ES2865723T3 - Formulación de FGF-18 en geles de xiloglucano - Google Patents

Abstract

Una formulación líquida adecuada para inyección intraarticular que comprende o consiste en FGF-18, un xiloglucano y un amortiguador, en donde dicho xiloglucano está parcialmente desgalactosilado.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación de FGF-18 en geles de xiloglucano

Campo de invención

La invención se refiere al campo de las formulaciones farmacéuticas. Más concretamente, se refiere a la formulación de la proteína del factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18) en geles de xiloglucano y a métodos para producir dichas formulaciones.

Antecedentes de la invención

El factor de crecimiento de fibroblastos 18 (FGF-18) es un miembro de la familia de proteínas del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), estrechamente relacionado con FGF-8 y FGF-17. Los miembros de la familia FGF se caracterizan por dominios de unión a heparina. Dicho supuesto dominio de unión a heparina se ha identificado para FGF-18. Se supone que la señalización mediada por receptor se inicia tras la unión del ligando de FGF formando un complejo con proteoglucanos de sulfato de heparina de la superficie celular.

Se ha demostrado que FGF-18 es un agente proliferativo de condrocitos y osteoblastos (Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002). Se ha propuesto el FGF-18 para el tratamiento de trastornos del cartílago como la osteoartritis (OA) y la lesión del cartílago (IC), ya sea solo (WO2008/023063) o en combinación con ácido hialurónico (documento WO2004/032849, también publicado como US 2008/193425).

Se conocen en la técnica composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido FGF. El documento WO2012172072 describe una formulación liofilizada que contiene FGF-18, en la que dicha composición comprende FGF-18, un amortiguador, un tensioactivo de poloxámero y un azúcar como agente estabilizante. Dicha formulación liofilizada de FGF-18 está mostrando resultados prometedores en el tratamiento de OA o CI. El régimen de administración actual, que usa dicha formulación liofilizada, es un ciclo de tratamiento de una inyección semanal durante 3 semanas. El ciclo de tratamiento se puede repetir.

En el caso de CI, el principal inconveniente de la formulación actual es que, una vez inyectado por vía intraarticular (i.a.), la presencia de FGF-18 en el líquido sinovial puede inducir un crecimiento incontrolado del cartílago también en áreas sanas. Esto puede inducir, por supuesto, efectos no deseados como la movilidad articular reducida. La administración de FGF-18 selectivamente en el sitio objetivo podría estimular el crecimiento del cartílago solo en el área dañada. En concreto, la administración de FGF-18 en el área dañada podría ser muy beneficiosa para el tratamiento de la IC junto con técnicas de microfractura. La microfractura es una técnica quirúrgica de reparación del cartílago articular que funciona creando pequeñas fracturas en el hueso subyacente. Esto provoca la liberación de células madre mesenquimatosas pluripotentes de la médula ósea (Ringe J. et al., 2012). Llenar el orificio del cartílago con un gel inyectable que contenga FGF-18 dirigiría las células dentro del gel que, entonces, actuarían como soporte mecánico para el crecimiento celular y depósito de fármaco al mismo tiempo. Por esta razón, sería preferible que el FGF-18 no se liberase del gel sino que permaneciera atrapado en la matriz.

Un enfoque típico en la ingeniería hística es el confinamiento de factores de crecimiento en una matriz 3D, es decir, una estructura, que puede implantarse o inyectarse, dependiendo de las propiedades mecánicas, para asumir la forma del sitio receptor. Las características obligatorias de la estructura son biocompatibilidad y capacidad de reabsorción. Además, las estructuras deben poder proporcionar a las células al entorno ideal para crecer, proliferar y reformar el tejido dañado. Idealmente, la matriz debería parecerse a las mismas propiedades mecánicas del tejido original y debería presentar una microporosidad capaz de albergar células madre (poros interconectados con un tamaño suficiente) (Tessmar y Gopferich, 2007).

Los hidrogeles son redes tridimensionales de cadenas de polímeros hidrófilos capaces de absorber y retener grandes cantidades de agua. Su característica principal es que pueden hincharse o encogerse pero no disolverse en medios acuosos. Por lo tanto, es posible atrapar en su matriz una molécula activa (ingrediente farmacéutico activo, es decir, API) que luego se libera o retiene lentamente, dependiendo de la presencia de interacciones específicas entre la matriz y el API (Lo Presti et al., 2011). La ventaja del uso de hidrogeles inyectables para el tratamiento de un trastorno del cartílago es la posibilidad de inyectar la estructura por artroscopia en ausencia del cartílago, sin necesidad de ninguna intervención quirúrgica invasiva utilizando estructuras sólidas.

Entre los diversos hidrogeles que ya se conocen, algunas formulaciones se basan en polímeros capaces de someterse al proceso de gelificación en respuesta a un determinado estímulo físico o químico. Estos están presentes como líquidos inyectables viscosos que, una vez inyectados, se convierten en geles macroscópicos en respuesta a estímulos ambientales en el lugar de la inyección, como cambios de temperatura, pH o fuerza iónica. La composición de la formulación se puede afinar para obtener hidrogeles con diferentes características, como propiedades viscoelásticas, microporosidad, etc. (documento WO2008063418; Lo Presti et al., 2001; C. Dispenza et al, 2011). Otros documentos como el documento CN102600066 o Madnan et al., 2009, describen geles sensibles a la temperatura y su uso como sistemas de administración de fármacos en diversas aplicaciones.

Los hidrogeles de polímeros naturales, especialmente polisacáridos, se han utilizado ampliamente por sus ventajas únicas, tales como atoxicidad, biocompatibilidad, biodegradabilidad y abundancia. Los polímeros naturales, incluidos colágeno, gelatina, glucosaminoglucanos y sus derivados a menudo poseen una alta afinidad por las proteínas. Un gran número de biopolímeros poseen la propiedad de autoestructurarse con la variación de temperatura o iónica.

Los xiloglucanos son una clase importante de polisacáridos estructurales que se encuentran en las paredes celulares primarias de las plantas superiores. Cuando el xiloglucano está parcialmente desgalactosilado (Deg-XG), se vuelve sensible a la temperatura (termosensible): puede formar geles físicos reversibles con variaciones de temperatura en soluciones acuosas. La desgalactosilación del xiloglucano se logra con la p-galactosidasa (Rilton et al., 2011). Los xiloglucanos desgalatosilados presentan algunas ventajas sobre otros sistemas de gelificación in situ disponibles actualmente: la gelificación no requiere la presencia de cationes divalentes y no se ve afectada por la naturaleza cargada del fármaco; el gel se forma en pocos minutos, dependiendo de la concentración de polímero en la solución y de la temperatura (Shirakawa et al., 1998).

Cuando se prepara una composición farmacéutica que comprende una proteína bioactiva, dicha composición debe formularse de tal manera que la actividad de la proteína se mantenga durante un período de tiempo apropiado. Una pérdida de actividad / estabilidad de la proteína puede producir inestabilidades químicas o físicas de la proteína, principalmente debido a desnaturalización, agregación u oxidación. Por tanto, los productos resultantes pueden ser farmacéuticamente inaceptables. Aunque se sabe que el uso de excipiente(s) y/o hidrogeles aumenta la estabilidad de una proteína dada, los efectos estabilizadores de estos excipientes dependen en gran medida del polímero en los geles, de la naturaleza de los excipientes y de la proteína bioactiva en sí.

Sigue habiendo necesidad de formulaciones adicionales que contengan FGF-18 como principio activo, en donde dichas formulaciones, manteniendo la bioactividad del principio activo y siendo adecuadas para su uso en inyectables, preferiblemente para inyección intraarticular, permitan reducir el número de inyecciones necesarias para el tratamiento. Dicha característica permitiría la reducción del riesgo de infecciones y aumentaría la comodidad del paciente. Dichas formulaciones podrían ser útiles para la administración en el tratamiento de un trastorno del cartílago en un paciente, como la osteoartritis o la lesión del cartílago.

Compendio de la invención

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar una formulación líquida adecuada para inyección intraarticular que comprende o consiste en FGF-18, un xiloglucano y un amortiguador, en la que dicho xiloglucano está parcialmente desgalactosilado. También se describe en la presente memoria un hidrogel que contiene FGF-18, en donde el hidrogel es preferiblemente un hidrogel termosensible y más preferiblemente un gel de xiloglucano. La invención también proporciona métodos para preparar hidrogeles que comprenden FGF-18, partiendo de una formulación líquida según la presente invención. El hidrogel que contiene FGF-18, obtenido según el método de la invención, puede servir para la administración en el tratamiento de trastornos del cartílago, tales como osteoartritis o lesión del cartílago. También se describe en la presente memoria un hidrogel de xiloglucano, que además contiene proteína FGF-18. Se observa que antes de la inyección, o antes de someterse a una temperatura de gelificación, los hidrogeles según la invención están en forma líquida.

