CN102226168A - 一种基于微纳米纤维的细胞捕获方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微纳米纤维的细胞捕获方法。对微纳米纤维表面进行化学修饰，嫁接可识别待捕捉细胞表面特定抗原的抗体；然后，通过细胞表面的抗原和微纳米纤维衬底上嫁接的相应抗体之间的免疫反应而实现细胞的捕获。本发明方法具有捕获效率高、操作简便、成本低廉、高质量的细胞成像、所捕获细胞活性良好等优点。

Description

一种基于微纳米纤维的细胞捕获方法

技术领域

本发明涉及一种基于微纳米纤维的细胞捕获方法，属于纳米技术和细胞化学领域。

背景技术

随着细胞生物学的发展，从组织和体液（血液、淋巴液、唾液、尿液）中对某一种或几种特定的细胞进行筛选和捕获，越来越吸引着生物学和医学科研工作者的重视。这些来源于组织液和体液的细胞，因其数量上的稀有性与生物学上的特异性，正为稀有细胞生物学及其基础医学研究提供了一扇新的认识窗口。然而，对于组织液和体液内的某些特定细胞，因其稀有性和低密度，对这些细胞的捕获与探测都面临着极大的挑战。过去十年间，发展起来各种基于不同运行机制的技术用于细胞的捕获和计数，包括免疫磁性分离、流式细胞仪、微流控芯片、细胞过滤器等技术。但这些技术仍然面临着如何提高细胞捕获效率、降低检测成本、避免细胞成像失焦、捕获非特异性抗原表达的细胞以及保证捕获细胞的活性以实现后续的分子水平的分析等各种挑战。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术的不足，提供了一种基于微纳米纤维的细胞捕获方法。这种方法在细胞捕获的应用中，具有捕获效率高、操作简便、成本低廉、高质量的细胞成像、保证所捕获细胞的活性良好等优点。

本发明为实现其目的所采用的技术方案是：

对微纳米纤维表面进行化学修饰，嫁接可识别待捕捉细胞表面特定抗原的抗体；然后，通过细胞表面的抗原和微纳米纤维衬底上嫁接的相应抗体之间的免疫反应而实现细胞的捕获。

所述微纳米纤维在同一平面上以便于后续细胞成像操作和保证成像质量。

所述微纳米纤维可以采用电纺的方法来制备，具体包括以下步骤：

a. 电纺前驱液的配制：称量钛酸丁酯、乙酰丙酮、乙二醇单甲醚和异丙醇，配成混合溶液，搅拌至澄清，再加入聚乙烯吡咯烷酮，常温搅拌2-3 h至高分子充分溶解，备用；

b. 在电纺装置上进行微纳米级电纺纤维衬底的制备：选择洁净硅片或载玻片作为衬底的面板，调节金属喷管的管径、喷管与衬底面板间的距离、施加的直流电压以及电纺时间等参数以获得直径范围在100-2000 nm间，且微纳米纤维网络的孔隙尺寸在100-2000 nm间的微纳米级纤维衬底；

c. 将硅片或载玻片上收集的微纳米级纤维材料，放入马弗炉煅烧，烧除电纺纤维中的高分子支架材料聚乙烯吡咯烷酮。

所述微纳米纤维的细胞捕获过程中，将经抗体修饰的微纳米纤维安放到多孔培养板的孔室中，将细胞悬浮液加入多孔培养板的孔室中，然后放入二氧化碳培养箱，孵育10-60分钟 。

所述微纳米纤维的直径以及孔隙尺寸都在100-2000 nm之间。微纳米纤维与普通的平滑衬底相比具有极大的比表面积（比表面积有数量级的提高），且微纳米纤维衬底（其直径以及孔隙尺寸均在100-2000 nm之间）与细胞膜表面的纳米结构（如微绒毛和丝状伪足，其尺寸在80-300nm范围内）在尺寸上较为匹配，这使得它们之间的局部拓扑交互反应得以增强。与此同时，根据待捕获细胞的特征，选择细胞膜上具有较高水平表达的细胞粘附因子作为识别和捕获标志。这些粘附分子即为抗原，如上皮细胞粘附分子（EpCAM）和E-选择素（E-selection）等。然后把对应的抗体嫁接到微纳米纤维衬底上，以达到增强细胞捕获性能的目的(与平滑衬底相比，微纳米纤维衬底捕获性能有15-20倍的提高)。

