KR20160036557A - 겔 타입 단백질이 있는, 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 혈액 조성물의 제제, 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

혈소판 및/또는 성장 인자 및 실제 초기 혈액 조성물로부터 유래하는 겔 상태인 단백질이 풍부한 초기 혈액 조성물로부터 유도되거나 또는 이를 포함 하는 제제. 또한 특정 온도 및 특정 기간 동안 초기 혈액 조성물을 가열 및 후속하여 냉각하는 단계를 포함하는, 상기 제제의 제조 방법이 청구된다. 기타 장점들 중에서, 본 발명에 따른 제제는 생체적합성 및 생분해성이며, 혈소판 또는 성장 인자의 존재에 의해 제공되는 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 나타내고, 또한 시간 경과에 따른 높은 수준의 치수 안정성을 나타낸다.

Description

겔 타입 단백질이 있는, 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 혈액 조성물의 제제, 및 그의 제조 방법{FORMULATION OF A BLOOD COMPOSITION RICH IN PLATELETS AND/OR GROWTH FACTORS, WITH GEL-TYPE PROTEINS, AND METHOD FOR THE PREPARATION THEREOF}

본 발명은 초기 혈소판-풍부 및/또는 성장 인자 풍부 혈액 조성물로부터 수득된, 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 갖는 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 제제의 제조 방법에 관한 것이다.

선행 기술은 유용한 생물학적 및 의학적 성질을 나타내는 혈소판-풍부 혈장(PRP) 및/또는 성장 인자 풍부 혈장(PRGF)이 수득 되도록 하는 방식으로 혈액이 처리된, 인간 또는 동물 혈액으로부터의 조성물의 제조를 기술한다. 상기 PRP 또는 PRGF는 생체 외 적용, 예를 들어 세포 배양 배지로서, 및 생체 내, 예를 들어 환자의 뼈 재생 과정을 수행하거나 또는 침윤에 의한 관절 통증을 앓는 환자의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다. 상기 조성물이 환자를 치료하기 위해 생체 내 적용에 사용되는 경우, PRP 및 PRGF 제제를 제조하기 위한 기술은 자가 조성물, 즉 환자 그/그녀 자신의 혈액으로부터 수집된 조성물의 제조를 위해 개발되어 왔다. 이들 타입의 조성물 및 제조 방법의 예는 특허 US6569204 및 ES2221770에서 확인될 수 있다.

지난 몇 년간 기술은 또한 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 조성물이 생약 조성물 또는 약제학적 제제의 형태로 수득 될 수 있음을 확보할 목적으로 발전되어 왔다. 생약 조성물 또는 약제학적 제제는 화학 또는 생물학적 기원(PRP 또는 PRGF의 단백질의 경우에서와 같이)의 약제 또는 주 활성 물질이 그들의 투여를 용이하게 하기 위해 채택된 개별 공급으로서 이해된다. 약제의 생약 조성물 또는 약제학적 제제는 복용량 및 조직으로의 약제 분자의 통과를 제어하므로, 치료제의 효능 및 안전성을 결정하는 핵심적으로 중요한 것이다. 더욱이, 약제의 생약 조성물 또는 약제학적 제제는 약제의 제조, 그의 복용량 및 그의 투여가 공지, 제어 및 비교적 용이하게 및 반복 가능한 방식으로 실행될 수 있도록 보장하는 결정 인자이다. 간단히 말해서, 생약 조성물 또는 약제학적 제제는 치료 목적을 위해 사용된 치료제 또는 물질의 취급, 보존, 수송, 투여 및, 전체적으로, 성질을 용이게 하기 위하여 추구하다.

가장 광범위하게 적용된 PRP 또는 PRGF의 의학적 제제 중의 하나는 특정 적용에서 매우 유용한 반고체 조도(稠度)를 갖는 제제인 피브린 겔 또는 피브린 메시로서 공지되어 있다. 피브린 겔 또는 메시의 제조 절차는 일반적으로 PRP 또는 PRGF가 적용 가능한 방법에 의해, 예를 들어 혈액이 다양한 분획으로 분리될 때까지 환자로부터 추출된 혈액을 원심분리하고, 상부 분획, 즉 혈소판-풍부 혈장(PRP) 또는 성장 인자 풍부 혈장(PRGF)의 분획을 추출함에 의해 수득 되는 첫 번째 상으로 시작된다. 그 후, PRP 또는 PRGF에서 함유된 혈소판은, 예를 들어 염화칼슘의 첨가에 의해 활성화된다(활성화는 혈소판이 그들의 내부에 함유된 특정 성장 인자의 방출을 야기하는 작용으로서 이해된다). 활성화 및 충분한 양의 시간이 지나갈 수 있도록 제공한 결과로서, 혈장 내에 함유된 피브리노겐으로부터 피브린의 중합이 마침내 발생하여, 피브린 응괴(생물학적 스펀지의 타입을 닮은, 그의 반고체 조도로 인하여 피브린 겔 또는 메시로서도 또한 공지됨)로 구성된 최종 화합물을 생성한다. 이것은 일반적으로 예컨대 시트르산 나트륨과 함께, 항응고제로 개질된 혈액으로부터 피브린 겔을 수득하기 위해 수행되는 공정이다. 혈액은 또한 항응고제와 미리 혼합함이 없이 처리될 수 있다. 이 경우, 혈액이 원심분리될 때, 혈장은 적혈구로부터 분리되며 피브린 겔은 염화칼슘 또는 기타 혈소판-활성화제를 첨가할 필요 없이 수득 된다. 피브린 겔 또는 메시는 예를 들어 하기 적용에 사용될 수 있다: 뼈 결손을 채우기 위한 생물학적 스캐폴드의 형성; 성장 인자의 점진적 방출을 위한 상처 또는 손상에 적용; 줄기세포의 배양을 위한 매트릭스로서 사용; 결손 또는 궤양을 밀봉하기 위한 멤브레인으로서 사용; 세포 및 성장 인자 이외에 세포가 성장할 수 있는 매트릭스 또는 스캐폴드를 갖는 것이 특히 중요한 조직 공학으로서 공지된 조직의 제조에서 그의 용도.

피브린 겔 또는 메시는 일부 유의한 제약이 있다. 피브린 겔 또는 메시의 주요 제약은 불안정하고 수축하는 경향이 있다는 사실이다. 결과적으로, 피브린 겔 또는 메시는 시간 경과에 따른 안정한 부피를 유지할 수 없거나 또는 시간 경과에 따른 안정한 조직 지지체를 제공할 수 없다. 수축하는 이러한 경향이 일부 적용에서는 바람직할 수 있지만, 다른 것에 대하여 바람직하지 않을 수 있다. 예를 들어, 동 거상술(sinus floor elevation)로 공지된 치과 수술 기술에서, 뼈 결손을 재생하기 위하여 사용되는 생체물질은 골전도성을 가지고 있어야 하지만 그것은 또한 골 매트릭스가 형성될 때까지 장시간 동안 물리적 공간을 유지할 수 있어야 하며; 그렇지 않으면, 공간은 붕괴되어 치조골의 수직 재생에 악영향을 줄 것이다. 또 다른 예는 유방 제거(유방 절제술)의 경우, 유방 공간을 충전하기 위하여 사용된 생체물질 또는 겔은 적당한 기계적 저항성을 제공하여야 하며, 상기 공간이 붕괴되지 않도록 장기간에 걸쳐 공간 및 부피를 제공하여야 한다. 추가의 예는 코너 및 주름의 부피를 증가시키고 상기 결손을 시정하여 더 젊은 모습을 제공하는 미학 분야에서 광범위하게 사용되는 충전 물질(부피를 제공 및 유지)인 필러 또는 성형용 충전제(예를 들어, 히알루론산); 조직의 부피를 유지할 수 있도록 기계적으로 안정하며 압축 저항성이 있어야 하는 필러 또는 충전제로서 작동하도록 설계된 제제의 경우이다. 더욱이, 수축하려는 피브린 겔 또는 메시의 경향은 추가의 외부 제제, 약제, 단백질 등을 방출하기 위한 제제로서 겔 또는 메시의 사용을 방해 및 심지어 방지한다.

