneration process in a patient or to treat a patient of an articular ailment through infiltrations.
  • the technology for preparing PRP and PRGF formulations has evolved towards the preparation of autologous compositions, that is, obtained from the patient's own blood.
  • Examples of such compositions and preparation methods can be found in US6569204 and ES2221770.
  • Galenic composition or pharmaceutical form is understood as the individualized provision to which adapt drugs or active ingredients, whether of chemical origin or biological origin (as is the case of PRP or PRGF proteins), to facilitate their administration.
  • the galenic composition or pharmaceutical form of a medication is key because it determines the efficacy and safety of the medication, since it controls the dose and transfer of the drug's molecules to the tissue.
  • the galenic composition or pharmaceutical form of the medicament is decisive so that the preparation of the medicament, its dosage and its administration are known, controlled and executable with relative ease and repeatedly.
  • a galenic composition or pharmaceutical form is intended to facilitate the handling, preservation, transport, administration and together the properties of any drug or substance with therapeutic activity.
  • PRGF is known as fibrin gel or fibrin mesh, which is a formulation whose semi-solid consistency is very convenient for certain applications.
  • the procedure for preparing the fibrin gel or mesh generally begins with a first phase in which the PRP or PRGF is obtained by an applicable method, for example by centrifuging blood taken from a patient until the blood separates into several fractions, and extracting the upper fraction, that is the fraction of platelet rich plasma (PRP) or growth factor rich plasma (PRGF). Subsequently, the activation of the platelets contained in the PRP or PRGF is performed (activation being understood as the action of causing the platelets to release certain growth factors contained therein) for example by the addition of caicic chloride.
  • PRP platelet rich plasma
  • PRGF growth factor rich plasma
  • fibrin gel also called fibrin gel or mesh by its semi-solid consistency, as a kind of biological sponge.
  • This procedure is usually performed to obtain a fibrin gel from a blood modified with an anticoagulant, such as sodium citrate.
  • an anticoagulant such as sodium citrate.
  • blood can also be processed without mixing it beforehand with anticoagulant; in this case, centrifuge the Blood is achieved both by separating the plasma from the red blood cells and, at the same time, obtaining the fibrin gel without the need to add caustic chloride or another activator of the platelets.
  • Some examples of application of the fibrin gel or mesh are: forming a biological scaffolding to fill bone defects; be applied to wounds or lesions for the progressive release of growth factors: be used as a matrix for the culture of stem cells; be used as a membrane to close defects or ulcers; be used in the manufacture of tissues, what is known as tissue engineering, where in addition to cells and growth factors it is especially important to have a matrix or scaffold where cells can grow.
  • the fibrin gel or mesh has some important limitations.
  • the main limitation of the fibrin gel or mesh is that it is unstable and tends to retract; Therefore, the fibrin gel or mesh is not able to maintain a stable volume over time or provide a stable tissue support over time. While this tendency to retract may be positive in some applications, it is negative in others.
  • the biomateria that is used to regenerate the bone defect must have osteoconductive properties but also must be able to maintain the physical space for a long period of time until the womb bone conform, since otherwise there would be a collapse of the space that would affect the vertical regeneration of the alveolar bone.
  • Another example is the case of a breast excision (mastectomy), during which the biomateriai or gel used to fill the breast space must have adequate mechanical resistance and provide a long-term space and volume so that it is not co-described. space.
  • Another example is still the case of fiiiers or aesthetic fillers (for example hiaiuronic acid), which are fillers (therefore give and maintain volume) widely used in the field of aesthetics to increase the volume in the corners and wrinkles and correct these defects, giving a rejuvenated appearance; Any agent that is intended to function as a filler or filler must be mechanically stable and resistant to compression to maintain tissue volume.
  • the tendency of the fibrin gel or mesh to retract makes it difficult and even prevents the use of the gel or mesh as a release agent for external agents, drugs, proteins, etc.
  • Another limited aspect of the fibrin gel or mesh is its impossibility of being able to be infiltrated or channeled in its normal, semi-solid state, which prevents its administration as a filler on the skin, in dermocosmetics, in traumatology and in other fields of biology or medicine .
  • the present invention aims to achieve a formulation with desirable biological or medical properties, obtained from an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors, which does not tend to retract and therefore allows to maintain a stable volume over time .
  • the formulation serve as an alternative to the fibrin gel or mesh in certain applications where a stable composition is required.
  • the object of the invention is a formulation with desirable biological or medical properties, which comprises or is derived from an initial blood composition (of human or animal origin; autologous, homologous or heterologous), rich in platelets and / or factors of growth and comprising proteins from the initial blood composition itself, with the particularity that said proteins are in a geiified state by a heating and cooling heat treatment.
  • the gelled proteins are preferably albumin, glycoproteins, globulins and / or fibrinogen.
  • the formulation according to the invention could be described as a "protein gel” (using a terminology analogous to that used to refer to fibrin gel) because it has a gelled consistency that is given by the geiified state proteins.
  • the formulation is deformable.
  • the composition has a new morphological and biomechanical configuration compared to the rest of filling geies, platelet-rich blood compositions and / or growth factors, and the like known in the state of the art.
  • a method of preparing the above formulation is also proposed, comprising the steps of: having an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors whose base formulation may vary; heating the initial blood composition at a temperature between 60 and 100 ° C for at least 1 minute; cool the initial blood composition for at least 1 minute.
  • This method of the invention which can be considered as a thermal sequence, allows to give volume and rigidity to a blood composition rich in platelets and / or growth factors in general, obtaining a protein gei or formulation of gei consistency thanks to the geiified state of certain proteins included in the initial blood composition.
  • the formulation according to the invention is biocompatible, biodegradable and has the desirable biological or medical properties provided by the presence of platelets or growth factors, while having a dense or viscous consistency due to the geiified state of certain proteins contained in the initial blood composition, with the important advantage that said dense or viscous consistency is stable over time.
  • the formulation according to the invention is therefore an advantageous alternative to the fibrin gei or mesh, due to the fact that the formulation does not retract and thus allows a physical space to be filled.
  • the formulation has a good compressive strength, similar or better than that of hyaluronic acid (usually used as a filler or filler), and adequately supports the resistance that a tissue can exert on it; Therefore, the formulation is very suitable for use as filler or filler.
  • both the fibrin mesh and the formulation according to the invention are semi-solid, only the second one can infiltrate or inject because it is deformable.
  • An additional advantage of the formulation is that it can be dried to subsequently rehydrate.
  • FIG. 1 shows two electron microscopy images of an example formulation according to the invention.
  • FIG. 3 shows the swelling factor of various formulations according to the invention prepared from fibrin coagulate treated at different temperatures and times.
  • FIG. 4 shows the swelling factor of various formulations according to the invention prepared from supernatant treated at different temperatures and times.
  • FIG. 5 shows cytocompatability results of various formulations according to the invention, tested with the MG 63 osteoblastic cell line.
  • FIG. 6 shows other cytocompatability results of various formulations according to the invention, tested with the MG 63 osteoblastic cell line.
  • FIG. 7 and 8 show respectively the content of the platelet-derived growth factor (PDGF-AB) and the transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ) in twelve formulations according to the invention.
  • PDGF-AB platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor beta
  • FIG. 9 shows the release kinetics of the PDGF-AB growth factor in four formulations according to the invention incubated for different periods of time.
  • FIG. 10 shows the release kinetics of growth factor TGF- ⁇ in four formulations according to the invention incubated for 2 days.
  • FIG. 1 shows a photograph of the back of a laboratory rat in which samples of four formulations according to the invention have been injected.
  • FIG. 12 shows a graph related to the test of the previous figure, illustrating the volume of hemieiipsis after injecting the formulations intradermally and after two weeks after the injection.
  • Said formulation comprises or is derived from an initial blood composition.
  • Said blood composition is rich in platelets and / or growth factors and also comprises various proteins. Therefore, the formulation is also rich in platelets and / or growth factors and comprises various proteins.
  • certain proteins are in a gelled state, that is, denatured and forming an ordered protein network, preferably due to a heat treatment of heating and cooling.
  • the proteins in the gelled state are preferably albumin, glycoproteins, globulins and / or fibrinogen. It has been found that the protein gei according to the invention does not retract, can be easily cannulated or infiltrated and maintains the volume and space unlike its homonyms based only on the fibrin network.
  • the initial blood composition may be, for example, a platelet-rich blood plasma, that is, a plasma with a high platelet concentration.
  • Said plasma has generally been obtained by the technique of centrifuging blood (to separate it into a fraction of red blood cell fraction, a white blood cell fraction and a platelet-rich plasma fraction (PRP)) and to separate all or part of the blood cell fraction.
  • platelet rich plasma (PRP) platelet rich plasma
  • the initial blood composition may also be a supernatant of a platelet rich blood plasma (PRP).
  • PRP platelet rich blood plasma
  • the supernatant is a substantial liquid that appears on the clot when coagulation of a platelet rich plasma (PRP) is caused and its subsequent retraction.
  • the initial blood composition can be a blood plasma rich in growth factors (PRGF) released, that is, a platelet-rich blood plasma that has been activated (for example by the contribution of calcium chloride, thrombin, a combination of calcium chloride and thrombin, sodium gluconate , of collagen, or of any other agent that acts by activating platelets and inducing fibrin formation) so that platelets have released certain growth factors from within.
  • PRGF blood plasma rich in growth factors
  • the initial blood composition may be a supernatant of a blood plasma rich in growth factors (PRGF) released, that is, a supernatant obtained after coagulation and subsequent retraction of a platelet rich plasma that has been previously activated (e.g. by the contribution of calcium chloride, thrombin, the combination of calcium chloride and thrombin, sodium gluconate, collagen, or any other agent that acts by activating platelets and inducing fibrin formation) so that platelets They have released certain growth factors from within.
  • PRGF blood plasma rich in growth factors
  • the initial blood composition may or may not contain leukocytes.
  • the initial composition may also be a fibrin gel obtained directly from blood processing that has not been modified with an anticoagulant.