En la presente memoria se describe una formulación líquida que comprende o consiste en xiloglucano, un amortiguador y FGF-18 como principio activo. Esta formulación se proporciona como un sistema de gelificación en forma líquida cuando se almacena a 5°C y se convierte en un gel (o un hidrogel) a 37°C, es decir una vez inyectado en el cuerpo humano. En un primer aspecto, la invención proporciona una formulación líquida adecuada para inyección intraarticular que comprende o consiste en FGF-18, un xiloglucano y un amortiguador, en donde dicho xiloglucano está parcialmente desgalactosilado. Preferiblemente, el xiloglucano es un Deg-xiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de o aproximadamente 44 o 45% y el amortiguador es un amortiguador de fosfato, como PBS. En una realización preferida, la concentración en xiloglucano es de aproximadamente 1 a 5% en peso, preferiblemente de aproximadamente 3 a 4% en peso o incluso más preferiblemente de aproximadamente 4%, el amortiguador está en una concentración de aproximadamente 95 a 99% en peso, preferiblemente al o aproximadamente 96% en peso. Preferiblemente, FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o consiste en la forma madura de FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de SEQ ID n°: 1,2) un polipéptido que comprende o consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 196 (Lys) de SEQ ID n°: 1, y 3) un polipéptido que comprende o que consiste en SEQ ID n°: 2. Más preferiblemente, FGF-18 es esprifermina, como se define a continuación.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para preparar un hidrogel de FGF-18, que comprende las etapas siguientes:

a. preparar una formulación líquida según la invención,

b. exponer la formulación líquida ex vivo, a una temperatura de 37°C o aproximadamente 37°C para formar el gel.

en donde el xiloglucano es preferiblemente un Deg-xiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45% y el amortiguador es un amortiguador de fosfato, tal como PBS. Preferiblemente, el pH de la formulación final se mantiene en o alrededor de 5 a 8, más especialmente en o alrededor de 5,5 a 7,5, tal como en o alrededor de 5,5, 6, 6,5, 7, 7,3 o 7,5, e incluso más preferiblemente en o alrededor de 5.5 a 6. En una realización preferida, FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o consiste en la forma madura del FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de SEQ ID n°: 1, 2) un polipéptido que comprende o consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 196 (Lys) de SEQ ID n°: 1 y 3) un polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID n°: 2. Más preferiblemente, FGF-18 es esprifermina, como se define a continuación. En una realización preferida, el gel se somete a la temperatura de gelificación tras la inyección en el cuerpo humano, es decir, in situ.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un hidrogel obtenido por el método según el segundo aspecto.

En un cuarto aspecto, se describe en la presente memoria un artículo de fabricación para uso farmacéutico o veterinario, que comprende un recipiente que comprende xiloglucano, proteína FGF-18 y un amortiguador, en el que el xiloglucano es preferiblemente un xiloglucano desgalactosilado, incluso más preferiblemente un Deg-xiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45% y el amortiguador es un amortiguador de fosfato, tal como PBS. La invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente y la formulación líquida según la invención, en el que dicha formulación líquida se mantiene en dicho recipiente. Preferiblemente, FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o consiste en la forma madura de FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de SEQ ID n°: 1,2) un polipéptido que comprende o consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 196 (Lys) de SEQ ID n°: 1, y 3) un polipéptido que comprende o que consta de la SEQ ID n°: 2. Más preferiblemente, FGF-18 es esprifermina, como se define a continuación.

Definiciones

- El término "proteína FGF-18" o "FGF-18", como se usa en la presente memoria, significa una proteína que mantiene al menos una actividad biológica de la proteína FGF-18 humana. El FGF-18 puede ser natural, en su forma madura, o una forma truncada del mismo. Las actividades biológicas de la proteína FGF-18 humana incluyen eminentemente el aumento de la actividad osteoblástica (véase el documento WO98/16644) o en la formación de cartílago (véase el documento WO2008/023063).

- El FGF-18 humano natural es una proteína expresada por los condrocitos del cartílago articular. El FGF-18 humano se denominó por primera vez zFGF-5 y se describe completamente en el documento WO98/16644. La SEQ ID n°: 1 corresponde a la secuencia de aminoácidos del FGF-18 humano natural, con un péptido señal que consta de los restos de aminoácidos 1 (Met) a 27 (Ala). La forma madura del FGF-18 humano corresponde a la secuencia de aminoácidos desde el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de la SEQ ID n°: 1 (180 aminoácidos).

- El FGF-18, en la presente invención, se puede producir mediante un método biotecnológico, tal como se enseña en la aplicación. WO2006/063362. Dependiendo de los sistemas y condiciones de expresión, el FGF-18 en la presente invención se expresa en una célula anfitriona biotecnológica con una metionina de partida (resto Met) o con una secuencia señal para la secreción. Cuando se expresa en un anfitrión procariota, como en mi. coli, FGF-18 contiene un resto Met adicional en el extremo N-terminal de su secuencia. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del FGF-18 humano, cuando se expresa en E. coli, comienza con un resto Met en el término N (posición 1) seguido de los restos 28 (Glu) hasta el resto 207 (Ala) de la SEQ ID n°: 1.

- El término "forma truncada" de FGF-18, como se usa en la presente memoria, se refiere a una proteína que comprende o consiste en los restos 28 (Glu) a 196 (Lys) de la SEC ID n°: 1. Preferiblemente, la forma truncada de la proteína FGF-18 es el polipéptido denominado "trFGF-18" (170 aminoácidos), que comienza con un resto Met (en el extremo N-terminal) seguido por los restos de aminoácidos 28 (Glu) -196 (Lys) del FGF-18 natural humano. La secuencia de aminoácidos de trFGF-18 se muestra en la SEQ ID n°: 2 (los restos de aminoácidos 2 a 170 de la SEQ ID n°: 2 corresponden a los restos de aminoácidos 28 a 196 de la SEQ ID n°: 1). trFGF-18 es una forma truncada biotecnológica del FGF-18 humano, producido en E. coli (véase el documento WO2006/063362). La denominación común internacional (DCI) para esta forma particular de FGF-18 es esprifermina. Se ha demostrado que la esprifermina presenta actividades similares a las del FGF-18 humano maduro, p. ej. aumenta la proliferación de condrocitos y la deposición de cartílago que conduce a la reparación y reconstrucción de una variedad de tejidos cartilaginosos (véase el documento WO2008/023063).

- Los términos "molécula activa" o "principio activo" se refieren a un principio farmacéutico activo, es decir, API. El API preferido, en el contexto de la presente invención, es FGF-18.

- El término "gel" o "hidrogel" se emplea indistintamente en esta solicitud. Se refieren a una matriz 3D, o estructura, útil como formulación farmacéutica.

- El término "formulación líquida", como se emplea en la presente memoria, se refiere a la formulación de hidrogel antes de la inyección, ya que el gel en sí se forma solo tras la variación de temperatura, una vez administrado en el cuerpo humano.

- El término "xiloglucano" se refiere a cualquier forma de xiloglucano, es decir, una hemicelosa producida en la pared celular primaria de las plantas vasculares. Es un agente gelificante bien conocido, especialmente cuando se somete a una temperatura de aproximadamente 37°C. Una de las formas preferidas que se puede usar en el contexto de la presente invención es una forma desgalactosilada, más preferiblemente que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45%. El xiloglucano desgalactosilado se describe aquí como Deg-Xiloglucano, D-xiloglucano o Deg-XG.

- El término "amortiguador", como se emplea en la presente memoria, se refiere a soluciones de compuestos que se sabe que son seguros en formulaciones para uso farmacéutico o veterinario y que tienen el efecto de mantener o controlar el pH de la formulación en el intervalo de pH deseado para la formulación. Los tampones aceptables para controlar el pH a un pH moderadamente ácido a un pH moderadamente básico incluyen, pero no se limitan a, tampones fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS e histidina. "TRIS" se refiere a 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol, ya cualquier sal farmacológicamente aceptable del mismo. Un amortiguador preferido según la presente invención es un amortiguador fosfato, tal como por ejemplo PBS.

- El término "vial" o "recipiente", como se emplea en la presente memoria, se refiere ampliamente a un depósito adecuado para mantener la formulación en forma líquida. Los ejemplos de un vial que se puede usar en la presente invención incluyen jeringuillas, ampollas, cartuchos u otro depósito adecuado para administrar la formulación de FGF-18 al paciente mediante inyección, preferiblemente mediante inyección intraarticular. Los viales adecuados para envasar productos para administración intraarticular son bien conocidos y reconocidos en la técnica.

- La expresión "trastorno del cartílago", como se emplea en la presente memoria, abarca trastornos que resultan de daños debidos a lesión traumática o condropatía. Los ejemplos de trastornos del cartílago que pueden tratarse mediante la administración de la formulación de FGF-18 descrita en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, artritis, como osteoartritis o artritis reumatoide, y lesión del cartílago.