피브린 겔 또는 메시의 추가의 제약은 그의 정상, 반고체 상태에서 침윤 또는 캐뉼러 삽입될 수 없다는 것이며, 이것은 피부 상에, 더모-코스메틱, 외상학에서 및 생물학 또는 의학과 같은 다른 분야에서 필러로서 투여되는 것을 방지한다.

본 발명의 목적은 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부하고 수축하는 경향이 없으며, 따라서 시간 경과에 따라 안정한 부피를 허용하는 초기 혈액 조성물로부터 수득되는 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 갖는 제제를 제공하는 것이다. 기타 적용 중에서, 안정한 조성물이 필요한 특정 적용에서 제제가 대안적으로 피브린 겔 또는 메시를 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명은 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부하며, 초기 혈액 조성물로부터 유래하는 단백질을 포함하는, 초기 혈액 조성물(인간 또는 동물 유래; 자가, 동종 또는 이종)로부터 유도되거나 또는 이를 포함하는, 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 갖는 제제에 관한 것이다. 제제는 열 가열 및 냉각 처리의 결과로서 상기 단백질이 겔 상태로 있는 독특한 특징을 나타낸다. 구체적으로, 겔화된 단백질은 바람직하게는 알부민, 당단백질, 글로불린 및/또는 피브리노겐이다. 본 발명의 제제는 겔 상태의 단백질에 의해 제공된 겔 유사 조도를 나타내므로 "단백질 겔"(피브린 겔을 언급하기 위해 사용되는 것과 유사한 용어 사용)로서 기술될 수 있다. 제제는 변형될 수 있다. 조성물은 기타 충전 겔, 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 기타 혈액 조성물, 및 선행 기술에 공지된 기타 유사한 조성물과 비교하여 새로운 형태학적 및 생체역학적 구성을 나타낸다.

방법은 또한 상술한 제제의 제조를 위해 제안되며, 그 방법은 하기 단계를 포함한다: 기본 제제가 변할 수 있는 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 초기 혈액 조성물을 수득하는 단계; 1분 이상 동안 60℃ 내지 100℃의 온도에서 초기 혈액 조성물을 가열하는 단계; 1분 이상 동안 초기 혈액 조성물을 냉각하는 단계. 열 시퀀스로서 간주될 수 있는 본 발명의 방법은 초기 혈액 조성물에 포함된 특정 단백질의 겔화된 상태로 인하여 단백질 겔 또는 겔의 조도를 갖는 제제를 생성하는 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 혈액 조성물에 부피 및 강성을 제공한다.

본 발명의 제제는 생체적합성, 생분해성이며 혈소판 또는 성장 인자의 존재에 의해 제공된 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 나타낸다. 또한, 그것은 초기 혈액 조성물 내에 함유된 특정 단백질의 겔화된 상태로 인하여 농후하거나 또는 점성이 있는 조도를 가지며, 상기 농후하거나 또는 점성이 있는 조도는 시간이 지남에 따라 안정하다. 본 발명의 제제는 그러므로 제제가 수축하지 않으며 따라서 충전될 물리적 공간이 남아있도록 허용한다는 사실로 인하여 유리한 대안적인 피브린 겔 또는 메시이다. 또한, 제제는 히알루론산(일반적으로 필러 또는 충전제로 사용됨)과 유사하거나 또는 더 우수한 양호한 압축 저항성을 제공하며, 조직이 가할 수 있는 저항성을 만족스럽게 견딘다. 결과적으로, 제제는 필러 또는 충전제로서 사용하기에 매우 적당하다. 더욱이, 심지어 피브린 메시 및 본 발명의 제제가 사실상 반고체 제제일 때, 그것이 변형될 수 있다는 사실로 인하여, 후자만이 침윤 또는 주입될 수 있다. 제제의 추가의 장점은 건조될 수 있으며 후에 재수화될 수 있다는 것이다.

본 발명의 상세한 설명은 첨부한 비 제한적인 도면에서 알 수 있다:
- 도　1은 본 발명에 따른 예시적인 제제의 두 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
- 도　2는 본 발명에 따른 또 다른 예시적인 제제의 두 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
- 도　3은 상이한 온도 및 시간에서 처리된 피브린 응괴로부터 제조된, 본 발명에 대한 다양한 제제의 팽윤 인자를 나타낸다.
- 도　4는 상이한 온도 및 시간에서 상청액을 처리하여 제조된, 본 발명에 따른 다양한 제제의 팽윤 인자를 나타낸다.
- 도 5는 MG 63 조골세포 유사 세포 주로 시험 된, 본 발명에 따른 다양한 제제의 세포학적 적합성 결과를 나타낸다.
- 도 6은 MG 63 조골세포 유사 세포 주로 시험 된, 본 발명에 따른 다양한 제제의 세포학적 적합성 결과를 나타낸다.
- 도 7 및 도 8은 본 발명에 따른 12 제제 내의 혈소판-유도 성장 인자(PDGF-AB) 및 베타 형질전환 성장 인자(TGF-β)의 함량을 각기 나타낸다.
- 도 9는 상이한 시간의 기간 동안 배양된 본 발명의 4 제제에서 PDGF-AB 성장 인자의 방출 키네틱을 나타낸다.
- 도 10은 2일 동안 배양할 때, 본 발명에 따른 4 제제에서 TGF-β 성장 인자의 방출 키네틱을 나타낸다.
- 도 11은 본 발명에 따른 4 제제의 샘플이 주입된 실험실 쥐의 후면의 사진을 나타낸다.
- 도 12는 주입 2주 후에 측정된, 피내 수준에서 제제 주입 후 반타원형(hemiellipse)의 부피를 나타내는, 이전 도면의 시험에 관한 그래프를 나타낸다.

