JP2016528225A

JP2016528225A - 血小板及び／又は成長因子が強化され、ゲル化タンパク質を含有する血液組成物の製剤、並びにその製造方法

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Publication number: JP2016528225A
Application number: JP2016530556A
Authority: JP
Inventors: アルデコア、エデュアルドアニトゥア
Original assignee: バイオテクノロジーインスティチュート、アイエムエーエスディー、エス．エル．
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2014-07-31
Publication date: 2016-09-15
Anticipated expiration: 2034-07-31
Also published as: CN105431155B; RU2697249C2; US9861684B2; CA2919314A1; WO2015015037A1; US20150037430A1; PE20160014A1; ES2527967R1; BR112015031733A2; KR20160036557A; TWI684454B; CL2015003579A1; CN105431155A; ES2527967A2; EP3028710A1; PT3028710T; PL3028710T3; JP6466443B2; RU2016102768A3; AR097176A1

Abstract

初期血液組成物を含む又は該初期血液組成物由来である製剤であり、該製剤は、血小板及び／又は成長因子が強化され、該初期血液細胞に由来するタンパク質が強化され、並びに該タンパク質はゲル状態である。本発明はまた、該初期細胞組成物を、ある温度及び時間で加熱し、次に冷却する工程を含む該製剤を製造する方法に関する。その他の有利な点は、本発明による製剤は、生物適合性及び生分解性であり、血小板又は成長因子の存在によって提供される望ましい生物学的又は医学的性質を示し、長期にわたって高次的安定性も示す。

Description

本発明は、血小板に及び／又は成長因子が強化された初期血液組成物から得られる、望ましい生物学的又は医学的性質を有する製剤に関する。本発明はまた、前記製剤を製造する方法に関する。

先行技術はヒト又は動物血液から組成物を製造する方法を記載しており、該方法において、該血液は有用な生物学的及び医学的性質を示す血小板強化血漿（ＰＲＰ）及び／又は成長因子強化血漿（ＰＲＧＦ）を得られるような方法で処理される。前記ＰＲＰ又はＰＲＧＦは、例えば、細胞培養液のようなｅｘｖｉｖｏ適用、及び、例えば、患者における骨再生工程の実施又は浸潤による関節痛に苦しむ患者の治療のようなｉｎｖｉｖｏにおいて成功のうちに用いられている。前記組成物が患者を治療するためのｉｎｖｉｖｏにおいて使用される場合では、ＰＲＰ及びＰＲＧＦ製剤を製造するための技術は、自己組成物、すなわち、患者自身の血液から得られた組成物の製造について開発された。このようなタイプの組成物及び製造方法の例はＵＳ６５６９２０４及びＥＳ２２２１７７０特許において記載されている。

近年、技術はまた、血小板及び／又は成長因子強化組成物をガレヌス組成物又は医薬製剤の形態で得られるように保証することを目標として発展してきた。ガレヌス組成物又は医薬製剤は、化学的又は生物的起源（ＰＲＰ又はＰＲＧＦ中のタンパク質の場合）であろうと、医薬又は主要活性化物質がその投与を促進するために適合させた適合供給体として理解される。医薬のガレヌス組成物又は医薬製剤は、用量及び組織への医薬の分子経路を調節するので、医薬の有効性及び安全性を決定するのに最も重要である。更に、医薬のガレヌス組成物又は医薬製剤は、該医薬の製造、その用量及びその投与が知られ、調節され、並びに比較的容易に、かつ繰り返して実施されうることを保証する決定因子である。すなわち、ガレヌス組成物又は医薬製剤は、扱い、保存、輸送、投与、及び総括すると、治療目的で使用される任意の医薬又は物質の性質を促進することを探求する。

最も広範に適用されるＰＲＰ又はＰＲＧＦ医薬製剤の一つは、フィブリンゲル又はフィブリンメッシュとして知られており、ある適用において非常に有用な半固体コンシステンシーを有する製剤である。フィブリンゲル又はメッシュの製造工程は、一般的にＰＲＰ又はＰＲＧＦが適用可能な方法（例えば、患者から抽出した血液を、血液が様々な分画に分離するまで遠心分離し、最上の分画（すなわち、血小板強化血漿（ＰＲＰ）又は成長因子強化血漿（ＰＲＧＦ）の分画）を抽出する）によって得られる第１のフェーズにより開始される。次に、例えば、塩化カルシウムの添加などによって、ＰＲＰ又はＰＲＧＦに含まれる血小板を活性化（活性化とは、血小板がその内部に含まれるある成長因子を放出することを引き起こす作用として理解される）する。該活性の結果として、及び十分な時間経過を可能にすることを条件として、血漿に含有されるフィブリノゲン由来のフィブリンの重合が最終的に起こり、これにより、フィブリン塊（これはまた、その半固体コンシステンシー、生物学的スポンジのタイプとの類似によって、フィブリンゲル又はメッシュとして知られる）中に存在する最終化合物を生成する。これは、クエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤によって改変された血液から得られるフィブリンゲルを得るために通常実施される工程である。該血液は、抗凝固剤と事前に混合されることにより、それなしで処理されうる。この場合、血液が遠心分離される時、血小板が赤血球細胞から分離され、フィブリンゲルは塩化カルシウム又は他の血小板活性化剤を添加する必要なく得られる。フィブリンゲル又はメッシュは、例えば、下記の適用において使用されうる：骨欠損を充填するための生物学的骨格の形成；成長因子の徐放のための創傷又は傷害への適用；幹細胞の培養のためのマトリックスとしての使用；封入欠損又は潰瘍のためのメンブレンとしての使用；及び細胞及び成長因子に加えて、その上で細胞が生育しうるマトリックス又は骨格を有することが特に重要である、ティシュエンジニアリングとして知られる組織の製造における使用。

