CN101535473A - 反应性表面、基质及生产和利用它们的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了反应性表面、基质及生产和利用这类基质和表面的方法。所述基质和表面提供了优选在另外的非反应性表面上的低密度反应性基团，用于各种不同应用，包括单分子分析。

Description

反应性表面、基质及生产和利用它们的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求Roitman等人2005年9月30日提交的名为“反应性表面、基质及生产和利用它们的方法”的USSN 11/240,662的优先权。该在先申请以其全文纳入本文作参考。
关于联邦资助研究的声明
不适用
发明背景
“上帝制造了固态，却将它的表面留给了魔鬼。”—Enrico Fermi
这种感受对材料科学家来说并不陌生。对表面特性和它与环境的相互作用的了解或缺乏了解一直是不朽发现和不朽失败的重点。事实上，这一问题渗透着每种技术努力，无论是工程、化学或生物学领域，无论是着眼于纳米材料技术、外星球探测、半导体技术、生物技术制造或药物施用和递送。而对材料的堆积性能的理解提出了一个问题，即材料的失效点，而且，必须理解和/或处理该材料的表面特性，而该表面将如何与环境相互作用又是完全不同的事物。
本发明涉及经选择和/或配置来满足各种不同需要的材料和/或它们的表面，各种不同需要包括但不限于，选择性结合到所需分子而防止过度结合不需要分子的能力和本领和其它通过阅读以下说明书可以明显知道的有益特性。
发明概述
本发明总体涉及具有各种不同用途的承载有改良表面的基质，以及生产这类基质及利用和应用这类基质的方法。具体说，本发明基质具有其上排列有选定密度的反应性基团和优选为选定低密度的这类反应性基团的表面。
在第一方面，本发明提供了一种包含表面的基质，所述表面包含偶联其上的第一反应性部分。根据本发明这一方面，所述反应性部分可以约1反应性部分/50,000nm2-1反应性部分/100nm2的密度结合到表面。类似地，本发明还提供了一种设备，包括其上结合有反应性部分的表面，其中所述反应性部分以小于1反应性部分/100nm2的密度结合到表面。
本发明还相关提供了包括其上结合有至少第一观察区的基质的装置，所述观察区的面积约为100-50000nm2。根据本发明的这些方面，所述基质包括结合到所述观察区内的表面的1-3个反应性部分。
本发明还提供了生产本发明基质和装置的方法，所述方法通过下述步骤实现：提供具有第一反应性表面的基质，然后提供第一和第二表面改良剂的混合物，其中所述第一和第二表面改良剂均能各自偶联到反应性表面，并以所选第一比率存在于混合物中以使所述第一和第二表面改良剂以第二比率结合到反应性表面。然后使所述反应性表面接触所述混合物来产生具有以第二比率偶联其上的第一和第二改良剂的改良表面。
还相关提供制备改良表面的方法，包括提供待改良表面，使所述待改良表面与表面改良组合物接触。在本发明的这个方面，所述表面改良组合物包含结合所需(desired)反应性部分的第一表面改良剂，和不结合所需反应性部分的第二表面改良剂。所述第一表面改良剂和第二表面改良剂以能产生所述改良表面的比率存在于所述表面改良组合物中，其中所述反应性部分以约1反应性部分/50,000nm2-1反应性部分/100nm2的密度存在于所述改良表面。
在还有另一方面，本发明提供了配置一种其上具有预期密度反应性部分的表面的方法，包括用基本上均匀结合到表面的组合物来处理表面，所述组合物包含不含有反应性部分的第一组分和含有反应性部分的第二组分，所述第二组分在组合物中的浓度与所述第一组分有关，从而能够在所述表面上提供预期密度的反应性部分。
附图描述
图1是其上具有低密度反应性基团的表面的示意图。
