CN104846483A - 水下透明的二氧化硅纳米纤维基底及其制备方法和在循环肿瘤细胞捕获方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水下透明二氧化硅纳米纤维基底及其制备方法和在循环肿瘤细胞捕获方面的应用。本发明将水解的正硅酸乙酯聚合物溶液，通过静电纺丝技术覆盖在基底表面，然后经过烘箱保温进行进一步水解；最后，经过高温煅烧处理，得到水下透明的二氧化硅纳米纤维基底；经过进一步生物化学表面抗体修饰，可用于循环肿瘤细胞的富集和检测。本发明制备的基底具有捕获循环肿瘤细胞效率高、灵敏度高等特点，可用于癌症病人的临床诊断。同时被该基底捕获的肿瘤细胞活性高，可进行实时监测，并提供细胞形态等相关信息，对于肿瘤细胞的后续研究具有潜在意义。
Description
技术领域
本发明涉及功能材料技术、生物医学材料、纳米材料技术领域，具体涉及一种水下透明的二氧化硅纳米纤维基底制备方法及用于循环肿瘤细胞的富集和检测。
背景技术
循环肿瘤细胞，简称CTCs。是指肿瘤细胞从原发肿瘤或者转移灶因自发或者诊疗操作释放进入外周血液循环，形成循环肿瘤细胞。从而后续在离病灶较远的器官增长更多的肿瘤，它是绝大多数恶性肿瘤患者在术后出现远处转移和术后复发的主要原因。1869年，ThomasAshworth首次在一个转移性癌症的患者体内观察到了CTCs，他们推测，细胞与那些在血液中发现的循环肿瘤细胞的识别很可能是在同一个病人体内发现多种肿瘤存在的原因。CTCs检测的重要性在于可以进行癌症病人的早期体外诊断，治疗诊断过程中的辅助手段等，进行判断癌症患者的预后情况及剩余存活时间，主要参照的就是CTCs是否存在及数目变化。
近年来不同形状结构的纳米材料，诸如纳米颗粒、纳米阵列等无机纳米材料以其独特的结构效应被应用于细胞行为及其界面设计等研究中。2012年，Zhang等利用二氧化钛纳米纤维经过功能化处理后做为基底，实现了循环肿瘤细胞的富集和检测(Adv.Mater.,2012,24,2756-2760)。2013年，Park等利用热化学气相沉积生长法制备出表面被金纳米簇均匀包覆的无机硅纳米线阵列基底。该基底经过表面抗体修饰后对靶向肿瘤细胞有高的捕获效率(NanoLett.,2012,12,1638-1642)。但这些基底都不能实现透明化，无法满足直接监测所捕获的肿瘤细胞的要求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种水下透明的二氧化硅纳米纤维基底及其制备方法，以及所述的纳米纤维基底在循环肿瘤细胞富集和检测中的应用。
本发明用于富集和检测循环肿瘤细胞的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底，是将水解的正硅酸乙酯聚合物溶液，通过静电纺丝技术覆盖在超洁净的基底表面，呈纳米纤维状，然后经过烘箱保温进行进一步水解，以实现纳米纤维和基底、纳米纤维和纳米纤维之间的牢固结合；最后，经过高温煅烧处理，将纳米纤维中的有机聚合物成分去除，得到水下透明的二氧化硅纳米纤维基底；经过进一步生物化学表面抗体修饰，所述的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底可用于循环肿瘤细胞的富集和检测。
本发明提供的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底的制备方法，采用静电纺丝技术，具体包括以下几个步骤：
步骤一：将化学纯正硅酸乙酯(TEOS)和结构导向剂溶解在乙醇里，正硅酸乙酯、结构导向剂和乙醇的质量比(w:w:w)满足1:1:6～1:1:7。室温下磁力搅拌，获得均相溶液。将TEOS的水解催化剂逐渐滴加到均相溶液中，水解催化剂和乙醇的质量比(w:w)满足1:95～1:100。然后进行回流加热。所述的回流加热温度为70～80℃。所述的结构导向剂可以为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。当选用聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)两种组成结构导向剂时，二者的质量比为1:2～1:3。
所述的TEOS的水解催化剂可以为盐酸、硝酸、醋酸中的任意一种。
步骤二：选取基底材料，并在基底下面垫有铝箔，采用步骤一中的均相溶液进行二氧化硅复合纳米纤维的静电纺丝过程，通过调控纺丝时间，得到所述基底上不同厚度的二氧化硅复合纳米纤维。所述基底选自玻璃片、云母片、石英片等二氧化硅材质的透明片。所述的静电纺丝过程设定电压为5～30kV之间，接收距离为5～30cm之间。