フィブリンゲル又はメッシュはいくつかの顕著な制限を有する。フィブリンゲル又はメッシュの主要な制限は、不安定性及び退縮傾向という事実である。結果として、フィブリンゲル又はメッシュは、経時で安定な容積を維持すること又は経時で安定な組織サポートを提供することができない。いくつかの適用においてはこの退縮傾向は望ましいものであるが、他においては望ましいものではない。例えば、サイナスフロアエレベーションとして知られる歯科外科手術において、骨欠損を再生するために使用されるバイオマテリアルは骨伝達特性を有する必要があり、しかし骨基質が形成されるまでの長期わたり物理的空間を維持できなければならない；さもなくば、該空間は崩壊し、歯槽骨の垂直再生に有害な影響を及ぼす。その他の例は、乳房除去（乳房切除術）の場合であり、乳房空間に充填されるのに使用されるバイオマテリアルやゲルが適切な機械的耐性を有しており、かつ前記空間が崩壊しないことを保証するために長期にわたって空間と容積を提供する必要がある。更なる例は、充填剤又は化粧充填剤（例えば、ヒアルロン酸）の場合であり、（容積を提供し維持する）充填物質は、くまやしわにおける容積を増加させ、これらの欠点を修正し、より若い外見を提供するために審美の分野において広く使用されている；充填剤や充填薬剤として作用するように設計されたいかなる薬剤も、組織の容積を維持することができるように、機械的に安定で、かつ圧力に耐性がなければならない。更に、フィブリンゲル又はメッシュの退縮傾向は、さらなる外用薬、薬品、タンパク質などの放出のための薬剤としてのゲル又はメッシュの使用を妨げるか、中止させることさえするものである。

フィブリンゲル又はメッシュの更なる制限は、その通常の、半固体状態において、浸潤又はカニューレ処理されることができないことであり、これにより、皮膚上において、皮膚化粧品において、外傷学及び生物学又は医学などの他の分野において、充填剤として投与することができない。

本発明の目的は、血小板及び／又は成長因子が強化された初期血液組成物から得られ、退縮傾向がなく、従って長期にわたって安定な容積を維持することができる、望ましい生物学的又は医学的性質を有する製剤を提供することである。他の適用において、該製剤は、安定な組成物が要求されるようなある適用において、フィブリンゲル又はメッシュの代替手段を提供するために望ましい。

本発明は望ましい生物学的又は医学的性質を有する製剤に関連し、該製剤は、血小板及び／又は成長因子が強化された（ヒト又は動物由来；自己的な、同種の又は異種の）初期血液組成物を含む又は該初期血液組成物由来であり、並びに該初期血液組成物に由来するタンパク質を含む。該製剤は、前記タンパク質が熱的加熱及び冷却処理の結果によりゲル化状態にあるという独特な特徴を示す。特に、ゲル化タンパク質は、好ましくはアルブミン、糖タンパク質、グロブリン及び／又はフィブリノゲンである。本願発明の製剤は、ゲル化状態の該タンパク質によって提供されるゲル様コンシステンシーを示すために、（フィブリンゲルを称呼するのに使用されたのと類似の用語法を用いて）「タンパク質ゲル」として記載されうる。該製剤は変形可能である。該組成物は、他の充填剤ゲル、他の血小板及び／又は成長因子強化血液組成物、及び当該分野で周知の他の類似組成物と比較して、新しい形態学的及び生物機械的形状を示す。

前述の製剤を製造するための方法も提案され、該方法は：基礎製剤は変更することができ、血小板及び／又は成長因子が強化された初期血液組成物を得る工程と、６０℃〜１００℃の温度で少なくとも１分間、該初期血液組成物を加熱する工程と；少なくとも１分間該初期血液組成物を冷却する工程を含む。本発明に係る方法は、加熱連続とみなされるものであり、血小板及び／又は成長因子が強化された血液組成物に容積と堅さを提供し、該初期血液組成物に含まれるあるタンパク質のゲル化状態のためにゲルのコンシステンシーを有するタンパク質ゲル又は製剤を生成する。

本願発明に係る製剤は、生物適合性、生分解性及び血小板及び成長因子の存在により提供される望ましい生物学的又は医学的性質を示す。加えて、これは、該初期血液組成物に含まれるあるタンパク質のゲル化状態に起因する密度の高い又は粘度の高いコンシステンシーも有し、前記密度の高い又は粘度の高いコンシステンシーは長期にわたり安定である。従って、本願発明に係る製剤は、該製剤が退縮せず、従って物理的空間が充填されたままであることを可能にするため、フィブリンゲル又はメッシュの有利な代替物となる。加えて、該製剤は、（充填剤又は充填薬剤として一般に使用されている）ヒアルロン酸と類似かより良い、圧力に対する良好な耐性を提供し、組織が発揮しうる耐性に満足に対抗する。結果として、該製剤は充填剤又は充填薬剤として使用するのに非常に適している。更に、フィブリンメッシュ及び本発明の製剤が両方とも本来的に半固体である場合であっても、後者のみが変形可能であるという事実のために、浸潤又は注入することができる。該製剤の追加の有利な点は、乾燥させ、のちに再水和させることができることである。

本発明の詳細は添付された非限定図に記載されている。
図１は、本発明による代表的な製剤の２つの電子顕微鏡イメージを示す。図２は、本発明によるその他の代表的な製剤の２つの電子顕微鏡イメージを示す。図３は、異なる温度及び時間で処理されたフィブリン塊から製造された、本発明による様々な製剤の膨張因子を示す。図４は、異なる温度及び時間で処理した上清から製造された、本発明による様々な製剤の膨張因子を示す。図５は、ＭＧ６３骨芽細胞様細胞株によって試験された、本発明による様々な製剤の細胞適合性結果を示す。図６は、ＭＧ６３骨芽細胞様細胞株によって試験された、本発明による様々な製剤の他の細胞適合性結果を示す。図７及び８は、本発明による１２の製剤における血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）及びベータ形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）中の内容物をそれぞれ示す。図７及び８は、本発明による１２の製剤における血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）及びベータ形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）中の内容物をそれぞれ示す。図９は、異なる期間でインキュベートされた４つの本発明に係る製剤におけるＰＤＧＦ−ＡＢ成長因子の放出動態を示す。図１０は、２日間インキュベートされた、本発明に係る４つの製剤におけるＴＧＦ−β成長因子の放出動態を示す。図１１は、本発明に係る４つの製剤の試料を注入された実験ラットの背中の写真を示す。図１２は、前の図の試験に関連するグラフであり、注入から２週間後に測定された、皮内レベルでの製剤注入後の半楕円の容積を示す。