  • a method of preparing a formulation with desirable biological or medical properties comprises the steps of: a) having an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors, which is preferably a rich plasma in platelets with or without leukocytes, a plasma rich in growth factors with or without leukocytes, a supernatant of a platelet-rich plasma with or without leukocytes, a supernatant of a plasma rich in growth factors with or without leukocytes, or a gel of fibrin obtained from blood not modified with anticoagulant; in case of counting the blood composition with platelets, optionally activate the platelets with some activating agent such as calcium chloride, thrombin, calcium gluconate, collagen or any other, or a combination thereof, and wait until a provisional fibrin is formed; c) heating the initial blood composition at a temperature between 60 and 100 ° C for at least 1 minute; d) cool or temper the initial blood composition for at least 1 minute.
  • an initial blood composition rich in platelets and / or growth factors which is
  • the above method develops a thermal shock on the initial blood composition so that protein geiification of several proteins existing in human plasma is induced, including albumin, glycoproteins, globulins and / or fibrinogen.
  • the process undergone by the molecules in which they polymerize or aggregate to form an ordered protein network is called "geiification.”
  • new biocompatibies and biodegradabies formulations are achieved, depending on the initial blood composition, whose common denominator is protein geiification or polymerization.
  • the formulation according to the invention provided with gelled proteins, substantially maintains the levels of growth factors of the initial blood composition. That is, thermal shock does not cause massive destruction of growth factors of said initial blood composition.
  • the initial blood composition is heated to a temperature between 70 and 85 ° C.
  • the initial blood composition rich in platelets and / or Growth is of human or animal origin.
  • it can be autologous (belonging to a patient to whom it is desired to later treat with the final formulation), homologous (belonging to a member of the same species as the patient, patients, cells or other biological entity to be treated or processed with the final formulation) or heterologous (belonging to a member of different species than the patient, patients, cells or other biological entity to be treated or processed with the final formulation).
  • the initial blood composition may optionally incorporate one or more additional substances, added prior to the claimed heat treatment.
  • additional substances may be:
  • bioactive agents selected from proteins, peptides, nucleic acids, poiisaccharides, lipids, non-protein organic substances and inorganic substances;
  • biodegradable polymers selected from: hiaiuronic acid, hiaiuronate salts, chondroitin 4 sulfate, chondroitin 6 sulfate, dextran, silica gel, alginate, hydroxypropylmethylcellulose, chitin derivatives, preferably chitosan, xanthan gum, agarose; glycolic polyethene (PEG), polyhydroxyethylene methacrylate (HEMA), synthetic or natural proteins, collagens;
  • organic polymers selected from the group of polycarpoiactone, polyglycolic, polylactic, and their co-polymers;
  • antibiotics antibiotics, antimicrobials, anticancer drugs, analgesics, growth factors, hormones;
  • inorganic components selected from the group of calcium salts, magnesium salts, and / or strontium salts.
  • the invention also contemplates that any of the above substances can be added to the formulation after the heat treatment has been carried out.
  • the formulation according to the invention contemplates various embodiments in which the formulation may comprise, in addition to the claimed technical aspects, other compounds, components, molecules, etc. that are convenient for the specific application to which it will be intended for formulation.
  • the invention is proposed as a family of new formulations based on protein geies, said family being formed by different formulations that have in common the presence of gelled proteins and which may differ in their additional composition.
  • the gelled protein formulations according to the invention can be dried (dry heat) or lyophilized to form a membrane.
  • This membrane can be subsequently rehydrated by different alternatives such as adding a saline solution, a platelet-rich plasma, a supernatant from a platelet-rich plasma, a plasma rich in growth factors, a supernatant from a plasma rich in growth factors, or any other solution that allows to hydrate the membrane.
  • the second container is cooled to a temperature of 4 ° C for 2 minutes.
  • a semi-solid substance with gel consistency is formed inside the syringe. Therefore, an activated formulation is obtained, with gel consistency both for the fibrin generated as a result of coagulation and for the geiification of the proteins produced by the heat treatment, and free of citrate and calcium.
  • the presence of fibrin gives the formulation a greater consistency, firmness and resistance, while the gelled proteins provide stability and constant volume. Thanks to its properties and mechanical strength, such a substance can be useful for example to correct vertical defects in facial tissues.
  • Example 2 It is based on a 9 ml sample of blood taken from a patient and stored in a tightly sealed extraction tube containing 3.8% citrate anticoagulant in an amount of 0.1 ml.
  • the blood is centrifuged at a speed of 580 g, for a time of 8 minutes and at room temperature. As a result of centrifugation, the blood contained in the tube is divided into several fractions.
  • the upper fraction or platelet-rich plasma fraction (PRP) is extracted, avoiding including the white blood cells in a 5 ml syringe.
  • the syringe is heated at a temperature of 80 ° C for 3 minutes. Subsequently, the syringe is cooled to a temperature of 20 ° C for 10 minutes.
  • PRP platelet-rich plasma fraction
  • a semi-solid substance is formed inside the second container, with a gel consistency, whose platelets are pending activation, and which does not comprise fibrin because it has not been previously coagulated.
  • a substance of this type can be useful for its application, for example, as a filler in cosmetic surgery and achieve rejuvenation by eliminating or minimizing the presence of wrinkles thanks to the injectability of the bio-gel through a needle (less than or equal to 25 G) and its consistency capable of elevating the skin.
  • This bio-gel is stable over time and also releases growth factors that stimulate cell growth and proliferation, thus being very advantageous compared to conventional substances such as acid hyaluronic Hyaluronic acid, which is the most commonly used filler material, precisely lacks bioactivity and therefore does not promote tissue formation or achieve persistence of improvements over time, which makes it necessary for it to be administered periodically, usually every 3-4 months.
  • the syringe is heated at a temperature of 75 ° C for 5 minutes. Subsequently, the syringe is cooled to room temperature for 10 minutes.
  • a semi-solid substance is formed inside the syringe, with the consistency of gei both by the fibrin generated as a result of the coagulation and by the geiification of the proteins produced by the heat treatment, provided with citrate, calcium and growth factors released.
  • a substance of this type may be useful for filling a bone defect, such as the socket remaining after removing a tooth, to promote regeneration of the socket.
  • the gei favors the filling of the socket with bone tissue, thus shortening the waiting times to place, for example, an implant dental in the socket that replaces the extracted tooth.
  • a solution of calcium chloride (with a concentration of 10% by weight / volume) in a ratio of 50 ⁇ per 1 ml of plasma is added and the tube is introduced in an oven at 37 ° C.
  • Calcium chloride causes platelet activation, that is, the release of growth factors, plasma coagulation and fibrin formation (said accelerated formation being seen by the tube being in the temperature conditions provided by the oven).
  • a solid phase which is a three-dimensional structure of fibrin
  • a supernatant liquid phase which contains proteins and piaquetary and plasma growth factors.
  • the liquid phase or supernatant is separated into a 3 ml syringe.
  • the syringe is heated at a temperature of 80 ° C for 10 minutes. Subsequently, the syringe is cooled to a temperature of 22 ° C for 5 minutes.
  • a semi-solid substance is formed inside the syringe, although with a less solid consistency than the formulations according to the invention which do comprise fibrin. Due to its less solid consistency, a substance of this type can be useful for example to fill intra-bone periodontal defects in order to promote the regeneration of periodontai tissue, or regenerate bone by infiltrating it subperiosteally or supraperiosteally.
  • a fibrin clot (substance prepared after centrifuging blood at a speed of 580 g and a temperature of 20 ° C to obtain platelet-rich plasma, add calcium chloride in a proportion of 50 ⁇ of calcium chloride for every 1 ml of plasma, and wait 10-20 minutes until polymerization of the fibrin) and was subjected to heating at 70 ° C for 10 minutes, followed by cooling at 20 ° C for 10 minutes, obtaining a protein gel.
  • Figure 1 shows two electron microscopy images of said protein gel. In the image on the left you can see the presence of round structures that represent denatured albumin and other linear structures that are fibrin fibers. In the image on the right you can see the compact (outer) surface of the gel.
  • a plasma rich in growth factors (substance prepared after centrifuging blood at a speed of 580 g and a temperature of 20 ° C for various fractions, separating a fraction of platelet rich plasma (PRP) , add calcium chloride in a proportion of 50 ⁇ of calcium chloride per 1 ml of plasma, in order to cause the release of growth factors and initiate coagulation of the plasma.
  • the clot retraction allowed to obtain a supernatant.
  • supernatant was subjected to heating at 70 ° C for 10 minutes, followed by cooling at 20 ° C for 10 minutes, obtaining a protein gel
  • Figure 2 shows two electron microscopy images of said protein gel. on the left you can see the inside of the gel and the presence of round structures that represent the denatured albumin In the image on the right you can see the surface c ompacta (exterior) of the gel.
  • protein gels were prepared by subjecting a fibrin clot (prepared as described in Example 5) at different temperatures and times.
  • the conditions of preparation were: heat the clot at 70 ° C for 15 minutes (square), heat the clot at 70 ° C for 30 minutes (circle), heat the clot at 80 ° C for 15 minutes (triangle); and cool all of them at a temperature of 4 ° C for 10 minutes.
  • These geies were dried at 37 ° C for 24 hours and then incubated in distilled water. At 24-hour intervals the gels were weighed to calculate the degree of swelling, defined as: swollen weight / initial weight.
  • Figure 3 represents the degree or swelling factor of protein gels prepared at different temperatures and times.
  • gels increase their initial weight between 2 and 3 times due to the absorption of water and its retention within its structure. It can also be seen that gels prepared at 70 ° C for 15 minutes (square) swell in 24 hours and their swelling factor is not significantly modified at longer incubation times. Geies prepared at 70 ° C for 30 minutes (circle), however, swell approximately 3 times their initial weight after 24 hours, but with increasing incubation time a slight decrease in the swelling factor is observed. Meanwhile, gels prepared at 80 ° C for 15 minutes (triangle) take longer than the previous two, specifically 48 hours, to reach maximum swelling.