步骤三：将覆有二氧化硅复合纳米纤维的基底放置在烘箱中进行保温，然后取出放置于马弗炉中进行高温煅烧处理，高温煅烧的处理的温度为500～1000℃，时间为0.5～10小时。冷却后，取出基底，即为本发明制备的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底，其中，二氧化硅纳米纤维直径在200～800nm之间。所述的烘箱的温度在80～120℃之间，保温时间12～48小时。制备得到的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底上二氧化硅纳米纤维的厚度为0.5～6μm，其中当厚度达到2μm以上为佳。
应用上述制备得到的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底用于循环肿瘤细胞的富集和检测，采用表面生物化学修饰技术，将水下透明的二氧化硅纳米纤维基底进行等离子体接枝；然后将二氧化硅纳米纤维基底用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液(优选体积比为4％(v/v))进行室温下修饰(优选时间12h)，然后用4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯修饰(优选时间45min)，然后用1～15μg mL-1的生物素在室温下对二氧化硅纳米纤维基底进行修饰(优选时间30min)，使生物素连接在4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯上，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)对其进行浣洗以便去除多余的生物素。1～20μg的上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM(优选anti-EpCAM的浓度为10μg mL-1，溶剂为磷酸盐缓冲液)的试剂加在二氧化硅纳米纤维基底表面进行修饰，室温下修饰(优选时间30min)，然后用磷酸盐缓冲液进行冲洗。然后加入3mL浓度为105个/mL的乳腺癌细胞(MCF7)的细胞悬浮液，在培养箱温度为37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养。
本发明具有的优点在于：
1、本发明提出一种通过静电纺丝技术制备的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底，造价低廉、操作简单、能耗低、制备效率高，并能用于循环肿瘤细胞的富集和检测。
2、本发明制备的基底具有捕获循环肿瘤细胞效率高、灵敏度高等特点，可用于癌症病人的临床诊断。同时被该基底捕获的肿瘤细胞活性高，可进行实时监测，并提供细胞形态等相关信息，对于肿瘤细胞的后续研究具有潜在意义。
3、本发明制备的基底具有良好的生物相容性，纤维之间孔径在纳米级别，使之具有较大的比表面积，而且整个基底的制备过程无有毒有害物质产生，对环境无污染，且稳定性能好。
4、实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞检测的二氧化硅纳米纤维基底对于特异性乳腺癌细胞MCF7的捕获效率高达40～99％。而做为对照实验中非特异性细胞系如：宫颈癌细胞Hela、人淋巴B细胞瘤Daudi、人外周血白血病T细胞Jurkat T在抗体修饰后的二氧化硅纳米纤维基底上极少粘附。这些数据表明，本发明的用于捕获肿瘤癌细胞的二氧化硅纳米纤维基底，具有较高的检测效率和灵敏度。
附图说明
图1：本发明所采用的静电纺丝技术制备二氧化硅纳米纤维的流程示意图；
图2：本发明实施例1的二氧化硅纳米纤维环境扫描电镜照片；(本照片及以下环境扫描电镜照片均由型号为FEI Quanta 200的环境扫描电子显微镜在7千伏电压下拍摄)
图3：本发明实施例1的制备的厚度为2μm的二氧化硅纳米纤维层的侧面扫描电镜照片；
图4：本发明实施例1的制备的用于捕获循环肿瘤细胞的二氧化硅纳米纤维基底置于水中的照片，说明在水中该基底展示出良好的透明性；
图5：本发明实施例1的二氧化硅纳米纤维基底进行生物化学修饰的过程示意图；
图6：本发明实施例1的二氧化硅纳米纤维基底捕获不同肿瘤细胞效率的定量数据；
图7：本发明实施例1的二氧化硅纳米纤维基底捕获乳腺癌细胞MCF7的免疫荧光显微照片；
图8：本发明实施例1的二氧化硅纳米纤维基底捕获乳腺癌细胞MCF7的明场照片；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1.