フィブリンゲル及びメッシュの安定性の欠如に関連する、先行技術における現存の問題を解決するために、望ましい生物学的又は医学的性質を有し、長期にわたって強化された安定性を有する代替的製剤が提案された。製剤は、初期血液組成物を含むか、初期血液組成物由来である。血液製剤は、血小板及び／又は成長因子が強化され、様々なタンパク質も含む。従って、該製剤もまた、血小板及び／又は成長因子が強化され、様々なタンパク質を含む。前記タンパク質中、ゲル化状態にある、あるタンパク質が存在し、すなわちこれらは変性しており、好ましくは熱的加熱及び冷却処理により、組織化されたタンパク質ネットワークを形成している。ゲル化状態のタンパク質は、好ましくはアルブミン、糖タンパク質、グロブリン及び／又はフィブリノゲンである。本願発明によるタンパク質ゲルは退縮しないことが証明されており、フィブリンネットワークのみによる他のゲルとは異なり、容易にカニューレ又は浸潤処理され、容積及び空間を維持することができる。

初期血液組成物は、例えば、高い血小板濃度の血漿である、血小板強化血漿であってよい。前記血漿は、一般的に、（血液を、赤血球細胞を含む分画、白血球細胞を含む分画及び血小板強化血漿（ＰＲＰ）を含む分画に分離するために）血液遠心分離技術手段によって得られ、その後、血小板強化血漿（ＰＲＰ）の全部又は一部の分画を分離する工程が続く。

初期血液組成物は、血小板強化血漿（ＰＲＰ）の上清であってもよい。該上清は、血小板強化血漿（ＰＲＰ）の凝固及びその後の退縮が起こるときの塊上に現れる実質的な液体である。

初期血液組成物は、放出された成長因子（ＰＲＧＦ）が強化された血漿、すなわち、血小板がその内部においてある成長因子を放出した結果、（例えば、塩化カルシウム、トロンビン、塩化カルシウム及びトロンビンの組み合わせ、グルコン酸ナトリウム、コラーゲン、又は血小板の活性化によって及びフィブリン形成の誘導によって作用する任意の他の薬剤によって）活性化された血小板強化血漿であってよい。

同様に、初期血液組成物は、放出された成長因子（ＰＲＧＦ）が強化された血漿の上清であってよく、すなわち、凝固の後、（例えば、塩化カルシウム、トロンビン、塩化カルシウム及びトロンビンの組み合わせ、グルコン酸ナトリウム、コラーゲン、又は血小板の活性化によって及びフィブリン形成の誘導によって作用する任意の他の薬剤によって）以前に活性化された血小板強化血漿の引き続く退縮によって得られた上清である。活性化は、血小板内部のある成長因子の放出を引き起こす。

初期血液組成物は白血球を含んでも含まなくてもよい。

初期血液組成物はまた、抗凝固剤によって改変されていない血液を処理して直接得られたフィブリンゲルであってもよい。

望ましい生物学的及び医学的性質を有する製剤を製造する方法も提案され、前記方法は、
ａ）好ましくは、白血球含むか含まない血小板強化血漿、白血球を含むか含まない成長因子強化血漿、白血球を含むか含まない血小板強化血漿の上清、白血球を含むか含まない成長因子強化血漿の上清、又は抗凝固剤によって改変されていない血液から得られたフィブリンゲルである、初期血液組成物を用意する工程と；
ｂ）血液組成物が血小板を有する場合、任意で、塩化カルシウム、トロンビン、グルコン酸カルシウム、コラーゲン、又はその他の活性化剤、又はこれらの組み合わせによって血小板を活性化し、暫定的なフィブリンが形成されるまで待つ工程と；
ｃ）少なくとも１分間６０℃〜１００℃の温度で初期血液組成物を加熱する工程と；
ｄ）少なくとも１分間初期血液組成物を冷却するかテンパリングする工程
を含む。

前述の方法は、初期血液組成物に対して熱的ショックを与え、ヒト血漿中のいくつかのタンパク質のタンパク質ゲル化を誘発する結果を招く；これらのタンパク質は、アルブミン、糖タンパク質、グロブミン及び／又はフィブリノゲンである。本発明の目的のために、「ゲル化」という名前は、分子が経験し、これらが重合するか一緒になって組織化したタンパク質ネットワークを形成する方法に付与される。要するに、熱的ショック方法の結果として、初期血液組成物、ゲル化又はタンパク質重合の共通点に依存して、新しい生物適合性及び生分解性製剤が創造された。

加えて、本発明による製剤は、ゲル化タンパク質を提供し、初期血液組成物中の成長因子レベルを主に維持する。言い換えれば、熱的ショックは前記初期血液組成物中の成長因子の大量破壊の原因とはならない。

好ましくは、初期血液組成物は、７０℃〜８５℃の温度で加熱される。

血小板及び成長因子が強化された初期血液組成物は、ヒト又は動物起源である。これはまた、自己的（最終製剤によって後のステージにおいて治療される患者に属する）、同種（最終製剤で治療されるか処理される患者、患者、細胞又はその他の生物学的実体と同じ種のメンバーに属する）又は異種（最終製剤によって治療されるか処理される患者、患者、細胞又はその他の生物学的実体と異なる種のメンバーに属する）であってよい。

