JPS59204130A - 新規プラスミノ−ゲンアクチベ−タ誘導体を含有してなる経口投与薬剤 - Google Patents
新規プラスミノ−ゲンアクチベ−タ誘導体を含有してなる経口投与薬剤Info
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- JPS59204130A JPS59204130A JP58074887A JP7488783A JPS59204130A JP S59204130 A JPS59204130 A JP S59204130A JP 58074887 A JP58074887 A JP 58074887A JP 7488783 A JP7488783 A JP 7488783A JP S59204130 A JPS59204130 A JP S59204130A
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- urokinase
- plasminogen activator
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- polyethylene glycol
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は化学修飾されたブラスミノーゲンアクチベータ
を含有してなる医薬品の経口投与への適用に関する。特
に、プラスミノーゲンアクテペータのアミノ酸側鎖に、
カップリング剤を介して、置換基としてアルキル基また
線アルカノイル基を含有していてもよい分子量２００〜
２０，０００のポリアルキレングリコールが結合してな
る新規プラスミノーゲンアクチベータ誘導体を含有する
経口血栓溶解剤ならびに経口血栓形成阻止剤に関する。
を含有してなる医薬品の経口投与への適用に関する。特
に、プラスミノーゲンアクテペータのアミノ酸側鎖に、
カップリング剤を介して、置換基としてアルキル基また
線アルカノイル基を含有していてもよい分子量２００〜
２０，０００のポリアルキレングリコールが結合してな
る新規プラスミノーゲンアクチベータ誘導体を含有する
経口血栓溶解剤ならびに経口血栓形成阻止剤に関する。
細菌を含む生体中には、線溶酵素グラスミンを賦活化す
る物質が種々存在することが知られている。その中でも
代表的なものが腎組織で生成され、尿中に排泄されるプ
ラスミノーゲンアクチベータ、すなわちウロキナーゼで
ある。ウロキナーゼはヒト尿よりの分離・精製、組織培
養あるいは遺伝子操作などによって得られる。現在繁用
されている線溶酵素賦活化剤としては溶血性連鎖球菌由
来の蛋白およびヒト尿由来の酵素であるウロキナーゼが
あげられるが、抗原性の観点よりヒトに対して抗原性の
ないヒト尿由来のウロキナーゼが臨床上好んで使用され
ている。ヒト尿由来のウロキナーゼには、高分子量ウロ
キナーゼ（分子量５４．０００ ）と低分子量ウロキナ
ーゼ（分子１ｔ５４０００）が存在するといわれている
。また、ウロキナーゼは近年血栓溶解剤もしくは制癌剤
との併用剤として用いられその臨床使用量は年々増大し
ている。
る物質が種々存在することが知られている。その中でも
代表的なものが腎組織で生成され、尿中に排泄されるプ
ラスミノーゲンアクチベータ、すなわちウロキナーゼで
ある。ウロキナーゼはヒト尿よりの分離・精製、組織培
養あるいは遺伝子操作などによって得られる。現在繁用
されている線溶酵素賦活化剤としては溶血性連鎖球菌由
来の蛋白およびヒト尿由来の酵素であるウロキナーゼが
あげられるが、抗原性の観点よりヒトに対して抗原性の
ないヒト尿由来のウロキナーゼが臨床上好んで使用され
ている。ヒト尿由来のウロキナーゼには、高分子量ウロ
キナーゼ（分子量５４．０００ ）と低分子量ウロキナ
ーゼ（分子１ｔ５４０００）が存在するといわれている
。また、ウロキナーゼは近年血栓溶解剤もしくは制癌剤
との併用剤として用いられその臨床使用量は年々増大し
ている。
しかしながら、ウロキナーゼは酵素であるが故に、種々
の条件下で不安定であること、さらに生体内の加水分解
酵素阻害物質による阻害やウロキナーゼ自身の代謝が極
めて速いことなどから、血中半減期が短かく、大量投与
、さらに点滴による持続投与が必要であり、臨床使用時
の大きな障害となっている。
の条件下で不安定であること、さらに生体内の加水分解
酵素阻害物質による阻害やウロキナーゼ自身の代謝が極
めて速いことなどから、血中半減期が短かく、大量投与
、さらに点滴による持続投与が必要であり、臨床使用時
の大きな障害となっている。
本発明者らは先に、人由来で抗原性のないグ２スミノー
ゲンアクチベータのアミノ酸側鎖にカップリング剤を介
して、置換基としてアルキル基またはアルカノイル基を
含有していてもよい分子量２００〜２０．０００のポリ
アルキレングリコールが結合してなるプラスミノーゲ／
アクチベータ誘導体が、血栓溶解剤および血栓形成阻止
剤として有用であることを見い出し、特許出願した（特
願昭５６−１７２９０８号、特願昭−５８−４０８０５
号）。ところで、これらの化学修飾プラスミノーゲンア
クチベータは、非修飾プラスミノーゲンアクチベータに
比べて分子量が大きくなっており、経口投与による吸収
は低下するというのが一般的な予想であった。しかし、
予想外にも上記の化学修飾プラスミノーゲンアクチベー
タは経口投与による活性発現が非修飾プラスミノーゲン
アクチベータに比べて優れていることを見い出し、本発
明を完成した。
ゲンアクチベータのアミノ酸側鎖にカップリング剤を介
して、置換基としてアルキル基またはアルカノイル基を
含有していてもよい分子量２００〜２０．０００のポリ
アルキレングリコールが結合してなるプラスミノーゲ／
アクチベータ誘導体が、血栓溶解剤および血栓形成阻止
剤として有用であることを見い出し、特許出願した（特
願昭５６−１７２９０８号、特願昭−５８−４０８０５
号）。ところで、これらの化学修飾プラスミノーゲンア
クチベータは、非修飾プラスミノーゲンアクチベータに
比べて分子量が大きくなっており、経口投与による吸収
は低下するというのが一般的な予想であった。しかし、
予想外にも上記の化学修飾プラスミノーゲンアクチベー
タは経口投与による活性発現が非修飾プラスミノーゲン
アクチベータに比べて優れていることを見い出し、本発
明を完成した。
従って、本発明の目的は、プラスミノーゲンアクチベー
タのアミノ酸側鎖にカップリング剤を介して、置換基と
してアルキル基またはアルカノイル基を含有していても
よい分子量２００〜２０，０００のポリアルキレングリ
コールが結合してなる新規プラスミノーゲンアクチベー
タを含有してなる経口血栓溶解剤ならびに経口血栓形成
阻止剤を提供することにある。
タのアミノ酸側鎖にカップリング剤を介して、置換基と
してアルキル基またはアルカノイル基を含有していても
よい分子量２００〜２０，０００のポリアルキレングリ
コールが結合してなる新規プラスミノーゲンアクチベー
タを含有してなる経口血栓溶解剤ならびに経口血栓形成
阻止剤を提供することにある。
本発明でいうプラスミノーゲンアクチベータには、ウロ
キナーゼだけでなく、各種組織由来のもの、たとえば、
腎組織、血管壁、悪投 包接など由来のものが含まれる。また、これらのプラス
ミノーゲンアクチベータは、由来組織培養さらには遺伝
子操作によって得られるものも含まれ、これらのグラス
ミノーゲンアクチベータの分子量に制限されるものでも
ない。例えば、人尿由来のプラスミノーゲンアクチペー
タであるウロキナーゼとしては、高分子ウロキナーゼ（
分子１１５４，０００）、低分子ウロキナーゼ（分子量
５４ｏｏｏ）いずれも用いられるし、混合しても用いら
れる。
キナーゼだけでなく、各種組織由来のもの、たとえば、
腎組織、血管壁、悪投 包接など由来のものが含まれる。また、これらのプラス
ミノーゲンアクチベータは、由来組織培養さらには遺伝
子操作によって得られるものも含まれ、これらのグラス