步骤一：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Mw≈1,300,000)、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)做为结构导向剂。将1.5g的正硅酸乙酯TEOS、0.5g的P123、1.18g的PVP溶解在10g乙醇里，室温下磁力搅拌1小时，获得均相溶液。将TEOS的水解催化剂，即0.1g的2M的HCl溶液逐滴加入到均相溶液中。然后在70℃下回流加热0.5h。
步骤二：如图1所示，纺丝电压为15kV，6号针头，以超洁净玻璃片为基底，基底下面垫有铝箔，接收距离为20cm，进行二氧化硅复合纳米纤维的静电纺丝过程，根据纺丝纤维厚度，确定纺丝时间45min，在石英片基底上制备得到二氧化硅复合纳米纤维。
步骤三：将覆有二氧化硅复合纳米纤维的玻璃片基底放置在80℃的烘箱中48h，进行进一步正硅酸乙酯的水解，以实现二氧化硅复合纳米纤维和玻璃片基底，二氧化硅复合纳米纤维和二氧化硅复合纳米纤维之间的牢固结合。将该覆有二氧化硅复合纳米纤维的玻璃片基底取出后放置于马弗炉中，以2℃/min的速率升温至500℃，然后在500℃保温10h，后逐渐冷却，取出，得到水下透明的二氧化硅纳米纤维基底待用。煅烧后得到二氧化硅纳米纤维基底的环境扫描电镜照片如图2所示，二氧化硅纳米纤维均匀的铺展在基底表面。如图3所示，二氧化硅纳米纤维层的侧面扫描电镜照片显示，二氧化硅纳米纤维厚度为2μm。
将上述制备得到的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底首先进行等离子体接枝(型号为DT-03低温等离子体表面处理仪，苏州奥米格机电科技有限公司)，功率设定为200W，时间为300s；然后在二氧化硅纳米纤维基底表面修饰生物素。
二氧化硅纳米纤维基底先用体积比为4％(v/v)的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行室温下修饰12h，然后用0.25mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯修饰45min，使其修饰在基底的表面，然后用10μg mL-1的生物素在室温下对二氧化硅纳米纤维基底进行修饰30min，使生物素连接在4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯上，然后用磷酸盐缓冲液PBS对其进行5次浣洗以便去除多余的生物素。20μg的上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM(anti-EpCAM的浓度为10μg mL-1溶剂为磷酸盐缓冲液)的试剂加在二氧化硅纳米纤维基底表面进行修饰，室温下修饰30min，然后用磷酸盐缓冲液PBS进行冲洗一次，如图5所示。
将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底放置在六孔板里，然后加入3mL浓度为105个/mL的乳腺癌细胞(MCF7)的细胞悬浮液，在培养箱温度为37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纳米纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，对被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率，二氧化硅纳米纤维基底对乳腺癌细胞MCF7的捕获效率较高，如图6所示。所捕获的乳腺癌细胞MCF7的免疫荧光显微照片如图7所示，从图中可以看到，乳腺癌细胞MCF7跟二氧化硅纳米纤维基底结合较好。所捕获的乳腺癌细胞MCF7的明场照片如图8所示，从图中可以看出，被二氧化硅纳米纤维基底捕获的乳腺癌细胞MCF7的形貌保持较好。
作为对照组1，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在六孔板的底部，然后向六孔板的每个孔里加入3mL浓度为105个/mL宫颈癌细胞Hela的细胞悬浮液，在培养箱温度为37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纳米纤维基底被轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞需要进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的二氧化硅纳米纤维基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个二氧化硅纳米纤维基底取10个不同位置，然后对该二氧化硅纳米纤维基底上所捕获的宫颈癌细胞Hela进行计数，计算捕获效率，如图6所示。
作为对照组2，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在六孔板的底部，然后向六孔板的每个孔里加入3mL浓度为105个/mL人淋巴B细胞瘤Daudi的细胞悬浮液，在培养箱37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纳米纤维基底被轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞需要进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个二氧化硅纳米纤维基底，每个二氧化硅纳米纤维基底取10个不同位置，然后对该二氧化硅纳米纤维基底上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率，如图6所示。