本発明は、初期血液組成物が、請求項に記載された熱処理の前に添加される任意で１以上の追加の物質を検討する。前記追加の物質は：
−タンパク質、ペプチド、核酸、多糖、脂質、非タンパク質有機物質及び無機物質から選択される、１以上の生物活性剤；
−ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デキストラン、シリカゲル、アルギネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン誘導体−好ましくはキトサン−、キサンチンガム、アガロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、合成又は天然タンパク質及びコラーゲンから選択される、１以上の生分解性ポリマー；
−ポリカプロラクトン、ポリグリコリド、ポリラクチド及びこれらのコポリマーにより形成された群から選択される、１以上の有機ポリマー；
−１以上の下記薬剤：抗生物質、抗菌剤、抗カルシノーゲン、鎮痛剤、成長因子、ホルモン；
−カルシウム塩、マグネシウム塩及び／又はストロンチウム塩の群から選択される１以上の無機成分であってよい。

本発明はまた、熱処理が実施された後に、任意の前述の物質が製剤に添加されうることを検討する。

本発明による製剤は、請求項に記載された技術的側面に追加して、様々な実施態様を示すことができ、該製剤は、製剤が使用される特定の適用に適した、さらなる化合物、成分及び分子などを含むことができる。すなわち、本発明はタンパク質ゲルに基づいた新しい製剤のファミリーとみなされ、前記ファミリーは、ゲル化タンパク質が存在し、これらの追加の組成物とは異なってもよい異なる製剤によって形成される。

更に、製剤をより多用途にするための手段としての乾燥マトリックスを含む、ゲル化タンパク質を伴う製剤に対して、さらなる工程を実施してもよい。言い換えれば、本発明のゲル化タンパク質の製剤は、膜を形成するために、乾燥（乾燥加熱）又は凍結乾燥させてもよい。この膜は、生理食塩水、血小板強化血漿、血小板強化血漿の上清、成長因子強化血漿、成長因子強化血漿の上清、又は膜を水和することができる他の溶液を添加することなどの様々な手段によって、続いて再水和されてもよい。

例１
方法は、クエン酸塩抗凝固剤を含まない密閉された封印チューブに保存された、患者から抽出された９ｍｌの血液サンプルにより開始される。血液は、５８０ｇのスピードで８分間及び周囲温度で遠心分離される。遠心分離の結果として、チューブに含まれた血液は、様々な分画に分けられる。白血球を含む、一番上の分画、又は血小板強化血漿（ＰＲＰ）の分画は、５ｍｌ注射器に抜き取られる。初期のチューブはクエン酸塩の添加がされていなかったので、ＰＲＰは凝固し始める。注射器の内容物は、７０℃で１０分間加熱される。容器は次に４℃で２分間冷却される。この熱的加熱−冷却連続の結果として、注射器の中でゲルのコンシステンシーを持つ半固体物質が形成される。このようにして活性化製剤が得られ、該活性化製剤は（凝固により発生したフィブリン及び熱処理により生成されたタンパク質のゲル化の両者の結果として）ゲル様コンシステンシーを示し、クエン酸塩及びカルシウムを有さない。フィブリンの存在は、製剤により大きいコンシステンシーと耐性を提供する一方、ゲル化タンパク質は、一定の安定性と容積を提供する。その性質及び機械的耐性により、このタイプの物質は、例えば、顔組織の垂直的欠陥を修正することにおいて有益でありうる。

例２
方法は、０．１ｍｌの３．８％クエン酸塩抗凝固剤を含む堅く封印された抽出チューブに保存された、患者から抽出された９ｍｌの血液サンプルにより開始される。血液は、５８０ｇのスピードで８分間及び周囲温度で遠心分離される。遠心分離の結果として、チューブに含まれている血液は、様々な分画に分けられる。一番上の分画、又は血小板強化血漿（ＰＲＰ）の分画は、白血球を含まないで５ｍｌ注射器に抜き取られる。注射器は８０℃で３分間加熱される。注射器は次に２０℃で１０分間冷却される。この熱的加熱−冷却連続の結果として、第２の容器中で半固体物質が形成される。物質は、ゲル様コンシステンシーを有し、その血小板はまだ活性化される必要がある。事前に凝固していなかったので、物質はフィブリンを含んでいない。このタイプの物質は、しわの存在を除去するか減少させることによってより若々しい外見を達成するために美容手術の充填剤として使用されてもよい；物質は（２５Ｇより小さいか同等の針を使用して）注入可能な能力及びそのコンシステンシーのおかげで、皮膚をリフティングすることができる。このバイオ−ゲルは、長期間安定であり、またヒアルロン酸などの従来の物質と比較して非常に有利とする、細胞成長及び増殖を刺激する成長因子も放出する。現時点において充填物質として最も広く使用されているヒアルロン酸は、生物活性を欠き、従って、組織の形成を促進せず又は長期持続する改善を達成できない。このことは、一般的に３、４か月毎である定期的投与の必要性を意味する。

例３
方法は、９ｍｌの血液サンプルを患者から抽出すること、及び０．１ｍｌの３．８％クエン酸塩抗凝固剤を含む堅く封印された抽出チューブに保存することから開始される。血液は、５８０ｇのスピードで８分間及び周囲温度で遠心分離される。遠心分離の結果として、チューブに含まれている血液は、様々な分画に分けられる。一番上の分画、又は血小板強化血漿（ＰＲＰ）の分画は、白血球を含まないで、５ｍｌ注射器に抜き取られる。次に、１０％塩化カルシウムを、各血漿１ｍｌに対して５０μｌの比で添加し、血小板の活性化、すなわち、成長因子の放出、及び血漿の凝固を引き起こす。注射器は７５℃で５分間加熱される。次に、注射器は周囲温度で１０分間冷却される。この熱的加熱−冷却連続の結果として、注射器の内部に半固体物質が形成する。物質は、凝固のために発生したフィブリン及び熱処理によって生成されたタンパク質のゲル化の両者の結果として、ゲル様コンシステンシーを有する。物質は、クエン酸塩、カルシウム及び放出された成長因子を含む。このタイプの物質は、歯槽の再生を促進するために、（歯断片の抽出に続く残された歯槽などの）骨欠損を埋めるのに使用することができる。細胞成長のサポートとして作動する、成長因子の放出及びゲルの能力のため、ゲルは骨組織を伴う歯槽を満たすことを促進し、これにより、例えば、抜歯された歯の置換における歯槽の歯科インプラントなどの、更なる調整のための待機時間を短縮する。