本发明具有如下的有益效果:

（1）本发明结合微纳米技术和免疫细胞化学识别技术，可实现细胞的高效捕获。与平整衬底材料相比，捕获细胞的性能有15-20倍的提高。

（2）本发明实现了高质量的细胞成像，为细胞的定量检测和分析提供了有力的途径。

（3）本发明能确保捕获的细胞的活性，使后续分子层次的分析和临床上应用成为可能。

（4）本发明利用电纺方法来制备微纳米级纤维衬底，其工艺简单，质量控制简便。

（5）本发明与流式细胞分离和磁珠免疫分离法相比，操作简便，且检测成本低廉。

附图说明

图1是微纳米级纤维在烧结前的光学显微照片。

图2是基于微纳米级电纺纤维衬底的循环肿瘤细胞捕获实验流程图。

图中，1.二氧化硅（SiO₂）衬底，2.二氧化钛（TiO₂）微纳米纤维, 3.循环肿瘤细胞（CTCs), 4.经anti-EpCAM包被的平整二氧化硅和纳米纤维二氧化钛纤维结构交接处的显微照片（煅烧前），5. 细胞捕获实验后平整二氧化硅和纳米纤维二氧化钛纤维结构交接处的明场显微照片，6.细胞捕获实验后平整二氧化硅和纳米纤维二氧化钛纤维结构交接处的荧光显微照片。

图3是微纳米纤维衬底和平整衬底所捕获的细胞密度的比例，三种情况分别是：（1）未经任何修饰；（2）只经过联酶亲和素（SA）修饰；（3）经过联酶亲和素（SA）和抗体（anti-EpCAM）修饰。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

为了确保试验数据的准确性和可重复性，需要向各个培养孔室中注入相同体积的细胞悬浮液，由于等体积和等浓度条件，使得培养孔室中每个样品上的结肠癌细胞HCT116的初始数目近似相等。为了使实验数据具有统计学意义，需要进行三组平行检测，最后对三组实验中所捕获细胞的数目取平均值。

A. 微纳米级电纺纤维衬底的制备

a. 电纺前驱液的配制

按照以下配方，称量并配制钛酸丁酯（titanium (IV) n-butoxide，0.1 g mL^-1），乙酰丙酮（acetic acid，0.01 g mL^-1），乙二醇单甲醚（2-methoxyethanol，0.66 g mL^-1）和异丙醇（IPA，0.16 g mL^-1）的混合溶液，搅拌至澄清，若出现微颗粒，用滤器（Ø = 0.45μm）过滤处理；再加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP，0.035 g mL^-1)，常温搅拌2-3 h至高分子充分溶解，备用。

b. 在电纺装置上进行微纳米级电纺纤维衬底的制备

选择洁净硅片或者载玻片作为衬底的面板。通过调节金属喷管的管径、喷管与接受面板间的距离、施加的直流电压以及静电纺时间等参数来获得直径和孔隙小于2 μm的微纳米纤维衬底。如图1所示，微纳米级纤维的的直径和微纳米级纤维网络的孔隙尺寸都在100-2000 nm之间。

c. 将收集在硅片或载玻片上的静电纺样品放入马弗炉，在450℃下煅烧30 min，然后自然退火。

d. 待温度降至室温后，取出待用。

B. 微纳米级电纺纤维衬底的表面修饰

a. 对微纳米级电纺纤维衬底进行等离子（PLASMA）处理3 min；

b. 将经步骤a处理后的样品浸入含4%体积分数的3-巯基丙基三甲氧硅烷（MPTMS）的无水乙醇溶液中，反应1-2h后用无水乙醇漂洗3次。

c. 将经步骤b处理后的样品浸入10μmol mL^-1的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺脂(GMBS)的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，然后用无水乙醇稀释10倍，反应30 -60min后用无水乙醇漂洗3次。

d. 将50μg mL^{-1 的联酶亲和素 (}Streptavidin)溶液滴到经步骤c处理后的样品表面上，孵育30 -60min后用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次。

e. 将10μg mL^-1的anti-EpCAM溶液滴到经步骤d处理后的样品表面上，孵育30 -60min后用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，然后浸入新鲜PBS溶液中，待用。