ミノーゲンアクチベータの分子量に制限されるものでも
ない。例えば、人尿由来のプラスミノーゲンアクチペー
タであるウロキナーゼとしては、高分子ウロキナーゼ（
分子１１５４，０００）、低分子ウロキナーゼ（分子量
５４ｏｏｏ）いずれも用いられるし、混合しても用いら
れる。
ポリアルキレングリコールの分子量は２００〜２０．０
００のものが含まれるが、特に１、０００〜１０．００
０が好ましい。また、ポリアルキレングリコールのうち
、ポリプロピレングリコールの形態としてはＨＯ（ＯＨ
（ＯＨ５）ＣＨ２０）ｎＨの様な直鎖もしくはＯＨ，０
Ｈ２Ｃ（ＣＨ２０（ＯＨ２（３Ｈ（（！Ｈ，５）Ｏ）ｎ
Ｈ）３、Ｈ［００Ｈ（ＯＨ５）（３Ｈ２）ｎＯＯＨ（Ｃ
Ｈ２（ＯＣＨ２０Ｈ（ＯＪ））ｎＯＨ）２などの分校状
のものも含まれる。
００のものが含まれるが、特に１、０００〜１０．００
０が好ましい。また、ポリアルキレングリコールのうち
、ポリプロピレングリコールの形態としてはＨＯ（ＯＨ
（ＯＨ５）ＣＨ２０）ｎＨの様な直鎖もしくはＯＨ，０
Ｈ２Ｃ（ＣＨ２０（ＯＨ２（３Ｈ（（！Ｈ，５）Ｏ）ｎ
Ｈ）３、Ｈ［００Ｈ（ＯＨ５）（３Ｈ２）ｎＯＯＨ（Ｃ
Ｈ２（ＯＣＨ２０Ｈ（ＯＪ））ｎＯＨ）２などの分校状
のものも含まれる。
ポリアルキレングリコールは、置換基としてアルキル基
またはアルカノイル基を有していてもよい。アルキル基
としては、メチル、エチル、プロピル、ステアリル基な
どがあけられ、アルカノイル基としてはアセチル、グロ
ビオニル、ステアロイル基などがあげられる。好ましく
は、無置換あるいはメチル基置換のポリアルキレングリ
コールがあげられる。
またはアルカノイル基を有していてもよい。アルキル基
としては、メチル、エチル、プロピル、ステアリル基な
どがあけられ、アルカノイル基としてはアセチル、グロ
ビオニル、ステアロイル基などがあげられる。好ましく
は、無置換あるいはメチル基置換のポリアルキレングリ
コールがあげられる。
ポリアルキレングリコールとプラスミノーゲンアクチペ
ータを結合させるためのカップリング剤としては、修飾
しようとするプラスミノーゲンアクチベータのアミノ酸
側鎖と化学的に反応しうるもの例えば、アシルアジド、
ハロゲン化シアヌル、ｐ−ジアゾニウムベンジルエーテ
ル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロ
キシプロピルエーテル、ジハロゲノ無水コハク酸などが
あげられる。
ータを結合させるためのカップリング剤としては、修飾
しようとするプラスミノーゲンアクチベータのアミノ酸
側鎖と化学的に反応しうるもの例えば、アシルアジド、
ハロゲン化シアヌル、ｐ−ジアゾニウムベンジルエーテ
ル、３−（ｐ−ジアゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロ
キシプロピルエーテル、ジハロゲノ無水コハク酸などが
あげられる。
すなわち、これらのカップリング剤を介してポリアルキ
レングリコールとプラスミノーゲンアクチベータとの結
合形態としては、次のような形態である。
レングリコールとプラスミノーゲンアクチベータとの結
合形態としては、次のような形態である。
ＦＡＧ −０ＣＯＯＨ２ＣＨ２ＣＯ−ＰＡ（ここで、Ｆ
ＡＧはポリアルキレングリコール残基を、Ｘはハロゲン
原子を、ＦＡはプ２スミノーゲンアクチベータ残基を示
伊）本発明の経口薬剤の有効成分である新規プラスミノ
ーゲンアクチベータ誘導体は、置換基としてアルキル基
またはアルカノイル基を含有していてもよい分子量２０
０〜２代０００のポリアルキレングリコールとカップリ
ング剤との結合物をプラスミノーゲンアクチベータと反
応させることにより製造される。
ＡＧはポリアルキレングリコール残基を、Ｘはハロゲン
原子を、ＦＡはプ２スミノーゲンアクチベータ残基を示
伊）本発明の経口薬剤の有効成分である新規プラスミノ
ーゲンアクチベータ誘導体は、置換基としてアルキル基
またはアルカノイル基を含有していてもよい分子量２０
０〜２代０００のポリアルキレングリコールとカップリ
ング剤との結合物をプラスミノーゲンアクチベータと反
応させることにより製造される。
ここで、ポリアルキレングリコールとカップリング剤の
結合物としては、ポリアルキレングリコール−４，６−
ジクロロ−１，３，５−トリアジン、ポリアルキレング
リコール−４，６−ジフルオロ−１，３，５−）リアジ
ン、ポリアルキレングリコール−４−クロロ−６−ヒド
ロキシ−１，５，５−）リアジン、ポリアルキレングリ
コール−β−（フロモカルボニル）−モノグロビオネー
ト、ポリアルキレングリコール−アジドカルボニルメチ
ルエーテル、ポリアルキレングリコール−５−（ｐ−ジ
アゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエー
テル、ポリアルキレングリコール−（ｐ−ジアゾニウム
ベンジル）エーテルなどがあげられる。
結合物としては、ポリアルキレングリコール−４，６−
ジクロロ−１，３，５−トリアジン、ポリアルキレング
リコール−４，６−ジフルオロ−１，３，５−）リアジ
ン、ポリアルキレングリコール−４−クロロ−６−ヒド
ロキシ−１，５，５−）リアジン、ポリアルキレングリ
コール−β−（フロモカルボニル）−モノグロビオネー
ト、ポリアルキレングリコール−アジドカルボニルメチ
ルエーテル、ポリアルキレングリコール−５−（ｐ−ジ
アゾニウムフェノキシ）−２−ヒドロキシプロピルエー
テル、ポリアルキレングリコール−（ｐ−ジアゾニウム
ベンジル）エーテルなどがあげられる。
ポリアルキレングリコール−カップリング剤結合物とグ
ラスミノーゲンアクチベータとのｌｉ応は、プラスミノ
ーゲンアクチベータの酵素活性の低下が少ない条件を選
ばなければならない。すなわち、バッファー等の水溶液
中で、０℃〜室温等の低温で行なうのが好ましい。反応
時間は、数分〜５時間が好ましい。
ラスミノーゲンアクチベータとのｌｉ応は、プラスミノ
ーゲンアクチベータの酵素活性の低下が少ない条件を選
ばなければならない。すなわち、バッファー等の水溶液
中で、０℃〜室温等の低温で行なうのが好ましい。反応
時間は、数分〜５時間が好ましい。
バッファーのｐＨは、グラスミノーゲンアクチベータの
酵素活性が低下しない範囲、すなわち２〜１０、特に５
〜９が好ましいが、カップリング剤の反応性によっても
変化する。
酵素活性が低下しない範囲、すなわち２〜１０、特に５
〜９が好ましいが、カップリング剤の反応性によっても
変化する。
ポリアルキレングリコール−カップリング剤の結合物の
試薬濃度を変化させることにより、グラスミノーゲンア
クチベータのアミノ酸側鎖の修飾耽を変化させることが
できる。例えげ、平均分子量ｓ、ｏｏｏのモノメチルエ
ーテルポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−１
，５，５−）リアジンの試薬濃度を（１４ｍＭ、４０ｍ
Ｍまたは６．０ ｍＭと変化させて、ｐ Ｈ７，０にお
いて高分子ウロキナーゼと反応させて得られた新規ウロ
キナーゼ誘導体について未修飾リジン残基を２．４．６
−ドリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いて定
量した。これより、修飾度を検討したとこ７）、２，４
．６−）リニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムと反応
するりジン残基中、［１４ｍＭの場合が修飾率６〜７
Ｔｏ Ｘ ４− Ｏｍ Ｍの場合が約４０％、＆ＯｍＭ
の場合が約６０チであった。また、これら反応成績体の
分子量を８Ｄｆ３ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いて測定したところ、平均分子量は［Ｌ４ｍＭの場合は
約６０，０００．４− Ｏｍ Ｍの場合は約１２０，０
００であり、ここに得られた知見は前述のりジン残基の
定量の結果とほぼ一致した。