例４
方法は、９ｍｌの血液サンプルを患者から抽出すること、及び０．１ｍｌの抗凝固剤として作動する３．８％（重量／容積）クエン酸塩溶液を含む堅く封印された抽出チューブに保存することから開始される。血液は、５８０ｇのスピードで８分間及び周囲温度で遠心分離される。遠心分離の結果として、チューブに含まれている血液は、様々な分画に分けられる。一番上の分画、又は血小板強化血漿（ＰＲＰ）の分画は、白血球を含まないで、９ｍｌ分留チューブに抜き取られる。塩化カルシウム溶液（１０％重量／容積濃度）は、各血漿１ｍｌに対して５０μｌの比で添加する。次に、チューブは、３７℃のオーブンに入れられる。塩化カルシウムは、血小板の活性化（成長因子放出）、血漿の凝固、フィブリンの形成を引き起こし、前記形成は、オーブン温度条件にチューブが置かれるという事実により加速される。塊退縮の結果として、次に２つの相が得られる：三次元フィブリン構造である固相、並びにタンパク質、血小板成長因子及び血漿成長因子を含む液上清相である。液相又は上清は、３ｍｌ注射器に分けられる。注射器は、次に８０℃で１０分間加熱される。注射器は次に、２２℃で５分間冷却される。この熱的加熱−冷却連続の結果として、注射器の中で半固体物質が形成される。この半固体物質は、本発明による製剤と比べてより少ない固体コンシステンシーを有し、フィブリンを含有する。このより少ない固体コンシステンシーのために、このタイプの物質は、例えば、歯牙周囲組織の再生を促進するために、歯牙周囲の骨内欠陥を充填するために有益でありうる。これはまた、物質の骨膜下又は滑膜上浸潤の実施による骨再生に有益でありうる。

例５
その他の例では、方法は、フィブリン塊（物質は、血小板強化血漿を得るために５８０ｇのスピード及び２０℃の温度で血液を遠心分離した後に、各１ｍｌ血漿に対して５０μｌの比で塩化カルシウムを添加し、フィブリンが重合するまで１０〜２０分間待つことによって製造された）で開始された。塊は、７０℃で１０分間加熱され、次に２０℃で１０分間冷却され、このようにしてタンパク質ゲルが得られた。図１は、前述のタンパク質ゲルの２つの電子顕微鏡イメージを示す。左のイメージは、変性されたアルブミンを表す丸い構造及びフィブリンのファイバーである直鎖構造の存在を示す。右のイメージはゲルの密集した（外）表面を示す。

例６
その他の例では、方法は、成長因子強化血漿（血液は、様々な分画を得るために、５８０ｇのスピード及び２０℃の温度で遠心分離した後に、血小板強化血漿（ＰＲＰ）の分画を分離し、成長因子を放出させ血漿の凝固を開始させるために、各１ｍｌ血漿に対して５０μｌの比で塩化カルシウムを添加して製造された）で開始された。塊の退縮は、上清の取得を可能にする。次に、前記上清は７０℃で１０分間加熱され、次に２０℃で１０分間冷却され、タンパク質ゲルが得られた。図２は、前述のタンパク質ゲルの２つの電子顕微鏡的イメージを示す。左のイメージは、ゲルの内部及び変性されたアルブミンを表す丸い構造の存在を示す。右のイメージはゲルの密集した（外）表面を示す。

例７
その他の例では、（例５で記載されたとおりに製造された）フィブリン塊を異なる温度及び時間にさらすことによって様々なタンパク質ゲルを製造した。製造条件は、下記のとおりである：塊を７０℃で１５分間（四角）加熱し、塊を７０℃で３０分間（丸）加熱し、塊を８０℃で１５分間（三角）加熱する；これらすべてを４℃で１０分間冷却する。これらのゲルは、蒸留水中においてインキュベートする前に、３７℃で２４時間乾燥された。ゲルは（膨張重量／初期重量として定義される）膨張の程度を計算するために、２４時間ごとに重量を計測された。図３は、異なる温度及び時間で製造されたタンパク質ゲルの膨張の程度を示す。ご覧のとおり、ゲルは、水の吸収及び構造中でのその保持によって、初期重量の２及び３倍に増加している。７０℃１５分間（四角）で製造されたゲルは、２４時間で膨張し、その膨張因子はより長いインキュベーション時間によって顕著に変化しないこともわかる。しかしながら、７０℃３０分間（丸）で製造されたゲルは、２４時間後に初期重量の約３倍に膨張しているが、インキュベーション時間が長くなると幾分膨張因子が落ちることが観察される。一方、８０℃１５分間（三角）で製造されたゲルは、先の２つより最高膨張に達するまでより長い時間がかかり、具体的には４８時間である。いずれにしても、ゲルの膨張性は、例えば、生物活性物質（タンパク質又は主要活性化物質）の局所放出のためのマトリックスとして使用されうることを意味する。この使用は、脱水ゲル上の前記生物活性物質を含む溶液を適用することによって通常実施され、これによって、ゲルの水和が起こり、よって生物活性物質の取り込みが起こる。

例８
その他の例では、（例６のとおりに製造された）上清を異なる温度及び時間にさらすことによって様々なタンパク質ゲルを製造した。製造条件は、下記のとおりである：上清を７０℃で１５分間（四角）加熱し、上清を７０℃で３０分間（丸）加熱し、上清を８０℃で１５分間（三角）加熱する；これらすべてを４℃で１０分間冷却する。これらのゲルは、蒸留水中においてインキュベートする前に、３７℃で２４時間乾燥された。ゲルは（膨張重量／初期重量として定義される）膨張の程度を計算するために、２４時間ごとに重量を計測された。初期重量は水中でのインキュベーション前の乾燥ゲルの重量である。図４は、異なる温度及び時間で製造されたタンパク質ゲルの膨張の程度を示す。ご覧のとおり、ゲルは、水の吸収及び構造中でのその保持によって、初期重量の約３倍に増加した。７０℃１５分間（四角）で製造されたゲルは、２４時間で膨張し、その膨張因子はより長いインキュベーション時間によって顕著に変化しないこともわかる。対照的に、７０℃３０分間（丸）で製造されたゲルは、４８時間後に初期重量の３倍に膨張しているが、インキュベーション時間が長くなると幾分膨張因子が落ちることが観察される。一方、８０℃１５分間（三角）で製造されたゲルは、２４時間インキュベーション後に、前記膨張因子がおおよそ３と等しくなる。いずれにしても、ゲルの膨張性は、例えば、生物活性物質（タンパク質又は主要活性化物質）の局所放出のためのマトリックスとして使用されうることを意味する。この使用は、脱水ゲル上の前記生物活性物質を含む溶液を適用することによって通常実施され、これによって、ゲルの水和が起こり、よってその内部への生物活性物質の取り込みが起こる。