  • the swelling capacity of geys allows gels to be used, for example, as matrices for the local release of bioactive substances (proteins or active ingredients).
  • bioactive substances proteins or active ingredients.
  • This use would normally be carried out by applying a solution containing said bioactive substances on the dehydrated geys, resulting in the subsequent hydration of the geies, which would then incorporate the bioactive substances inside.
  • Figure 4 represents the degree of swelling of protein gels prepared at different temperatures and times. As can be seen, gels have increased approximately 3 times their initial weight due to the absorption of water and its retention within its structure. It can also be seen that gels prepared at 70 ° C for 15 minutes (square) swell in 24 hours and their swelling factor is not significantly modified at longer incubation times. On the other hand, gels prepared at 70 ° C for 30 minutes (circle) swell 3 times their initial weight after 48 hours but after a longer incubation period a slight decrease in swelling factor is observed. Meanwhile, gels prepared at 80 ° C for 15 minutes (triangle) reach said swelling factor approximately equal to 3 after 24 hours of incubation.
  • the swelling capacity of the gels allows gels to be used, for example, as matrices for the local release of bioactive substances (proteins or active ingredients).
  • bioactive substances proteins or active ingredients.
  • This use would normally be carried out by applying a solution containing said bioactive substances on dehydrated gels, resulting in hydration of the gels, which would then incorporate the bioactive substances inside.
  • SN supernatant
  • Fibrin fibrin clot
  • Without activating a platelet-rich plasma without activating
  • heat treatment consisting of heating the starting substances before 70 ° C for 15 minutes and cool to 21 ° C for 10 minutes.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagie's Medium
  • the five culture media were used to grow MG 63 cells, renewing at 2 (square), 4 (circle) and 7 days (triangle).
  • Figure 5 shows the cytocompatability results of the protein gels tested with the MG 63 osteoblastic cell line.
  • the gels are not toxic as shown by the increase in cell proliferation with respect to the control sample.
  • the gel prepared from the platelet-rich plasma without activating resulted in increased cell proliferation.
  • these differences are absent at longer proliferation times (circle, triangle). Therefore, this example serves to demonstrate that the formulations according to the invention exhibit a suitable behavior to stimulate cell growth and are also biocompatible, which allows their development directed towards their clinical use.
  • the collected media were stored for use in culturing MG 63 cells.
  • the cells were allowed to grow with this medium for 48 hours, after which cell proliferation was evaluated using the WST-1 chimeimetric reagent and a plate reader.
  • Figure 8 shows cell proliferation in each culture medium and in each incubation time interval. As can be seen, the greatest cell proliferation was achieved after 2 days of incubation.
  • the first substance was a fibrin gei obtained after activating a platelet-rich plasma with calcium chloride in a ratio of 50 ⁇ per 1 ml of plasma (as in Example 6).
  • the second substance was a supernatant obtained after retraction of a fibrin gei (as in Example 6). Both substances were subjected to three different heat treatments: a heating at 70 ° C for 15 minutes, a heating at 70 ° C for 30 minutes and a heating at 80 ° C for 15 minutes. In all cases, the warming was followed by cooling at a temperature of 4 ° C or at a temperature of 20 ° C, for 10 minutes. Twelve protein geies were obtained.
  • four protein geies or formulations according to the invention were prepared, applying a heat treatment consisting of heating at 70 ° C for 15 minutes and cooling at 21 ° C for 10 minutes the following initial substances: a supernatant (SN) , a fibrin clot (fibrin), a platelet-rich plasma without activating (without activating) and a platelet-rich plasma activated with 10% CaC without coagulation (activated without coagulation).
  • SN supernatant
  • fibrin clot fibrin clot
  • platelet-rich plasma without activating
  • platelet-rich plasma activated with 10% CaC without coagulation activated without coagulation
  • Figure 9 shows the kinetics of release of PDGF-AB in DMEM medium, indicating with black, white and striped bars the measures corresponding to the incubation time periods of 2, 4 and 7 days. It can be seen that the release of PDGF-AB was greater during 2 and 4 days of incubation for the protein gel prepared from the supernatant. The other gels do not show significant differences between the three incubation times.
  • Figure 10 shows the release kinetics of TGF- ⁇ in DMEM medium after 2 days of incubation.
  • the filling effect of protein gels or formulations according to the invention was tested in laboratory rats.
  • four formulations according to the invention were prepared.
  • the preparation of the four formulations began with the completion of the following steps. First, blood was taken from some patients to 9 ml tubes without anti-coagulant; The tubes were centrifuged at 850 g for 8 minutes to separate the plasma from the red blood cells. Then, the entire plasma column above the red blood cell fraction was removed into new 9 ml tubes, excluding leukocytes.
  • This plasma was used to prepare: on the one hand, the liquid plasma itself (B); on the other hand, a fibrin clot (C), for which 10% caustic chloride was added in a ratio of 50 ⁇ per 1 ml of plasma, producing plasma activation and clot formation; and on the other hand, a supernatant (A), for which a fibrin clot was prepared just like the previous one, and 60 minutes were waited at 37 ° C to allow fibrin retraction and obtaining the supernatant.
  • the blood of the patients was also extracted in 9 ml extraction tubes with 0.1 ml of 3.8% sodium citrate as an anti-coagulant.
  • the blood was centrifuged at 850g for 8 minutes, then the 2 ml of plasma just above the leuco-platelet layer was obtained and activated with 10% caustic chloride in a ratio of 50 ⁇ per 1 ml of plasma to obtain the blood clot. fibrin (D).
  • These four initial substances (A, B, C, D) were treated at 70 ° C for 10 minutes and cooled to 20 ° C for 10 minutes to obtain gels.
  • a dose of 0.6 ml of each of the gels formulations was administered to each rafa.
  • the photograph visible in Figure 1 1 shows the formation of increase in volume sustained by the protein gels indicating an improvement in their mechanical properties.
  • a plasma rich in growth factors (referred to as "PRGF-Endoret") was prepared following the steps of extracting blood in 9 ml tubes with 0.1 ml of 3.8% sodium citrate, centrifuging the blood at 850 g for 8 minutes, separate the platelet-rich plasma fraction (the 2 ml of the plasma column just above of the fraction of red blood cells, not including leukocytes) and, at the moment before injecting it into the rat, activate the plasma (cause the release of platelet growth factors) by adding 50 ⁇ of calcium chloride for every 1 ml .
  • PRGF-Endoret a plasma rich in growth factors
  • Figure 12 shows the changes in volume after 2 weeks of injecting protein geies into rats and using hyaluronic acid and growth-rich plasma "PRGF-Endoret" described above as controls. It can be concluded that protein gels are as effective in maintaining the volume of heme ellipsis as hyaluronic acid, while "PRGF-Endoret" growth factor-rich plasma was not useful in maintaining hemielipsis volume.
  • Platelet-rich plasma is prepared as described in Example 2. Next, a type I collagen is added. The mixture is then strained at a temperature of 75 ° C for 10 minutes and subsequently cooled to a temperature of 20 ° C for 3 minutes. The result of this preparation is a protein gel that shows greater consistency. This type of gel can be used as a filler for the treatment of wrinkles as it shows greater stability and a slower degradation rate than without collagen. Thus, this modification helps to slow down even more the degradation of the formulation. Clinically, this improvement in stability increases the period between a first and a second administration of the gel. This is a solution to the disadvantage of the treatment of wrinkles with hyaluronic acid, which requires repeated administration every 3-4 months, that is, in a short period of time.
  • Example 15 Platelet rich plasma is prepared as described in the
  • Example 2 Next, calcium phosphate, for example granules, is added. The mixture is then heated at a temperature of 80 ° C for 10 minutes and cooled to a temperature of 20 ° C for 3 minutes.
  • the hybrid material resulting from this preparation shows better mechanical properties than the unmodified gel with calcium phosphate.
  • the modification of gel with calcium phosphate increases the resistance of the gel to compression and tension forces.
  • This type of material can be used for the regeneration of bone defects that require greater mechanical stability of the filling material due to the lack of one or more walls in the defect.
  • the protein gel according to the invention is prepared according to the method of preparation described in any of the previous examples. Then, the gel is combined with hiaiuronic acid to produce a hybrid material. This material shows better viscoelastic properties, which increases its stability in the administration area thus preventing its migration. This hybrid material is useful for application on surfaces such as the vestibular wall of the narrow alveolar process to cause horizontal bone growth and thus increase the thickness of the alveolar process to allow the insertion of dental implants with sufficient bone coverage.
  • Example 8 After preparing the gel and drying it as described in Example 8 (any of the examples of protein gel described therein is valid), the dried material is incubated, for 24 hours and in the dark, in a liquid containing a doxycycline hyclata antibiotic in a concentration of 15 mg / ml. The result is gel swelling including in its structure the antibiotic for its subsequent release in the area of application.
  • this gei now serves for the controlled release of the antibiotic for the treatment of an infection in an area where there is less blood supply such as bone and prevents systemic administration of the antibiotic. This procedure can be repeated with other antibiotics and other drugs to ensure local release of the same.

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Abstract

Formulación que comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y proteínas provenientes de la propia composición sanguínea inicial, donde dichas proteínas se encuentran en estado gelificado. Se reivindica asimismo un método de preparación de dicha formulación, que comprende los pasos de calentar y posteriormente enfriar la composición sanguínea inicial a unas determinadas temperaturas y tiempos. Entre otras ventajas, la formulación según la invención es biocompatible y biodegradable, presenta las propiedades biológicas o médicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento, y además presenta una elevada estabilidad dimensional a lo largo del tiempo.

Description

FORMULACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN SANGUÍNEA RICA EN PL AS
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Sector de la técnica
La invención se refiere a una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, obtenida de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento. La invención se refiere asimismo a un método de preparación de dicha formulación.