試薬濃度を変化させることにより、グラスミノーゲンア
クチベータのアミノ酸側鎖の修飾耽を変化させることが
できる。例えげ、平均分子量ｓ、ｏｏｏのモノメチルエ
ーテルポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−１
，５，５−）リアジンの試薬濃度を（１４ｍＭ、４０ｍ
Ｍまたは６．０ ｍＭと変化させて、ｐ Ｈ７，０にお
いて高分子ウロキナーゼと反応させて得られた新規ウロ
キナーゼ誘導体について未修飾リジン残基を２．４．６
−ドリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いて定
量した。これより、修飾度を検討したとこ７）、２，４
．６−）リニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムと反応
するりジン残基中、［１４ｍＭの場合が修飾率６〜７
Ｔｏ Ｘ ４− Ｏｍ Ｍの場合が約４０％、＆ＯｍＭ
の場合が約６０チであった。また、これら反応成績体の
分子量を８Ｄｆ３ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いて測定したところ、平均分子量は［Ｌ４ｍＭの場合は
約６０，０００．４− Ｏｍ Ｍの場合は約１２０，０
００であり、ここに得られた知見は前述のりジン残基の
定量の結果とほぼ一致した。
このように、ブラスミノーゲンアクチベータに対しポリ
アルキレングリコールーカッグリング剤結合物による修
飾度を高めようとすれば、高いｐＨで該結合物の量を増
やし、修飾度を低めようとすれば低いｐａｌで該結合物
の量を減じて反応を行えばよい。また、反応時間を調節
することによっても修飾度を変えることもできる。
アルキレングリコールーカッグリング剤結合物による修
飾度を高めようとすれば、高いｐＨで該結合物の量を増
やし、修飾度を低めようとすれば低いｐａｌで該結合物
の量を減じて反応を行えばよい。また、反応時間を調節
することによっても修飾度を変えることもできる。
ポリアルキレングリコールとカップリング剤の結合物と
プラスミノーゲンアクチペータの反応終了後、生成物の
単離・精製はそれ自体公知の生化学的方法、例えばゲル
Ｅ過、透析、イオン交換クロマトグラフィおよびアフイ
ニテイクロマトグラフイ等の方法を単独もしくは組みあ
わせることにより行なわれる。
プラスミノーゲンアクチペータの反応終了後、生成物の
単離・精製はそれ自体公知の生化学的方法、例えばゲル
Ｅ過、透析、イオン交換クロマトグラフィおよびアフイ
ニテイクロマトグラフイ等の方法を単独もしくは組みあ
わせることにより行なわれる。
なお、生成物はバッファーや生理的塩類を含む状態ある
いは単品の溶液として一２０℃以下に凍結するか、もし
くはそれらを凍結乾燥して保存するのが好ましい。
いは単品の溶液として一２０℃以下に凍結するか、もし
くはそれらを凍結乾燥して保存するのが好ましい。
以上の如くして得られる本発明の経口投与薬剤の有効成
分は、至適ｐＨが約８〜９の範囲である。これは、合成
基質Ｓ−２４４４を用いてアミダーゼ活性で測定した時
のものでおるが、修飾率、修飾剤などにより異なるもの
である。例えば平均分子量５． ＯＤ Ｏのモノメチル
エーテルポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−
１，３，５−）リアジンの試薬濃度４．０ ｍＭ 、
ｐＨ７，０，０℃、３時間で修飾した高分子ウロキナー
ゼのアミダーゼ活性における至適ｐＨはａ２であった。
分は、至適ｐＨが約８〜９の範囲である。これは、合成
基質Ｓ−２４４４を用いてアミダーゼ活性で測定した時
のものでおるが、修飾率、修飾剤などにより異なるもの
である。例えば平均分子量５． ＯＤ Ｏのモノメチル
エーテルポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ−
１，３，５−）リアジンの試薬濃度４．０ ｍＭ 、
ｐＨ７，０，０℃、３時間で修飾した高分子ウロキナー
ゼのアミダーゼ活性における至適ｐＨはａ２であった。
−また、本発明の有効成分は物理的および生体内での安
定性が増大している。例えば、平均分子量５，０００の
モノメチルエーテルポリエチレングリコール−４，６−
ジクロロ−１ｖ ５ ＃ ｓ −Ｆリアジンの試薬濃度
４．０ ｍＭ 。
定性が増大している。例えば、平均分子量５，０００の
モノメチルエーテルポリエチレングリコール−４，６−
ジクロロ−１ｖ ５ ＃ ｓ −Ｆリアジンの試薬濃度
４．０ ｍＭ 。
ｐＨ７，０，０℃、３時間で修飾した高分子ウロキナー
ゼは、リンゲル液中あるいは生理食塩水中でも室温下で
、非修飾ウロキナーゼに比べて顕著な安定性を示した。
ゼは、リンゲル液中あるいは生理食塩水中でも室温下で
、非修飾ウロキナーゼに比べて顕著な安定性を示した。
また、凍結・融解操作による失活に対する抵抗性も増大
していた。さらに、ウサギに静注してその血中持続性を
検討したところ、当該修飾ウロキナーゼは、非修飾ウロ
キナーゼに対し、約２０〜３０倍に血中半減期が延長さ
れていた。
していた。さらに、ウサギに静注してその血中持続性を
検討したところ、当該修飾ウロキナーゼは、非修飾ウロ
キナーゼに対し、約２０〜３０倍に血中半減期が延長さ
れていた。
本発明の有効成分が経口投与により活性を発現するか否
かを、犬に経口投与した後、経時的にプロトロンとン時
間、フィブリノーゲンｉ、ＦＤＰ（ｉ、プラスミン量を
測定し、トロンボエラストグラムを記録することにより
検討した。その結果、プロトロンビン時間が延長し、ト
ロンボエラストグラムにより凝固系が抑制され、線溶系
が光通していることが確認された。この結果は、修飾ウ
ロキナーゼが非修飾ウロキナーゼよりも高分子であるこ
とを考えると驚くべきことである。さらに、本発明の有
効成分を、十二指腸内投与ならびに腸溶性錠剤として投
与した場合の活性発現は、上記結果を指示し、有用性が
確認された。
かを、犬に経口投与した後、経時的にプロトロンとン時
間、フィブリノーゲンｉ、ＦＤＰ（ｉ、プラスミン量を
測定し、トロンボエラストグラムを記録することにより
検討した。その結果、プロトロンビン時間が延長し、ト
ロンボエラストグラムにより凝固系が抑制され、線溶系
が光通していることが確認された。この結果は、修飾ウ
ロキナーゼが非修飾ウロキナーゼよりも高分子であるこ
とを考えると驚くべきことである。さらに、本発明の有
効成分を、十二指腸内投与ならびに腸溶性錠剤として投
与した場合の活性発現は、上記結果を指示し、有用性が
確認された。
また、ラットに実施例７で得られた修飾ウロキナーゼを
１，０００，０００１ｕ／Ｋｇ静脈内投与しても全く死
亡例はなく、安全であることが確認された。
１，０００，０００１ｕ／Ｋｇ静脈内投与しても全く死
亡例はなく、安全であることが確認された。
本発明の経口投与用薬剤は、動静派内血栓、冠動脈閉塞
、心筋梗塞、脳内梗塞、肺塞栓および腎炎などの血液の
過凝固性を基礎疾患とする種々の疾病治療に使用される
。経口投与用の剤型としては、カプセル剤、顆粒剤、錠
剤、さらにこれらの腸溶性剤型があげられるが、安定性
の確保、吸収性から特に腸溶性錠剤が好ましい。製剤に
は、凍結乾燥された成分に乳糖、炭酸ナトリウム、ショ
糖、マンニトール、デンプン、結晶セルロース、硫酸カ
ルシウム、リン酸カルシウム、沈降炭酸カルシウムなど
の賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、精製タルクなど
の滑沢剤、また結合剤などを必要に応じて添加すること
ができんさらに、腸溶性とする場合のコーティング剤と
しては、ヒドロキシメチルグロビルセルロース、ヒドロ
キシグロビルセルロースなどが用いられる。また、本発
明の薬剤を人に投与する場合、１日当り１．０００ ｉ
ｕ〜１．０００゜０００１ｕが好ましい。
、心筋梗塞、脳内梗塞、肺塞栓および腎炎などの血液の