例９
その他の例では、上清（この例の最後におけるグラフで「ＳＮ」と示される）、フィブリン塊（「フィブリン」）、非−活性化血小板強化血漿（「非−活性化」）及び凝固せずに１０％ＣａＣｌ２により活性化された血小板強化血漿（「活性化−凝固なし」）から、本発明に従って４つのタンパク質ゲル又は製剤が製造され、及び前述の初期物質を、７０℃１５分間での物質の加熱処理及び２１℃１０分間での物質の冷却からなる熱処理を実施した。これらの初期物質の製造方法は、例２、３及び６において説明されている。熱処理後に得られたこれらの４つの各製剤は、ウシ胎児血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において４８時間インキュベートされた。加えて、該方法は、ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭからなる、第５の物質又は対照物質を分けた。この５つの培地は、ＭＧ６３細胞を培養するために使用され、２（四角）、４（丸）及び７（三角）日毎に新しくされた。これらの各期間後、細胞増殖は、比色試薬ＷＳＴ−１及びプレートリーダーを使用して評価された。増殖のパーセントは、下記の関数を用いて計算された：増殖％＝（ＷＳＴ−１のゲル吸収／ＷＳＴ−１の対照物質吸収）×１００。図５は、ＭＧ６３骨芽細胞様細胞株によって試験されたタンパク質ゲルの細胞適合性結果を示す。ご覧のとおり、対照試料に関する細胞増殖の増加によって示されるように、ゲルは非毒性である。増殖の２日後（四角）、非活性化血小板強化血漿から製造されたゲルはより多くの細胞増殖という結果を得た。しかしながら、これらの相違は、より長い増殖時間を生じるものではない（丸、三角）。従って、この例は、本発明による製剤が細胞成長への刺激に対する適切な挙動及び生物適合性を示し、製剤を臨床使用の為に開発することができることを証明した。

例１０
先行する例に記載されているとおり、４つのタンパク質ゲル又は製剤は：上清（四角）、フィブリン塊（丸）、非活性化血小板強化血漿（中央頂点が上部を指している三角）及び凝固せずに１０％ＣａＣｌ２によって活性化された血小板強化血漿（中央頂点が下部を指している三角）から、本発明に従って製造された。すべての物質は、７０℃１５分間での物質の加熱及び２１℃１０分間での物質の冷却からなる熱処理を実施した。これらの初期物質の製造方法は、例２、３及び６において説明されている。得られた４つの製剤は、培地中で２、４、７及び９日間インキュベートされた。各期間の終わりに、培地は集められ、ゲルに新しい培地が添加された。集められた培地はＭＧ６３細胞を培養するための用途のために保存された。細胞は、この培地中において４８時間成長させることが可能である。次に細胞増殖は、比色試薬ＷＳＴ−１及びプレートリーダーを使用して評価された。増殖のパーセントは、下記の関数を用いて計算された：増殖％＝（ＷＳＴ−１のゲル吸収／ＷＳＴ−１の対照物質吸収）×１００、ここで血清を含まないＤＭＥＭは対照物質として使用された。図６は、培地中の及び各インキュベーション時間間隔における細胞増殖を示す。ご覧のとおり、インキュベーションの２日後により多くの細胞増殖が達成された。より長いインキュベーション時間では、培地はより少ない細胞増殖を促進し、このことは、成長因子の放出はインキュベーション２日後に大きくなり、成長因子のこの内容はより長いインキュベーション時間（４、７及び９日）で培地中でより少なくなったことを示唆しているようである。従って、これらの結果は、ゲル中の細胞増殖刺激物質の放出が、時間の経過に伴って減少し、インキュベーションの最初の数時間で生物活性物質の多くの量を放出し（「バースト」効果）、時間経過に伴って放出量は顕著に減少するという特徴を有する、他のタイプのゲルに類似する放出プロフィールに従うということを示す。