피브린 겔 및 메시의 안정성의 결여와 관련된 선행 기술의 기존 문제점을 극복하기 위하여, 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 가지며 시간이 지남에 따라 향상된 안정성을 갖는 대안적인 제제가 제안된다. 제제는 초기 혈액 조성물로부터 유도되거나 이를 포함한다. 혈액 조성물은 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부하며 또한 다양한 단백질을 포함한다. 그러므로, 제제는 또한 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부하며 다양한 단백질을 포함한다. 상기 단백질 중에서, 겔화된 상태의 특정 단백질이 있으며, 바람직하게는 열 가열 및 냉각 처리로 인하여 이들이 변성되고 조직적인 단백질 네트워크를 형성한다는 것을 의미한다. 겔 상태의 단백질은 바람직하게는 알부민, 당단백질, 글로불린 및/또는 피브리노겐이다. 본 발명에 따른 단백질 겔은 수축하지 않으며, 용이하게 캐뉼러 삽입되거나 침윤될 수 있고, 피브린 네트워크 만을 근거로 다른 겔 과는 달리, 부피 및 공간을 유지하는 것으로 입증되었다.

초기 혈액 조성물은 예를 들어, 혈소판-풍부 혈장, 즉 고농도의 혈소판을 갖는 혈장일 수 있다. 상기 혈장은 혈액 원심 분리 기술(혈액을 적혈구의 분획, 백혈구의 분획 및 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 분획으로 분리하기 위하여)에 이어 혈소판-풍부 혈장(PRP) 분획의 일부 또는 전부를 분리하는 단계에 의해 일반적으로 수득된다.

초기 혈액 조성물은 또한 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 상청액일 수 있다. 상청액은 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 응집 및 그의 후속 수축이 야기될 때 응괴 상에 나타나는 실질적인 액체이다.

초기 혈액 조성물은 방출된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장, 즉 혈소판이 그들 내부에서 특정 성장인자를 방출하는 결과로 활성화(예를 들어, 염화칼슘, 트롬빈, 염화칼슘 및 트롬빈의 조합, 글루콘산 나트륨, 콜라겐, 또는 혈소판을 활성화하고 피브린의 형성을 유도함에 의해 작용하는 기타 제제의 첨가에 의해)되는 혈소판 풍부 혈장일 수 있다.

유사하게, 초기 혈액 조성물은 방출된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액, 즉, 응집에 이어 후속하는 미리 활성화(예를 들어, 염화칼슘, 트롬빈, 염화칼슘 및 트롬빈의 조합, 글루콘산 나트륨, 콜라겐, 또는 혈소판을 활성화하고 피브린의 형성을 유도함에 의해 작용하는 기타 제제의 첨가에 의해)된 혈소판-풍부 혈장의 수축에 의해 수득된 상청액일 수 있다. 활성화는 혈소판이 그들의 내부에서 특정 성장인자를 방출하도록 야기한다.

초기 혈액 조성물은 백혈구를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다.

초기 조성물은 또한 항응고제로 개질되지 않은 처리 혈액으로부터 직접적으로 수득 되는 피브린 겔일수 있다.

바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 갖는 제제의 제조 방법이 또한 제안되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 바람직하게는 백혈구가 있거나 없는 혈소판-풍부 혈장, 백혈구가 있거나 없는 성장 인자 풍부 혈장, 백혈구가 있거나 없는 혈소판-풍부 혈장의 상청액, 백혈구가 있거나 없는 성장 인자 풍부 혈장의 상청액, 또는 항응고제로 개질되지 않은 혈액으로부터 수득된 피브린 겔인, 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 초기 혈액 조성물을 제공하는 단계;

b) 혈액 조성물이 혈소판을 갖는 경우, 활성화제 예컨대 염화칼슘, 트롬빈, 글루콘산 칼슘, 콜라겐, 또는 기타 활성화제, 또는 이의 조합으로 혈소판을 임의로 활성화하는 단계, 및 일시적인 피브린이 형성될 때까지 대기하는 단계;

c) 1분 이상 동안 60℃ 내지 100℃의 온도에서 초기 혈액 조성물을 가열하는 단계;

d) 1분 이상 동안 초기 혈액 조성물을 냉각 또는 템퍼링하는 단계.

상술한 방법은 인간 혈장 내의 몇몇 단백질의 단백질 겔화를 유발하는 결과로 초기 혈액 조성물 상에 열 충격을 전개한다; 이들 중 단백질은 알부민, 당단백질, 글로불린 및/또는 피브리노겐이다. 본 발명의 목적을 위하여, "겔화(gelation)"는 분자가 진행되는 과정에서 주어지는 이름이며, 이들은 중합 또는 함께 결합되어 조직적인 단백질 네트워크를 형성한다. 요약하자면, 열 충격 과정의 결과로서, 새로운 생체적합성 및 생분해성 제제가 초기 혈액 조성물에 따라 생성되며, 이의 공통점은 겔화 또는 단백질 중합이다.

또한, 겔화된 단백질이 제공된 본 발명에 따른 제제는 초기 혈액 조성물 내의 성장 인자의 수준을 상당히 유지나는 것으로 나타났다. 다시 말해서, 열 충격은 상기 초기 혈액 조성물 내의 성장 인자의 대량 파괴를 유발하지 않는다.

바람직하게는, 초기 혈액 조성물은 70℃ 내지 85℃의 온도에서 가열된다.

혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 초기 혈액 조성물은 인간 또는 동물 유래이다. 그것은 또한 자가(최종 제제로 이후 단계에서 치료될 환자에 속함), 동종(최종 제제로 치료 또는 처리될 환자, 환자들, 세포 또는 또 다른 생물학적 존재와 동일한 종의 군에 속함) 또는 이종(최종 제제로 치료 또는 처리될 환자, 환자들, 세포 또는 또 다른 생물학적 존재와 상이한 종의 군에 속함)일 수 있다.

본 발명은 초기 혈액 조성물이 청구된 열 처리 전에 첨가된 임의로 하나 이상의 추가의 물질을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 상기 추가 물질은 하기일 수 있다:

- 단백질, 펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 지질, 비단백 유기 물질 및 무기 물질로부터 선택된 하나 이상의 생물활성제;

- 히알루론산, 히알루로네이트 염, 콘드로이틴 4-술페이트, 콘드로이틴 6-술페이트, 덱스트란, 실리카겔, 알기네이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 키틴 유도체 -바람직하게는 키토산-, 크산탄검, 아가로오스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트(PHEMA) 합성 또는 천연 단백질 및 콜라겐으로부터 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자;

- 폴리카프로락톤, 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드 및 그들의 공중합체로 형성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기 고분자;

- 하나 이상의 하기 제제: 항생제, 항균제, 항발암물질, 진통제, 성장 인자, 호르몬;

- 칼슘염, 마그네슘염 및/또는 스트론튬 염의 군으로부터 선택된 하나 이상의 무기 성분.

본 발명은 또한 열 처리가 수행된 후 상술한 물질이 제제에 첨가될 수 있음을 고려한다.

본 발명에 따른 제제는 청구된 기술적 측면 이외에 제제가 사용될 특정 제제를 위해 적당한 추가의 화합물, 성분 및 분자 등을 포함할 수 있는 다양한 실시양태가 존재할 수 있다. 즉, 본 발명은 단백질 겔 기재의 신규 제제의 패밀리로서 간주되며, 상기 패밀리는 겔화된 단백질이 존재하고, 그의 추가적이 조성이 상이할 수 있는 상이한 제제에 의해 형성된다.