- El término "osteoartritis" se emplea para referirse a la forma más corriente de artritis. Puede producirse por la rotura del cartílago. Los pedazos de cartílago pueden desprenderse y causar dolor e abultamiento en la articulación entre los huesos. Con el tiempo, el cartílago puede desgastarse por completo y los huesos se frotarán entre sí. La osteoartritis puede afectar cualquier articulación, pero generalmente afecta a las manos y las articulaciones que soportan peso, como las caderas, las rodillas, los pies y la columna. En un ejemplo preferido, la osteoartritis puede ser osteoartritis de rodilla u osteoartritis de cadera. El experto en la materia conoce perfectamente las clasificaciones de la osteoartritis que se utilizan en la técnica, en particular el sistema de evaluación OARSI (véase, por ejemplo, Custers etal., 2007). La osteoartritis es uno de los trastornos del cartílago preferidos que se pueden tratar administrando las formulaciones de FGF-18 según la presente invención.

- La expresión "lesión del cartílago", como se emplea en la presente memoria, es un trastorno del cartílago o daño del cartílago que resulta eminentemente de un traumatismo. Las lesiones del cartílago pueden ocurrir como resultado de una destrucción mecánica traumática, especialmente después de un accidente o de una intervención quirúrgica. También se considera dentro de esta definición las lesiones relacionadas con el deporte o el desgaste de los tejidos de la articulación relacionado con el deporte.

- El término "pg" o "mcg" se emplea indistintamente y se refiere a una división de la unidad SI por masa.

Descripción detallada de la invención

En la presente memoria se describe una formulación de gel de xiloglucano (o hidrogel) que comprende o consiste en un xiloglucano, una proteína FGF-18 y un amortiguador. Dicho hidrogel que está en forma líquida antes de la inyección in situ, o antes de exponerse a la temperatura de gelificación.

El objeto principal de la invención es una formulación líquida adecuada para inyección intraarticular que comprende o consiste en FGF-18, un xiloglucano y un amortiguador, en el que dicho xiloglucano está parcialmente desgalactosilado.

En una realización preferida, el xiloglucano es un Deg-xiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45% y el amortiguador es un amortiguador fosfato, tal como PBS.

Dicha formulación líquida (o hidrogel) es adecuada para inyectables en el cartílago. Preferiblemente, la proteína FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o consiste en la forma madura del FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de la SEQ ID n°: 1,2) un polipéptido que comprende o consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 196 (Lys) de SEQ ID n°: 1, y 3) un polipéptido que comprende o consiste en la SEQ ID n°: 2. Más preferiblemente, FGF-18 es esprifermina.

La ventaja del uso de hidrogeles inyectables es la posibilidad de inyectar la estructura (o el componente de la estructura; estando dicha estructura en forma líquida antes de ser expuesto a la temperatura de gelificación), conteniendo ya FGF-18, en la ausencia de cartílago, sin necesidad de ninguna intervención quirúrgica invasiva utilizando estructuras sólidas. Preferiblemente, la inyección se realiza por artroscopia.

Como se describe en la presente memoria, los hidrogeles descritos en la presente memoria se forman in situ, tras la inyección.

En la presente memoria se describe el uso de soluciones poliméricas líquidas (o formulaciones líquidas) que son capaces de sufrir un proceso de gelificación, una vez administradas al paciente, debido a variaciones de temperatura.

Se observa que la formulación líquida y el hidrogel, en el contexto de esta invención, se refieren a la misma formulación. Sin embargo, la formulación líquida se refiere especialmente a la forma de la formulación antes de la gelificación, mientras que el hidrogel se refiere a la misma formulación pero que se ha sometido al proceso de gelificación. Por tanto, los componentes de ambas formulaciones son los mismos.

La concentración de FGF-18 en la formulación líquida (o en el hidrogel) según la invención está preferiblemente comprendida entre 1 ng/ml y 600 mcg/ml o aproximadamente, preferiblemente entre 0,001,0,006, 0,01,0,1, 1 ,5 ,6 ,5 , 10, 20, 30, 40, 50, 54, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o 300, 540 mcg/ml o aproximadamente. Más preferiblemente, el FGF-18 está en una concentración de 0,1 a 100 mcg/ml o aproximadamente, incluso más preferiblemente de 0,1 a 54 mcg/ml o aproximadamente.

El componente de gelificación, es decir el xiloglucano, en la formulación líquida o en el hidrogel según la invención, está en una concentración de aproximadamente 1 a 5% en peso, preferiblemente de 2 a 4% en peso o aproximadamente, incluso preferiblemente de 3 o 4% en peso o aproximadamente. Preferiblemente, dicho xiloglucano es un Deg-xiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45%. La ventaja específica de dicho Deg-xiloglucano es que el gel soluble de transición está a alrededor de 37°C, es decir, la temperatura del cuerpo humano, mientras que el gel-sol de transición está a alrededor de 70°C. Por lo tanto, una vez que el gel se forma en el cuerpo humano, permanece en estado de gel; no hay riesgo de que vuelva al estado soluble.

El amortiguador, tal como PBS, está en 95-99% en peso o aproximadamente, más preferiblemente en 96-97% en peso o aproximadamente.

En una realización preferida, la formulación líquida o el hidrogel (ya que la formulación líquida forma un hidrogel una vez inyectado en el cuerpo humano) que comprende o consiste en FGF-18 en 0,1-100 mcg/ml o aproximadamente, xiloglucano al 3 o 4% en peso, el amortiguador al 96 o 97% en peso. Preferiblemente, la relación entre el polímero (es decir, xiloglucano) y FGF-18 está entre 20:1 y 1:1, más preferiblemente de 9:1.

Una vez mezclados, las concentraciones finales de cada componente son preferiblemente las siguientes:

- FGF-18: de 0,00001 a 0,6% en peso, tal como 0,0054% en peso;

- Xiloglucano: de 1 a 5% en peso, tal como 3 o 4% en peso;

- Amortiguador: de 95 a 99% en peso, tal como 96 o 97% en peso.

En una realización preferida, el pH de la formulación final se mantiene de 5 a 8 o aproximadamente, más especialmente de 5,5 a 7 o aproximadamente, tal como de 5,5, 6, 6,5, 7, 7,3 o 7,5 o aproximadamente, e incluso más preferiblemente de 5,5 a 6 o aproximadamente.

La invención proporciona además un método para preparar un hidrogel de FGF-18, que comprende las etapas siguientes:

a. preparar una formulación líquida según la invención,

b. exponer la formulación líquida ex vivo, a una temperatura de 37°C o aproximadamente 37°C para formar el gel.

en donde el xiloglucano es preferiblemente un xiloglucano desgalactosilado, incluso más preferiblemente un Degxiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45% y el amortiguador es un amortiguador fosfato, tal como PBS. Preferiblemente, el pH de la formulación final se mantiene en de 5 a 8 o aproximadamente, más especialmente de 5,5 a 7 o aproximadamente, tal como de 5,5, 6, 6,5, 7, 7,3 o 7,5 o aproximadamente, e incluso más preferiblemente de 5,5 a 6 o aproximadamente. En una realización preferida, FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o consiste en la forma madura del FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de la SEQ ID n°: 1,2) un polipéptido que comprende o consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 196 (Lys) de la SEQ ID n°: 1 y 3) un polipéptido que comprende o consiste en la SEQ ID n°: 2. Más preferiblemente, FGF-18 es esprifermina, como se define a continuación. En una realización preferida, la formulación líquida se somete a la temperatura de gelificación tras la inyección en el cuerpo humano, es decir, in situ, formando así un gel (o hidrogel).

Preferiblemente, la relación entre el polímero (es decir, xiloglucano) y FGF-18 está entre 20:1 y 1:1, más preferiblemente de 9:1. Cada uno de los compuestos (es decir, FGF-18, xiloglucano y el amortiguador) se puede usar según cualquiera de las concentraciones, pH y/o relaciones descritas anteriormente.

En un tercer aspecto, se describe en la presente memoria un artículo de fabricación para uso farmacéutico o veterinario, que comprende un recipiente que comprende o consiste en la formulación líquida según la invención. Dicha formulación líquida comprende o consiste en un xiloglucano, una proteína FGF-18 y un amortiguador, en donde el xiloglucano es preferiblemente un xiloglucano desgalactosilado, incluso más preferiblemente un Deg-xiloglucano que tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45%, y el amortiguador es un amortiguador de fosfato, como PBS. La invención proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente y la formulación líquida según la invención, en el que dicha formulación líquida se mantiene en dicho recipiente. Preferiblemente, FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en: 1) un polipéptido que comprende o consiste en la forma madura de FGF-18 humano, correspondiente a la secuencia que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 207 (Ala) de la SEQ ID n°: 1,2) un polipéptido que comprende o consiste en una forma truncada de FGF-18 humano que comprende o consiste en el resto 28 (Glu) al resto 196 (Lys) de la SEQ ID n°: 1, y 3) un polipéptido que comprende o que consiste en la SEQ ID n°: 2. Más preferiblemente, FGF-18 es esprifermina, como se define a continuación. Preferiblemente, la relación entre el polímero (es decir, xiloglucano) y FGF-18 está comprendida entre 20:1 y 1:1, más preferiblemente de 9:1. Cada uno de los compuestos (es decir, FGF-18, xiloglucano y el amortiguador) puede usarse según cualquiera de las concentraciones descritas en la presente memoria.