图2是具有分层或多层作用状态的基质示意图，其上提供了相对低密度的反应性基团。
图3是一种生产本发明表面的示例性方法的示意图。
图4是另一种生产本发明所述低密度反应性表面的示例性方法的示意图。
图5是基于位阻生产本发明表面来提供选择性定位的反应性基团的方法例的示意图。
图6是其上排列有两种不同功能的衍生基团来获得相对低密度反应性表面的表面示意图。
图7是其它地方为非反应性基团的表面中浓度各异的反应性基团表面上的水接触角的曲线图。
发明详述
本发明一般涉及材料和它们的表面，下文中通常称基质，其中所述表面经选择和/或配置而具有进行各类应用所需的特性。本发明还涉及生产这类表面的方法和工艺，以及在各种用途中使用这类表面的方法和工艺。
本发明尤其感兴趣的是具有选择性分子结合或连结特性的基质和表面，如通过在其上选择性包含分子结合部分，和选择性地利用这类表面来选择性地将所需分子结合到所述表面。较感兴趣的还有当这类表面选择性结合到化学和/或生物活性分子时，可以将它们用于化学和/或生物过程，如制备操作和/或分析操作中。
尽管可以从下文中获知本发明的用途广泛，在一个尤其优选的实施例中，在观察和/或监控区域内，具有低密度反应性基团的表面包括单个反应性基团，优选酶，如核酸聚合酶，能使观察者实时了解该单个酶所催化的反应，如DNA合成。这类系统对核酸的模板依赖型分析或测序尤其有用。
I.基质和表面
A.概述
如上所述，在化学和生物科学和利用这些科学的工业中，对表面在分子水平上与其环境相互作用的能力和/或倾向尤其感兴趣。例如，过去对表面上存在的反应性基团进行操作的努力主要着眼于一个或另一个极端。具体说，通过使表面上反应性基团数目最大化来使结合到具体表面的分子密度最大化，如高密度结合，而使许多应用从中获益。其它应用中，目的是基本上排除表面和与那些表面接触的材料间的所有结合或其它连结作用，包括吸附作用，通过覆盖或遮盖表面上的反应性基团为特定应用创建惰性表面。
例如在生物反应性表面的情况下，例如DNA阵列技术，关注在特定区域内尽量多地结合活性多核苷酸探针，从而使这类探针产生的杂交反应性信号最大化。同样，采用例如抗体的亲和表面也类似地关注于增加表面上结合基团的密度来增加灵敏性。或者，许多其它应用中，过去的努力主要涉及有效中和表面结合作用，以将表面与化学或生物化学环境的相互作用减到最小或将其消除。例如，微观流体学领域，具体包括毛细管电泳领域中，有很多研究人员鉴定能够掩蔽熔融石英毛细管的任何功能基团以避免分子与那些表面发生任何结合的涂层材料或其它表面处理方法。
然而，本发明针对特定表面上既没有将反应性化学基团既不会最多，又不会完全消除的表面。本发明提供了一种其上具有选定相对低密度的反应性基团的表面和这类表面的许多有价值的应用。(技术人员)将会意识到，反应性基团的性质并非指或需要某一基团能与另一基团共价连结，而是包括能产生其它相互作用形式的基团，包括疏/亲水性作用、范德瓦尔作用(Van der Waals interaction)等。如此，如本文所述的表面反应性包括但不限于共价结合和非共价结合，如吸附。
尽管为了便于讨论，本文中以平面固体基质描述所述基质和表面，应该意识到本发明的方法、过程、表面等可以应用于能应用本发明反应性表面特性的各种不同基质类型。具体说，这类表面可以包括平面固体表面，包括无机材料，如二氧化硅基基质(即，玻璃、石英、熔融石英、硅等)、其它半导体材料(即III-V族、II-VI族或IV族半导体)，和有机材料，如聚合材料(即，聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖或任何常规用作反应性介质支持物的各种有机基质材料)。除了用作基质的材料的种类以外，还应该意识到这类材料可以有各种物理形状，如微粒，即珠子、纳米颗粒，即纳米晶体、纤维、微纤、纳米纤维、纳米丝、纳米管、垫、平面薄片、平面圆片或载玻片、多孔平板、包括其它结构的光学载玻片、毛细管、微流体通道等。