더욱이, 추가의 단계는 그들을 더 다용도로 만드는 수단으로서 매트릭스 건조를 포함하는, 겔화된 단백질로 제제 상에서 수행될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 겔화된 단백질의 제제는 멤브레인을 형성하기 위하여 건조(건조 가열) 또는 동결건조될 수 있다. 이 멤브레인은 후속하여 염수 용액, 혈소판-풍부 혈장, 혈소판-풍부 혈장의 상청액, 성장 인자 풍부 혈장, 성장 인자 풍부 혈장의 상청액, 또는 멤브레인이 수화되도록 허용하는 기타 용액을 첨가하는 것과 같은 다양한 대안에 의해 재수화될 수 있다.

실시예

실시예 1

본 방법은 환자로부터 추출된 혈액 샘플 9ml로 출발하여 시트레이트 항응고제를 함유하지 않는 기밀 튜브에 저장된다. 혈액은 8분 동안 580g의 속도 및 주위 온도에서 원심분리된다. 원심분리의 결과로, 튜브 내에 함유된 혈액은 다양한 분획으로 분할된다. 백혈구를 포함하는 상부 분획, 또는 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 분획은 5ml 주사기로 추출된다. 초기 튜브가 시트레이트화되지 않았으므로, PRP는 응고가 시작된다. 시린지의 내용물은 10분 동안 70℃의 온도에서 가열된다. 용기는 그 후 2분 동안 4℃의 온도에서 냉각된다. 이러한 열 가열-냉각 시퀀스의 결과로서, 겔의 조도를 갖는 반고체 물질은 시린지의 내부에서 형성된다. 활성화된 제제는 그러므로 수득되며, 활성화된 제제는 겔 유사 조도를 나타내며(응집으로 인해 발생하는 피브린의 결과로서 및 열 처리에 의해 생성된 단백질의 겔화의 결과 양자로서) 시트레이트 및 칼슘이 부족하다. 피브린의 존재는 더 큰 조도 및 저항성을 갖는 제제를 제공하는 한편, 겔화된 단백질은 일정한 안정성 및 부피를 제공한다. 그의 성질 및 기계적 저항성으로 인하여, 이러한 타입의 물질은, 예를 들어, 얼굴 조직에서 수직 결손을 보정하는 것에 유용할 수 있다.

실시예 2

본 방법은 환자로부터 추출된 혈액 샘플 9ml로 출발하여 0.1ml의 양으로 3.8% 시트레이트 항응고제를 함유하는 밀봉된 추출 튜브에 저장된다. 혈액은 8분 동안 580g의 속도 및 주위 온도에서 원심분리된다. 원심분리의 결과로, 튜브 내에 함유된 혈액은 다양한 분획으로 분할된다. 상부 분획, 또는 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 분획은 백혈구를 포함함이 없이 5ml 주사기로 추출된다. 시린지는 3분 동안 80℃의 온도에서 가열된다. 시린지는 그 후 10분 동안 20℃의 온도에서 냉각된다. 이러한 열 가열-냉각 시퀀스의 결과로서, 반고체 물질은 제2 용기 내부에서 형성된다. 물질은 겔 유사 조도를 가지며, 그의 혈소판은 여전히 활성화되지 않는다. 물질은 사전에 응고되어 있지 않았기 때문에 피브린을 포함하지 않는다. 이러한 타입의 물질은 예를 들어, 주름의 존재를 제거 또는 감소시킴에 의해 더 젊은 모습을 달성하기 위하여, 미용 성형외과에서 필러로서 사용될 수 있으며; 물질은 피부를 리프팅할 수 있는 그의 주입(25G 이하의 바늘사용)되는 능력 및 그의 조도로 인하여 사용될 수 있다. 이러한 바이오-겔은 시간이 지남에 따라 안정하며 또한 세포 성장 및 증식을 자극하는 성장 인자를 방출하고, 이것은 히알루론산과 같은 종래의 물질과 비교하여 그러므로 매우 유리하게 한다. 이 시점에서 가장 광범위하게 필러 물질인 히알루론산은 생물활성이 결여되어 있으며 따라서 조직의 형성을 촉진하지 않거나 또는 시간의 경과에 따른 지속적인 개선을 달성하지 않으며, 이것은 주기적으로, 일반적으로는 3-4개월 마다 투여되는 것을 의미한다.

실시예 3

본 방법은 환자로부터 9ml의 혈액 샘플을 추출하고 0.1ml의 3.8% 시트레이트 항응고제를 함유하는 밀봉된 추출 튜브에 혈액을 저장한다. 혈액은 8분 동안 580g의 속도 및 주위 온도에서 원심분리된다. 원심분리의 결과로, 튜브 내에 함유된 혈액은 다양한 분획으로 분할된다. 상부 분획, 또는 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 분획은 백혈구를 포함함이 없이 5ml 주사기로 추출된다. 그 후, 10% 염화칼슘을 각기 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 비로 첨가하여, 혈소판의 활성화, 즉 성장 인자의 방출, 및 혈장의 응고를 야기한다. 시린지는 그 후 5분 동안 75℃의 온도에서 가열된다. 시린지는 그 후 10분 동안 주위 온도로 냉각된다. 이러한 열 가열-냉각 시퀀스의 결과로서, 반고체 물질은 시린지의 내부에서 형성된다. 물질은 응집으로 인하여 발생된 피브린 및 열 처리에 의해 생성된 단백질의 겔화 양자의 결과로서 겔 유사 조도를 갖는다. 그 물질은 시트레이트, 칼슘 및 방출된 성장 인자를 포함한다. 이러한 타입의 물질은 치조의 재생을 장려하도록 치과 피이스의 추출에 이어 치조 좌측과 같은 뼈 결손을 충전하기 위하여 사용될 수 있다. 성장 인자의 방출 및 셀 성장을 위한 지지체로서 작용하는 겔의 능력으로 인하여, 겔은 뼈 조직으로 치조의 충전을 장려하며, 이에 의해 추출된 치아의 교체에서 예를 들어 치조 내의 치과용 임플란트의, 추가의 피팅을 위한 대기 시간이 줄어든다.

실시예 4

본 방법은 환자로부터 9ml의 혈액 샘플을 추출하고 항응고제로서 작용하는 3.8%(중량/부피)의 농도를 갖는 시트르산 나트륨 용액 0.1ml를 함유하는 밀봉된 추출 튜브에서 혈액을 저장한다. 혈액은 8분 동안 580g의 속도 및 주위 온도에서 원심분리된다. 원심분리의 결과로, 튜브 내에 함유된 혈액은 다양한 분획으로 분할된다. 상부 분획, 또는 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 분획은 백혈구를 포함함이 없이 9ml 분별 튜브로 추출된다. 염화칼슘 용액(10% 중량/부피 농도)을 각기 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 비로 첨가한다. 튜브는 그후 37℃ 오븐에 넣는다. 염화칼슘은 혈소판의 활성화(성장 인자 방출), 혈장의 응집 및 피브린의 형성을 야기하며, 상기 형성은 튜브가 오븐 온도 조건으로 전송된다는 사실에 의해 촉진된다. 응괴 수축의 결과로, 두 상은 그 후 수득 된다: 3차원 피브린 구조를 갖는 고체상, 및 단백질, 혈소판 성장 인자 및 혈장 성장 인자를 함유하는 액체 상청액 상. 액체상 또는 상청액은 3ml 주사기로 분리된다. 주사기는 그 후 10분 동안 80℃의 온도로 가열된다. 주사기는 그 후 5분 동안 22℃의 온도로 냉각된다. 열 가열-냉각 시퀀스의 결과로서, 반고체 물질은 주사기 내부에서 형성된다. 이러한 반고체 물질은 피브린을 포함하는 본 발명에 따른 제제보다 더 작은 고체 조도를 갖는다. 더 작은 고체 조도로 인하여, 이러한 타입의 물질은 예를 들어 치주 조직의 재생을 촉진할 목적으로 치주골 내 뼈 결손을 충전하기 위해 유용할 수 있다. 그것은 또한 물질의 골막하 또는 상위 골막의 침윤을 수행함에 의한 뼈 재생에 유용할 수 있다.