C. 基于微纳米级电纺纤维衬底的结肠癌细胞（HCT116）捕获实验（如图2）

a. 准备1mL细胞密度为10⁵ cells mL^-1 HCT116细胞悬浮液，然后加入二乙酸荧光素（FDA，终止浓度100 μg mL^-1），对CTCs进行活体染色10-15min。

b. 将经过anti-EpCAM修饰的上述样品放入多孔培养板的腔室中，然后向培养孔室注入1mL细胞密度为10⁵ cells mL^-1 HCT16细胞悬浮液。

c. 将多孔培养板放置在二氧化碳培养箱，在37 ℃，5% (v/v) CO₂条件下孵育1 h。

d. 用磷酸盐缓冲液（PBS）对附着有HCT116细胞的衬底轻柔地冲洗5次，然后用氮气缓慢吹干，待用。

D. 对微纳米级电纺纤维衬底所捕获的结肠癌细胞的观测和计数

a. 将捕获有HCT116细胞的样品，放置在倒置荧光显微镜下，进行明场与暗场的光学观测，如图2所示。

b. 利用CCD数字摄像装置和IPP成像软件, 对上述样品表面所捕获的细胞进行图像拍摄和数据处理。如图3所示，纵坐标表示维纳米级纤维衬底上捕获的细胞密度与平整硅衬底上捕获的细胞密度之比，第一个柱图表示未经任何修饰的两种衬底所捕获细胞的密度之比；第二个柱图表示只经过联酶亲和素（SA）修饰后两种衬底所捕获细胞的密度之比；第三个柱图表示经过联酶亲和素（SA）和抗体(anti-EpCAM)修饰后两种衬底所捕获细胞的密度之比。通过实验数据可得，经过修饰SA和anti-EpCAM后，维纳米级电纺纤维衬底跟平整硅衬底相比，其捕获细胞的性能有15-20倍的提高。

Claims (4)

1.一种基于微纳米纤维的细胞捕获方法，其特征在于，对微纳米纤维表面进行化学修饰，嫁接待捕捉细胞的抗体；然后，通过细胞表面的抗原和微纳米纤维衬底上嫁接的相应抗体之间的免疫反应而实现细胞的捕获。

2.如权利要求1所述的细胞捕获方法，其特征在于，所述微纳米纤维的的直径以及孔隙尺寸都在100-2000 nm之间。

3.如权利要求1或2所述的细胞捕获方法，其特征在于，所述微纳米纤维在同一平面上。

4.如权利要求1或2所述的细胞捕获方法，其特征在于，所述微纳米纤维采用电纺的方法来制备，具体包括以下步骤：

a. 电纺前驱液的配制：称量钛酸丁酯、乙酰丙酮、乙二醇单甲醚和异丙醇，配成混合溶液，搅拌至澄清，再加入聚乙烯吡咯烷酮，常温搅拌2-3 h至高分子充分溶解，备用；

b. 在电纺装置上进行微纳米级电纺纤维衬底的制备：选择洁净硅片或载玻片作为衬底的面板，调节金属喷管的管径、喷管与衬底面板间的距离、施加的直流电压以及电纺时间等参数以获得直径范围在100-2000 nm间，且微纳米纤维网络的孔隙尺寸在100-2000 nm间的微纳米级纤维衬底；

c. 将硅片或载玻片上收集的微纳米级纤维材料，放入马弗炉煅烧，烧除电纺纤维中的高分子支架材料聚乙烯吡咯烷酮。

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