实施时，本发明表面的选择性和限制性反应性旨在以限制性方式在表面上提供具体需要的感兴趣分子或分子类型，通常是选定的感兴趣反应性分子，如特定酶、核酸等，而阻止感兴趣分子和/或其它潜在的妨碍分子结合到表面上其它地方。优选用途中，所期望结果是得到包括被其它地方的非反应性表面所包围的相对低密度选定反应性分子的表面。尽管讨论了感兴趣的分子或分子类型，应该意识到，包括如2、3、4或更多种感兴趣的不同分子或分子类型的混合功能性表面也属于本发明范围内。
因此，本文用来修饰本发明基质表面上不同基团的术语“反应性”和“非反应性”指(1)这类表面组分与感兴趣的特定分子间的相对反应性或联结性(association)，和优选还指(2)这类表面组分与这类表面的特定应用中的其它物质间的相对反应性或联结性，所述物质可能干扰这类应用，包括如标记反应物和/或可能干扰检测的产物，以及抑制剂或会干扰在所述表面反应性部位或其它位置进行的感兴趣反应过程的其它试剂。
根据这类反应性的第一方面，表面上的所述反应性部分或基团通常对感兴趣分子的亲合力比非反应性表面高出10倍，优选高出100倍以上，和更优选至少高出1000倍。因此，应该意识到在相同条件下，感兴趣分子和反应性表面的联结水平实质性高于非反应性表面，如，高出10倍以上、高出100倍以上和优选高出1000倍以上。这种更高的联结性包括各联结的更高频率和/或更高的持续时间。
根据表面反应性或非反应性的第二方面，在许多情况下，这类反应性与第一方面一致。具体说，当酶构成表面反应性部分时，通常与其基质具有高亲合力，因此，与这类基质的联结水平比非反应性部分高得多，例如上面所述。然而，有些情况下，表面的“反应性”部分可以不具有与某些潜在干扰分子联结的能力。这种情况下，还可以采用术语吸附性和非吸附性。尽管如此，还是希望可以防止这类干扰分子与表面剩余部分联结。因此，可以根据所述非反应性表面与这类干扰组分的反应性来定义所述非反应性表面。
因为许多应用中的不良干扰的主要来源都是试剂与表面非反应性部位而非预期的反应性部位的非特异性作用，这种情况下，通常可以通过非反应性基团和具体干扰分子间的联结平衡常数来表征所述非反应性表面，该常数优选比反应性表面与反应性分子间的联结平衡常数低10倍，优选低100倍(或更低)。还可以通过低活化障碍来表征非反应表面的联结反应性，从而可以预期对应的离解反应动力学应该很快，其平均结合时间优选至少比所述应用中检测过程的有效时间范围(significanttimescale)短至少10倍，优选短100倍或更多。
应该意识到，这类非反应性和反应性表面的所述特征通常取决于所述表面的具体用途，包括环境特征，如pH、盐浓度等。在尤其优选的方面，环境条件通常包括生物化学系统的那些条件，如，pH约为2-9和具有生物化学相关离子强度的盐离子水平，如，约为0-100mM。
图1以块状图形式提供了本发明表面的简单示意图。如图所示，基质100包括表面102。如本文其它地方所提到，任选衍生表面102提供整个活性表面104。如下所述，任选地，所述基质可以天然(inherently)具有整个反应性表面。然后，处理所述反应性表面104来提供包括以相对低密度与所述反应性表面104结合的反应性基团106的表面。如下所述，这些反应性部分优选位于另外的(otherwise)中性或非反应性表面108上或当中。在尤其优选的方面，所述反应性基团106可以包括，或经进一步处理而包括其它反应性基团，如，催化组分，如酶110等，也如图1所示。
本发明表面的一个重要优点是能提供相对分离的反应性基团。反应性基团的分离使得能够不受毗邻反应性基团干扰而进行和/或监测特定的反应。这在进行基于单分子反应的分析时、检测分辨需要分离时(例如能够光学上区分反应性分子(光学分离)、电化学区分不同反应性分子的反应(电化学分离)，或者当来自一个部位某一反应的化学污染可能影响毗邻部位的反应(化学分离))尤其有价值。