실시예 5

또 다른 실시예에서, 그 방법은 피브린 응괴로 시작된다(580g의 속도 및 20℃의 온도에서 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장을 수득하고, 각기 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 염화칼슘의 비율로 염화칼슘을 첨가하며, 피브린이 중합할 때까지 10 내지 20분 동안 대기한 후 제조된 물질). 응괴는 10분 동안 70℃에서 가열을 수행하고, 이어서, 10분 동안 20℃에서 냉각하여, 단백질 겔이 수득 된다. 도　1은 상술한 단백질 겔의 두 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 왼쪽의 이미지는 변성된 알부민을 나타내는 둥근 구조 및 피브린 섬유인 선형 구조의 존재를 나타낸다. 오른쪽 이미지는 겔의 압축 (외부)표면을 나타낸다.

실시예 6

또 다른 실시예에서, 그 방법은 성장 인자 풍부 혈장(PRGF)으로 시작된다(580g의 속도 및 20℃의 온도에서 혈액을 원심분리하여 다양한 분획을 수득하고, 혈소판-풍부 혈장(PRP)의 분획을 분리하며, 성장 인자의 방출을 야기하고 혈장의 응집을 개시할 목적으로 각기 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 염화칼슘의 비율로 염화칼슘을 첨가한 후 제조된 물질). 응괴의 수축은 상청액이 수득 되도록 허용한다. 상기 상청액은 그 후 10분 동안 70℃에서 가열을 수행하고, 이어서, 10분 동안 20℃에서 냉각하여, 단백질 겔이 수득된다. 도　2는 상술한 단백질 겔의 두 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 왼쪽의 이미지는 겔의 내부 및 변성된 알부민을 나타내는 둥근 구조의 존재를 나타낸다. 오른쪽 이미지는 겔의 압축 (외부)표면을 나타낸다.

실시예 7

또 다른 실시예에서, 다양한 단백질 겔은 상이한 온도 및 시간에서 피브린 응괴(실시예　5에서 기술된 바와 같이 제조)를 처리하여 제조되었다. 제조 조건은 하기와 같다: 15분 동안 70℃에서 응괴를 가열하고(정사각형), 30분 동안 70℃에서 응괴를 가열하며(원), 15분 동안 80℃에서 응괴를 가열하고(삼각형); 이들 모두를 10분 동안 4℃의 온도에서 냉각한다. 이들 겔은 증류수에서 배양하기 전에 24시간 동안 37℃에서 건조하였다. 겔은 하기와 같이 정의된 팽윤도를 계산하기 위하여 24시간의 간격으로 칭량하였다: 팽윤 중량/초기 중량. 도 3은 상이한 온도 및 시간에서 제조된 단백질 겔의 팽윤 인자 또는 정도를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 겔은 물의 흡수 및 그의 구조 내부의 보유로 인하여 그의 초기 중량의 2 내지 3배 증가한다. 그것은 또한 15분 동안 70℃에서 제조된 겔(정사각형)은 24시간 내에 팽윤하며, 그들의 팽윤 인자는 더 긴 배양 시간에 걸쳐 유의하게 변하지 않는다는 것을 알 수 있다. 그러나, 30분 동안 70℃에서 제조된 겔(원)은 24시간 후 그들의 초기 중량의 대략 3배로 팽윤되지만, 배양 시간이 증가함에 따라, 팽윤 인자가 약간하락하는 것이 관측된다. 한편, 15분 동안 80℃에서 제조된 겔(삼각형)은 특히 48시간으로 최대 팽윤에 도달하는 시간이 이전 두 겔 보다 더 길다. 어떠한 경우에도, 겔의 팽윤성은 이들이, 예를 들어, 생물활성 물질(단백질 또는 주요 활성 물질)의 국소 방출을 위한 매트릭스로 사용될 수 있음을 의미한다. 이러한 사용은 보통 탈수된 겔에 상기 생물활성 물질을 함유하는 용액을 적용하여 수행되며, 그러므로 이것은 겔의 수화를 야기하고, 따라서 생물활성 물질이 혼입된다.

실시예 8

또 다른 실시예에서, 다양한 단백질 겔은 상이한 온도 및 시간에서 상청액(실시예　6에따라 제조)를 처리하여 제조되었다. 제조 조건은 하기와 같다: 15분 동안 70℃에서 상청액을 가열하고(정사각형), 30분 동안 70℃에서 상청액을 가열하며(원), 15분 동안 80℃에서 상청액을 가열하고(삼각형); 이들 모두를 10분 동안 4℃의 온도에서 냉각한다. 이들 겔은 증류수에서 배양하기 전에 24시간 동안 37℃에서 건조하였다. 겔은 하기와 같이 정의된 팽윤도를 계산하기 위하여 24시간의 간격으로 칭량하였다: 팽윤 중량/초기 중량. 초기 중량은 물에서 배양 전에 건조 겔의 중량이다. 도 4는 상이한 온도 및 시간에서 제조된 단백질 겔의 팽윤도를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 겔의 초기 중량은 물의 흡수 및 그의 구조 내부의 보유로 인하여 대략 3배 증가한다. 그것은 또한 15분 동안 70℃에서 제조된 겔(정사각형)은 24시간 내에 팽윤하며, 그들의 팽윤 인자는 더 긴 배양 시간에 걸쳐 유의하게 변하지 않는다는 것을 알 수 있다. 반면, 30분 동안 70℃에서 제조된 겔(원)은 48시간 후 그들의 초기 중량의 대략 3배로 팽윤되지만, 더 긴 배양 시간에서, 팽윤 인자가 약간 하락하는 것이 관측된다. 한편, 15분 동안 80℃에서 제조된 겔(삼각형)은 24시간의 배양 후 상기 팽윤 인자가 대략 3에 도달한다. 어떠한 경우에도, 겔의 팽윤성은 이들이, 예를 들어, 생물활성 물질(단백질 또는 활성 성분)의 국소 방출을 위한 매트릭스로 사용되도록 한다. 이러한 사용은 보통 탈수된 겔에 상기 생물활성 물질을 함유하는 용액을 적용하여 수행되며, 그러므로 겔의 수화를 야기하고, 따라서 생물활성 물질이 그들의 내부로 혼입된다.