La presente invención se refiere además a un hidrogel obtenido según el método según la invención.

También se describe un material de envasado que proporciona instrucciones para formar el hidrogel según la presente invención, preferiblemente in situ.

La formulación líquida, capaz de formar el hidrogel de la invención, puede almacenarse durante al menos aproximadamente 12 meses a aproximadamente 24 meses. En condiciones de almacenamiento preferidas, antes del primer uso, las formulaciones se mantienen alejadas de la luz brillante (preferiblemente en la oscuridad), preferiblemente a temperatura refrigerada (a 2-8°C o aproximadamente).

La presente invención proporciona formulaciones líquidas o hidrogeles que comprenden FGF-18, en especial para un solo uso, adecuados para uso farmacéutico o veterinario. Las formulaciones líquidas o hidrogeles (ya que las formulaciones líquidas son capaces de formar un hidrogel cuando se exponen a una temperatura de gelificación) que comprenden FGF-18, según la presente invención, se pueden usar para la administración para mejorar la reparación del cartílago o para el tratamiento de trastornos del cartílago, como la osteoartritis o las lesiones del cartílago. Estas formulaciones líquidas, o hidrogeles, son adecuadas para su uso en inyecciones y sistemas de administración alternativos. En una realización especialmente preferida, las formulaciones de la invención son para inyección intraarticular. Pueden administrarse mediante inyección directa en el defecto, en el que el gel se forma preferiblemente in situ. En una realización preferida de la presente invención, la administración intraarticular se realiza en una articulación seleccionada entre la articulación de la cadera, rodilla, codo, muñeca, tobillo, columna, pies, dedos de las manos, dedos del pie, mano, hombro, costillas, omóplatos, muslos, espinillas, talones ya lo largo de los puntos óseos de la columna. En otra realización preferida más, la administración intraarticular se realiza en la articulación de la cadera o la rodilla.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar más la preparación de las formulaciones líquidas y los hidrogeles de la invención. El alcance de la invención no se debe interpretar que consiste simplemente en los ejemplos siguientes.

Descripción de las figuras:

Figura 1: (a) Viscosidad por cizalladura frente a velocidad de cizalladura y (b) velocidad de cizalladura frente a esfuerzo cortante para sistemas Deg-XG preparados en agua.

Figura 2: Viscosidad por cizalladura frente a velocidad de cizalladura para sistemas Deg-XG preparados en D-PBS.

Figura 3: Mediciones de la viscosidad por cizalladura para (a) Deg-XG al 3% en peso cargado con FGF-18; (b) Deg-XG 4% en peso en D-PBS cargado con FGF-18, después de diferentes tiempos de incubación a 25°C.

Figura 4: Mediciones de barrido de tiempo a 25°C y 1 Hz, para Deg-XG 4,4% en peso y Deg-XG 4% en peso cargado con FGF-18 a 54 mcg/ml en D-PBS.

Figura 5: Efecto de esterilización en autoclave en sistemas Deg-XG/agua (4 y 5% en peso) sobre la viscosidad por cizalladura.

Figura 6: (a) Efecto de esterilización en autoclave sobre la viscosidad por cizalladura de los sistemas Deg-XG/D-PBS (3,3, 4,4, 5,5% en peso); (b) Comparación entre los sistemas Deg-XG/Agua (4 y 5% en peso) y Deg-XG/D-PBS (4,4 y 5,5% en peso), ambos esterilizados en autoclave.

Figura 7: Gráficos de barrido de deformación para sistemas Deg-XG/agua (a) después de 5 minutos y (b) después de 30 minutos de incubación a 37°C.

Figura 8: Gráficos de barrido de deformación para sistemas Deg-XG/D-PBS (a) 3% en peso con y sin FGF-18; (b) 4% en peso con y sin FGF-18; (c) 5% en peso con y sin FGF-18.

Figura 9: Gráficos de barrido de frecuencia para sistemas Deg-XG/agua (a) incubados durante 5 minutos a 37°C; (b) incubados 30 minutos a 37°C.

Figura 10: Gráficos de barrido de frecuencia para sistemas Deg-XG/D-PBS con (a) 3% en peso con y sin FGF-18, (b) 4% en peso con y sin FGF-18, (c) 5% en peso con y sin FGF-18.

Figura 11: G' y G" a 1 Hz frente al tiempo para los sistemas Deg-XG/agua.

Figura 12: Efecto de congelificación-descongelificación en el sistema Deg-XG/D-PBS 4,4% en peso.

Figura 13: Deg-XG liofilizado y reconstituido al 4,4% en peso en D-PBS, tanto en forma de sol como de gel. Figura 14: Gráficos de barrido de frecuencia para muestras frescas y erosionadas: (a) Deg-XG al 4% en peso cargado con FGF-18 a 540 gm/ml; (b) Deg-XG al 4% en peso cargado con FGF-18 a 54 gm/ml; (c) Deg-XG al 5% en peso cargado con FGF-18 a 540 gm/ml; (d) Deg-XG al 5% en peso cargado con FGF-18 a 54 gm/ml. Figura 15: Ensayo de proliferación celular con reactivo Alamar Blue (eje X: tiempo de incubación (días). Eje Y: viabilidad celular). Muestra los resultados del ensayo Alamar Blue (5000 condrocitos/pocillos) para la proliferación celular realizada con condrocitos cultivados en muestras de hidrogel Deg-XG (al 3,3% en peso), descargadas (referencia) o cargadas con FGF-18 en tres concentraciones diferentes: 54 mcg/ml, 6,7 mcg/ml, 6,7 ng/ml. Figura 16: Tinción con naranja de acridina de condrocitos cultivados durante 12 días en Deg-XG (arriba a la izquierda); Deg-XG FGF-18 a 6,7 ng/ml (arriba a la derecha); Deg-XG FGF-18 a 6,7 gg/ml (abajo a la izquierda); Deg-XG FGF-18 a 54 gg/ml (abajo a la derecha).

Figura 17: Secuencia de FGF-18 humano, correspondiente a la SEQ ID n°: 1 (a) y secuencia de esprifermina correspondiente a la SEQ ID n°: 2 (b).

Descripción de las secuencias:

SEQ ID n° 1: Secuencia de aminoácidos del FGF-18 humano natural.

SEQ ID n° 2: Secuencia de aminoácidos del FGF-18 truncado biotecnológico (trFGF-18 o esprifermina).

Ejemplos

Materiales

El FGF-18 truncado biotecnológico (trFGF-18 o esprifermina) de los presentes ejemplos se ha preparado internamente mediante expresión en E. coli, según la técnica descrita en la solicitud WO2006/063362. En los ejemplos siguientes, esprifermina y FGF-18 se usan indistintamente. Otras sustancias principales utilizadas en los ejemplos son las siguientes:

- Xiloglucano de semillas de tamarindo se adquirió en Megazyme International (Irlanda). Se desgalactosió según un protocolo descrito por Rilton. et al., 2011.

- BSA, HSA y Poloxamer F68 se adquirieron en Sigma Aldrich.

- Penicilina Estreptomicina (Pen-Strep) y Dulbecco PBS 10x se adquirieron en Gibco.

- Quitosano 75% DD HMW, Sigma Aldrich 419419,

- Quitosano 95% DD LMW, Faravelli 43000,

- Quitosano 95% DD HMW, Heppe medical 24711.

Se realizaron caracterizaciones cualitativas en soluciones de una variante desgalactosilada de xiloglucano (Deg-XG) con el fin de realizar un cribado rápido inicial de diferentes formulaciones. En particular, estas caracterizaciones fueron ensayos de inyectabilidad a temperatura ambiente y ensayos de comportamiento basculante a 37°C. En sistemas seleccionados también se realizaron caracterizaciones y experimentos adicionales, también en presencia de FGF-18, en su caso.

Para distinguir claramente en este apartado entre la formulación antes y después del proceso de gelificación, la primera se ha denominado "solución líquida" y la última "gel", respectivamente.

Métodos

Preparación de soluciones de FGF-18

FGF-18 a 5,41 mg/ml se almacena a -80°C en viales individuales de 3 ml y, después de fundirse a temperatura ambiente, se añade directamente a la solución de polímero (en una relación de 9:1 entre la solución de polímero y FGF-18) para alcanzar la concentración final objetivo de 540 mcg/ml o diluido con la "mayor parte de proteína" para alcanzar la concentración final objetivo de 54 mcg/ml antes de la adición a la solución de polímero.

La "mayor parte de proteína" es una solución de PBS a pH 7,3 preparada a partir de Na²HPÜ⁴ (7 mM), KH² PO⁴ (1 mM) y KCl (2,7 mM). La fuerza iónica de este amortiguador es de aproximadamente 25 mM.