Estado de la técnica
En el estado de la técnica se conoce la preparación de composiciones a partir de la sangre humana o animal, donde la sangre es procesada de manera que se obtiene un plasma rico en plaquetas (PRP) y/o un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) que presentan útiles propiedades biológicas y médicas. Dichos PRP o PRGF vienen siendo utilizados con éxito en aplicaciones ex vivo, por ejemplo como medio de cultivo celular, e in vivo, por ejemplo para realizar un proceso de regeneración ósea en un paciente o para tratar a un paciente de una dolencia articular mediante infiltraciones. En el caso de que dichas composiciones vayan a ser utilizadas en aplicaciones in vivo para tratar a un paciente, la tecnología de preparación de formulaciones PRP y PRGF ha ido evolucionando hacia la preparación de composiciones autólogas, es decir, obtenidas de la sangre del propio paciente. Ejemplos de este tipo de composiciones y métodos de preparación pueden encontrarse en las patentes US6569204 y ES2221770.
En los últimos años la tecnología también está evolucionando con el objetivo de conseguir que las composiciones ricas en plaquetas y/o en factores de crecimiento puedan obtenerse en forma de composiciones galénicas o formas farmacéuticas. Se entiende como composición galénica o forma farmacéutica a la disposición individualizada a que se adaptan los fármacos o principios activos, ya sean de origen químico o de origen biológico (como es el caso de las proteínas del PRP o PRGF), para facilitar su administración. La composición galénica o forma farmacéutica de un medicamento es clave porque determina la eficacia y seguridad del medicamento, ya que controla la dosis y la cesión de las moléculas del medicamento ai tejido. Además, la composición galénica o forma farmacéutica del medicamento es determinante para que la preparación del medicamento, su dosificación y su administración sean conocidas, estén controladas y sean ejecutables con relativa facilidad y de manera repetibie. En resumidas palabras, una composición galénica o forma farmacéutica pretende facilitar la manipulación, conservación, transporte, administración y en conjunto las propiedades de cualquier fármaco o sustancia con actividad terapéutica. Una de las formulaciones de mayor aplicación médica del PRP o
PRGF es la conocida como gel de fibrina o malla de fibrina, que es una formulación cuya consistencia semisólida resulta muy conveniente para ciertas aplicaciones. El procedimiento de preparación del gel o malla de fibrina generalmente comienza con una primera fase en la cual se obtiene el PRP o PRGF por un método aplicable, por ejemplo centrifugando sangre extraída de un paciente hasta que la sangre se separa en varias fracciones, y extrayendo la fracción superior, es decir la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP) o plasma rico en factores de crecimiento (PRGF). Posteriormente, se realiza la activación de las plaquetas contenidas en el PRP o PRGF (entendiéndose por activación la acción de provocar que las plaquetas liberen ciertos factores de crecimiento contenidos en su interior) por ejemplo mediante la adición de cloruro cáicico. Como consecuencia de la activación, y si se espera un tiempo suficiente, se produce la eventual polimerización de fibrina a partir del fibrinógeno contenido en el plasma, obteniéndose un compuesto final que es un coágulo de fibrina (también denominado gel o malla de fibrina por su consistencia semisólida, como una especie de esponja biológica). Este procedimiento es el que suele realizarse para obtener un gel de fibrina a partir de una sangre modificada con un anticoaguiante, como por ejemplo con citrato sódico. Pero también se puede procesar la sangre sin mezclar ésta previamente con anticoagulante; en este caso, ai centrifugar la sangre se consigue tanto separar el plasma de los glóbulos rojos como, al mismo tiempo, obtenerse el gel de fibrina sin necesidad de añadir cloruro cáicico u otro activador de las plaquetas. Algunos ejemplos de aplicación del gel o malla de fibrina son: formar un andamiaje biológico para rellenar defectos óseos; ser aplicado sobre heridas o lesiones para la liberación progresiva de los factores de crecimiento: ser empleado como matriz para el cultivo de células madre; ser empleado como una membrana para poder cerrar defectos o úlceras; ser empleado en la fabricación de tejidos, lo que se conoce como ingeniería de tejidos, donde además de células y factores de crecimiento es de especial importancia contar con una matriz o andamiaje donde las células puedan crecer.
El gel o malla de fibrina presenta algunas limitaciones importantes. La principal limitación del gel o malla de fibrina es que es inestable y tiende a retraerse; por ello, el gel o malla de fibrina no es capaz de mantener un volumen estable a lo largo del tiempo ni de proporcionar un soporte tisular estable a lo largo del tiempo. Si bien esta tendencia a retraerse puede ser positiva en algunas aplicaciones, resulta negativa en otras. Por ejemplo, en una técnica de cirugía dental conocida como elevación del seno maxilar, el biomateriai que se emplea para regenerar el defecto óseo debe tener propiedades osteoconductoras pero además debe ser capaz de mantener el espacio físico durante un largo periodo de tiempo hasta que la matriz ósea se conforme, ya que en caso contrario habría un colapso del espacio que afectaría a la regeneración vertical del hueso alveolar. Otro ejemplo es el caso de una extirpación mamaria (mastectomía), durante la cual el biomateriai o gel que se emplee para rellenar el espacio mamario debe tener una resistencia mecánica adecuada y proporcionar un espacio y volumen a largo plazo de forma que no se coiapse dicho espacio. Otro ejemplo aún es el caso de los fiiiers o agentes de relleno estético (por ejemplo el ácido hiaiurónico), que son materiales de relleno (por lo tanto dan y mantienen volumen) ampliamente usados en el campo de la estética para aumentar el volumen en las comisuras y arrugas y corregir dichos defectos, dando un aspecto rejuvenecido; cualquier agente que esté dirigido a funcionar como filler o agente de relleno debe ser mecánicamente estable y resistente a la compresión de forma que mantenga el volumen del tejido. Por otra parte, la tendencia del gel o malla de fibrina a retraerse dificulta e incluso impide el empleo del gel o malla como agente de liberación de agentes externos, fármacos, proteínas, etc. Otro aspecto limitado del gel o malla de fibrina es su imposibilidad de poder ser infiltrado o canuiado en su estado normal, semisóiido, lo que impide su administración como relleno en la piel, en dermocosmética, en traumatología y en otros campos de la biología o medicina. La presente invención tiene como objetivo conseguir una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, obtenida de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, que no tienda a retraerse y por tanto permita mantener un volumen estable a lo largo del tiempo. Entre otras aplicaciones, se desea que la formulación sirva como alternativa al gel o malla de fibrina en determinadas aplicaciones donde se requiere una composición estable.
Descripción breve de ta Invención Es objeto de la invención una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, que comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial (de origen humano o animal; autóloga, homologa u heterologa), rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y que comprende proteínas provenientes de la propia composición sanguínea inicial, con la particularidad de que dichas proteínas se encuentran en estado geiificado por un tratamiento térmico de calentamiento y enfriamiento. En particular, las proteínas gelificadas son preferentemente albúmina, glicoproteínas, globulinas y/o fibrinógeno. La formulación de acuerdo con la invención podría calificarse como un "gel de proteínas" (usando una terminología análoga a la utilizada para referirse ai gel de fibrina) debido a que presenta una consistencia gelificada que viene dada por las proteínas en estado geiificado. Además, la formulación es deformable. La composición presenta una configuración morfológica y biomecánica nueva en comparación con el resto de geies de relleno, composiciones sanguíneas ricas en plaquetas y/o factores de crecimiento, y similares conocidos en el estado de la técnica. Se propone también un método de preparación de la formulación anterior, que comprende los pasos de: disponer de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento cuya formulación de base puede variar; calentar la composición sanguínea inicial a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto; enfriar la composición sanguínea inicial durante ai menos 1 minuto. Este método de la invención, que puede considerarse como una secuencia térmica, permite dar volumen y rigidez a una composición sanguínea rica en plaquetas y/o factores de crecimiento en general, obteniendo un gei proteico o formulación de consistencia de gei gracias ai estado geiificado de ciertas proteínas comprendidas en la composición sanguínea inicial.
La formulación de acuerdo con la invención es biocompatible, biodegradabie y presenta las propiedades biológicas o médicas deseables proporcionadas por la presencia de plaquetas o factores de crecimiento, a la vez que tiene una consistencia densa o viscosa debido al estado geiificado de ciertas proteínas contenidas en la composición sanguínea inicial, con la importante ventaja de que dicha consistencia densa o viscosa es estable a lo largo del tiempo. La formulación según la invención es por tanto una alternativa ventajosa al gei o malla de fibrina, debido al hecho de que la formulación no se retrae y permite por ello mantener relleno un espacio físico. Además, la formulación presenta una buena resistencia a la compresión, similar o mejor que la del ácido hialurónico (utilizado habitualmente como fiiier o agente de relleno), y soporta adecuadamente la resistencia que le puede ejercer un tejido; por tanto, la formulación resulta muy apta para ser utilizada como filler o agente de relleno. Además, aun cuando tanto la malla de fibrina como la formulación según la invención tienen carácter semisóiido, solamente la segunda puede infiltrarse o inyectarse debido a que es deformable. Una ventaja adicional de la formulación es que puede ser desecada para posteriormente re-hidratarse.
Descripción breve de ¡as figuras
Los detalles de la invención se aprecian en las figuras que se acompañan, no pretendiendo éstas ser limitativas del alcance de la invención:
- La Figura 1 muestra dos imágenes de microscopía electrónica de un ejemplo de formulación según la invención.
- La Figura 2 muestra dos imágenes de microscopía electrónica de otro ejemplo de formulación según la invención.
- La Figura 3 muestra el factor de hinchamiento de varias formulaciones según la invención preparadas a partir de coagulo de fibrina tratado a diferentes temperaturas y tiempos.
- La Figura 4 muestra el factor de hinchamiento de varias formulaciones según la invención preparadas a partir de sobrenadante tratado a diferentes temperaturas y tiempos.
- La Figura 5 muestra unos resultados de citocompatabilidad de varias formulaciones según la invención, ensayada con la línea celular osteoblástica MG 63.
- La Figura 6 muestra otros resultados de citocompatabilidad de varias formulaciones según la invención, ensayada con la línea celular osteoblástica MG 63.