실시예 9

또 다른 실시예에서, 4의 단백질 겔 또는 제제는 하기로부터 본 발명에 따라 제조되었으며: 상청액(본 실시예의 끝에서 언급된 그래프에서 "SN"으로 나타냄), 피브린 응괴("피브린"), 비활성화된 혈소판-풍부 혈장("비활성화됨") 및 응괴 없이 10%　CaCl2로 활성화된 혈소판-풍부 혈장("응괴 없이 활성화됨"), 및 물질을 15분 동안 70℃에서 가열하고 10분 동안 21℃에서 냉각하는 것으로 구성된 상술한 초기 물질의 열처리를 수행한다. 이들 초기 물질의 제조 방법은 실시예　2, 3 및 6에서 설명된다. 열 처리에 이어 수득 된 각각의 이들 4 제제는 48시간 동안 소 태아 혈청 없이 둘베코 수정 이글 배지(DMEM)에서 48시간 동안 배양하였다. 게다가, 그 방법은 소 태아 혈청 없이 DMEM으로 구성된 다섯 번째 물질 또는 대조 물질로 또한 나누었다. 5의 배양 배지가 MG　63세포를 배양하기 위하여 사용되었으며, 2일(정사각형), 4일(원) 및 7일(삼각형) 마다 갱신하였다. 이들 각각의 기간에 이어, 세포 증식은 비색 시약 WST-1 및 플레이트 판독기를 사용하여 평가하였다. 증식의 백분율은 하기 함수를 사용하여 계산하였다: %　증식=(WST-1의 겔 흡광도/WST-1의 대조 물질 흡광도)　x　100. 도　5는 MG 63 조골세포 유사 세포 주로 시험된 단백질 겔의 세포학적 적합성의 결과를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 대조 샘플과 관련하여 세포 증식의 증가로 나타난 바와 같이 겔은 독성이 아니다. 증식 2일 후(정사각형), 비 활성화된 혈소판-풍부 혈장으로부터 제조된 겔은 더 큰 세포 증식을 초래한다. 그러나, 이들 차이는 더 긴 증식 시간(원, 삼각형)에서 발생하지 않는다. 그러므로 이 실시예는 본 발명에 따른 제제가 세포 성장을 촉진하기 위해 적당한 거동을 나타내며, 임상적 용도로의 개발을 허용하는 생체 적합성이 있음을 나타낸다.

실시예 10

이전의 실시예에서와 같이, 4의 단백질 겔 또는 제제는 하기로부터 본 발명에 따라 제조되었다: 상청액(정사각형), 피브린 응괴(원), 비 활성화된 혈소판-풍부 혈장(중심 정점이 위쪽을 향하는 삼각형) 및 응괴 없이 10%　CaCl2로 활성화된 혈소판-풍부 혈장(중심 정점이 아래쪽을 향하는 삼각형). 모든 물질은 물질을 15분 동안 70℃에서 가열하고 10분 동안 21℃에서 냉각하는 것으로 구성된 열 처리를 수행하였다. 이들 초기 물질의 제조 방법은 실시예　2, 3 및 6에서 설명된다. 수득된 4 제제는 2, 4, 7 및 9일 동안 배양 배지에서 배양하였다. 각각의 기간의 끝에서, 배지를 수집하고, 새로운 배지는 겔에 첨가한다. 수집된 배지는 이들의 사용을 위하여 MG　63 세포의 배양에서 저장하였다. 세포는 48시간 동안 이 배지에서 성장시켰다. 세포 증식은 그 후 비색 시약 WST-1 및 플레이트 판독기를 사용하여 평가하였다. 증식의 백분율은 하기 함수를 사용하여 계산하였다: %　증식=(WST-1의 겔 흡광도/WST-1의 대조 물질 흡광도)　x　100, 여기에서 혈청 없는 DMEM이 대조 물질로서 사용되었다. 도　6은 배양 배지에서 및 각각의 배양 시간 간격에서의 세포 증식을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 더 큰 세포 증식이 배양 2일 후 달성되었다. 더 긴 배양 시간에서, 배양 배지는 더 작은 세포 증식으로 증진되며, 이것은 성장 인자의 방출이 배양 2일 후 더 크며 성장 인자의 성분은 더 긴 배양 시간(4, 7 및 9일)의 배지에서 보다 더 작다는 것을 암시하는 것으로 보여진다. 이들 결과는 그러므로 처음 몇 시간의 배양 동안 다량의 생물활성 물질이 방출함을 특징으로 하는 다른 타입의 겔과 유사한 방출 프로파일에 따라 겔 내의 세포 증식 촉진 물질의 방출이 시간이 지남에 따라 감소되며("버스트" 효과), 시간의 경과와 함께 방출 양이 유의하게 감소됨을 나타낸다.

실시예 11

또 다른 실시예에서, 방법은 두 초기 물질로 시작된다. 제1 물질은 (실시예　6 에서와 같이)각각의 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 비의 염화칼슘으로 혈소판-풍부 혈장을 활성화 한 후 수득된 피브린 겔이었다. 제2 물질은 (실시예　6 에서와 같이)피브린 겔의 수축에 이어 수득된 상청액이었다. 두 물질은 세 가지 상이한 열 처리를 수행하였다: 15분 동안 70℃에서 가열, 30분 동안 70℃에서 가열 및 15분 동안 80℃에서 가열. 모든 경우에, 가열에 이어 10분 동안 4℃의 온도에서 또는 20℃의 온도에서 냉각하였다. 12 단백질 겔을 수득하였다. 12 겔은 그 후 20분 동안 14,800rpm에서 원심분리하였다. 혈소판-유도 성장 인자(PDGF-AB) 및 베타 형질전환 성장 인자(TGF-β)의 함량은 그후 측정하였다. 이들 측정 결과는 도 7 및 8에 나타내며, 12겔은 2겔씩 6그룹으로 나타내며, 그룹은 "1"(15분, 70℃에서 피브린 겔), "2"(30분, 70℃에서 피브린 겔), "3"(15분, 80℃에서 피브린 겔), "4"(15분, 70℃에서 상청액 겔), "5"(30분, 70℃에서 상청액 겔) 및 "6"(15분, 80℃에서 상청액 겔)로 명명되며, 여기에서, 각각의 그룹 중, 4℃로 냉각된 겔은 흑색 막대로 나타내며, 20℃에서 냉각된 겔은 백색 막대로 나타낸다. 도 7은 관측된 PDGF-AB 성장 인자의 함량을 나타낸다. 이러한 성장 인자의 함량은 30분 동안 70℃("5") 및 80℃("6")에서 제조된 상청액 겔을 제외하고 일반적으로 4℃에서 냉각된 겔(흑색 막대)보다 20℃에서 냉각된 겔(백색 막대)이 더 크며, 여기에서 냉각 온도에 의존하여 PDGF-AB의 함량의 차이는 거의 관측되지 않음을 결론지을 수 있다. 도 8은 TGF-β 성장 인자의 관측된 함량을 나타낸다. 피브린(그룹 "1", "2", "3")으로부터 제조된 겔에 관하여, 20℃에서 수행된 냉각의 경우(백색 막대), TGF-β 인자의 함량은, 즉 겔 제조를 위한 상이한 열 처리에 대하여, 세 그룹에서 유사하였으며, 한편 4℃에서 수행된 냉각의 경우(흑색 막대) TGF-β 인자의 함량은 15분 동안 70℃에서 제조된 겔(그룹 "1")에서 더 크다는 결론을 내릴 수 있다. 반면, 상청액으로부터 제조된 겔(그룹 "4", "5", "6")에 관하여, 15분 동안 70℃에서 상청액으로부터 제조된 단백질 겔(그룹 "1")만이 TGF-β를 방출하였으며, 상기 인자는 상청액으로부터 제조된 다른 겔에서 검출되지 않았음을 알 수 있다. 그러므로 피브린 겔은 70℃ 초과의 온도에서 상청액 보다 더 높은 성장 인자 함량을 유지하며, 따라서 가열 온도 및 냉각 온도는 이러한 성장 인자 함량에 영향을 주며, 함량은 더 낮은 가열 온도 및 21℃의 냉각 온도에서 더 크다는 결론을 내릴 수 있다. PDGF-AB는 고온에서 TGF-β보다 더 안정하며, 피브린 기재의 단백질 겔은 상청액 기재의 단백질 겔보다 더 큰 양의 TGF-β를 함유한다는 결론을 또한 내릴 수 있다.