作为对照组3，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在六孔板的底部，然后向六孔板的每个孔里加入3mL浓度为105个/mL人外周血白血病T细胞Jurkat T的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纳米纤维基底被轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞需要进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的二氧化硅纳米纤维基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个二氧化硅纳米纤维基底，每个二氧化硅纳米纤维基底取10个不同位置，然后对该二氧化硅纳米纤维基底上所捕获的人外周血白血病T细胞Jurkat T进行计数，计算捕获效率，如图6所示。
实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞捕获的二氧化硅纳米纤维基底对于乳腺癌肿瘤细胞MCF7的捕获效率为85.1％。对照实验中的宫颈癌细胞Hela的捕获效率仅为4.8％；人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为1.9％；人外周血白血病T细胞Jurkat T的捕获效率仅为0.8％。这些数据表明，本发明的用于捕获肿瘤癌细胞的二氧化硅纳米纤维基底，具有较高的循环肿瘤癌细胞捕获效率和灵敏度，且被捕获的循环肿瘤癌细胞活性高。
实施例2.
步骤一：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Mw≈1,300,000),聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)做为结构导向剂。将1.5g的TEOS、0.5g的P123、1.18g的PVP溶解在10g乙醇里，室温下磁力搅拌1h，获得均相溶液。将TEOS的水解催化剂，即0.1g的2M的HNO3被逐渐滴加入到均相溶液中。然后在75℃下被回流加热0.5h。
步骤二：纺丝电压为20kV，6号针头，以超洁净云母片为基底，基底下面垫有铝箔，接收距离为30cm，进行二氧化硅复合纤维的静电纺丝过程，根据纺丝纤维厚度，纺丝时间90min，得到厚度为5μm的二氧化硅复合纳米纤维层。
步骤三：将覆有二氧化硅复合纳米纤维层的基底放置在100℃的烘箱中24h，进行进一步正硅酸乙酯的水解，以实现二氧化硅复合纳米纤维和基底，二氧化硅复合纳米纤维和二氧化硅复合纳米纤维之间的牢固结合。将该覆有二氧化硅复合纳米纤维层的基底取出后放置于马弗炉中，以2℃/min的速率升温至800℃，然后在800℃保温2h后逐渐冷却，取出基底待用。
上述水下透明的二氧化硅纳米纤维基底的应用：将二氧化硅纳米纤维基底进行等离子体接枝，功率设定为200W，时间为300s；然后在二氧化硅基底表面修饰生物素：首先，二氧化硅纤维基底先用体积比为4％(v/v)的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行室温下修饰12h，然后用0.25mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯修饰45min，然后用10μg mL-1的生物素在室温下对二氧化硅基底进行修饰30min，使生物素连接在4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯上，然后用磷酸盐缓冲液PBS对其进行5次浣洗以便去除多余的生物素。20μg的上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM(anti-EpCAM的浓度为10μg mL-1溶剂为磷酸盐缓冲液)的试剂加在基底表面进行修饰，室温下修饰30min，然后用磷酸盐缓冲液PBS进行冲洗一次。
修饰上抗体之后，二氧化硅纤维基底被放置在六孔板里，然后加入3mL浓度为105个/mL乳腺癌细胞(MCF7)的细胞悬浮液，在培养箱37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底被轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞需要进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。
作为对照组1，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个六孔板里加入3mL浓度为105个/mL的宫颈癌细胞Hela细胞悬浮液，在培养箱37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的宫颈癌细胞Hela进行计数，计算捕获效率。
作为对照组2，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个六孔板里加入3mL浓度为105个/mL的人淋巴B细胞瘤Daudi的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
作为对照组3，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个六孔板里加入3mL浓度为105个/mL的人外周血白血病T细胞Jurkat T的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的人外周血白血病T细胞Jurkat T进行计数，计算捕获效率。
实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞捕获的二氧化硅纳米纤维基底对于乳腺癌肿瘤细胞MCF7的捕获效率为86.7％。对照实验中的宫颈癌细胞Hela的捕获效率仅为4.2％；人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为1.7％；人外周血白血病T细胞Jurkat T的捕获效率仅为0.9％。这些数据表明，本发明的用于捕获肿瘤癌细胞的二氧化硅纳米纤维基底，具有较高的循环肿瘤癌细胞捕获效率和灵敏度，且被捕获的循环肿瘤癌细胞活性高。
实施例3.