過凝固性を基礎疾患とする種々の疾病治療に使用される
。経口投与用の剤型としては、カプセル剤、顆粒剤、錠
剤、さらにこれらの腸溶性剤型があげられるが、安定性
の確保、吸収性から特に腸溶性錠剤が好ましい。製剤に
は、凍結乾燥された成分に乳糖、炭酸ナトリウム、ショ
糖、マンニトール、デンプン、結晶セルロース、硫酸カ
ルシウム、リン酸カルシウム、沈降炭酸カルシウムなど
の賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、精製タルクなど
の滑沢剤、また結合剤などを必要に応じて添加すること
ができんさらに、腸溶性とする場合のコーティング剤と
しては、ヒドロキシメチルグロビルセルロース、ヒドロ
キシグロビルセルロースなどが用いられる。また、本発
明の薬剤を人に投与する場合、１日当り１．０００ ｉ
ｕ〜１．０００゜０００１ｕが好ましい。
次に参考例および実施例をあけて本発明を詳細に説明す
るが、もとより本発明はこれにより何ら制限されるもの
ではない。
るが、もとより本発明はこれにより何ら制限されるもの
ではない。
参考例１゜
モノメチルエーテルポリエチレンクリコール−４，６−
ジクロロ−１，３，５−トリアジン： ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子
量５．０００ ） ２５．０１（ＩｌｌＬ００５モル）
を乾燥ベンゼン２００ｄに加温溶解し、今後無水炭酸ナ
トリウム５．０？および塩化シアヌルＺ７５ｆ（［Ｌｏ
１５モル）を加え室温にて一晩攪拌した。反応終了後
、濾過し、ｐ液に石油エーテル６００ｄを加え、沈澱物
を吸引濾過にて得、少量の石油エーテルで洗浄した。乾
燥ベンゼン−石油エーテルによる再沈澱を５回繰り返し
て精製し、モノメチルエーテルポリエチレンクリコール
−４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジンの白色粉
末を定量的に得た。このものは加水分解後、塩素イオン
の定性反応（ＡｇＮＯｓ ）を示した。
ジクロロ−１，３，５−トリアジン： ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子
量５．０００ ） ２５．０１（ＩｌｌＬ００５モル）
を乾燥ベンゼン２００ｄに加温溶解し、今後無水炭酸ナ
トリウム５．０？および塩化シアヌルＺ７５ｆ（［Ｌｏ
１５モル）を加え室温にて一晩攪拌した。反応終了後
、濾過し、ｐ液に石油エーテル６００ｄを加え、沈澱物
を吸引濾過にて得、少量の石油エーテルで洗浄した。乾
燥ベンゼン−石油エーテルによる再沈澱を５回繰り返し
て精製し、モノメチルエーテルポリエチレンクリコール
−４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジンの白色粉
末を定量的に得た。このものは加水分解後、塩素イオン
の定性反応（ＡｇＮＯｓ ）を示した。
同様に、平均分子量５５０，７００，２．ＤＯＯ，１０
，０００，１５，０００，２０，０００のポリエチレン
グリコールモノメチルエーテルと塩化シアヌルとを反応
させ、各平均分子量のモノメチルエーテルポリエチレン
グリコール−４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジ
ンを定量的に得た。
，０００，１５，０００，２０，０００のポリエチレン
グリコールモノメチルエーテルと塩化シアヌルとを反応
させ、各平均分子量のモノメチルエーテルポリエチレン
グリコール−４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジ
ンを定量的に得た。
参考例Ｚ
モノステアリルポリエチレングリコール−４，６−ジク
ロロ−１，３，５−トリアジン：ポリエチレングリコー
ルモノステアリルエーテル（平均分子ｔ４ｚｏｏ）１６
．ｏｒ（ｏ。
ロロ−１，３，５−トリアジン：ポリエチレングリコー
ルモノステアリルエーテル（平均分子ｔ４ｚｏｏ）１６
．ｏｒ（ｏ。
００５モル）を乾燥ベンゼン２００＋＋＋ｌＣ溶Ｓし、
攪拌下に無水炭酸ナトリウム５． Ｏｆおよび塩化シア
ヌル１７５ ｔ （０，０１ｓモル）を加え、室温にて
一晩攪拌した。反応終了後、不溶物をＦ別し、Ｅ液にｎ
−へキサン約６゜ａ−を加え、再沈澱を行った。沈澱物
に乾燥ベンゼン１００ｍを加えて溶解し、ｎ−ヘキサン
５００ｄを加えて再沈澱した。この操作を３回繰り返し
、モノステアリルエーテルポリエチレンクリコール−４
，６−ジクロロ＝１、３．５−トリアジン（ＰＥ０部分
の平均分子量３．２００）の白色粉末を定量的に得た。
攪拌下に無水炭酸ナトリウム５． Ｏｆおよび塩化シア
ヌル１７５ ｔ （０，０１ｓモル）を加え、室温にて
一晩攪拌した。反応終了後、不溶物をＦ別し、Ｅ液にｎ
−へキサン約６゜ａ−を加え、再沈澱を行った。沈澱物
に乾燥ベンゼン１００ｍを加えて溶解し、ｎ−ヘキサン
５００ｄを加えて再沈澱した。この操作を３回繰り返し
、モノステアリルエーテルポリエチレンクリコール−４
，６−ジクロロ＝１、３．５−トリアジン（ＰＥ０部分
の平均分子量３．２００）の白色粉末を定量的に得た。
参考例＆
ポリエチレンクリコール−４−クロロ−６−ヒドロヤジ
ー１．５．５−トリアジン：ポリエチレングリコール（
平均分子量へ０ＤＯ）５５．６ｔを乾燥ベンゼン１５０
ｍ１に加温溶解した。今後無水炭酸ナトリウム１．６ｔ
および塩化シアヌル０．７４ ｆを添加し、室温にて一
晩攪拌した。次いで水１．０ゴを添加し、室温にて６時
間、さらに４０℃で一晩攪拌した。不溶物を遠心分離（
２，０００ｒｐｍ。
ー１．５．５−トリアジン：ポリエチレングリコール（
平均分子量へ０ＤＯ）５５．６ｔを乾燥ベンゼン１５０
ｍ１に加温溶解した。今後無水炭酸ナトリウム１．６ｔ
および塩化シアヌル０．７４ ｆを添加し、室温にて一
晩攪拌した。次いで水１．０ゴを添加し、室温にて６時
間、さらに４０℃で一晩攪拌した。不溶物を遠心分離（
２，０００ｒｐｍ。
１０分〕により除去し、上清を減圧下留去した。残渣を
乾燥ベンゼンに加温溶解後、溶媒を留去した。この操作
をさらに２回繰り返し、残渣を減圧乾燥して、ポリエチ
レングリコール−４−クロロ−６−ヒドロキシ−１，３
、５−） リアジン（ＰＦｊＧ部分の平均分子量６、０
００ ）を得た。同様に、平均分子量１．０００．４，
０００のポリエチレングリコールを用いて対応する各平
均分子量のボリエ≠レングリコーＡＩ−４−クロロ−６
−ヒドロキシ−１，５，５−）リアジンを定量的に得た
。
乾燥ベンゼンに加温溶解後、溶媒を留去した。この操作
をさらに２回繰り返し、残渣を減圧乾燥して、ポリエチ
レングリコール−４−クロロ−６−ヒドロキシ−１，３
、５−） リアジン（ＰＦｊＧ部分の平均分子量６、０
００ ）を得た。同様に、平均分子量１．０００．４，
０００のポリエチレングリコールを用いて対応する各平
均分子量のボリエ≠レングリコーＡＩ−４−クロロ−６
−ヒドロキシ−１，５，５−）リアジンを定量的に得た
。
参考例４゜
ステアロイルポリエチレングリコール−４，６−ジクロ
ロ−１，５，５−トリアジン：ポリエチレングリコール
モノステアレート（平均分子量２．７００）６．７６５
ｆを無水ベンゼン１００−に溶解し、無水炭酸ナトリウ
ムＺＳｔを加え攪拌下に塩化シアヌル１．３８２を加え
た。室温にて一夜攪拌し、濾過した。
ロ−１，５，５−トリアジン：ポリエチレングリコール
モノステアレート（平均分子量２．７００）６．７６５
ｆを無水ベンゼン１００−に溶解し、無水炭酸ナトリウ
ムＺＳｔを加え攪拌下に塩化シアヌル１．３８２を加え
た。室温にて一夜攪拌し、濾過した。
ろ液を減圧留去し、残渣を減圧乾燥して白色ロウ状のス
テアロイルポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ
−１，５，５−）リアジン（ＰＦ；（）部分の平均分子
！２．７００）を定量的に得た。