실시예 12

또 다른 실시예에서, 4의 단백질 겔 또는 제제는 초기 물질을 15분 동안 70℃에서 가열하고 10분 동안 21℃에서 냉각하는 것으로 구성된 열 처리를 적용함에 의해, 본 발명에 따라 제조되었다: 상청액(SN), 피브린 응괴(피브린), 비 활성화된 혈소판-풍부 혈장(활성화되지 않음) 및 응괴 없이 10%　CaCl₂로 활성화된 혈소판-풍부 혈장(응괴없이 활성화됨). 이들 초기 물질의 제조는 실시예 2, 3 및 6에서 설명된다. 4의 단백질 겔은 상이한 시간의 기간 동안(2, 4 및 7일) DMEM에서 배양하였다. 각각의 배양 시간에서, 배지 시간은 4 단백질 겔의 이들 성장 인자의 방출 키네틱을 결정하는 목적으로 PDGF-AB 및 TGF-β의 함량을 결정하기 위하여 추출되었다. 도 9는 흑색, 백색 및 줄무늬 막대로 나타낸 2, 4 및 7일의 배양 시간 기간에 상응하는 측정으로 DMEM 배지에서 PDGF-AB의 방출 키네틱을 나타낸다. PDGF-AB의 방출은 상청액으로부터 제조된 단백질에 대한 2 및 4 일 동안의 배양에서 더 크다는 것을 알 수 있다. 다른 겔은 3 배양 시간 간에 유의한 차이를 나타내지 않는다. 결국, 도　10은 배양 2일 후 DMEM 배지에서 TGF-β의 방출 키네틱을 나타낸다. 이러한 인자는 상청액 및 피브린으로부터 제조된 단백질 겔에서 만이 존재하였으며, 상청액으로부터 단백질 겔 내의 TGF-β의 방출은 더 크다는 것을 알 수 있다. 그러므로, 성장 인자는 상청액 기재의 단백질 겔로부터 더 신속하게 방출된다는 결론을 내릴 수 있을 것이다.

실시예 13

또 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 단백질 겔 또는 제제의 충전 효과는 실험실 쥐에서 시험되었다. 본 발명의 4 제제는 이 목적을 위해 제조하였다. 4 제제의 제조는 하기 단계로 시작하였다. 첫 번째로, 혈액은 항응고제 없이 9ml 튜브에 환자로부터 추출되었다. 튜브는 8분 동안 850g에서 원심분리하여 적혈구로부터 혈장을 분리하였다. 백혈구를 제외한, 적혈구의 분획 위에 위치한 혈장의 전체 컬럼은 그 후 새로운 9ml 튜브로 추출하였다. 이 혈장은 하기를 제조하기 위하여 사용되었다: 혈장액 자체(B); 혈장의 활성화 및 응괴의 형성을 야기하는, 각각의 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 비로 10% 염화칼슘이 첨가되는 목적을 위한, 피브린 응괴(C); 및 피브린이 수축하고 상청액이 수득될 수 있도록 제조, 및 37℃에서 60분의 기간이 경과하도록 허용된, 상술한 것과 동일한 특징을 갖는 피브린 응괴의 제조를 위한 상청액(A). 혈액은 또한 항응고제로서 3.8%의 시트르산 나트륨 0.1ml로 9　ml 추출 튜브에서 환자로부터 추출되었다. 혈액은 수득 된 백혈구-혈소판 층 바로 위의 2ml의 혈장으로 8분 동안 850g에서 원심분리되고 피브린 응괴(D)를 수득하기 위하여 각기 1ml의 혈장에 대하여 50μl의 비로 10% 염화칼슘을 사용하여 활성화되었다. 이들 4의 초기 물질(A, B, C, D)은 10분 동안 70℃에서 처리 및 10분 동안 20℃에서 냉각하여 겔을 수득하였다. 각각의 겔 제제의 0.6ml의 용량을 각각의 쥐에게 투여하였다. 도 11에 나타낸 사진은 그들의 기계적 성질의 향상을 나타내는, 단백질 겔에 의한 지속적인 부피 증가의 형성을 나타낸다.

또한 성장 인자 풍부 혈장(이것은 "PRGF-Endoret"으로 언급될 것이다)은 0.1 ml의 3.8% 시트르산 나트륨으로 9ml 튜브에서 혈액을 추출, 8분 동안 850g에서 혈액을 원심분리, 혈소판 풍부 혈장의 분획 분리(백혈구를 포함함이 없이, 적혈구의 바로 위의 분획에서 2ml의 혈장 컬럼) 및, 쥐에게 주입하기 바로 전에, 각각의 1ml에 대하여 50μl의 염화칼슘을 첨가하여 혈장을 활성화(혈소판의 성장 인자의 방출을 야기함)하여 제조되었다.

도　12는 대조로서 상기에서 기술된 히알루론산 및 PRGF-Endoret 성장 인자 풍부 혈장을 사용하여 쥐에게 단백질 겔을 주입한 2주 후의 부피의 변화를 나타낸다. 단백질 겔은 히알루론산으로서 반타원형의 부피 유지에 효과적이며, 한편 PRGF-Endoret 성장 인자 풍부 혈장은 반타원형의 부피 유지에 유용하지 않다는 결론을 내릴 수 있다.

피브린 겔의 안정성과 본 발명에 따른 단백질 겔의 안정성을 비교할 목적으로, 시험동안 시도는 또한 종래의 피브린 겔(응괴)의 주입으로 이루어지는 것이 추가되어야 한다. 결과는 피브린 겔이 그 자체로서 투여되는 것을 방지하는, 상 분리(상청액으로부터의 피브린 분리)가 발생하기 때문에 상기 피브린 겔을 주입하는 것은 가능하지 않았다.

실시예 14

혈소판-풍부 혈장은 실시예　2에서 기술된 바와 같이 제조된다. 타입-I 콜라겐은 그 후 첨가한다. 혼합물은 그 후 10분 동안 75℃의 온도에서 가열하고, 후속하여 3분 동안 20℃의 온도에서 냉각한다. 이 제제의 결과는 더 큰 조도를 나타내는 단백질 겔이다. 이러한 타입의 겔은 더 큰 안정성을 나타내며 콜라겐이 없는 것보다 더 느린 분해 속도를 나타내므로 주름 처리를 위한 필러로서 사용될 수 있다. 이러한 개질은 따라서 심지어 더 제제의 분해를 느리게 하는 것을 돕는다. 임상적으로, 이러한 안정성의 향상은 겔의 제1 및 제2 투여 간의 기간을 증가시킨다. 이것은 히알루론산을 사용한 주름 처리의 단점에 대한 해결책을 나타내며, 이것은 3 내지 4개월 마다, 다시 말해서, 단시간 내에 그의 반복 투여를 포함한다.