- Las Figuras 7 y 8 muestran respectivamente el contenido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) y del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) en doce formulaciones de acuerdo con la invención.
- La Figura 9 muestra la cinética de liberación del factor de crecimiento PDGF-AB en cuatro formulaciones de acuerdo con la invención incubadas durante diferentes periodos de tiempo.
- La Figura 10 muestra la cinética de liberación del factor de crecimiento TGF-β en cuatro formulaciones de acuerdo con la invención incubadas durante 2 días.
- La Figura 1 1 muestra una fotografía de la espalda de una rata de laboratorio en la cual se han inyectado muestras de cuatro formulaciones según la invención.
- La Figura 12 muestra una gráfica relacionada con el ensayo de la figura anterior, ilustrando el volumen de la hemieiipsis tras inyectar las formulaciones a nivel intradérmico y transcurridas dos semanas tras la inyección. Descripción detailada de ia invención
Con e! fin de superar problemas aún existentes en el estado de la técnica relacionados con la falta de estabilidad de los geles o mallas de fibrina, se propone una formulación alternativa con propiedades biológicas o médicas deseables y con una estabilidad mejorada a lo largo del tiempo. Dicha formulación comprende o se deriva de una composición sanguínea inicial. Dicha composición sanguínea es rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y además comprende diversas proteínas. Por tanto, ia formulación igualmente es rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y comprende diversas proteínas. De entre dichas proteínas, determinadas proteínas se encuentran en estado gelificado, es decir, desnaturalizadas y formando una red proteica ordenada, preferentemente debido a un tratamiento térmico de calentamiento y enfriamiento. Las proteínas en estado gelificado son preferentemente albúmina, glicoproteínas, globulinas y/o fibrinógeno. Se ha comprobado que el gei proteico de acuerdo con ia invención no se retrae, puede canuiarse o infiltrarse fácilmente y mantiene el volumen y espacio a diferencia de sus homónimos basados sólo en la red de fibrina.
La composición sanguínea inicial puede ser, por ejemplo, un plasma sanguíneo rico en plaquetas, es decir, un plasma con una concentración elevada de plaquetas. Dicho plasma se ha obtenido generalmente mediante la técnica de centrifugar sangre (para separarla en una fracción de fracción de glóbulos rojos, una fracción de glóbulos blancos y una fracción de plasma rico en plaquetas (PRP)) y separar toda o parte de la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP).
La composición sanguínea inicial puede también ser un sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en plaquetas (PRP), El sobrenadante es una sustancial líquida que aparece sobre el coágulo cuando se causa la coagulación de un plasma rico en plaquetas (PRP) y su posterior retracción.
La composición sanguínea inicial puede ser un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento (PRGF) liberados, es decir, un plasma sanguíneo rico en plaquetas que ha sido activado (por ejemplo mediante la aportación de cloruro de calcio, de trombina, de una combinación de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sódico, de colágeno, o de cualquier otro agente que actúe activando las plaquetas e induciendo la formación de fibrina) de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.
Análogamente, la composición sanguínea inicial puede ser un sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento (PRGF) liberados, es decir, un sobrenadante obtenido tras la coagulación y posterior retracción de un plasma rico en plaquetas que ha sido previamente activado (por ejemplo mediante la aportación de cloruro de calcio, de trombina, de la combinación de cloruro de calcio y trombina, de gluconato sódico, de colágeno, o de cualquier otro agente que actúe activando las plaquetas e induciendo la formación de fibrina) de manera que las plaquetas han liberado de su interior ciertos factores de crecimiento.
La composición sanguínea inicial puede contener o no leucocitos.
La composición inicial también puede ser un gel de fibrina obtenido directamente del procesado de sangre que no haya sido modificada con un anticoagulante.
Se propone asimismo un método de preparación de una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, donde dicho método comprende los pasos de: a) disponer de una composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento, la cual es preferentemente un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas con o sin leucocitos, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento con o sin leucocitos, o un gel de fibrina obtenido a partir de sangre no modificada con anticoagulante; en caso de contar la composición sanguínea con plaquetas, activar opcionalmente las plaquetas con algún agente activador como cloruro cálcico, trombina, gluconato cálcico, colágeno o cualquier otro, o una combinación de ellos., y esperar hasta que se forme una fibrina provisional; c) calentar la composición sanguínea inicial a una temperatura entre 60 y 100°C durante al menos 1 minuto; d) enfriar o atemperar la composición sanguínea inicial durante al menos 1 minuto.
El método anterior desarrolla un choque térmico sobre la composición sanguínea inicial de forma que se induce una geiificación proteica de varias proteínas existentes en el plasma humano, entre ellas la albúmina, las glicoproteínas, las globulinas y/o el fibrinógeno. A ios efectos de la presente invención, se denomina "geiificación" ai proceso sufrido por las moléculas en el cual se polimerizan o agregan para formar una red proteica ordenada. En resumen, como consecuencia del proceso de choque térmico se logran nuevas formulaciones biocompatibies y biodegradabies, dependiendo de cuál sea la composición sanguínea inicial, cuyo denominador común es la geiificación o polimerización proteica.
Ademas, se ha comprobado que la formulación según la invención, provista de proteínas gelificadas, mantiene sustanciaimente los niveles de factores de crecimiento de la composición sanguínea inicial. Es decir, el choque térmico no provoca una destrucción masiva de factores de crecimiento de dicha composición sanguínea inicial.
Preferentemente, la composición sanguínea inicial se calienta a una temperatura de entre 70 y 85°C.
La composición sanguínea inicial rica en plaquetas y/o factores de crecimiento es de origen humano o animal. Además, puede ser autóloga (perteneciente a un paciente ai cual se desea tratar posteriormente con la formulación final), homologa (perteneciente a un miembro de la misma especie que el paciente, los pacientes, las células u otra entidad biológica que vaya a ser tratada o procesada con la formulación final) o heteróloga (perteneciente a un miembro de diferente especie que el paciente, ios pacientes, las células u otra entidad biológica que vaya a ser tratada o procesada con la formulación final).
La invención contempla que la composición sanguínea inicial puede incorporar opcionaimente una o más sustancias adicionales, añadidas de forma previa ai tratamiento térmico reivindicado. Dichas sustancias adicionales pueden ser:
- uno o más agentes bioactivos seleccionados entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, poiisacáridos, lípidos, sustancias orgánicas no proteicas y sustancias inorgánicas;
- uno o más polímeros biodegradables seleccionados entre: ácido hiaiurónico, sales de hiaiuronato, chondroitín 4 sulfato, chondroitín 6 sulfato, dextrán, gel de sílice, algínato, hidroxipropiímetilceluiosa, derivados de chitín, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietiieno glicóiicos (PEG), polihidroxietilenometacriiato (HEMA), proteínas sintéticas o naturales, colágenos;
- uno o más polímeros orgánicos seleccionados del grupo de policarpoiactona, poiiglicólico, poiiláctico, y sus co-polímeros;
- uno o más de entre los siguientes agentes: antibióticos, antimicrobianos, anticancerígenos, analgésicos, factores de crecimiento, hormonas;
- uno o más componentes inorgánicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio.
La invención contempla también que cualquiera de las sustancias anteriores puedan ser añadidas a la formulación después de realizado el tratamiento térmico. La formulación según la invención contempla modos de realización diversos en los que la formulación pueda comprender, además de ¡os aspectos técnicos reivindicados, otros compuestos, componentes, moléculas, etc. que resulten convenientes para ¡a aplicación concreta a ¡a que vaya a estar destinada ¡a formulación. En otras palabras, la invención se plantea como una familia de nuevas formulaciones basadas en geies de proteínas, estando formada dicha familia por diferentes formulaciones que tienen en común ¡a presencia de proteínas gelificadas y que pueden diferir en su composición adicional.
Además, es posible realizar pasos adicionales sobre la formulación con proteínas gelificadas que incluyen desecados de ¡as matrices para aumentar su versatilidad. Es decir, ¡as formulaciones de proteínas gelificadas de acuerdo con la invención pueden ser desecadas (calor seco) o liofilizadas para formar una membrana. Esta membrana puede ser posteriormente rehidrata mediante diferentes alternativas tales como añadir una solución salina, un plasma rico en plaquetas, un sobrenadante de un plasma rico en plaquetas, un plasma rico en factores de crecimiento, un sobrenadante de un plasma rico en factores de crecimiento, o cualquier otra solución que permita hidratar ¡a membrana.
Ejemplos Ejemplo 1
Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo con cierre hermético y que no contiene anticoagulante citrato. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de ¡a centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae ¡a fracción superior, o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), incluyendo también los glóbulos blancos, a una jeringa de 5 mi. Debido a que el tubo inicial no se encontraba citratado, el PRP ha comenzado a coagular. Se calienta el contenido de ¡a jeringa a una temperatura de 70°C durante 10 minutos. Posteriormente, se enfría el segundo contenedor a una temperatura de 4°C durante 2 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisóiida, con consistencia de gel. Por tanto, se obtiene una formulación activada, con consistencia de gel tanto por la fibrina generada como consecuencia de la coagulación como por ia geiificación de las proteínas producida por el tratamiento térmico, y libre de citrato y calcio. La presencia de fibrina otorga a ia formulación una consistencia mayor firmeza y resistencia, mientras que las proteínas gelificadas aportan estabilidad y volumen constante. Gracias a sus propiedades y resistencia mecánica, una sustancia de este tipo puede ser útil por ejemplo para corregir defectos verticales en ios tejidos faciales.