Preparación de disolventes de polímeros y medios de liberación (líquidos sinoviales simulados modificados):

Tipo I (también denominado D-PBS): Dulbecco PBS 10x, diluido diez veces con agua Millipore, 0,1% en peso de Pen-Strep; pH 5,5. La fuerza iónica del D-PBS 1x es de aproximadamente 166 mM y su composición es la siguiente: CaCl² (0,9 mM), MgCl² (0,49 mM), KCI (2,66 mM), KH² PO⁴ (1,47 mM), NaCl (137,9 mM), Na²HPO⁴ (8,06 mM). Tipo II: como Tipo I con 0,1% en peso de BSA.

Tipo III: como la "mayor parte de proteína" con 0,25 g/l de Poloxamer, 1% en peso de Pen-Strep y 1% en peso de HSA; pH 7,3.

Protocolo de carga FGF-18

Para las soluciones de Deg-XG, preparadas en disolvente Tipo I (D-PBS) o PBS pH 7,3 (preparado como la "la mayor parte de proteína), la concentración de polímero se incrementó en un 10% para tener la misma concentración final de polímero que cuando se cargan los sistemas con soluciones de FGF-18 en una relación en peso de 9:1.

La solución de proteína se cargó lentamente con una jeringuilla, con la aguja moviéndose alrededor de la muestra para asegurar una distribución uniforme. El gel cargado se almacenó siempre a 5°C, durante la noche, sin agitar antes de su uso.

Soluciones poliméricas: preparación y almacenamiento

Se prepararon soluciones de Deg-XG tanto en agua Millipore como en disolvente de Tipo I, pH 5,5. También se preparó una solución de Deg-XG al 4,4% en peso en la "mayor parte de proteína", a pH 7,3.

El procedimiento de disolución es el siguiente:

• Adición de polímero sólido a agua fría o PBS frío a la concentración deseada;

• Homogeneización durante 5 h a 5°C y 13.500 rpm;

• Esterilización en autoclave a 120°C durante 20 minutos;

• Conservación a 5°C.

Durante el trabajo de preformulación se mezcló quitosano con otros excipientes para obtener soluciones acuosas con una osmolalidad aceptable para entre otros, inyecciones (objetivo: 350 mOsm/Kg). A continuación, se ensayaron las soluciones líquidas para determinar su tiempo y temperatura de gelificación.

Ensayos de inyectabilidad, viscosidad por cizalladura y comportamiento de balanceo

Inyectabilidad: La inyectabilidad se probó a temperatura ambiente inyectando 1 ml con una jeringuilla con una aguja G25. Se evaluaron el tiempo de inyección y la cantidad residual en la jeringuilla.

Viscosidad por cizalladura: Se hicieron mediciones de la viscosidad por cizalladura a 25°C con un reómetro Ar 1000 (TA Instruments).

Ensayos de comportamiento de balanceo: Se incubaron 2-3 ml de solución a 37°C en tubos cilíndricos transparentes y se observaron después de diferentes tiempos. Los tubos se balancearon para evaluar si el material era similar a un líquido ("flujo”) o similar a un gel ("sin flujo”).

Reometría dinámica de esfuerzos mecánicos

Se evaluaron las propiedades dinámico-mecánicas de los geles Deg-XG mediante experimentos de cizalladura de pequeña amplitud (tensión controlada). Los Ensayos se realizaron utilizando un reómetro de tensión controlada Ar 1000 (TA Instruments) con una geometría de placa acrílica (diámetro 4 cm) y un espacio de 500 pm.

• Los ensayos de barrido de deformación se realizaron a una frecuencia de 1 Hz, mientras que los ensayos de barrido de frecuencia se realizaron a 4.10^-3 de deformación. Los ensayos de barrido de deformación y barrido de frecuencia se realizaron después de 5 y 30 minutos de incubación a 37°C.

• Se estudió la cinética de gelificación a 37°C con ensayos de barrido de frecuencia repetidas a 4.10^-3 de deformación.

• Se estudió la cinética de gelificación a 25°C con ensayos de barrido de tiempo a una frecuencia fija de 1 Hz y una deformación de 4.10^-3.

Microscopía SEM

Se obtuvieron imágenes de la morfología de la superficie mediante un sistema de microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (FESEM) (JEOL) a un voltaje de aceleración de 10 kV. Las muestras para FESEM se recubrieron con una capa de oro con un recubridor de oro JFC-1300 (JEOL) durante 50 s a 30 mA antes del barrido. Se montaron muestras liofilizadas sobre manguitos de aluminio SEM por medio de una capa adhesiva de grafito.

Estudios de abultamiento-erosión

Para estudios preliminares con geles Deg-XG preparados en agua, se colocaron muestras de gel (4-6 para cada sistema) en viales de vidrio cilíndricos pesados previamente con fondo poroso (vidrio sinterizado de porosidad G0/G1), sumergidas en un gran exceso de medio de liberación tipo I y se colocaron en un termostato a 37°C. Para los geles Deg-XG cargados con FGF-18, las muestras de geles se colocaron en las inserciones pesadas previamente de una placa de pocillos múltiples con una membrana porosa (0,4 pm) en la parte inferior, se sumergieron en el medio de liberación tipo II y se colocaron en un termostato ajustado a 37°C. Se proporcionó agitación orbital a 100 rpm. El medio de liberación se cambió cada 2-3 días. Las muestras de gel se pesaron antes de la incubación y después de diferentes tiempos de incubación a 37°C. Ws(t) es el peso de la muestra hinchada en el momento t y Ws (0) es el peso de la muestra en el tiempo = 0.

Estudios de erosión- liberación

Para el estudio de liberación, realizado en 4% en peso de Deg-XG preparado en PBS a pH 7,3 (como la "mayor parte de proteína") y cargado con FGF-18, las muestras de gel se colocaron en las inserciones pesadas previamente de placas de pocillos múltiples con una membrana porosa (0,4 pm) en el fondo, se sumergieron en el medio de liberación tipo III y se colocaron en un agitador orbital a 37°C. Los sistemas sometidos a este ensayos (4 muestras para cada uno) fueron:

• Deg-XG 4% en peso;

• Deg-XG 4% en peso cargado con FGF-18 a 540 pg/ml;

• Deg-XG 4% en peso cargado con FGF-18 a 54 pg/ml.

El medio de liberación se cambió después de 24 horas, 48 horas y luego cada 3-4 días. Las fases receptoras recogidas después de 24 horas, 48 horas y 7 días se sometieron a análisis Biacore y RP-HPLC.

Estudio de liberación in vitro

Las mismas muestras utilizadas para los ensayos de abultamiento se analizaron también para los ensayos de liberación in vitro. En particular, las fases recogidas se analizaron por HPLC. Las muestras seleccionadas también se analizaron por Biacore (datos no mostrados).

Ejemplo 1: Sistemas de gelificación sensibles a la temperatura basados en DEG-XG

Se prepararon soluciones de Deg-XG en agua al 1, 2, 3, 4, 5% en peso. Se prepararon Deg-XG en D-PBS al 3,3% en peso y al 4,4% en peso y también se cargaron con FGF-18 a 54 pg/ml. Todos los sistemas se sometieron a ensayos de inyectabilidad después del almacenamiento a 5°C durante la noche (tiempo = 0) y después de 1, 2 y 3 h de incubación adicional a 37°C.

Inyectabilidad (Tablas 1 y 2). El tiempo para inyectar un volumen dado (1 ml) de solución de polímero aumenta con la concentración de polímero. La cantidad residual en la jeringuilla está entre el 5-8% hasta una concentración del 4% en peso, mientras que aumenta significativamente a aproximadamente el 15% para el 5% en peso. La presencia de FGF-18 no afecta significativamente al comportamiento de ambos sistemas caracterizados (3 y 4% en peso). Tras el almacenamiento a 25°C, la cantidad residual en la jeringuilla solo aumenta después de 4 h para el sistema al 3% en peso, mientras que para el sistema al 4% en peso, la cantidad residual en la jeringuilla aumenta más marcadamente con el tiempo de incubación a 25°C y el el tiempo de inyección casi se duplica después de 2 horas. Estos resultados sugieren que la gelificación se produce a 25°C para ambos sistemas y con diferentes cinéticas (más rápido para la mayor concentración de polímero).

Comportamiento por basculación (Tabla 1). Mientras que 4 y 5 Deg-XG% en peso se convirtieron en geles incluso antes de 5 minutos de incubación a 37°C, las soluciones menos concentradas se convirtieron en geles no antes de 30 minutos de incubación. Para el 1% en peso no se observó gelificación macroscópica.

Mediciones de viscosidad por cizallamiento (comportamiento de flujo a 25°C). Los resultados de los geles Deg-XG preparados en agua y esterilizados en autoclave se muestran en la Fig. 1 (a-b). La viscosidad por cizallamiento aumenta con la concentración de polímero y el comportamiento no newtoniano se vuelve más pronunciado.