本发明表面的另外优点是所述表面剩余部位能够无活性而不结合潜在的干扰分子，如荧光分析物或产物。具体说，尽管在一些应用中需要结合少许选定分子，但不受控或非特异性地结合表面剩余部位往往是非常不希望的。通过只是以有选择的、相对低密度提供自身带有具有所需反应性部分的所需反应性基团，或者在一些情况下，只是以有选择的、相对低密度提供能与具有所需反应性的另一种分子反应的所需反应性基团，可以根据需要选择性地处理表面剩余部位使它能够有效抵制不需要的结合，从而大大减少或消除表面其它部位的这类不需要的结合。根据本发明优选方面，提供选定的反应性基团和在表面剩余部位提供非反应性基团来减少这类不需要的表面作用，得以在相同的处理步骤中实现。
B.密度
根据本发明，在表面上设计低密度的、选定的所需反应性部分或化学基团，以在相对大区域内提供单个反应性部分，用于某些用途，例如单分子分析，而该区域其余部位基本上为非反应性。通常，这意味着任何存在于所述表面区域剩余部位的反应性基团均被覆盖、掩蔽或用其它方式将其变成非反应性。因此，低密度反应性基团通常以反应性基团密度大于1/1×106nm2表面积但小于约1/100nm2存在于基质表面。在更优选方面，表面上所述反应性基团的密度将大于1/100,000nm2、1/50,000nm2、1/20,000nm2和1/10,000nm2，和将小于约1/100nm2、1/1000nm2和1/10,000nm2。某些优选应用中，所述密度通常落于约1/2500nm2-1/300nm2之间，在有些情况下高达约1/150nm2。
C.观察区
在尤其优选的方面，本发明在表面上提供了一定密度的反应性基团，使得在进行监测或观察(“观察区”)的区域内存在1个、2个、3个或少许反应性基团。通过在观察区内提供单个或少许反应性基团，观察者可以具体监测所述具体单个反应性基团的反应或经其催化的反应。可以通过进行监测的检测系统来确定这类观察区，例如，对准基质表面来查询如产生、消耗或结合荧光、荧光团、发光、生色团或发色团反应物的反应的激光斑大小，或光学监测系统的光学纤维的纤维尖端区域，化学域效应晶体管(chemical field effect transistor，ChemFET)的栅区等，或者可以单独限定观察区，如通过采用结构或光学限制(confinement)来进一步限定和描绘观察区。
尤其优选的观察区的例子包括光学限制，如零模式波导(ZMW)。零模式波导以及它们在单分子分析中的应用非常详尽地描述于美国专利号6,917,726，出于所有目的以其全文纳入本文作参考。因为这类ZMW能提供极小如仄升(zeptoliters)数量级的观察体积，因此已被研究用于单分子分析中。在这类情况下，所述观察区通常包括所述观察体积的横截面积，具体是横断所涉及的表面的那部分观察体积。
优选方面中，本发明在波导底面提供了一个或仅少数个反应性基团。这种情况下，用反应性基团数目除以波导底面面积来检测密度。因此，单纯处于示例性的目的，当圆形波导的半径为10nm，在其底面上固定有单个反应性分子时，则所述反应性基团的密度约为1/314nm2。因此，举例来讲，采用零模式波导或其它观察区的话，应该意识到分别(即面积约大分子数目越多)以半径约为10-100nm或面积约为314-31,416nm2的区域中有1个、2个、3个或多达10个反应性分子的密度存在的反应性分子被本文所述密度所涵盖。优选方面，通常优选每观察区中存在1个、2个或3个分子。