テアロイルポリエチレングリコール−４，６−ジクロロ
−１，５，５−）リアジン（ＰＦ；（）部分の平均分子
！２．７００）を定量的に得た。
参考例５
ポリグロビレングリコールー４−クロロ−６−ヒドロキ
シ−１，５，５−トリアジン：平均分子［１，０００の
ポリプロピレングリコール４．Ｏｆを無水ベンゼン５０
ｄに溶解し、無水炭酸ナトリウム１．２７ ｆを加え、
攪拌下に塩化シアヌルｒＪ、５５２ｆを加えた。室温に
て一夜攪拌後、水１ｄを加え、更に６時間室温にて攪拌
した。反応液を濾過後、Ｆ液を減圧下留去し、残渣に無
水べ／ゼンと無水硫酸ナトリウムを加え、室温下１０分
間攪拌した。濾過後、Ｆ液を減圧留去し、残渣を減圧乾
燥して無色粘稠油として、ＰＰ０部分の平均分子−Ｊｉ
１．０００のポリプロピレングリコール−４−クロロ
−６−ヒドロキシ−１，３゜５−トリアジンを定量的に
得た０ 同様にして、ＰＰ０部分の平均分子量４，０００．１０
，０００のポリプロピレングリコール−４−クロロ−６
−ヒドロキシ−１，６゜５−トリアジンを得た。ここで
用いたポリプロピレングリコールは直鎖状のものである
。
シ−１，５，５−トリアジン：平均分子［１，０００の
ポリプロピレングリコール４．Ｏｆを無水ベンゼン５０
ｄに溶解し、無水炭酸ナトリウム１．２７ ｆを加え、
攪拌下に塩化シアヌルｒＪ、５５２ｆを加えた。室温に
て一夜攪拌後、水１ｄを加え、更に６時間室温にて攪拌
した。反応液を濾過後、Ｆ液を減圧下留去し、残渣に無
水べ／ゼンと無水硫酸ナトリウムを加え、室温下１０分
間攪拌した。濾過後、Ｆ液を減圧留去し、残渣を減圧乾
燥して無色粘稠油として、ＰＰ０部分の平均分子−Ｊｉ
１．０００のポリプロピレングリコール−４−クロロ
−６−ヒドロキシ−１，３゜５−トリアジンを定量的に
得た０ 同様にして、ＰＰ０部分の平均分子量４，０００．１０
，０００のポリプロピレングリコール−４−クロロ−６
−ヒドロキシ−１，６゜５−トリアジンを得た。ここで
用いたポリプロピレングリコールは直鎖状のものである
。
さらに、分枝状のポリプロピレングリコールを用いても
、同様にして平均分子−１ｉ１４０００．４，０００の
ポリグロビレングリコールー４−クロロ−６−ヒドロキ
シ−１，３゜５−トリアジンを得た０ 参考例＆ モノメチルエーテルポリエチレングリコールメトキシカ
ルボヒドラジド： ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子
量５，０００）１五５ｒ（ｏ、ｏ。
、同様にして平均分子−１ｉ１４０００．４，０００の
ポリグロビレングリコールー４−クロロ−６−ヒドロキ
シ−１，３゜５−トリアジンを得た０ 参考例＆ モノメチルエーテルポリエチレングリコールメトキシカ
ルボヒドラジド： ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（平均分子
量５，０００）１五５ｒ（ｏ、ｏ。
２７モル〕を窒素ガス気流下、無水テトラヒドロ７ラン
４０Ｏｄに溶解した。少量のジフェニル酢酸を指示薬と
して加え、水冷下ｎ−ブチルリチウムを反応液が黄色に
なるまで滴下した。り四ツ酢酸エチルエステル５ｍ（（
１０４７モル）を室温にて滴下し、−晩攪拌した。更に
１時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を留去し、残渣
を含水アセトン２０〇−に溶解し、活性炭処理した０濃
縮後ベンゼンを加え、一度共沸により水を除去し、残渣
をベンゼン−ｎ−ヘキサンから再沈澱し、黄色粉末を得
た。得られた粉末をメタノール１５０−に溶解し、抱水
ヒドラジン１５ｍ１を加え、１晩加熱還流した。溶媒を
減圧留去後、水１５０７！を加え過剰のヒドラジンを共
沸により除去した。残渣中に含まれる水をベンゼンとの
共沸により除去し、再びベンゼンに溶解し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣を温ベンゼン
に溶解し、活性炭処理後濃縮した。ベンゼン−ｎ−へキ
サ／ｊり再沈澱を２回行い、更に活性炭処理、シリカゲ
ル処理し、再度ベンゼン−ｎ−へキサンより再沈澱して
モノメチルエーテルポリエチレングリコールメトキシカ
ルボヒドラジドの白色粉末を得た。同様にして、平均分
子量５５０．７００．２，０００．１０，０００゜１５
．０００．２０，０００のポリエチレングリコールモノ
メチルエーテルを原料として各々のヒドラジドを得た。
４０Ｏｄに溶解した。少量のジフェニル酢酸を指示薬と
して加え、水冷下ｎ−ブチルリチウムを反応液が黄色に
なるまで滴下した。り四ツ酢酸エチルエステル５ｍ（（
１０４７モル）を室温にて滴下し、−晩攪拌した。更に
１時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を留去し、残渣
を含水アセトン２０〇−に溶解し、活性炭処理した０濃
縮後ベンゼンを加え、一度共沸により水を除去し、残渣
をベンゼン−ｎ−ヘキサンから再沈澱し、黄色粉末を得
た。得られた粉末をメタノール１５０−に溶解し、抱水
ヒドラジン１５ｍ１を加え、１晩加熱還流した。溶媒を
減圧留去後、水１５０７！を加え過剰のヒドラジンを共
沸により除去した。残渣中に含まれる水をベンゼンとの
共沸により除去し、再びベンゼンに溶解し、無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した。溶媒を留去し、残渣を温ベンゼン
に溶解し、活性炭処理後濃縮した。ベンゼン−ｎ−へキ
サ／ｊり再沈澱を２回行い、更に活性炭処理、シリカゲ
ル処理し、再度ベンゼン−ｎ−へキサンより再沈澱して
モノメチルエーテルポリエチレングリコールメトキシカ
ルボヒドラジドの白色粉末を得た。同様にして、平均分
子量５５０．７００．２，０００．１０，０００゜１５
．０００．２０，０００のポリエチレングリコールモノ
メチルエーテルを原料として各々のヒドラジドを得た。
参考例Ｚ
モノメチルエーテルポリエチレングリコ−／Ｉ／−４，
６−ジクロロ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナー
ゼ： ウロキナーゼ（分子量５４．０００．６へ６００ ｉ
ｕ ／ ｗｔ ）液０．６１ｓｔに水冷下０．１Ｍリン
酸バｙ ７７− （ｐ ＨＺ Ｏ） １０１ｄを加え、
更に試薬濃度が４ｍＭとなるように、ＰＥ０部分の平均
分子３１５，０００のモノメチルエーテルポリエチレン
グリコール−４，ｂ−ジクロロ−１，３，５−トリアジ
ンを加え水冷下３時間反応させた。反応終了後、反応液
を透析チー−ブに移して、透析により過剰の試薬を除去
した０透析は氷冷下、ＣＬ Ｉ Ｍ ＩＪン酸ノくツフ
ァー（１＞ Ｉ（７，２）で５時間、更に生理食塩水に
て１時間行い、内容物を４ ｍｌにメスアップし、−８
０℃にて凍結保存した。得られたモノメチルエーテルポ
リエチレングリコール−４，６−ジクロロ−１，３，５
−トリアジン修飾ウロキナーゼはフィブリン平板法によ
るウロキナーゼ活性測定で４，５５０１ｕ／−であり、
原料ウロキナーゼに対し、５５チの活性低下が認められ
た。
６−ジクロロ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナー
ゼ： ウロキナーゼ（分子量５４．０００．６へ６００ ｉ
ｕ ／ ｗｔ ）液０．６１ｓｔに水冷下０．１Ｍリン
酸バｙ ７７− （ｐ ＨＺ Ｏ） １０１ｄを加え、
更に試薬濃度が４ｍＭとなるように、ＰＥ０部分の平均
分子３１５，０００のモノメチルエーテルポリエチレン
グリコール−４，ｂ−ジクロロ−１，３，５−トリアジ
ンを加え水冷下３時間反応させた。反応終了後、反応液
を透析チー−ブに移して、透析により過剰の試薬を除去
した０透析は氷冷下、ＣＬ Ｉ Ｍ ＩＪン酸ノくツフ
ァー（１＞ Ｉ（７，２）で５時間、更に生理食塩水に
て１時間行い、内容物を４ ｍｌにメスアップし、−８
０℃にて凍結保存した。得られたモノメチルエーテルポ