실시예 15

혈소판-풍부 혈장은 실시예　2에서 기술된 바와 같이 제조된다. 예를 들어 과립 형태의 인산 칼슘을 그 후 첨가한다. 혼합물은 그 후 10분 동안 80℃의 온도에서 가열하고, 3분 동안 20℃의 온도에서 냉각한다. 이러한 제조로부터 수득한 하이브리드 물질은 인산 칼슘으로 개질되지 않은 겔 보다 더 우수한 기계적 성질을 나타낸다. 인산 칼슘을 사용한 겔의 개질은 겔의 압축 및 인장력에 대한 저항성을 증가시킨다. 이러한 타입의 물질은 결함에서 하나 이상의 벽의 부족으로 인하여 더 큰 기계적 안정성을 갖는 필러 물질이 필요한 뼈 결손을 재생하기 위해 사용될 수 있다.

실시예 16

본 발명에 따른 단백질 겔은 상술한 실시예에서 기술된 제조 방법을 사용하여 제조된다. 겔은 그 후 히알루론산과 결합하여 하이브리드 물질을 생성한다. 이 물질은 투여 영역에서 그의 안정성을 증가시키며, 이에 의해 그의 이동을 방지하는, 더 우수한 점탄성을 나타낸다. 이러한 하이브리드 물질은 수평 뼈 성장을 야기하며 이에 의해 충분한 뼈 커버와 함께 치과 임플란트를 삽입 가능하도록 치조 돌기의 두께를 증가시키기 위하여 좁은 치조 돌기의 전방 벽과 같은 표면상에서 그의 적용에 유용하다.

실시예 17

실시예　8(그 안에서 기술된 모든 단백질 겔의 예가 유효하다)에서 기술된 바와 같이 겔을 제조 및 건조 한 후, 건조 물질은 15mg/ml의 농도로 독시사이클린 하이클레이트 항생제를 함유하는 액체 내에서 24시간 동안 및 암흑에서 배양한다. 결과는 겔의 팽윤이며, 겔의 구조는 적용 영역에서 그의 후속 방출을 위한 항생제를 포함한다. 이 겔은 그러므로 더 낮은 혈액 공급이 있는 영역 -뼈, 예를 들어- 에서의 감염의 치료를 위한 항생제의 제어 방출 및 항생제의 전신 투여를 방지하기 위하여 사용될 수 있다. 이 절차는 그들의 국소 방출을 보장하기 위하여 다른 항생제 및 다른 약제로 반복될 수 있다.

Claims (21)

1. 제제는 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부하며 초기 혈액 조성물로부터 유래하는 겔화된 상태인 단백질이 풍부한, 인간 또는 동물 유래의 초기 혈액 조성물로부터 유도되거나 또는 이를 포함함을 특징으로 하는, 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 갖는 제제.
   
2. 제1항에 있어서,
   단백질이 알부민, 당단백질, 글로불린 및/또는 피브리노겐임을 특징으로 하는 제제.
   
3. 제1항에 있어서,
   단백질이 가열 및 냉각 처리의 결과로서 겔화된 상태임을 특징으로 하는 제제.
   
4. 제1항에 있어서,
   초기 혈액 조성물이 혈소판-풍부 혈장임을 특징으로 하는 제제.
   
5. 제1항에 있어서,
   초기 혈액 조성물이 혈소판-풍부 혈장으로부터 수득된 상청액임을 특징으로 하는 제제.
   
6. 제1항에 있어서,
   초기 혈액 조성물이 방출된 성장 인자가 풍부한 혈장임을 특징으로 하는 제제.
   
7. 제1항에 있어서,
   초기 혈액 조성물이 방출된 성장 인자가 풍부한 혈장으로부터 수득된 상청액임을 특징으로 하는 제제.
   
8. 제1항에 있어서,
   초기 조성물이 피브린 겔임을 특징으로 하는 제제.
   
9. 제1항에 있어서,
   단백질, 펩티드, 핵산, 폴리사카라이드, 지질, 비단백 유기 물질 및 무기 물질 중에서 선택된 하나 이상의 생물활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
   
10. 제1항에 있어서,
    하기로부터 선택된 하나 이상의 생분해성 고분자를 포함함을 특징으로 하는 제제: 히알루론산, 히알루로네이트 염, 콘드로이틴 4-술페이트, 콘드로이틴 6-술페이트, 덱스트란, 실리카겔, 알기네이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 키틴 유도체 -바람직하게는 키토산-, 크산탄검, 아가로오스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트(PHEMA), 합성 또는 천연 단백질, 콜라겐.
    
11. 제1항에 있어서,
    폴리카프로락톤, 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드 및 그들의 공중합체에 의해 형성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기 고분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
    
12. 제1항에 있어서,
    하나 이상의 하기 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제: 항생제, 항균제, 항발암물질, 진통제, 성장 인자 및 호르몬.
    
13. 제1항에 있어서,
    칼슘염, 마그네슘염, 및/또는 스트론튬염의 군으로부터 선택된 하나 이상의 무기 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
    
14. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바람직한 생물학적 또는 의학적 성질을 갖는 제제의 제조방법:
    a) 혈소판 및/또는 성장 인자가 풍부한 인간 또는 동물 유래의 초기 혈액 조성물을 제공하는 단계;
    b) 1분 이상 동안 60℃ 내지 100℃의 온도에서 초기 혈액 조성물을 가열하는 단계; 및
    c) 1분 이상 동안 초기 혈액 조성물을 냉각하는 단계.
    
15. 제14항에 있어서,
    초기 혈액 조성물이 70℃ 내지 85℃의 온도에서 가열됨을 특징으로 하는 제제의 제조방법.
    
16. 제14항에 있어서,
    초기 혈액 조성물이 혈소판-풍부 혈장임을 특징으로 하는 제제의 제조방법.
    
17. 제14항에 있어서,
    초기 혈액 조성물이 혈소판-풍부 혈장의 상청액임을 특징으로 하는 제제의 제조방법.
    
18. 제14항에 있어서,
    초기 혈액 조성물이 방출된 성장 인자가 풍부한 혈장임을 특징으로 하는 제제의 제조방법.
    
19. 제14항에 있어서,
    초기 혈액 조성물이 방출된 성장 인자가 풍부한 혈장의 상청액 임을 특징으로 하는 제제의 제조방법.
    
20. 제14항에 있어서,
    초기 조성물이 또한 피브린 겔임을 특징으로 하는 제제의 제조방법.
    
21. 제14항에 있어서,
    초기 혈액 조성물이 혈소판을 포함하며, 그 방법은 가열 전에 혈소판을 활성화하는 단계 및 일시적인 피브린이 형성될 때까지 대기하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제의 제조방법.

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