在许多情况下，ZMW以10、100、1000、10,000或更多波导的阵列提供。因此，难以在各种和每种ZMW中固定单个反应性基团，如酶。然而，制备一些不被酶占据的ZMW时，基于稀释的方法与本发明表面组合一般将导致大部分被酶占据的ZMW(其中固定有至少一个酶分子的那些ZMW)中仅有一个或所需数目的酶。具体说，在ZMW具有反应性分子像酶位于其中的情况下，通常，50％以上被占据的ZMW将有一个或所需数目的反应性分子位于其中，如，具体类型的酶分子，优选大于75％和更优选大于约90％和甚至大于95％被占据的ZMW其中将带有所需数目的反应性分子，其尤其优选方面可以是1个、2个、3个或高达10个特定类型的反应性分子。如其它地方所提到，在有些情况下，还可以提供所需密度的不同反应性分子来提供混合性功能表面。根据本发明，根据所涉及的反应性基团的种类，如催化型或结合型，应该意识到可确定单个占据的ZMW或阵列中的多ZMW的密度。
D.具体反应性基团
本发明表面上存在的所述反应性基团或部分包括具有化学和/或生物学活性的各种各样不同类型的反应性基团，它们可以通过外加而结合到材料或基质表面，或者本来就存在于这类表面上。这些反应性基团包括具有结合其它化学基团的活性的表面基团，如能够通过特异性或非特异性相互作用、通过共价吸附、范德瓦尔斯力、疏水作用等结合另一种化学部分。本领域容易了解为表面提供大量反应性基团的方法，包括，例如，离子性官能团、多离子基团、环氧化物、酰胺、巯基、疏水基团，如脂族基、单或多环基团等，如常用于反相和/或疏水作用色谱(HIC)中的施陶丁格结扎基团(staudinger ligation groups)(参见例如，Lin等，J.Am.Chem.Soc.(2005)，127：2686-95)、采用化学选择性叠氮乙炔键的Click化学偶联(Click chemistrycoupling)(参见，Deveraj等，JACS 2005，127：8600-8601；Lummerstorfer等，J.Phys.Chem.B(2004)108：3963-3966和Collman等，Langmuir(2004)20：1051-1053，均以其全文纳入本文作参考)和以非特异性方式结合其它基团或能够与其它基团偶联的其它基团。此外，还描述了如何利用表面上的特异性结合基团，如能特异性识别互补结合伴侣的基团，包括如，互补核酸对、抗体-表位对，能识别特异性大分子结构的结合肽，如蛋白质识别序列、肽或核酸、凝集素、螯合剂、生物素-抗生物素键等。
通常可以通过利用在许多情况下本身就是反应性基团的报告子分子来确定反应性基团的数目和/或密度。具体举例来讲，可以通过分析酶活来确定偶联到表面区的酶分子数目。同样，还可以通过其它方法，如滴定、偶联标记基团等来定量其它反应性基团。
本文采用的反应性基团和非反应性基团预想了一种将应用所述表面的环境，并且在该环境中反应性或非反应性很明显。应该意识到，不同的基团可能会在某些环境中有反应性，而在其它环境中没有反应性，本发明，如广泛实施的，考虑可应用于很多不同环境中。为了便于讨论，在优选方面，本发明表面最常用于生物或生物化学反应中，因此处于合适的环境中。这类环境通常包括具有生物化学相关离子强度、pH约为2-9和优选约为5-8但可以根据所进行反应而变化的水系统。
在某些优选方面，所述反应性化学基团还包括具有催化活性，如能与另一部分作用而改变该部分而不是通过结合，即，酶活性、催化电荷转移活性等的基团。在尤其优选方面，本发明所述活性化学基团包括化学结合基团，此外任选地是催化性基团，根据本发明利用所述结合基团将催化性基团偶联到某一表面。例如，酶或其它催化性基团可以经由中间结合或接头基团偶联到表面上，而所述中间结合或接头基团反过来直接偶联到以预期密度淀积在表面材料上的反应性基团。
根据本发明可以采用各种各样的反应性基团，这一定程度上取决于所采用的表面以及所述反应性基团是否提供一般低密度的、或非特异性结合或联结功能、低密度特异性结合功能、或低密度催化功能。