リエチレングリコール−４，６−ジクロロ−１，３，５
−トリアジン修飾ウロキナーゼはフィブリン平板法によ
るウロキナーゼ活性測定で４，５５０１ｕ／−であり、
原料ウロキナーゼに対し、５５チの活性低下が認められ
た。
上記方法に従い、ＰＥ０部分の平均分子量５５０．７０
口および２，０００のモノメチルエーテルホリエチレン
グリコールー４．６−シクロロー１．５．５−トリアジ
ンを用いて、フィブリン平板法によるウロキナーゼ活性
値が各々９８００ ｉ ｕ／ゴ、１００００ｉｕ／−１
６５００ｉ ｕ ／ ｍ７！の修飾ウロキナーゼが得ら
れた。
口および２，０００のモノメチルエーテルホリエチレン
グリコールー４．６−シクロロー１．５．５−トリアジ
ンを用いて、フィブリン平板法によるウロキナーゼ活性
値が各々９８００ ｉ ｕ／ゴ、１００００ｉｕ／−１
６５００ｉ ｕ ／ ｍ７！の修飾ウロキナーゼが得ら
れた。
さらに、原料の平均分子量の変化、試薬濃度の変化を組
みあわせることにより、種々の修飾ウロキナーゼが得ら
れた。
みあわせることにより、種々の修飾ウロキナーゼが得ら
れた。
参考例＆
モノメチルエーテルポリエチレンクリコールカルボメチ
ルアジド修飾ウロキナーゼ：（１）参考例＆で製造した
ＰＥ０部分の平均分子ｚ５．ｏｏｏのモノメチルエーテ
ルポリエチレングリコールメトキシカルボヒドラジド２
００■に水冷下、１Ｎ塩酸２−を加え、更に（ＬＯＯ８
Ｎ亜硝酸ナトリウムを１ｍ／！加え室温下２０分間攪拌
し、次いで１Ｎ水酸化す） ＩＪウム２＋ｄを加えて得
られたモノメチルエーテルポリエチレングリコールカル
ボメチルアジドの溶液を１℃で保存する。
ルアジド修飾ウロキナーゼ：（１）参考例＆で製造した
ＰＥ０部分の平均分子ｚ５．ｏｏｏのモノメチルエーテ
ルポリエチレングリコールメトキシカルボヒドラジド２
００■に水冷下、１Ｎ塩酸２−を加え、更に（ＬＯＯ８
Ｎ亜硝酸ナトリウムを１ｍ／！加え室温下２０分間攪拌
し、次いで１Ｎ水酸化す） ＩＪウム２＋ｄを加えて得
られたモノメチルエーテルポリエチレングリコールカル
ボメチルアジドの溶液を１℃で保存する。
（２）ウロキナーゼ（分子量３３．口００．４５゜６０
０ ｉ ｕ ／ ｔｄ ）液１−に０．１Ｍリン酸バｙ
７７−（ｐＨ＆０ ） ｌ ５６５ｔｌＩｔを加え九次
いで（１）で調製したモノメチルエーテルポリエチレン
グリコールカルボメチルアジドの溶液（１４５５ｄを加
え、室温下２時間反応させた。反応液を透析チー−プに
移し、水冷下４時間［１１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７
：２）で透析し、内容液を８−にメスアップし、−８１
℃で凍結保存した。得られたモノメチルエーテルポリエ
チレンクリコールカルボメチルアジド修飾ウロキナーゼ
はフィブリン平板法による活性測定で７３０Ｏｉｕ／−
であった。従って非修飾ウロキナーゼに対して２８％の
活性増強が認められた０ 参考例９ モノステアリルエーテルポリエチレングリコール−４，
６−ジクロロ−１，５，５−）リアジン修飾ウロキナー
ゼ： ウロキナーゼ（分子量５４１口００．１０１゜１６７
ｉ ｕ ／ ｔｎｌ ）液α２−に氷冷下０．１Ｍリン
酸バッファー（ｐＨＩＺＯ）０．６６−を加え、更に試
薬濃度が２ｍＭとなるようにＰＥ０部分の平均分子ｆｉ
５２００のモノステアリルエーテルポリエチレングリコ
ール−４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジンを加
え、水冷下６時間反応させた。反応終了後、反応液ヲ透
析チー−プに移して透析し、過剰の試薬を除去した。透
析は水冷下、（１１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，２）
で４時間行った。内容物に３．０チ牛血清アルブミン水
溶液０．１−を加え、さらに０．１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７，０）で４．０艷にメスアップし、−８０℃で
凍結保存した。このものは、フィブリン平板法で４４．
１％の活性低下が認められた。（活性は２８２６ ｉ
ｕ ／ ｔｔ ）。同様に、試薬濃度４ｍＭ、６ｍＭ、
８ｍＭと変えて反応させた修飾ウロキナーゼの活性はそ
れぞれ２３５１１ｕ／ゴ、１４３０ｉｕ／ｄ、１０５９
ｉｕ／−でありた。
０ ｉ ｕ ／ ｔｄ ）液１−に０．１Ｍリン酸バｙ
７７−（ｐＨ＆０ ） ｌ ５６５ｔｌＩｔを加え九次
いで（１）で調製したモノメチルエーテルポリエチレン
グリコールカルボメチルアジドの溶液（１４５５ｄを加
え、室温下２時間反応させた。反応液を透析チー−プに
移し、水冷下４時間［１１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７
：２）で透析し、内容液を８−にメスアップし、−８１
℃で凍結保存した。得られたモノメチルエーテルポリエ
チレンクリコールカルボメチルアジド修飾ウロキナーゼ
はフィブリン平板法による活性測定で７３０Ｏｉｕ／−
であった。従って非修飾ウロキナーゼに対して２８％の
活性増強が認められた０ 参考例９ モノステアリルエーテルポリエチレングリコール−４，
６−ジクロロ−１，５，５−）リアジン修飾ウロキナー
ゼ： ウロキナーゼ（分子量５４１口００．１０１゜１６７
ｉ ｕ ／ ｔｎｌ ）液α２−に氷冷下０．１Ｍリン
酸バッファー（ｐＨＩＺＯ）０．６６−を加え、更に試
薬濃度が２ｍＭとなるようにＰＥ０部分の平均分子ｆｉ
５２００のモノステアリルエーテルポリエチレングリコ
ール−４，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジンを加
え、水冷下６時間反応させた。反応終了後、反応液ヲ透
析チー−プに移して透析し、過剰の試薬を除去した。透
析は水冷下、（１１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，２）
で４時間行った。内容物に３．０チ牛血清アルブミン水
溶液０．１−を加え、さらに０．１Ｍリン酸バッファー
（ｐＨ７，０）で４．０艷にメスアップし、−８０℃で
凍結保存した。このものは、フィブリン平板法で４４．
１％の活性低下が認められた。（活性は２８２６ ｉ
ｕ ／ ｔｔ ）。同様に、試薬濃度４ｍＭ、６ｍＭ、
８ｍＭと変えて反応させた修飾ウロキナーゼの活性はそ
れぞれ２３５１１ｕ／ゴ、１４３０ｉｕ／ｄ、１０５９
ｉｕ／−でありた。
参考例１０゜
ポリエチレングリコール−４−クロロ−６−ヒドロキシ
−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナーゼ： ウロキナーゼ（分子量５４．０００．４５，６００ ｉ
ｕ ／ ｄ ）液１−に氷冷下α０５Ｍホウ酸バッフ
ァー（ｐ Ｈ９，２） ４．０−を加え、更にＰＥ０部
分の平均分子量へ０００のポリエチレンクリコール−４
−クロロ−６−ヒドロキシ−１，５，５−トリアジンλ
５４１９を加え、水冷下３時間反応させた。反応終了後
、反応液を透析チューブに移して透析により過剰の試薬
を除去した。透析は水冷下、［Ｌ０５Ｍホウ酸バッファ
ー（ｐ Ｈ９，２）で１時間、さらに［１１Ｍリン酸バ
ッファー（ｐ Ｈ７，２）で３時間行った。内容物にＱ
、１Ｍリン酸バッファー（ｐ Ｈ７，２）でａＯ−にメ
スアップし、−８０℃で凍結保存した。得られた修飾ウ
ロキナーゼのフィブリン平板法による活性測定で、活性
は４６０ ｉ ｕ ／ ｎｔでありた。
−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナーゼ： ウロキナーゼ（分子量５４．０００．４５，６００ ｉ
ｕ ／ ｄ ）液１−に氷冷下α０５Ｍホウ酸バッフ
ァー（ｐ Ｈ９，２） ４．０−を加え、更にＰＥ０部
分の平均分子量へ０００のポリエチレンクリコール−４
−クロロ−６−ヒドロキシ−１，５，５−トリアジンλ
５４１９を加え、水冷下３時間反応させた。反応終了後