步骤一：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Mw≈1,300,000),聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)做为结构导向剂。将1.5g的TEOS，0.5g的P123,1.18g的PVP溶解在10g乙醇里，室温下磁力搅拌1h，获得均相溶液。将TEOS的水解催化剂，即0.1g的2M的醋酸被逐渐滴加入到溶液中。然后溶液在80℃下被回流加热3h。
步骤二：纺丝电压为30kV，6号针头，以超洁净石英片为基底，下面垫有铝箔，接收距离为5cm，进行二氧化硅复合纳米纤维的静电纺丝过程，根据纺丝纤维厚度，纺丝时间60min，得到厚度为3μm的二氧化硅复合纳米纤维层。
步骤三：将覆有二氧化硅复合纳米纤维层的基底放置在120℃的烘箱中12h，进行进一步正硅酸乙酯的水解，以实现二氧化硅复合纳米纤维和基底，二氧化硅复合纳米纤维和二氧化硅复合纳米纤维之间的牢固结合。将覆有二氧化硅复合纳米纤维层的基底取出后放置于马弗炉中，以2℃/min的速率升温至1000℃，然后在1000℃保温0.5h，后逐渐冷却，取出基底，即为水下透明的二氧化硅纳米纤维基底，待用。
上述制备得到的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底用于循环肿瘤细胞的富集和检测，首先将二氧化硅纳米纤维基底进行等离子体接枝，功率设定为200W，时间为300s；然后在二氧化硅基底表面修饰生物素。首先，二氧化硅纤维基底先用体积比为4％(v/v)的(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行室温下修饰12h，然后用0.5mM的4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯修饰30min，然后用10μg mL-1的生物素在室温下对二氧化硅基底进行修饰30min，使生物素连接在4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯上，然后用磷酸盐缓冲液PBS对其进行5次浣洗以便去除多余的生物素。20μg的上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM(anti-EpCAM的浓度为10μg mL-1溶剂为磷酸盐缓冲液)的试剂加在基底表面进行修饰，室温下修饰30min，然后用磷酸盐缓冲液PBS进行冲洗一次。
修饰上抗体之后，二氧化硅纤维基底被放置在六孔板里，然后加入3mL浓度为105个/mL的乳腺癌细胞(MCF7)的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纳米纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的乳腺癌细胞MCF7进行计数，计算捕获效率。
作为对照组1，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个六孔板里加入3mL浓度为105个/mL宫颈癌细胞Hela的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的宫颈癌细胞Hela进行计数，计算捕获效率。
作为对照组2，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个六孔板里加入3mL浓度为105个/mL人淋巴B细胞瘤Daudi的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μgmL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的人淋巴B细胞瘤Daudi进行计数，计算捕获效率。
作为对照组3，将进行表面修饰过的二氧化硅纳米纤维基底正面朝上放置在6孔板的底部，然后向每个六孔板里加入3mL浓度为105个/mL人外周血白血病T细胞Jurkat T的细胞悬浮液，在培养箱温度37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养45min，捕获有细胞的二氧化硅纤维基底轻轻地在磷酸盐缓冲溶液中洗3次。然后，被捕获的细胞进行荧光显微镜观察，具体步骤如下：首先，被捕获的细胞用质量浓度为4％的多聚甲醛进行固定20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗一次。然后，固定有细胞的基底滴入20μL的体积浓度为0.2％的聚乙二醇辛基苯基醚进行细胞的穿膜10min，紧接着进行磷酸盐缓冲液清洗一次。最后，加入20μL的2μg mL-1的4',6-二脒基-2-苯基吲哚进行细胞核染色，同样进行一次磷酸盐缓冲液冲洗，用Nikon倒置荧光显微镜10倍下进行计数拍照，每组每次选取3个基底，每个基底取10个不同位置，然后对该基底上所捕获的人外周血白血病T细胞Jurkat T进行计数，计算捕获效率。