例１１
その他の例では、２つの初期物質により方法が開始した。第１の物質は、（例６のように）各１ｍｌ血漿に対して５０μｌの比の塩化カルシウムによる血小板強化血漿の活性化後に得られたフィブリンゲルであった。第２の物質は、（例６のように）フィブリン塊の退縮後に得られた上清であった。両物質は、７０℃１５分間での加熱、７０℃３０分間での加熱及び８０℃１５分間での加熱という３つの異なる加熱処理を受けさせた。すべての場合で、加熱には４℃又は２０℃の温度で１０分間での冷却が続いた。１２のタンパク質ゲルが得られた。次に１２のゲルは１４，８００ｒｐｍで２０分間遠心分離された。次に、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＢ）及びβ−形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）が測定された。これらの測定の結果は図７及び８に示され、１２のゲルは２つの６グループに示され、これらのグループは、「１」（７０℃、１５分間のフィブリンゲル）、「２」（７０℃、３０分間のフィブリンゲル）、「３」（８０℃、１５分間のフィブリンゲル）、「４」（７０℃、１５分間の上清ゲル）、「５」（７０℃、３０分間の上清ゲル）及び「６」（８０℃、１５分間の上清のゲル、並びに各グループにおいて、４℃で冷却されたゲルは黒棒で、２０℃で冷却されたゲルは白棒で示されている。図７は、観察されたＰＤＧＦ−ＡＢ成長因子の内容物を示している。この成長因子の内容物は一般的に、４℃で冷却されたゲル（黒棒）より２０℃で冷却されたゲル（白棒）において多かったが、但し、冷却温度に依存したＰＤＧＦ−ＡＢの内容物に差異がほとんど観察されなかった、７０℃３０分間で製造された上清ゲル（「５」）及び８０℃で製造された上清ゲル（「６」）は例外である。図８は、観察されたＴＧＦ−β成長因子の内容物を示している。フィブリン（グループ「１」、「２」、「３」）から製造されたゲルに関して、２０℃での冷却を実施した場合（白棒）、この３つのグループにおいてＴＧＦ−βの内容物は類似していると結論付けることができる。すなわち、ゲルを製造する異なる熱処理に関して、４℃で冷却を実施するところ（黒棒）、ＴＧＦ−β因子の内容物は、７０℃１５分間（グループ「１」）で製造したゲルにおいて多い。対照的に、上清から製造したゲル（グループ「４」、「５」、「６」）に関して、７０℃１５分間での上清から製造したタンパク質ゲル（グループ「１」）のみがＴＧＦ−βを放出したことが把握でき、上清から製造された他のゲルにおいては前記因子は検出されなかった。従って、７０℃を超える温度において、フィブリンゲルは、上清より、より高い成長因子内容物を維持し、よって加熱温度及び冷却温度はこの成長因子内容物に影響を与え、内容物はより低い加熱温度及び２１℃での冷却温度でより多くなると結論付けることができる。また、高い温度においては、ＴＧＦ−βよりＰＤＧＦ−ＡＢの方がより安定であり、フィブリンに基づくタンパク質ゲルは上清に基づくタンパク質ゲルより多量のＴＧＦ−βを含むと結論付けることができる。

例１２
その他の例では、下記の初期物質を７０℃１５分間での加熱及び２１℃１０分間での冷却からなる熱処理を適用することによって、本発明による４つのタンパク質ゲル又は製剤が製造された：上清（ＳＮ）、フィブリン塊（「フィブリン」）、非−活性化血小板強化血漿（「非−活性化」）及び凝固せずに１０％ＣａＣｌ２により活性化された血小板強化血漿（「活性化−凝固なし」）。これらの初期物質の製造は、例２、３及び６において説明されている。４つのタンパク質ゲルは、ＤＭＥＭ中で異なる期間（２、４及び７日間）インキュベートされた。各インキュベーション時間において、４つのタンパク質ゲルのこれらの成長因子の放出動態を決定する目的でＰＤＧＦ−ＡＢ及びＴＧＦ−β内容物を測定するために培地時間を抽出した。図９は、黒、白、及びストライプ棒によって示された２、４及び７日間のインキュベーション時間に対応する測定として、ＤＭＥＭ培地中のＰＤＧＦ−ＡＢの放出動態を示す。ＰＤＧＦ−ＡＢの放出は、上清から製造されたタンパク質ゲルの２及び４日間のインキュベーションにおいてより多いことがわかる。他のゲルは、この３つのインキュベーション時間の間に顕著な差異は示さない。次に、図１０は、インキュベーションの２日後のＤＭＥＭ培地中のＴＧＦ−βの放出動態を示す。この因子は上清及びフィブリンから製造されたタンパク質ゲルのみにおいて存在し、上清から製造されたタンパク質ゲルからのＴＧＦ−βの放出がより多いことがわかる。従って、上清に基づくタンパク質ゲルからより迅速に成長因子が放出されると結論付けることができる。

例１３
その他の例では、本発明によるタンパク質ゲル又は製剤の充填効果が実験ラットによって試験された。この目的のために４つの発明に係る製剤が製造された。４つの製剤の製造は下記の工程により開始された。まず、抗凝固剤を含まない９ｍｌチューブに患者からの血液を抽出した。次にチューブを８５０ｇで８分間遠心分離して赤血球細胞から血漿を分離した。血漿の全体カラムは、白血球を含まずに、赤血球細胞の上部に置かれ、次に新しい９ｍｌチューブに抽出された。この血漿は下記を製造するために使用された：血漿液自身（Ｂ）；血漿の活性化を起こして塊を形成させる目的のために、各１ｍｌ血漿に対して５０μｌの比で１０％塩化カルシウムを添加した、フィブリン塊（Ｃ）；前記と同じ特徴を有するフィブリン塊を製造し、３７℃で６０分間経過させフィブリンを退縮させて上清を得る目的のための、上清（Ａ）。血液はまた、抗凝固剤としての０．１ｍｌの３．８％クエン酸ナトリウムを含む９ｍｌ抽出チューブに患者から抽出された。該血液を８５０ｇで８分間遠心分離し、白血球血小板層のすぐ上部に２ｍｌの血漿が得られ、フィブリン塊（Ｄ）を得るために各１ｍｌ血漿に対して５０μｌの比の１０％塩化カルシウムによって活性化された。これらの４つの初期物質（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）は、ゲルを得るために７０℃で１０分間加熱し、２０℃で１０分間冷却した。各ゲル製剤０．６ｍｌ用量を各ラットに投与した。図１１に示される写真は、その機械的性質の改善を示唆する、タンパク質ゲルによる容積増加の維持の形成を示す。

加えて、（「ＰＲＧＦ−Ｅｎｄｏｒｅｔ」と称呼される）成長因子強化血漿は、０．１ｍｌの３．８％クエン酸ナトリウムを含む９ｍｌチューブに血液を抽出し、該血液を８５０ｇで８分間遠心分離し、血小板強化血漿の分画（白血球を含まない、赤血球細胞分画のすぐ上の２ｍｌ血漿カラム）を分離することによって製造された。そして、ラットに注射する直前に、各１ｍｌに対して５０μｌの塩化カルシウムを添加することによって（血小板の成長因子の放出を起こし）血漿を活性化させた。