Ejemplo 2 Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo de extracción con cierre hermético que contiene anticoaguiante citrato al 3,8% en una cantidad de 0, 1 mi. Se centrifuga ia sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de ia centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae ia fracción superior o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir ios glóbulos blancos, a una jeringa de 5 m i. Se calienta ia jeringa a una temperatura de 80°C durante 3 minutos. Posteriormente, se enfría ia jeringa a una temperatura de 20°C durante 10 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior del segundo contenedor una sustancia semisóiida, con consistencia de gel, cuyas plaquetas se encuentran pendientes de activar, y que no comprende fibrina por no haber sido previamente coagulada. Una sustancia de este tipo puede ser útil para su aplicación por ejemplo como relleno en ia cirugía estética y conseguir un rejuvenecimiento eliminando o minimizando la presencia de arrugas gracias a ia inyectabilidad del bio-gel a través de aguja (menor o igual de 25 G) y su consistencia capaz de elevar la piel. Este bio-gel es estable en el tiempo y además libera factores de crecimiento que estimulan el crecimiento y la proliferación celular, resultando por tanto muy ventajoso en comparación con sustancias convencionales tales como el ácido hialuronico. El acido hialuronico, que es el material de relleno mas utilizado en la actualidad, precisamente carece de bioactividad y por lo tanto no promueve la formación de tejidos ni consigue ia persistencia de mejoras a lo largo del tiempo, lo cual hace necesario que deba ser administrado periódicamente, generalmente cada 3-4 meses.
Ejemplo 3
Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo de extracción con cierre hermético que contiene anticoaguiante citrato al 3,8% en una cantidad de 0, 1 mi. Se centrifuga ia sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de ia centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae ia fracción superior o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir ios glóbulos blancos, a una jeringa de 5 mi. Se añade cloruro de calcio al 10% en una relación de 50 μ! por cada 1 mi de plasma, causando la activación de las plaquetas, es decir, la liberación de factores de crecimiento, y ia coagulación del plasma. Entonces, se calienta la jeringa a una temperatura de 75°C durante 5 minutos. Posteriormente, se enfría la jeringa a una temperatura ambiente durante 10 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de ia jeringa una sustancia semisóiida, con consistencia de gei tanto por la fibrina generada como consecuencia de ia coagulación como por la geiificación de las proteínas producida por el tratamiento térmico, provista de citrato, calcio y factores de crecimiento liberados. Una sustancia de este tipo puede ser útil para rellenar un defecto óseo, como por ejemplo el alveolo que queda tras extraer una pieza dental, para fomentar la regeneración del alveolo. Gracias a la liberación de factores de crecimiento y ia capacidad del gei para actuar como soporte del crecimiento celular, el gei favorece el que se produzca el relleno del alveolo con tejido óseo, acortando así ios tiempos de espera para colocar, por ejemplo, un implante dental en el alveolo que sustituya al diente extraído. Ejemplo 4
Se parte de una muestra de 9 mi de sangre extraída de un paciente y almacenada en un tubo de extracción con cierre hermético que contiene 0, 1 mi de una solución de citrato sódico con una concentración de 3,8% (peso/volumen) que actúa como anticoagulante. Se centrifuga la sangre a una velocidad de 580 g, durante un tiempo de 8 minutos y a una temperatura ambiente. Como consecuencia de la centrifugación, la sangre contenida en el tubo se divide en varias fracciones. Se extrae la fracción superior o fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), evitando incluir ios glóbulos blancos, a un tubo de fraccionamiento de 9 mi. Se añade una solución de cloruro de calcio (con una concentración de 10% en peso/volumen) en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma y se introduce el tubo en un horno a 37°C. El cloruro de calcio causa la activación de las plaquetas, es decir, la liberación de factores de crecimiento, la coagulación del plasma y la formación de fibrina (viéndose dicha formación acelerada por encontrarse el tubo en las condiciones de temperatura proporcionadas por el horno). Seguidamente, por la retracción del coágulo se obtienen dos fases: una fase sólida, que es una estructura tridimensional de fibrina, y una fase líquida sobrenadante, que contiene proteínas y factores de crecimiento piaquetaríos y plasmáticos. Se separa la fase líquida o sobrenadante a una jeringa de 3 mi. Entonces, se calienta la jeringa a una temperatura de 80°C durante 10 minutos. Posteriormente, se enfría la jeringa a una temperatura de 22°C durante 5 minutos. Como consecuencia de esta secuencia térmica de calentamiento-enfriamiento, se forma en el interior de la jeringa una sustancia semisólida, aunque con una consistencia menos sólida que las formulaciones de acuerdo con la invención que sí comprenden fibrina. Debido a su consistencia menos sólida, una sustancia de este tipo puede ser útil por ejemplo para rellenar defectos periodontaies intra-óseos con el objetivo de promover la regeneración del tejido periodontai, o regenerar hueso infiltrándolo subperióstico o supraperióstíco.
Ejemplo 5
En otro ejemplo, se partió de un coágulo de fibrina (sustancia preparada tras centrifugar sangre a una velocidad de 580 g y una temperatura de 20°C para obtener plasma rico en plaquetas, añadir cloruro cálcico en una proporción de 50 μΙ de cloruro cálcico por cada 1 mi de plasma, y esperar 10-20 minutos hasta la polimerización de la fibrina) y se sometió al mismo a un calentamiento a 70°C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 20°C durante 10 minutos, obteniéndose un gel proteico. La Figura 1 muestra dos imágenes de microscopía electrónica del citado gel proteico. En la imagen de la izquierda se puede observar la presencia de estructuras redondas que representan la albúmina desnaturalizada y otras estructuras lineales que son fibras de fibrina. En la imagen de la derecha se puede observar la superficie compacta (exterior) del gel.
Ejemplo 8
En otro ejemplo, se partió de un plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) (sustancia preparada tras centrifugar sangre a una velocidad de 580 g y una temperatura de 20°C para diversas fracciones, separar una fracción de plasma rico en plaquetas (PRP), añadir cloruro cálcico en una proporción de 50 μΙ de cloruro cálcico por cada 1 mi de plasma, con el fin de provocar la liberación de factores de crecimiento e iniciar la coagulación del plasma. La retracción del coágulo permitió obtener un sobrenadante. Entonces, dicho sobrenadante se sometió a un calentamiento a 70°C durante 10 minutos, seguido de un enfriamiento a 20°C durante 10 minutos, obteniéndose un gel proteico. La Figura 2 muestra dos imágenes de microscopía electrónica del citado gel proteico. En la imagen de la izquierda se puede observar el interior del gel y la presencia de estructuras redondas que representan la albúmina desnaturalizada. En la imagen de la derecha se puede observar la superficie compacta (exterior) del gel.
Ejemplo 7
En otro ejemplo, se prepararon varios geles proteicos sometiendo un coágulo de fibrina (preparado según lo descrito en el Ejemplo 5) a diferentes temperaturas y tiempos. Las condiciones de preparación fueron: calentar el coágulo a 70°C durante 15 minutos (cuadrado), calentar el coágulo a 70°C durante 30 minutos (círculo), calentar el coágulo a 80°C durante 15 minutos (triangulo); y enfriar todos ellos a una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Estos geies fueron desecados a 37°C durante 24 horas y después fueron incubados en agua destilada. En intervalos de 24 horas los geles fueron pesados para calcular el grado de hinchamiento, definido como: peso hinchado / peso inicial. La Figura 3 representa el grado o factor de hinchamiento de los geles proteicos preparados a diferentes temperaturas y tiempos. Como puede observarse, ios geles aumentan entre 2 y 3 veces su peso inicial debido a la absorción del agua y la retención de la misma dentro de su estructura. También se puede observar que los geles preparados a 70°C durante 15 minutos (cuadrado) se hinchan en 24 horas y su factor de hinchamiento no se ve modificado significativamente a mayores tiempos de incubación. Los geies preparados a 70°C durante, en cambio, 30 minutos (círculo) se hinchan aproximadamente 3 veces su peso inicial tras 24 horas pero al incrementarse el tiempo de incubación se observa un descenso ligero del factor de hinchamiento. Mientras, los geles preparados a 80°C durante 15 minutos (triángulo) tardan más que los dos anteriores, concretamente 48 h, en alcanzar un hinchamiento máximo. En cualquier caso, la capacidad de hinchamiento de los geies permite que ios geles puedan ser utilizados, por ejemplo, corno matrices para la liberación local de sustancias bioactivas (proteínas o principios activos). Este uso se llevaría a cabo normalmente aplicando una solución que contenga dichas sustancias bioactivas sobre ios geies deshidratados, produciéndose la consiguiente hidratación de los geies, los cuales entonces incorporarían las sustancias bioactivas en su interior.
Ejemplo 8
En otro ejemplo, se prepararon varios geles proteicos sometiendo un sobrenadante (preparado según el Ejemplo 6) a diferentes temperaturas y tiempos. Las condiciones de preparación fueron: calentar el sobrenadante a 70°C durante 15 minutos (cuadrado), calentar el sobrenadante a 70°C durante 30 minutos (círculo), calentar el sobrenadante a 80°C durante 15 minutos (triángulo); y enfriar todos ellos a una temperatura de 4°C durante 10 minutos. Estos geles fueron desecados a 37°C durante 24 horas y después fueron incubados en agua destilada. En intervalos de 24 horas ¡os geles fueron pesados para calcular el grado de hinchamiento, definido como: peso hinchado / peso inicial. El peso inicial es el peso del gel seco antes de su incubación en agua. La Figura 4 representa el grado de hinchamiento de ¡os geles de proteínas preparados a diferentes temperaturas y tiempos. Como puede observarse, los geles han aumentado aproximadamente 3 veces su peso inicial debido a ¡a absorción de¡ agua y ¡a retención de la misma dentro de su estructura. También se puede observar que ¡os geles preparados a 70°C durante 15 minutos (cuadrado) se hinchan en 24 horas y su factor de hinchamiento no se ve modificado significativamente a mayores tiempos de incubación. En cambio, los geles preparados a 70°C durante 30 minutos (círculo) se hinchan 3 veces su peso inicial tras 48 horas pero a mayor tiempo de incubación se observa un descenso ligero de¡ factor de hinchamiento. Mientras, ¡os geles preparados a 80°C durante 15 minutos (triángulo) alcanzan dicho factor de hinchamiento aproximadamente igual a 3 tras 24 horas de incubación. En cualquier caso, ¡a capacidad de hinchamiento de ios geles permite que ¡os geles puedan ser utilizados, por ejemplo, como matrices para la ¡iberación local de sustancias bioactivas (proteínas o principios activos). Este uso se ¡levaría a cabo norma¡mente apücando una solución que contenga dichas sustancias bioactivas sobre ¡os geles deshidratados, produciéndose ¡a consiguiente hidratación de ios geles, los cuales entonces incorporarían ¡as sustancias bioactivas en su interior.