、反応液を透析チューブに移して透析により過剰の試薬
を除去した。透析は水冷下、［Ｌ０５Ｍホウ酸バッファ
ー（ｐ Ｈ９，２）で１時間、さらに［１１Ｍリン酸バ
ッファー（ｐ Ｈ７，２）で３時間行った。内容物にＱ
、１Ｍリン酸バッファー（ｐ Ｈ７，２）でａＯ−にメ
スアップし、−８０℃で凍結保存した。得られた修飾ウ
ロキナーゼのフィブリン平板法による活性測定で、活性
は４６０ ｉ ｕ ／ ｎｔでありた。
参考例１１゜
ステアロイルポリエチレングリコールー４．６−ジクロ
ロ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナーゼ： ウロキナーゼ（分子ｉ１５４０００．１０１１６７ ｉ
ｕ ／ ｍｌ ）液Ｑ、５ｍｇに水冷下、ａ１Ｍリン
酸バッファー（ｐ Ｈ７，０） １．５ゴを加え、更に
ＰＥ０部分の平均分子１２７００のステアロイルポリエ
チレングリコール−４，６−ジクロロ−１，５，５−）
リアジンのジオキサン溶液（２７０η／ゴ） ｏ、 ｏ
ｓ−を加え、水冷下３持間反応させた。反応終了後、
反（ｐ Ｈ７，２）で４時間行い、内容物・テリン酸バ
ッファーで５−にメスアップし、−８０℃にて凍結保存
した。得られた修飾ウロキナーゼのフィブリン平板法に
よる活性は原料ウロキナーゼの１０６％を有していた。
ロ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナーゼ： ウロキナーゼ（分子ｉ１５４０００．１０１１６７ ｉ
ｕ ／ ｍｌ ）液Ｑ、５ｍｇに水冷下、ａ１Ｍリン
酸バッファー（ｐ Ｈ７，０） １．５ゴを加え、更に
ＰＥ０部分の平均分子１２７００のステアロイルポリエ
チレングリコール−４，６−ジクロロ−１，５，５−）
リアジンのジオキサン溶液（２７０η／ゴ） ｏ、 ｏ
ｓ−を加え、水冷下３持間反応させた。反応終了後、
反（ｐ Ｈ７，２）で４時間行い、内容物・テリン酸バ
ッファーで５−にメスアップし、−８０℃にて凍結保存
した。得られた修飾ウロキナーゼのフィブリン平板法に
よる活性は原料ウロキナーゼの１０６％を有していた。
同様に、ステアロイルポリエチレングリコール−４゜６
−ジクロロ−１，５，５−）リアジンのジオキサン浴液
（２７ｏｓｖ／ｄ）の量をそれぞれｃＬｌＭｔ、、［１
，２１ｎｔと変えて反応させ、得られた修飾ウロキナー
ゼの活性は原料ウロキナーゼの１０６％、１０１チであ
った。
−ジクロロ−１，５，５−）リアジンのジオキサン浴液
（２７ｏｓｖ／ｄ）の量をそれぞれｃＬｌＭｔ、、［１
，２１ｎｔと変えて反応させ、得られた修飾ウロキナー
ゼの活性は原料ウロキナーゼの１０６％、１０１チであ
った。
ｋ考例１２゜
ポリプロピレングリコール−４−クロロ−６−ヒドロキ
シ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナーゼ： ウロキナーゼ（分子量５４． ＯＯ０１１０１゜１６７
ｉ ｕ ／ ｔｔｒｔ ）液［Ｌ５ｍＡに水冷下、０
．１Ｍリン酸バッファー（ｐ Ｈ７，０） １５ ｍｌ
を加え、更に参考例翫で得たＰＰ０部分の平均分子ｉｌ
１．０００のポリプロピレングリコール−４−クロロ
−６−ヒドロキシ−１，３，５−）リアジンのジオキサ
ン溶液（１００Ｗ／＋ｄ）［Ｌ０５−を加え、氷冷下３
時間反応させた。
シ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナーゼ： ウロキナーゼ（分子量５４． ＯＯ０１１０１゜１６７
ｉ ｕ ／ ｔｔｒｔ ）液［Ｌ５ｍＡに水冷下、０
．１Ｍリン酸バッファー（ｐ Ｈ７，０） １５ ｍｌ
を加え、更に参考例翫で得たＰＰ０部分の平均分子ｉｌ
１．０００のポリプロピレングリコール−４−クロロ
−６−ヒドロキシ−１，３，５−）リアジンのジオキサ
ン溶液（１００Ｗ／＋ｄ）［Ｌ０５−を加え、氷冷下３
時間反応させた。
反応終了後、反応液を透析チー−ブに移して透析し、過
剰の試薬を除去した。透析は、氷冷下、Ｑ、１Ｍリン酸
バッファー（ｐＨ７，２）で４時間透析し、内容物をリ
ン酸バッファーで５−にメスアップし、−８０℃にて凍
結保存した。得られた修飾ウロキナーゼはフィブリン平
板法によす活性測定で、原料ウロキナーゼに対して９＆
４％の活性を有していた。
剰の試薬を除去した。透析は、氷冷下、Ｑ、１Ｍリン酸
バッファー（ｐＨ７，２）で４時間透析し、内容物をリ
ン酸バッファーで５−にメスアップし、−８０℃にて凍
結保存した。得られた修飾ウロキナーゼはフィブリン平
板法によす活性測定で、原料ウロキナーゼに対して９＆
４％の活性を有していた。
さらに、試薬添加量を０．１ｒｎｔ、Ｃｌ３−に変えて
得られた同様の修飾ウロキナーゼの活性はそれぞれ原料
に対し、９９３％、１０＆８％であった。
得られた同様の修飾ウロキナーゼの活性はそれぞれ原料
に対し、９９３％、１０＆８％であった。
また、平均分子量の異なるポリプロピレンクリコール−
４−クロロ−６−ヒドロキシ−１，３，５−トリアジン
を用いても修飾ウロキナーゼが得られた。
４−クロロ−６−ヒドロキシ−１，３，５−トリアジン
を用いても修飾ウロキナーゼが得られた。
実施例１゜
体重１０匂のピーグル犬に、参考例Ｚにて得られたモノ
メチルエーテルポリエチレングリコール−４，６−ジク
ロロ−１，３，５−トリアジン修飾ウロキナーゼ（ＰＥ
０部分の平均分子量５０００、試薬濃度４ｍＭ）の凍結
乾燥品または非修飾ウロキナーゼの凍結乾燥品を牛乳に
溶解し経口投与した。投与前および投与後１，２，４，
６．８時間後に採血し、その血液につき、プロトロンビ
ン時間、ＦＤＰＪＬプラスミン量を測定し、さらにトロ
ンボエラストダラムを記録し、凝固線溶系におよばず影
響を検討した。
メチルエーテルポリエチレングリコール−４，６−ジク
ロロ−１，３，５−トリアジン修飾ウロキナーゼ（ＰＥ
０部分の平均分子量５０００、試薬濃度４ｍＭ）の凍結
乾燥品または非修飾ウロキナーゼの凍結乾燥品を牛乳に
溶解し経口投与した。投与前および投与後１，２，４，
６．８時間後に採血し、その血液につき、プロトロンビ
ン時間、ＦＤＰＪＬプラスミン量を測定し、さらにトロ
ンボエラストダラムを記録し、凝固線溶系におよばず影
響を検討した。
モノメチルエーテルポリエチレングリコール−４，６−
ジクロロ−１，５，５−トリアジン修飾ウロキナーゼは
、フィブリン平板法による活性６７５００ｉｕを、非修
飾ウロキナーゼは１６００００ｉｕを動物１頭あたり投
与した。その結果、ＦＤＰｔ、プラスミン量については
、修飾ウロキナーゼ投与群と非修飾ウロキナーゼ投与群
に差はなかった。しかし、プロトロンビン時間について
は、非修飾ウロキナーゼ投与群では、変化がみられなか
ったが、修飾ウロキナーゼ投与群では投与後１時間目か
ら６時間目まで１〜５秒の延長が認められた。また、ト
ロンポエラストダラムにおいては、修飾ウロキナーゼ投
与群において、投与後８時間にて振幅が１簡になるまで
の時間（ｒ）が６分から１５．５分に、振幅が２０ ｍ
Ｋなる丑での時間（１！が２．７５分から１０分にそ
れぞれ延長し、凝固がおこりにくくなっていた。さらに
、振幅の最大値（Ｍａ ）が７２．５０から６５ｆｌｌ
ｌｌ＋に、２００分後の振幅（Ａ２００ ）が５＆２ｆ
ｉから２１！ＩＩＩ＋１にそれぞれ短縮し、線溶系が元
通していた。
ジクロロ−１，５，５−トリアジン修飾ウロキナーゼは
、フィブリン平板法による活性６７５００ｉｕを、非修
飾ウロキナーゼは１６００００ｉｕを動物１頭あたり投
与した。その結果、ＦＤＰｔ、プラスミン量については
、修飾ウロキナーゼ投与群と非修飾ウロキナーゼ投与群
に差はなかった。しかし、プロトロンビン時間について
は、非修飾ウロキナーゼ投与群では、変化がみられなか
ったが、修飾ウロキナーゼ投与群では投与後１時間目か
ら６時間目まで１〜５秒の延長が認められた。また、ト
ロンポエラストダラムにおいては、修飾ウロキナーゼ投
与群において、投与後８時間にて振幅が１簡になるまで
の時間（ｒ）が６分から１５．５分に、振幅が２０ ｍ