实验结果表明，本发明的用于循环肿瘤细胞捕获的二氧化硅纳米纤维基底对于乳腺癌肿瘤细胞MCF7的捕获效率为84.6％。对照实验中的宫颈癌细胞Hela的捕获效率仅为3.9％；人淋巴B细胞瘤Daudi的捕获效率仅为1.5％；人外周血白血病T细胞Jurkat T的捕获效率仅为0.8％。这些数据表明，本发明的用于捕获肿瘤癌细胞的二氧化硅纳米纤维基底，具有较高的循环肿瘤癌细胞捕获效率和灵敏度，且被捕获的循环肿瘤癌细胞活性高。
Claims (9)
1.水下透明的二氧化硅纳米纤维基底的制备方法，采用静电纺丝技术，其特征在于，具体包括以下几个步骤：
步骤一：将正硅酸乙酯和结构导向剂溶解在乙醇里，室温下磁力搅拌，获得均相溶液；将TEOS的水解催化剂逐渐滴加到均相溶液中，然后进行回流加热；
步骤二：选取基底材料，并在基底下面垫有铝箔，采用步骤一中回流加热后的均相溶液进行二氧化硅复合纳米纤维的静电纺丝过程，得到覆有二氧化硅复合纳米纤维的基底；
步骤三：将覆有二氧化硅复合纳米纤维的基底放置在烘箱中进行保温，然后取出放置于马弗炉中进行高温煅烧处理，高温煅烧的处理的温度为500～1000℃，时间为0.5～10小时；冷却后，取出基底，即为本发明制备的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的正硅酸乙酯、结构导向剂和乙醇的质量比满足1:1:6～1:1:7；水解催化剂和乙醇的质量比满足1:95～1:100。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的结构导向剂为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种；所述的水解催化剂为盐酸、硝酸、醋酸中的任意一种；所述基底选自玻璃片、云母片或石英片。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤一中回流加热温度为70～80℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤二中所述的静电纺丝过程设定电压为5～30kV之间，接收距离为5～30cm之间。
6.根据权利要求1～5中任意一个权利要求中所述的制备方法，其特征在于：选用聚乙烯吡咯烷酮、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物做为结构导向剂；选取正硅酸乙酯1.5g、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物为0.5g、聚乙烯吡咯烷酮为1.18g，乙醇为10g。
7.水下透明的二氧化硅纳米纤维基底，其特征在于：二氧化硅纳米纤维直径在200～800nm之间；基底上二氧化硅纳米纤维的厚度为0.5～6μm。
8.根据权利要求7所述的水下透明的二氧化硅纳米纤维基底，其特征在于：二氧化硅纳米纤维厚度为2～6μm。
9.水下透明的二氧化硅纳米纤维基底在循环肿瘤细胞捕获方面的应用，其特征在于：应用水下透明的二氧化硅纳米纤维基底进行循环肿瘤细胞的富集和检测，首先将水下透明的二氧化硅纳米纤维基底进行等离子体接枝；然后将二氧化硅纳米纤维基底用(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液进行室温下修饰，然后用4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯修饰，然后用1～15μg mL-1的生物素在室温下对二氧化硅纳米纤维基底进行修饰，使生物素连接在4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯上，然后用磷酸盐缓冲液对其进行浣洗；1～20μg的上皮细胞粘附分子抗体anti-EpCAM的试剂加在二氧化硅纳米纤维基底表面进行修饰，室温下修饰，然后用磷酸盐缓冲液进行冲洗；然后加入3mL浓度为105个/mL的乳腺癌细胞的细胞悬浮液，在培养箱温度为37℃和二氧化碳体积浓度为5％的环境下培养。
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