Eiempio 9
En otro ejempto, prepararon cuatro ge¡es proteicos o formulaciones de acuerdo con ¡a invención a partir de un sobrenadante (indicado como "SN" en la gráfica a la que se hará referencia al final de este ejemplo), un coágulo de fibrina ("Fibrina"), un plasma rico en plaquetas sin activar ("Sin activar") y un piasma rico en plaquetas activado con 10% CaCI2 sin coagular ("activ~sin coaguiar"), realizando un tratamiento térmico consistente en calentar las sustancias inicíales anteriores a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos. Los métodos de preparación de estas sustancias iniciales están explicados en ios Ejemplos 2, 3 y 6. Cada una de estas cuatro formulaciones obtenidas tras el tratamiento térmico se incubó en medio de cultivo Dulbecco's Modified Eagie's Médium (DMEM) sin suero bovino fetal durante 48 horas. Por otra parte, se partió asimismo de una quinta sustancia o sustancia de control, consistente en el propio DMEM sin suero bovino fetal. Los cinco medios de cultivo fueron empleados para cultivar células MG 63, renovándose a los 2 (cuadrado), 4 (círculo) y 7 días (triángulo). Después de cada uno de estos periodos de tiempo se evaluó la proliferación celular utilizando el reactivo colorimétrico WST-1 y un lector de placa. El porcentaje de proliferación se calculó con la siguiente función: % proliferación = (absorbancia del WST-1 para los geles / absorbancia del WST-1 para control) * 100. La Figura 5 muestra ios resultados de citocompatabilidad de los geles proteicos ensayados con la línea celular osteoblástica MG 63. Como puede observarse, los geles no son tóxicos como muestra el aumento en la proliferación celular con respecto a la muestra de control. A los 2 días de proliferación (cuadrado) el gel preparado a partir del plasma rico en plaquetas sin activar resultó en mayor proliferación celular. Sin embargo, estas diferencias son ausentes a mayores tiempos de proliferación (círculo, triángulo). Por tanto, este ejemplo sirve para demostrar que las formulaciones según la invención presentan un comportamiento adecuado para estimular el crecimiento celular y también son biocompatibles, lo que permite su desarrollo dirigido hacia su uso clínico.
Ejemplo 10
Ai igual que en el ejemplo anterior, se prepararon cuatro geles proteicos o formulaciones de acuerdo con la invención a partir de un sobrenadante (cuadro), un coágulo de fibrina (círculo), un plasma rico en plaquetas sin activar (triángulo con vértice central hacia arriba) y un plasma rico en plaquetas activado con 10% CaCI2 sin coagular (triángulo con vértice central hacia abajo), realizando un tratamiento térmico consistente en calentar las sustancias iniciales anteriores a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos. Los métodos de preparación de estas sustancias iniciales están explicados en ios Ejemplos 2, 3 y 6, Las cuatro formulaciones obtenidas fueron incubadas en medio de cultivo durante 2, 4, 7 y 9 días. Después de cada tiempo, ios medios fueron recogidos y se añadió nuevo medio a los geies. Los medios recogidos se guardaron para usarlos para cultivar las células MG 63. Las células se dejaron crecer con este medio durante 48 horas, tras las cuales fue evaluada la proliferación celular utilizando el reactivo coiorimétrico WST-1 y un lector de placa. El porcentaje de proliferación fue calculada con la siguiente función: % proliferación = (absorbancia del WST-1 para los geies / absorbancia del WST-1 para control) * 100, donde como sustancia de control se utilizó un DMEM sin suero. La Figura 8 muestra la proliferación celular en cada medio de cultivo y en cada intervalo de tiempo de incubación. Como puede observarse, la mayor proliferación celular fue conseguida tras 2 días de incubación. A mayores tiempos de incubación, ios medios de cultivo promovieron una menor proliferación celular, lo que podría indicar que la liberación de los factores de crecimiento fue mayor tras 2 días de incubación y este contenido en factores de crecimiento fue menor en ios medios de mayor tiempo de incubación (4, 7 y 9 días). Así, estos resultados muestran que la liberación en los geies de sustancias bioactivas que estimulan la proliferación celular va disminuyendo en función del tiempo siguiendo un perfil de liberación parecido a otros tipos de geies que se caracterizan por liberar grandes cantidades de sustancias bioactivas durante las primeras horas de incubación (efecto "burst"), y que con el paso de tiempo se disminuye notablemente la cantidad liberada.
Ejemplo 1 1
En otro ejemplo, se partió de dos sustancias iniciales. La primera sustancia era un gei de fibrina obtenido tras activar un plasma rico en plaquetas con cloruro cálcico en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma (como en el Ejemplo 6). La segunda sustancia era un sobrenadante obtenido tras la retracción de un gei de fibrina (como en el Ejemplo 6). Ambas sustancias fueron sometidas a tres tratamientos térmicos diferentes: un calentamiento a 70°C durante 15 minutos, un calentamiento a 70°C durante 30 minutos y un calentamiento a 80°C durante 15 minutos. En todos los casos, ios calentamientos fueron seguidos de un enfriamiento a temperatura de 4°C o a una temperatura de 20°C, durante 10 minutos. Se obtuvieron doce geies proteicos. Seguidamente, se centrifugaron ios doce geies a 14800 rpm durante 20 minutos y se midió el contenido del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AB) y del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β). Los resultados de estas medidas se muestran en las Figuras 7 y 8, donde se visualizan ios doce geies en seis grupos de dos, indicándose los grupos como "1 " (gei de fibrina a 70°c, 15 minutos), "2" (gel de fibrina a 70°c, 30 minutos), "3" (gei de fibrina a 80°c, 15 min), "4" (gel de sobrenadante a 70°C, 15 min), "5" (gel de sobrenadante a 70°C, 30 min) y "8" (gel de sobrenadante a 80°C, 15 min), y donde dentro de cada grupo se indica con una barra negra el gei enfriado a 4°C y con una barra blanca el gei enfriado a 20°C, La Figura 7 muestra los contenidos del factor de crecimiento PDGF-AB observados. Puede concluirse que el contenido de este factor de crecimiento fue en general mayor en ios geies enfriados a 20°C (barras blancas) que los geies enfriados a 4°C (barras negras), exceptuando ios geies de sobrenadante preparado a 70°C durante 30 minutos ("5") y a 80°C ("6"), donde no se observaron apenas diferencias en el contenido de PDGF-AB en función de la temperatura de enfriamiento. La Figura 8 muestra ios contenidos del factor de crecimiento TGF-β observados. Puede concluirse que, en lo que respecta a ios geies preparados a partir de fibrina (grupos "1 ", "2", "3"), en el caso de realizarse el enfriamiento a 20°C (barras blancas) el contenido del factor TGF-β fue similar en los tres grupos, es decir, para diferentes tratamientos térmicos de preparación de ios geies, mientras que en el caso de realizarse el enfriamiento a 4°C (barras negras) el contenido del factor TGF-β fue mayor en el gel preparado a 70°C durante 15 minutos (grupo "1 "). En cambio, en lo que respecta a los geies preparados a partir de sobrenadante (grupos "4", "5", "6"), puede observarse que solamente el gel proteico preparado a partir del sobrenadante a 70°C durante 15 minutos (grupo "1 ") liberó el TGF-β, no siendo detectado dicho factor en ios demás geies preparados a partir del sobrenadante. Así, es posible concluir que el gel de fibrina mantiene más contenido de factores de crecimiento que el sobrenadante a temperaturas superiores a 70°C y que tanto la temperatura de calentamiento como la temperatura de enfriamiento afectan a este contenido de factores de crecimiento, siendo mayor el contenido a temperaturas de calentamiento más bajas y a una temperatura de enfriamiento de 21 °C. También puede concluirse que el PDGF-AB es más estable que el TGF-β a temperaturas altas y que el gel proteico basado en fibrina contiene más cantidad de TGF-β que el gel proteico basado en el sobrenadante.