Ｋなる丑での時間（１！が２．７５分から１０分にそ
れぞれ延長し、凝固がおこりにくくなっていた。さらに
、振幅の最大値（Ｍａ ）が７２．５０から６５ｆｌｌ
ｌｌ＋に、２００分後の振幅（Ａ２００ ）が５＆２ｆ
ｉから２１！ＩＩＩ＋１にそれぞれ短縮し、線溶系が元
通していた。
実施例２゜
製剤例
（１）モノメチルエーテルポリエチレングリコール−４
，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナ
ーゼ（ＰＥ０部分の平均分子１ｉ１５０００、試薬濃！
４ｍＭ）フィブリン平板活性 １０００００ｉｕ（２
） 乳 糖 １５０η （３）ステアリン酸マグネシウム ａｔ（１）、（２
）、（３）を混合して、打錠し、ヒドロキシメチルプロ
ピルセルロースで＆溶性＝’−ティングを施し、腸溶錠
とした。
，６−ジクロロ−１，３，５−）リアジン修飾ウロキナ
ーゼ（ＰＥ０部分の平均分子１ｉ１５０００、試薬濃！
４ｍＭ）フィブリン平板活性 １０００００ｉｕ（２
） 乳 糖 １５０η （３）ステアリン酸マグネシウム ａｔ（１）、（２
）、（３）を混合して、打錠し、ヒドロキシメチルプロ
ピルセルロースで＆溶性＝’−ティングを施し、腸溶錠
とした。
実施例五
製剤例
実施例２で得られた錠剤に、白糖、沈降炭酸カルシウム
、カルナバロウにて糖衣を施して、腸溶性糖衣錠とした
。
、カルナバロウにて糖衣を施して、腸溶性糖衣錠とした
。
実施例
製剤例
実施例２と同様の修飾ウロキナーゼ５へ０００１ｕに乳
糖３００１９を加えて顆粒とし、さらにヒドロキシメチ
ルプロピルセルロースにて被覆して、顆粒剤とした。
糖３００１９を加えて顆粒とし、さらにヒドロキシメチ
ルプロピルセルロースにて被覆して、顆粒剤とした。
以 上
特許出願人 日本ケミファ株式会社
ＥＴ＝続補正書（自発）
昭和５８年６ 月２０日
特許庁長官若杉和夫殿
１、事件の表示
昭和５３（年特８′１願第（１７４８８７号２、発明の
名称 新規プラスミノーゲンアクチベータ誘導体を含有してな
る経口投与薬剤 ３、補正をする者 事件との関係 特Ｆｌ出願入 住 所 東京都千代田区岩本１ｒ２丁目２番３号５、
補正の対象
名称 新規プラスミノーゲンアクチベータ誘導体を含有してな
る経口投与薬剤 ３、補正をする者 事件との関係 特Ｆｌ出願入 住 所 東京都千代田区岩本１ｒ２丁目２番３号５、
補正の対象
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） プラスミノーゲンアクチベータのアミノ酸側
鎖にカップリング剤を介して、置換基としてアルキル基
またはアルカノイル基を含有していてもよい分子量２０
０〜 ２０、０００のポリアルキレングリコールが結合してな
る新規プラスミノーゲンアクチペータ誘導体を含有する
経口血栓溶解剤。 （２） グラスミノーゲンアクチベータのアミノ酸側
鎖にカップリング剤を介して、置換基としてアルキル基
またはアルカノイル基を含有していてもよい分子量２０
０〜 ２０．０００のポリアルキレングリコールが結合してな
る新規プラスミノーゲンアクチベータ誘導体を含有する
経口血栓形成阻止剤。 （５） プラスミノーゲンアクチベータがウロキナー
ゼである特許請求の範囲第１項記載の経口血栓溶解剤。 （４）プラスミノーゲンアクチペータがウロキナーゼで
ある特許請求の範囲第２項記載の経口血栓形成阻止剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58074887A JPS59204130A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 新規プラスミノ−ゲンアクチベ−タ誘導体を含有してなる経口投与薬剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58074887A JPS59204130A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 新規プラスミノ−ゲンアクチベ−タ誘導体を含有してなる経口投与薬剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59204130A true JPS59204130A (ja) | 1984-11-19 |
Family
ID=13560324
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58074887A Pending JPS59204130A (ja) | 1983-04-30 | 1983-04-30 | 新規プラスミノ−ゲンアクチベ−タ誘導体を含有してなる経口投与薬剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59204130A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63245671A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Kanebo Ltd | 修飾ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ |
| JPS6460375A (en) * | 1987-08-28 | 1989-03-07 | Kuraray Co | Chemical modification of bilirubin oxidase |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5042087A (ja) * | 1973-07-20 | 1975-04-16 | ||
| JPS57192435A (en) * | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Toyobo Co Ltd | Modified polypeptide |
| JPS58225025A (ja) * | 1982-06-24 | 1983-12-27 | Nippon Chem Res Kk | 効力持続性組成物 |
-
1983
- 1983-04-30 JP JP58074887A patent/JPS59204130A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5042087A (ja) * | 1973-07-20 | 1975-04-16 | ||
| JPS57192435A (en) * | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Toyobo Co Ltd | Modified polypeptide |
| JPS58225025A (ja) * | 1982-06-24 | 1983-12-27 | Nippon Chem Res Kk | 効力持続性組成物 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63245671A (ja) * | 1987-03-31 | 1988-10-12 | Kanebo Ltd | 修飾ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ |
| JPS6460375A (en) * | 1987-08-28 | 1989-03-07 | Kuraray Co | Chemical modification of bilirubin oxidase |
| JP2632518B2 (ja) * | 1987-08-28 | 1997-07-23 | 天野製薬株式会社 | ビリルビンオキシダーゼの化学修飾体 |
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