Se ha comprobado la viscosidad por cizallamiento frente a la velocidad de cizalladura para los sistemas Deg-XG/D-PBS (esterilizados en autoclave) (Fig. 2). De manera similar, la viscosidad por cizalladura aumenta con la concentración de polímero y el comportamiento no newtoniano se vuelve más pronunciado. Se repitieron las mediciones para el 3 y 4% en peso en presencia de FGF-18 después de diferentes tiempos de incubación a 25°C: 1, 2 y 4 horas (Figura 3). Como era de esperar, la viscosidad por cizalladura en el intervalo de velocidad de cizalladura baja aumenta progresivamente con el tiempo de incubación a 25°C y la pendiente de la curva también aumenta. Estos resultados apoyan la hipótesis de una modificación progresiva de los materiales hacia la gelificación ya a 25°C.

Este comportamiento se confirma aún más mediante un estudio cinético realizado mediante un ensayo de barrido de tiempo a una frecuencia fija de 1 Hz en Deg-XG/D-PBS al 4,4% en peso y cargado con FGF-18 a 54 pg/ml (4% en peso). (Fig. 4).

Influencia del tratamiento en autoclave. Los geles Deg-XG preparados en agua al 4 y 5% en peso se sometieron a mediciones de viscosidad por cizallamiento antes y después de la esterilización en autoclave. La esterilización en autoclave no afecta significativamente la viscosidad de las soluciones al 5% en peso (en el intervalo de velocidad de cizalladura investigado) en tanto que reduce la viscosidad por cizalladura a velocidades de cizalladura bajas para el 4% en peso (Figura 5). Se puede suponer que el tratamiento térmico a 120°C fue beneficioso para la disolución del polímero en agua.

Para las soluciones de Deg-XG preparadas en D-PBS, la concentración de polímero se incrementó en un 10% para tener la misma concentración final de polímero cuando estos sistemas se cargan con soluciones de FGF-18 (relación en peso de las soluciones de polímero/FGF-18 = 9:1). Las soluciones esterilizadas en autoclave muestran un ligero amarilleo con respecto a las no esterilizadas en autoclave. También para estos sistemas, la influencia del tratamiento en autoclave es más pronunciada a concentraciones más bajas (Fig. 6a). La esterilización en autoclave en presencia de D-PBS produce una reducción de la viscosidad por cizalladura con respecto a sistemas similares preparados en agua (véase la Figura 6b). De hecho, de la figura se desprende que las curvas referentes a sistemas 10% más concentrados, pero esterilizados en autoclave en presencia del amortiguador, se superponen a las del polímero menos concentrado pero esterilizados en autoclave como solución acuosa.

Ejemplo 2: Comportamiento mecánico dinámico de sistemas de gelificación sensibles a la temperatura basados en DEG-XG.

El comportamiento mecánico dinámico de los geles incubados a 37°C en diferentes momentos se investigó mediante ensayos de esfuerzo y barrido de frecuencia.

Las curvas G' de los barridos de deformación a una frecuencia de 1 Hz para sistemas de gel a base de agua, después de 5 y 30 minutos de incubación a 37°C, se muestran en la Fig. 7. G' aumenta significativamente con el aumento de concentración, aunque cuanto más elástico se vuelve el material, menor es la deformación que puede soportar antes de perder integridad (condición detectada por la abrupta disminución de G'). Los ensayos de barrido de deformación después de 30 minutos de acondicionamiento a 37°C muestran un aumento adicional general del módulo de almacenamiento y evidencian una diferencia entre los sistemas de 4 y 5% en peso de Deg-XG/agua. Se llevaron a cabo ensayos análogas en geles de D-PBS cargados con GF a 540 y 54 pg/ml y en los sistemas "placebo" (geles de D-PBS sin GF) (Fig. 8a-c).

El efecto combinado de la dilución y adición de FGF-18 está en la dirección de disminuir G'. El GF diez veces más concentrado provoca solo una ligera disminución adicional de G', por lo que la reducción observada en G' parece ser principalmente atribuible a la dilución.

Se llevaron a cabo ensayos de barrido de frecuencia en todos los sistemas a 37°C. En la fig. 9 se muestran los gráficos G', G" para los sistemas Deg-XG/agua después de 5 minutos o 30 minutos de incubación a 37°C. Todos los sistemas, excepto el 1% en peso, tienen G'>G" y G' casi invariante con la frecuencia. G "se vuelve invariante con la frecuencia solo para las concentraciones más altas. Ambas curvas G' y G" aumentan con la concentración de polímero.

También se llevaron a cabo ensayos de barrido de frecuencia en geles de D-PBS cargados con FGF-18 a 540 y 54 pg/ml y en los sistemas "placebo" (geles de D-PBS sin FGF-18) (Fig. 10 a-c).

Estos resultados confirman la disminución ya observada de G' cuando los sistemas se diluyen para ser cargados con el GF y no pueden apreciarse efectos evidentes del aumento de la concentración de FGF-18.

Ejemplo 3: Estudio de la cinética de gelificación

El estudio de la cinética de gelificación se llevó a cabo mediante barridos de frecuencia repetidos a intervalos de tiempo dados en sistemas Deg-XG/agua a 37°C. Los valores del módulo de almacenamiento y del módulo de pérdida a 1 Hz se representan en función del tiempo (Fig. 11).

Mientras que el 1% en peso del sistema Deg-XG muestra un aumento constante con el tiempo de G' y G" que primero aumentan y luego disminuyen, todos los demás sistemas muestran valores casi constantes de ambos componentes del módulo complejo en el marco de tiempo investigado. Estos resultados están también de acuerdo con la investigación preliminar cualitativa del comportamiento del flujo con ensayos de balanceo.

A la luz de las similitudes observadas entre los sistemas de D-PBS y de agua, podemos suponer que los dos tipos de geles tienen el mismo comportamiento cualitativo.

Ejemplo 4: Efectos de congelación-descongelación y liofilización

Con el fin de recopilar alguna información sobre las posibles condiciones de almacenamiento de los geles Deg-XG, en el sistema al 4,4% en peso preparado en D-PBS se investigó el efecto de un ciclo de congelación-descongelación en el espectro mecánico dinámico. Con el mismo propósito, se evaluó el efecto de la liofilización y la redisolución. En este último caso, el material se liofilizó tanto a partir del sol (a la temperatura de almacenamiento de 5°C) como del estado de gel (después del acondicionamiento a 37°C) (Figuras 12 y 13).

Tanto G' como G" aumentan después de la congelación-descongelación, mientras que el efecto de la liofilización y la redisolución en D-PBS a 5°C durante la noche sin agitar está en la dirección de una disminución tanto de G' como de G", independientemente del estado inicial del material. Ambos resultados evidencian que los procesos que favorecen la disolución de Deg-XG conducen a geles más fuertes, mientras que los procesos que favorecen la agregación de Deg-XG reducen la resistencia del gel. La disolución de Deg-XG en el medio acuoso es un parámetro crítico para la calidad de la red formada a 37°C.

Ejemplo 5: Microscopía electrónica de barrido de geles liofilizados.

Los geles Deg-XG preparados en agua, congelados rápidamente sumergiéndolos en nitrógeno líquido (dentro de un vial) y liofilizados se analizaron por microscopía electrónica de barrido (datos no mostrados). Todos los sistemas muestran una porosidad irregular, con cavidades más grandes de decenas de micrones y poros más pequeños de solo unas pocas micras. Al aumentar la concentración de polímero, el efecto predominante es reducir las dimensiones de las cavidades más grandes. Pero a pesar de la heterogeneidad inherente, la morfología de las muestras fue bastante uniforme.

Ejemplo 6: Estudios de abultamiento-erosión

Se realizó un estudio preliminar del comportamiento de abultamiento-erosión de los geles de Deg-XG/agua al 4% en peso y al 5% en peso durante una escala de tiempo de 60 días. Las muestras de gel se pesaron antes y durante la incubación a 37°C. Ws(t) es el peso de la muestra hinchada en el momento t y Ws (0) es el peso de la muestra en el tiempo t = 0 (Tabla 3). Después de 60 días, el ensayo se interrumpió debido al crecimiento de moho. Para ambos sistemas, Ws(t)/Ws(0) [%] disminuye lentamente con el tiempo. Los geles erosionados se sometieron a microscopía SEM después de congelarlos rápidamente en nitrógeno líquido y liofilizarlos (datos no mostrados). Después de la erosión, la estructura del gel no se colapsa y la porosidad se vuelve más homogénea. Además, la porosidad parece más abierta e interconectada para el sistema del 4% en peso que para el sistema del 5% en peso.