図１２は、対照としてヒアルロン酸と上記のＰＲＧＦ−Ｅｎｄｏｒｅｔ成長因子強化血漿を使用した、ラットにおけるタンパク質ゲル注入２週間後の容積の変化を示す。タンパク質ゲルは、ヒアルロン酸としての半楕円の容積を維持するのに効果的である一方、ＰＲＧＦ−Ｅｎｄｏｒｅｔ成長因子強化血漿は、半楕円の容積を維持するのに有用でないと結論付けることができる。

試験において、本発明によるタンパク質ゲルの安定性とフィブリンゲルの安定性を比較する目的で、従来のフィブリンゲル（塊）を注入させる試みも行われたことを追記するべきである。結果は、（上清からフィブリンが分離し）相分離が起きたことにより、フィブリンゲルをそのように投与することができず、前記フィブリンゲルを注入することが不可能であった。

例１４
例２に記載されているとおり血小板強化血漿を製造する。次に、タイプ−Ｉコラーゲンが添加される。次に、混合物は７５℃で１０分間加熱され、続いて２０℃で３分間冷却される。この製造の結果は、より高いコンシステンシーのタンパク質ゲルである。このタイプのゲルは、より高い安定性を示し、コラーゲンなしの場合より、より遅い崩壊速度を示すために、しわを治療するための充填剤として使用しうる。従って、この改変は、製剤の崩壊を更に遅延させる。臨床的には、この安定性の改善は、ゲルの第１及び第２の適用の期間を延長させる。このことは、３〜４か月毎の繰り返し投与、言い換えれば、短期間である、ヒアルロン酸によるしわの治療の欠点の解決を示す。

例１５
例２に記載されているとおり血小板強化血漿を製造する。次に、例えば、顆粒形態のリン酸カルシウムを添加する。次に、混合物は８０℃で１０分間加熱され、続いて２０℃で３分間冷却される。この製造の結果により得られたハイブリッド物質は、リン酸カルシウムによって改変されていないゲルより、より良い機械的性質を示す。リン酸カルシウムによるゲルの改変は、圧縮及び引張力に対するゲルの耐性を増加する。このタイプの物質は、欠損中の１以上の壁の欠如により、より良い機械的安定性を有する充填物質を要する骨欠損の再生のために使用することができる。

例１６
本発明によるタンパク質ゲルが前述のいずれかの例に記載された製造方法を使用して製造される。次に、ゲルはハイブリッド物質を生成するためにヒアルロン酸と混合される。この物質は、適用領域においてその安定性を促進する、より良い粘弾性性質を示し、これにより、その移動を防ぐ。このハイブリッド物質は、水平骨成長を起こし、これにより歯槽突起の厚さを増加し、十分な骨被覆を伴った歯科インプラントの挿入を可能にする、狭歯槽突起の前庭壁などの表面に適用するのに有益である。

例１７
例８（プロテインゲルが記載されているあらゆる例は有効である）に記載されているとおりにゲルを製造及び乾燥した後、乾燥物質は、２４時間、暗所において、ドキシサイクリンヒクラート抗生物質を１５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む液体中でインキュベートする。結果は、適用領域において続いて起こる放出のための該抗生物質を含むゲル構造である、ゲルの膨張である。よって、より低い血液供給である、すなわち、骨領域の感染治療のための該抗生物質の調節された放出のためにこのゲルを使用することができ、かつ該抗生物質の全身投与を防ぐ。この手順は、その局所放出を保証するために、他の抗生物質、他の薬剤で繰り返すことができる。

Claims

望ましい生物学的又は医学的性質を有する製剤であって、ヒト又は動物起源の初期血液組成物を含む又は該初期血液組成物由来であることを特徴とし、血小板及び／又は成長因子が強化され、並びに該初期血液組成物に由来するタンパク質が強化され、前記タンパク質はゲル化状態である、製剤。
該タンパク質は、アルブミン、糖タンパク質、グロブリン及び／又はフィブリノゲンであることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
該タンパク質は、加熱及び冷却処理の結果によりゲル化状態にあることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
該初期血液組成物は血小板強化血漿であることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
該初期血液組成物は血小板強化血漿から得られた上清であることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
該初期血液組成物は放出された成長因子が強化された血漿であることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
該初期血液組成物は放出された成長因子が強化された血漿から得られた上清であることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
該初期血液組成物はフィブリンゲルであることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
タンパク質、ペプチド、核酸、多糖、脂質、非タンパク質有機物質及び無機物質から選択される１以上の生物活性剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デキストラン、シリカゲル、アルギネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、キチン誘導体−好ましくはキトサン−、キサンチンガム、アガロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、合成又は天然タンパク質、コラーゲンから選択される、１以上の生分解性ポリマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
ポリカプロラクトン、ポリグリコリド、ポリラクチド及びこれらのコポリマーにより形成された群から選択される、１以上の有機ポリマーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
下記の薬剤：抗生物質、抗菌剤、抗カルシノーゲン、鎮痛剤、成長因子及びホルモン、の１以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
カルシウム塩、マグネシウム塩、及び／又はストロンチウム塩の群から選択される１以上の無機成分を含むことを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
ａ）ヒト又は動物起源の、血小板及び／又は成長因子が強化された初期血液組成物を用意する工程；
ｂ）該初期血液組成物を、６０〜１００℃の温度で少なくとも１分間加熱する工程；
ｃ）該初期血液組成物を、少なくとも１分間冷却する工程：
を含むことを特徴とする、望ましい生物学的又は医学的性質を有する製剤を製造する方法。
該初期血液組成物は７０〜８５℃の温度で加熱されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
該初期血液組成物は血小板強化血漿である、請求項１４に記載の方法。
該初期血液組成物は血小板強化血漿の上清である、請求項１４に記載の方法。
該初期血液組成物は放出された成長因子が強化された血漿である、請求項１４に記載の方法。
該初期血液組成物は放出された成長因子が強化された血漿の上清である、請求項１４に記載の方法。
該初期組成物はまたフィブリンゲルであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
該初期血液組成物は血小板を含み、及び該方法は、加熱の前に、血小板を活性化し、暫定的フィブリンが形成されるまで待つ工程を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。