Ejemplo 12
En otro ejemplo, se prepararon cuatro geies proteicos o formulaciones de acuerdo con la invención, aplicando un tratamiento térmico consistente en calentar a 70°C durante 15 minutos y enfriar a 21 °C durante 10 minutos las siguientes sustancias iniciales: un sobrenadante (SN), un coagulo de fibrina (fibrina), un plasma rico en plaquetas sin activar (sin activar) y un plasma rico en plaquetas activado con 10% CaC sin coagular (activado sin coagular). La preparación de estas sustancias iniciales está explicada en los Ejemplos 2, 3 y 6. Los cuatro geles proteicos fueron incubados en D EM durante distintos periodos de tiempo (2, 4 y 7días). Los medios de cada tiempo de incubación fueron extraídos para determinar el contenido del PDGF-AB y el TGF-β con el objetivo de determinar la cinética de liberación de estos factores de crecimiento de los cuatro geles proteicos. La Figura 9 muestra la cinética de liberación del PDGF-AB en medio de DMEM, indicándose con barras negras, blancas y rayadas las medidas correspondientes a los periodos de tiempo de incubación de 2, 4 y 7 días. Puede observarse que la liberación del PDGF-AB fue mayor durante 2 y 4 días de incubación para el gel proteico preparado desde el sobrenadante. Los demás geles no muestran diferencias significativas entre los tres tiempos de incubación. Por su parte, la Figura 10 muestra la cinética de liberación del TGF-β en medio de DMEM después de 2 días de incubación. Puede observarse que este factor fue presente solo en ios geles proteicos preparados a partir del sobrenadante y la fibrina, siendo mayor la liberación del TGF-β del gel proteico a partir del sobrenadante. Así, se puede concluir que la liberación de los factores de crecimiento es más rápida desde los geies proteicos basados en el sobrenadante. Ejemplo 13
En otro ejemplo, se ensayó el efecto de relleno de los geles de proteínas o formulaciones de acuerdo con la invención en ratas de laboratorio. Para ello se prepararon cuatro formulaciones según la invención. La preparación de las cuatro formulaciones comenzó con la realización de los pasos siguientes. En primer lugar, se extrajo sangre de unos pacientes a tubos de 9 mi sin anti-coaguiante; se centrifugaron ios tubos a 850 g durante 8 minutos para separar el plasma de los glóbulos rojos. Entonces, se extrajo a tubos nuevos de 9 mi toda la columna de plasma situada encima de la fracción de glóbulos rojos, excluyendo ios leucocitos. Este plasma fue empleado para preparar: por una parte, el propio plasma líquido (B); por otra parte, un coágulo de fibrina (C), para lo cual se añadió 10% cloruro cáicico en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma, produciéndose la activación del plasma y la formación del coágulo; y por otra parte, un sobrenadante (A), para lo cual se preparó un coágulo de fibrina igual que el anterior, y se esperó 60 minutos a 37°C para permitir la retracción de la fibrina y la obtención del sobrenadante. También se extrajo la sangre de ios pacientes en tubos de extracción de 9 mi con 0.1 mi de 3.8% de citrato sódico como anti-coaguiante. La sangre fue centrifugada a 850g durante 8 minutos, seguidamente los 2 mi de plasma justo encima de la capa leuco-plaquetaria fue obtenida y activada con 10% cloruro cáicico en una relación de 50 μΙ por cada 1 mi de plasma para obtener el coágulo de fibrina (D). Estas cuatro sustancias iniciales (A, B, C, D) fueron tratadas a 70°C durante 10 minutos y enfriadas a 20°C durante 10 minutos para obtener ios geles. Se administró una dosis de 0,6 mi de cada una de las formulaciones de los geles a cada rafa. La fotografía visible en la Figura 1 1 muestra la formación de aumento en volumen sostenido por ios geles proteicos indicando una mejora en sus propiedades mecánicos.
Además, se preparó un plasma rico en factores de crecimiento (ai que se hará referencia corno "PRGF-Endoret") siguiendo ios pasos de extraer sangre en tubos de 9 mi con 0, 1 mi de 3.8% de citrato sódico, centrifugar la sangre a 850 g durante 8 minutos, separar la fracción de plasma rica en plaquetas (los 2 mi de la columna de plasma justo encima de ¡a fracción de glóbulos rojos, sin incluir los leucocitos) y, en el momento antes de inyectarlo en la rata, activar el plasma (causar la liberación de factores de crecimiento de las plaquetas) añadiendo 50 μΙ de cloruro cálcico por cada 1 mi.
La Figura 12 muestra ios cambios en volumen tras 2 semanas de inyectar los geies proteicos en ratas y empleando como controles ácido hialurónico y el plasma rico en factores de crecimiento "PRGF-Endoret" descrito anteriormente. Se puede concluir que los geles proteicos son tan eficaces en mantener el volumen de la hem ¡elipsis como el ácido hialurónico, mientras que el plasma rico en factores de crecimiento "PRGF-Endoret" no fue útil para mantener el volumen de la hemielipsis.
Es interesante añadir que, durante ¡a realización de este ensayo, se intentó asimismo inyectar gel (coágulo) de fibrina convencional, con el fin de comparar la estabilidad de ¡os geies proteicos según la invención con la estabiüdad del gel de fibrina. El resultado fue que no resultó posible inyectar dicho gel de fibrina porque se producía una separación de fase (se separaba la fibrina del sobrenadante), impidiendo ¡a administración del gel de f¡br¡na como tal.
Ejemplo 14
Se prepara el plasma rico en plaquetas como se ha descrito en el Ejemplo 2. A continuación se le añade un colágeno tipo I. Seguidamente, se callenta la mezcla a una temperatura de 75°C durante 10 minutos y se enfría posteriormente hasta una temperatura de 20°C durante 3 minutos. El resultado de esta preparación es un gel de proteínas que muestra mayor consistencia. Este tipo de gel se puede emplear como "filler" (relleno) para el tratamiento de arrugas ya que muestra mayor estabilidad y una tasa de degradación más lenta que sin el colágeno. Asi, esta modificación contribuye a ralentizar en mayor medida aún ¡a degradación de ¡a formulación. Clínicamente, esta mejora en ¡a estabilidad aumenta el periodo entre una primera y una segunda administración del gel. Esto supone una solución a la desventaja del tratamiento de arrugas con el ácido hialurónico, que requiere repetir su administración cada 3-4 meses, es decir, en un corto periodo de tiempo. Ejemplo 15 Se prepara el plasma rico en plaquetas como se ha descrito en el
Ejemplo 2. A continuación se le añade un fosfato cálcico, por ejemplo granulado. Seguidamente, se calienta la mezcla a una temperatura de 80°C durante 10 minutos y se enfría hasta una temperatura de 20°C durante 3 minutos. El material híbrido resultado de esta preparación muestra mejores propiedades mecánicas que el gel sin modificar con fosfato cálcico. Así, la modificación de gel con fosfato cálcico aumenta la resistencia del gel a fuerzas de compresión y de tensión. Este tipo de material se puede emplear para la regeneración de defectos óseos que requieran una mayor estabilidad mecánica del material de relleno a causa de la falta de una o más paredes en el defecto.
Ejemplo 18
Se prepara el gel de proteínas según la invención, según el método de preparación descrito en cualquiera de ios ejemplos anteriores. Entonces, el gel se combina con ácido hiaiurónico para producir un material híbrido. Este material muestra mejores propiedades visco- elásticas, lo que aumenta su estabilidad en la zona de administración evitando así su migración. Este material híbrido es útil para su aplicación en superficies como puede ser la pared vestibular del proceso alveolar estrecho para provocar un crecimiento óseo horizontal y así aumentar el grosor del proceso alveolar para permitir la inserción de implantes dentales con suficiente cobertura ósea. Ejemplo 17
Después de preparar el gel y desecarlo como se ha descrito en el Ejemplo 8 (cualquiera de ios ejemplos de gel de proteínas descrito en el mismo es válido), el material seco se incuba, durante 24 horas y en oscuridad, en un líquido que contiene un antibiótico de doxiciclina hyclata en una concentración de 15 mg/ml. El resultado es el hinchamiento del gel incluyendo en su estructura el antibiótico para su posterior liberación en la zona de aplicación. Así, este gei sirve ahora para la liberación controlada del antibiótico para el tratamiento de una infección en zona dónde hay menor suministro sanguíneo como por ejemplo el hueso y evita la administración sistémica del antibiótico. Este procedimiento puede repetirse con otros antibióticos y otros fármacos para garantizar la liberación local de ios mismos.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, que se caracteriza por que comprende o se deriva de una composición sanguínea inicia!, de origen humano o animal, rica en plaquetas y/o factores de crecimiento y proteínas provenientes de la propia composición sanguínea inicia!, donde dichas proteínas se encuentran en estado gelificado.
2. Formulación, según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que las proteínas son albúmina, glícoproteínas, globulinas y/o fibrinógeno.
3. Formulación, según ¡a reivindicación 1 , que se caracteriza por que las proteínas se encuentran en estado gelificado por un tratamiento de calentamiento y enfriamiento.
4. Formulación, según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un plasma sanguíneo rico en plaquetas.
5. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un sobrenadante obtenido a partir de un plasma sanguíneo rico en plaquetas.
6. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento liberados.
7. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un sobrenadante obtenido a partir de un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento liberados.
8. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que la composición inicial es un gel de fibrina.
9. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que comprende uno o más agentes bioactivos seleccionados entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, sustancias orgánicas no proteicas y sustancias inorgánicas.
10. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que comprende uno o más polímeros biodegradables seleccionados entre: ácido hialurónico, sales de hialuronato, chondroitín 4 sulfato, chondroitín 6 sulfato, dextrán, gel de sílice, alginato, hidroxipropilmetilcelulosa, derivados de chitín, preferiblemente chitosano, goma xanthan, agarosa; polietileno glicólicos (PEG), polihidroxietilenometacrilato (HE A), proteínas sintéticas o naturales, colágenos.
1 1 . Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que comprende uno o más polímeros orgánicos seleccionados del grupo de policarpolactona, poliglicólico, poliláctico, y sus co-polímeros.
12. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que comprende uno o más de entre los siguientes agentes: antibióticos, antimicrobianos, anticancerígenos, analgésicos, factores de crecimiento, hormonas.
13. Formulación según la reivindicación 1 , que se caracteriza por que comprende uno o más componentes inorgánicos seleccionados del grupo de sales de calcio, sales de magnesio, y/o sales de estroncio.
14. Método de preparación de una formulación con propiedades biológicas o médicas deseables, caracterizado por que comprende los pasos de: a) disponer de una composición sanguínea inicial, de origen humano o animal, rica en plaquetas y/o factores de crecimiento; b) calentar la composición sanguínea inicial a una temperatura entre 80 y 100eC durante al menos 1 minuto;
c) enfriar la composición sanguínea inicial durante al menos 1 minuto.
15. Método según la reivindicación 14, que se caracteriza por que ¡a composición sanguínea inicial se calienta a una temperatura de entre 70 y 85QC.
16. étodo según la reivindicación 14, que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un plasma sanguíneo rico en plaquetas.
17. étodo según la reivindicación 14, que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en plaquetas.
18. Método según la reivindicación 14, que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento liberados.
19. Método según la reivindicación 14, que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial es un sobrenadante de un plasma sanguíneo rico en factores de crecimiento liberados.
20. Método según la reivindicación 14, que se caracteriza por que la composición inicial también es un gel de fibrina.
21 . Método según la reivindicación 14, que se caracteriza por que la composición sanguínea inicial comprende plaquetas, y por que el método comprende el paso de, antes de calentar, activar las plaquetas y esperar hasta que se forme una fibrina provisional.
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