Los experimentos de abultamiento-erosión se repitieron para geles de Deg-XG/D-PBS al 4 y 5% en peso cargados con FGF-18 a 540 pg/ml y 54 pg/ml (Tabla 4). Para cada sistema Ws(t)/Ws(0) [%] disminuye lentamente con el tiempo, y comparativamente cada vez más rápidamente con respecto a los sistemas producidos en agua. Esto puede ser un efecto directo de las sales de PBS o, más probablemente, un efecto indirecto de PBS que afecta a la estructura molecular del polímero al esterilizar en autoclave. Después de 22 días de permanencia en el medio de liberación, los geles erosionados se sometieron a ensayos de barrido de frecuencia para evaluar sus propiedades mecánicas (Fig. 14 a-d).

Después de 22 días de inmersión en el medio de liberación, los geles restantes generalmente presentaban valores de módulo de almacenamiento G' y módulo de pérdida G" más altos, lo que sugiere una reordenación de la red hacia una estructura más fuerte, que es concomitante con la erosión de las partes del material menos reticuladas. Sólo Deg-XG al 5% en peso cargado con FGF-18 a 54 pg/ml mostró una tendencia opuesta.

Ejemplo 7: Estudio de la erosión del gel/liberación de proteínas

El estudio se realizó en Deg-XG al 4% en peso preparado en PBS a pH 7,3. Las fases receptoras recogidas después de 24 horas, 48 horas y 7 días se sometieron a análisis Biacore y RP-HPLC (datos no mostrados). El análisis de RP-HPLC no reveló picos cromatográficos distintos atribuibles a una liberación repentina de FGF-18. Las mismas fases receptoras se sometieron también a análisis Biacore. Asimismo, no se detectó FGF-18. Esto sugiere que la proteína está atrapada en la matriz del gel durante el período de observación.

Ejemplo 8: Ensayo de proliferación celular

8.1. Ensayo con Alamar Blue para la proliferación celular

El ensayo con Alamar Blue (5.000 condrocitos/pocillos) para la proliferación celular se llevó a cabo con condrocitos cultivados en hidrogel Deg-XG (al 3,3% en peso), descargados (referencia) o cargados con FGF-18 a tres concentraciones diferentes: 54 mcg/ml , 6,7 mcg/ml, 6,7ng/ml. Todos los sistemas, incluido el sistema de referencia (gel Deg-XG sin FGF-18), mostraron una proliferación celular significativa a lo largo del tiempo (véase la Figura 15). La presencia del factor de crecimiento no afectó la tasa de proliferación durante los primeros ocho días, mientras que la incrementó ligeramente en los periodos de incubación prolongados. No se observó influencia de la concentración de FGF-18 en el intervalo de concentración investigado para el factor de crecimiento.

8.2. Tinción con naranja de acridina para la evaluación de la apoptosis

El análisis de microscopía confocal se llevó a cabo en células cultivadas durante 12 días en hidrogeles Deg-XG cargados y descargados con FGF-18 después de teñir con naranja de acridina. Naranja de Acridina es un tinte de unión a ácidos nucleicos que penetra en las células y que emite fluorescencia verde cuando se une a ADN bicatenario y fluorescencia roja cuando se une a ADN o ARN monocatenario. Esta tinción discrimina entre células vivas (núcleos verdes) y apoptóticas (núcleos rojos). Como se muestra en la Fig. 16, los núcleos redondos de color verde indican que las células no sufrieron daño en el ADN tanto en presencia como en ausencia de FGF-18.

8.3. Estudio de microscopía óptica en función del tiempo de incubación y contenido de carga de FGF-18

Se siguió en un microscopio óptico la proliferación de condrocitos en geles Deg-XG cargados y descargados con FGF-18 durante un período de tiempo de 7 días. El contenido de carga para el factor de crecimiento osciló entre 6,7 ng/ml y 54 gg/ml. Se observó que en todos los sistemas los condrocitos formaron inicialmente grupos. Cuando los geles se cargaban con FGF-18 a concentraciones más bajas (6,7 ng/ml y 6,7 mcg/ml), después de 48 h de incubación, los condrocitos se alejaban de los grupos, colonizando otras partes de la estructura (datos no mostrados).

8.4. Estudios de invasión celular por microscopía confocal.

Se llevó a cabo un análisis de microscopía confocal de diferentes secciones tomadas de una capa de 210 gm de espesor de una muestra de hidrogel de aproximadamente 2 mm de espesor total para el sistema Deg-Xg FGF 6,7 mcg después de 4 días de incubación. Las células se tiñeron con bromuro de etidio (rojo). Los resultados muestran la presencia de condrocitos en todo el espesor del material. Dado que la siembra de células se realizó en la superficie del hidrogel, la presencia de células en diferentes posiciones a través del espesor sugiere que las células proliferantes pueden acceder a las capas internas de los geles (datos no mostrados).

Ejemplo 9: Preparación de geles de quitosano

9.1. Generalidades

Para la selección de las formulaciones de quitosano, la preparación de las soluciones líquidas de polímero utiliza tres quitosanos diferentes: 95% de grado de desacetilación (DD) con alto peso molecular (HMW), 95% de DD con bajo MW (LMW) y 75% de DD con alto MW (HMW). Se prepararon soluciones líquidas de polímero añadiendo gradualmente el quitosano a una solución de ácido acético 0,1 N con agitación vigorosa a 5°C o a 25°C. Se calculó que la cantidad de polímero tenga una concentración final de polímero en la solución líquida de polímero de 1% en peso, 1,5% en peso o 2% en peso. Una vez completamente disuelto el quitosano, se añadió una solución de KH² PO⁴ a una concentración de 10 mM, 100 mM o 500 mM en agua miliQ con agitación, para tener una concentración final en la solución líquida de polímero de 1 mM, 10 mM o 50 mM. Por último, se añadió una solución de p-Glicerofosfato (p-GP) a una concentración del 20% en peso en agua milliQ para ajustar el pH de la solución líquida final a un valor de 6,0, 6,5 o 7,0. La concentración final de p-GP en la solución líquida de polímero osciló entre el 0,5% en peso y el 7% en peso, para las formulaciones aceptadas. No siempre fue posible alcanzar el valor de pH deseado ya que era necesaria una cantidad demasiado alta de p-GP, superando el valor de osmolalidad objetivo de 350 mOsm/kg u obteniendo un gel ya a temperatura ambiente. Las soluciones líquidas de polímero, cuando procedía, se incubaron luego a 37°C hasta la formación de gel. Se midió la osmolalidad de todas las formulaciones seleccionadas, descartando las formulaciones con una osmolalidad superior a 350 mOsm/kg, es decir, formulaciones con concentraciones finales de p-GP superiores al 2,5% en peso.

9.2. Selección preliminar de formulaciones de placebo (véase la Tabla 5):

Se señala que el quitosano puede experimentar transiciones sol-gel con cambios de temperatura, pero el proceso está muy influenciado por el peso molecular del polímero (MW), su grado de desacetilación (DD), la concentración del polímero en la solución, la temperatura, el tiempo y la velocidad de mezcla durante la disolución del polímero, el pH final de la solución y la presencia de otros excipientes.

Por tanto, se requería una selección exhaustiva de las diferentes combinaciones posibles. Es de destacar que el quitosano se puede disolver en agua solo a pH ácido. Un aumento del pH provoca su agregación y precipitación. Una forma de superar este problema es el uso de p-GP para aumentar el pH mientras se mantiene el quitosano en solución.

El estudio se centró al principio en el quitosano HMW con 75% de DD. Se prepararon varias soluciones líquidas de polímero en ácido clorhídrico 0,1 N, diferenciándose para la concentración final de quitosano, de 1% p a 2,5% p, la concentración final de p-GP, de 1,6% p a 50% p (1,6, 5, 5,6, 8, 30, 50%), diferentes excipientes, a saber gelatina, glucosamina, ácido hialurónico, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, trehalosa y diferentes valores de pH finales, de 6,0 a 7,0. Se señaló que estos excipientes desempeñan un papel en la inducción de la formación de gel (Cheng et al., 2010; Schuetz et al., 2008; Yan et al., 2010).

Solo una de las formulaciones seleccionadas pudo formar un gel a 37°C después de 5 minutos de incubación a 37°C, pero la cantidad de p-GP fue superior al 8% en peso, descrito en la literatura como el límite por encima del cual se registra citotoxicidad (Ahmadi etal., 2008). Por lo tanto, todas las formulaciones siguientes se prepararon considerando esa limitación. La selección continuó cambiando a un quitosano que tenía un valor de DD más alto. Los primeros ensayos se basaron en quitosano de bajo peso molecular con 95% de DD. Las soluciones de polímero se prepararon siempre en ácido clorhídrico 0,1 N, disolviendo el polímero con agitación vigorosa a 5°C o a 25°C.

Después de la disolución completa del polímero, se agregaron los demás excipientes, agregando p-GP solo al final. El p-GP fue el responsable del aumento del valor de pH, favoreciendo luego el proceso de gelificación. Los primeros ensayos se centraron en formulaciones basadas únicamente en quitosano y p-GP en diferentes combinaciones de concentraciones relativas. Se observó que al usar altas concentraciones de quitosano (2% o 3% p) y altas concentraciones de p-GP (8% p), la formación del gel se produjo ya a temperatura ambiente, y en algunos casos también a 5°C.