例如，就二氧化硅基表面，如玻璃、石英、熔融石英、硅等而言，可以通过对表面进行硅烷处理，如使用环氧硅烷、氨基硅烷、活化羧酸硅烷、异氰酸硅烷、醛硅烷、巯基硅烷、乙烯基硅烷、羟末端硅烷、丙烯酸硅烷等来提供反应性基团。这类处理可以产生如称为低密度非特异性联结基团的反应性基团，或者它们可以产生或经进一步处理提供特异性结合基团或催化性基团，来作为最终反应性基团。或者或此外，表面上还可以提供其它无机或有机反应性基团。在无机表面像二氧化硅基基质的情况下，这类另外材料可以经由中间化学偶联，如采用即如上所述的硅烷化学而偶联到表面上。这些另外材料可以包括小分子，如离子基团、金属离子、有机小基团以及较大或聚合物/寡聚物分子，如有机聚合物。为了便于讨论，本文中可以交换使用聚合物和寡聚物来指包括多个化学结构类似的亚单位的分子。
在尤其优选方面，可以采用较长接头分子，优选有机接头分子将反应性基团联接到表面，例如通过在表面和反应性基团间提供更大空间来增进整体联接的弹性。具体说，一端具有预期反应性基团的聚合物或寡聚物链，例如在玻璃表面的情况下，可以通过硅烷联接将其另一端联接到表面。通过选择不同类型和长度的聚合物接头，可以进一步调节表面特性，如不同基团/区域的相对疏水性、与表面的相对距离、整体或局部表面电荷等。可用接头的例子包括如：纤维质聚合物(如羟乙基-纤维素、羟丙基-纤维素等)、烷基或烯基接头、多元醇(如聚乙基二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA))、丙烯酸聚合物(如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等)、聚乙烯聚合物(如聚环氧乙烷)、生物聚合物(如聚氨基酸像聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸等)，其它糖聚合物(如黄原胶、藻酸盐、右旋糖苷)、合成聚阴离子或聚阳离子(如聚丙烯酸、羧末端树枝状聚合物(dendrimers)、聚乙烯亚胺等)等。此外，根据所采用的接头类型，所述接头可以进一步包括与其偶联的预期反应性基团。
尽管常称为将反应性基团用于表面，应该意识到可以将无活性的或反应性较低的前体活性基团用于表面，接着活化得到预期的反应性基团。具体说，可以提供的反应性基团可以是可光、热或化学激活前体基团，如，带有光解涂层的基团、带有温度敏感涂层的基团或带有易于酸或碱分解涂层的基团、感兴趣反应性部分被封闭的基团。然后可以选择性活化所述基团，如，通过使用光、热或化学处理来获得预期表面。各种这类基团为本领域已知，参见如Guillier等的Linkers and CleavageStrategies in Solid Phase Organic Synthesis and Combinatorial Chemistry，Chem.Rev.100：2091-2157(2000)。
如上所述，表面上的所述反应性基团可以具有前述特异性或非特异性结合部分，或可以包括催化基团，所述催化基团直接或通过上述特异性或非特异性结合或联结基团偶联到表面，即，依次直接或间接偶联到表面，或通过另外的偶联到表面的特异性或非特异性结合基团而偶联到表面。催化基团可以包括催化性化学制品，如，催化性金属或含金属化合物，如镍、锌、钛、二氧化钛、铂、金等。然而，在优选方面，所述以预期低密度存在于本发明表面上的催化基团包括生物活性分子，如包括核酸、核酸类似物、生物结合化合物如肽或蛋白质、生物素、抗生物素、链球菌抗生物素等和酶。在核酸或核酸类似物的情况下，这类表面可用于各种特异性结合试验如，来寻找核酸混合物中的感兴趣核酸片段(参见例如，美国专利号5,153,854、5,405,783和6,261,776)。同样，通常使用结合蛋白和肽来查询生物样品中存在或不存在感兴趣的特定分子。通常这类蛋白质或肽体现为抗体或这类抗体的结合片段或结合表位。在尤其优选方面，本发明各表面带有催化基团，包括感兴趣的酶，可用来监测该酶的活性。在生物、生物化学和药物研究和诊断中需要定期监测和检测各种各样的酶。优选的酶的例子包括那些在遗传分析如DNA测序应用中所监控的酶，例如聚合酶，如DNA和RNA聚合酶、核酸酶(内切和外切核酸酶)、连接酶和用于各种其它制药和诊断相关反应中的那些酶，如激酶、磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶等。