Disminuyendo las concentraciones de cualquiera de los componentes, la formulación permaneció líquida, también después de una larga incubación a 37°C. Solo en un caso se registró la formación del gel, pero después de 2 horas de incubación a 37°C, tiempo demasiado largo para el propósito de este estudio. Por tanto, la adición de un excipiente era obligatoria para mejorar la formulación. Se seleccionó hidroxietilcelulosa (HEC) como el excipiente más apropiado y se llevó a cabo una selección adicional. Durante esta evaluación, la concentración de quitosano osciló entre 1,5% en peso y 2% en peso y la concentración inicial de HEC fue de 0,5% en peso, pero en estas condiciones, la solución de polímero se convirtió en un gel incluso a temperatura ambiente durante la adición de p-GP, si su concentración estaba por encima del 1,8% en peso. Se obtuvo una solución líquida capaz de convertirse en gel a 37°C después de 13 minutos de incubación con la siguiente composición: 1,5% en peso de quitosano, 0,5% en peso de HEC y 1,7% en peso de p-GP.

9.3. Optimización de la formulación (véase Tabla 5)

En el intento de mejorar esta formulación, se realizaron los siguientes ensayos manteniendo la concentración de p-GP casi constante en el valor de 1,65-1,7% en peso, la concentración de quitosano varió de 1,5% en peso a 1,8% en peso y la cantidad de HEC disminuyó gradualmente hasta un 0,1% en peso.

Se seleccionaron varias formulaciones candidatas con esta estrategia. Sin embargo, la investigación no continuó en esta dirección, ya que se descubrió que el excipiente de HEC puede contener un contaminante referido como citotóxico y, por otro lado, responsable de la modulación del proceso de gelificación en presencia de quitosano (Hoemann et al., 2007). Otros excipientes probados en los experimentos anteriores, como la gelatina o la glucosamina, no dieron resultados positivos.

Luego se inició un trabajo de cribado final, utilizando tres tipos de polímero de quitosano, que se diferencian por el peso molecular y el DD: quitosano HMW con 75% DD, quitosano HMW con 95% DD y quitosano LMW con 95% DD. También se planificó el trabajo sobre quitosano LMW con 85% de DD, pero el material no estuvo disponible antes del final del estudio. En ese trabajo se probó cada quitosano a tres concentraciones fijas, 1, 1,5 y 2% en peso, y se prepararon las soluciones de polímero para que tuvieran valores de pH finales de 6,0, 6,5 y 7,0. Con el fin de reducir la cantidad de p-GP utilizada para aumentar el valor de pH de la solución, el polímero se disolvió en ácido acético 0,1 N, en lugar del HCl 0,1 N utilizado en los experimentos anteriores. También se controló la osmolalidad de la solución final y se mantuvo por debajo del valor de ~ 350 mOsm/kg. Por tanto, se descartaron las formulaciones que requerían una cantidad demasiado alta de p-GP para alcanzar el pH deseado, lo que también conducía a un valor de osmolalidad demasiado alto. En estos ensayos de selección también se estudió la contribución de la fuerza iónica, ya que se dio cuenta de que la presencia de sales podría dar una contribución positiva al proceso de gelificación (Filion et al., 2007).

Ya que debían evitarse las sales de sodio por posibles interacciones con la proteína, se eligió KH² PO⁴ y se añadió a la solución de polímero a la concentración final de 1 mM, 10 mM o 50 mM. El quitosano con 75% de DD no dio resultados positivos y se abandonó por completo. Tampoco el quitosano HMW con 95% de DD dio resultados positivos: las concentraciones de quitosano superiores al 1% en peso requirieron una cantidad demasiado alta de p-GP para alcanzar los valores de pH fijos, excediendo el valor de osmolalidad objetivo, y las formulaciones al 1% en peso no pudieron formar un gel a 37°C. Se seleccionaron dos formulaciones candidatas con quitosano LMW que tenía 95% de DD, ya que experimentaron una transición sol-gel a 37°C, pero la preparación de estas soluciones de polímero no fue completamente reproducible. De hecho, se observó que el tiempo requerido para obtener un gel y las características físicas macroscópicas de las soluciones líquidas de polímero cambiaron significativamente, dependiendo del tiempo empleado para disolver el polímero, de la velocidad de mezclado durante la disolución del polímero y durante el mezclado de los excipientes y, por último, la temperatura y el volumen de la solución preparada.

Esta alta variabilidad en los resultados llevó a la decisión de interrumpir el estudio sobre este polímero.

Tabla 1: Datos de ensayos de inyectabilidad y comportamiento de balanceo para sistemas Deg-XG/agua

Tabla 2: Datos de inyectabilidad para Deg-XG 3% en peso y 4% en peso cargado con FGF-18 a 54 mcg/ml

Tabla 3: Datos de erosión de abultamiento para sistemas Deg-XG preparados en agua

Tabla 4: Datos de erosión de abultamiento para sistemas Deg-XG cargados con FGF-18 a 54 mcg/ml (esterilizados en autoclave)

Tabla 5: Tiempo de gelificación a 372C de formulaciones seleccionadas a base de quitosano

Referencias

1. Ellsworth et al., 2002, Osteoartritis and Cartilage, 10: 308-320.

2. Shimoaka et al., 2002, JBC 277 (9): 7493-7500

3. WO2008023063

4. WO2004032849, también publicado como US 2008/193425

5. WO2012172072

6. Ringe, J. et al. (2012) Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering, Nature Reviews Rheumatology, 8 (8): 493-498.

7. J.K. Tessmar, A.M. Gopferich, 2007, "Matrices and scaffolds for protein delivery in tissue engineering", Adv. Drug Delivery Rev.59: 274-291.

8. C. Lo Presti et al., 2011, Pulsatile protein release and protection using radiation-cross-linked polypeptide hydrogel delivery devices Reactive & Functional Polymers, 71: 155-167.

9. WO2008063418

10. C. Dispenza et al., 2011, "E-beam irradiation and UV photocrosslinking of microemulsion-laden poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) hydrogels for “in situ” encapsulation of volatile hydrophobic compounds" ", Polym. Chem., 2:192.

11. Rilton et al., 2011, " Deglatosylation of xyloglucan: effect on aggregation and conformation, as determined by time dependent static light scattering HPSEC-MALLS and viscometry". Carbohydrate Polymers 83.

12. Shirakawa et al., 1998, "Tailoring of the xyloglucan properties using an enzyme "Food Hydrocolloids 12.

13. WO98/16644

14. WO2006/063362

15. Custers et al., 2007, Osteoartritis and Cartilage, 15:1241-1248.

16. Cheng et al., 2010, Tissue Engineering 16A:695-703

17. Schuetz et al., 2008, Eur. J. Pharm.Biopharm. 68:19-25

18. Yan et al., 2010, J. Biomat. Appl. 24:625-637

19. Ahmadi et al., 2008, J. Biomed. Mater. Res. 86A:824-832.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación líquida adecuada para inyección intraarticular que comprende o consiste en FGF-18, un xiloglucano y un amortiguador, en donde dicho xiloglucano está parcialmente desgalactosilado.

2. La formulación líquida según la reivindicación 1, en donde dicho xiloglucano tiene un grado de desgalactosilación de aproximadamente 44 o 45%.

3. La formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el amortiguador es un amortiguador de fosfato.

4. La formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde FGF-18 se selecciona del grupo que consiste en:

a. un polipéptido que comprende o consiste en los restos de aminoácidos 28-207 de la SEQ ID n°: 1, b. un polipéptido que comprende o consiste en los restos de aminoácidos 28-196 de la SEQ ID n°: 1, y c. un polipéptido que comprende o consiste en la SEQ ID n°: 2.

5. La formulación líquida según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el xiloglucano está en una concentración de 3 a 4% en peso y el amortiguador está en una concentración de 96 o 97% en peso.

6. La formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la relación polímero: FGF-18 es 9:1.

7. La formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha formulación forma un hidrogel cuando se expone a una temperatura de 37°C o aproximadamente.

8. Un método para producir un hidrogel que comprende FGF-18, que comprende las etapas siguientes:

a. preparar una formulación líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,

b. exponer la formulación líquida ex vivo, a una temperatura de 37°C o aproximadamente 37°C para formar el gel.

9. Un hidrogel obtenido según el método de la reivindicación 8.

10. Un artículo de fabricación que comprende un recipiente y la formulación líquida como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha formulación líquida se mantiene en dicho recipiente.

11. La formulación líquida según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en la reparación del cartílago o para su uso en el tratamiento de trastornos del cartílago, en donde dicha formulación líquida se administra por inyección intraarticular.

12. La formulación líquida según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso según la reivindicación 11, en donde el trastorno del cartílago es osteoartritis o lesión del cartílago.