谈到根据本发明将酶固定到表面，由本文其它地方提到的优点组合可得到本发明表面的另一个优点。具体说，当通过特异性联接选择性固定生物分子如酶，并使它们不会吸附到表面其它地方时，可以更有选择性的保存表面上存在的生物分子的活性，而单靠吸附可能获得大量的无活性或低活性分子。因此，所得到的表面存在尽管是低密度但却具有相对高特异性活性的生物分子，如，感兴趣的活性生物分子数比存在的生物分子总数)。
在某些催化活性基团，如酶的情况下，这类反应性基团的密度还考虑活性分子相对于固定化无活性分子的密度。例如，就以相对低密度固定于表面上的酶而言，这类密度通常包括对固定化酶的特异性活性的分配，如固定化过程的效力。因此，当所述固定化过程只能产生50％的有活力的或活性的酶，则活性和其它酶分子的总密度通常是活性分子密度的2倍。因此，在确定这类反应性基团的预期密度时，通常需要估计淀积活性分子的固定化过程的相对效力。如本文其它地方提到，本发明方法的某些方面对保留固定于表面的酶的非常高特异性的活性尤其有用(参见实施例)，优选能提供20％以上、30％以上，更优选50％以上，和在还更优选方面，75％以上，和某些情况下，90％以上的特异性活性(具有活性的固定化酶的分数)。
与本发明基质上预期反应性基团的低密度相反，通常还优选所述表面的剩余部分为非反应性。如上所述，这类非反应性包括与反应性基团相比，对感兴趣分子的亲合力大大降低，但除此以外还优选包括不会过量结合或联结到潜在干扰所述表面终端应用的分子。例如，当另外的催化性基团欲与表面上预期低密度的所述反应性基团群偶联时，通常需要这类催化性基团基本上不与表面剩余部位特异性或非特异性联结。同样，应用时，另外的化学基团也会接触本发明表面，则通常需要所述表面的剩余部位或非反应性表面不会催化与这类材料的反应，或与所述材料结合或联结而可能带来的有害或噪声信号与感兴趣反应性基团的反应不对应。
在单荧光分子试验中，尤其希望避免未反应的荧光试剂或荧光产物与表面而不是感兴趣的反应性基团(例如酶)过量(如，持续时间和/或频率)、非特异性结合或联结或“粘附”，因为这类联结可能会产生错误信号、背景信号噪声和长时间积累的信号噪声。通常希望化合物与表面非反应性部位的非特异性联结相当于这种化合物在溶液中的扩散速率。换句话说，在观察区或光界限(confinement)中观察的标记化合物与非反应性表面发生非特异性联结产生的信号通常与这类化合物随机扩散进或出观察区或进行特定分析的液体体积所产生的信号在相同或类似的数量级，如是这类基于扩散的信号的不到100倍，和优选是这类基于扩散的信号的不到10倍(持续时间和/或频率)。就可能潜在干扰预期应用的荧光化合物或其它信号发生化合物而言，通常希望这类化合物与非反应性表面联结产生的信号(本文中指“非特异性信号发生”)比反应性基团产生的信号至少低10倍，优选低100倍以上，还更优选，比所述反应性分子的作用(“特异性信号发生”)，如预期酶活性，产生的信号低1000倍以上。这类非特异性信号发生的降低包括频率和/或持续时间的减少，如，信号事件数目的减少或这类非特异性信号发生体现的信号总量的减少。
又根据表面将处的环境，所述表面剩余部位上可以采用各种非反应性基团。然而，总体而言，是末端羟基、甲基、乙基、环烷基、甲氧基、羟基，如，非反应性醇和多元醇中，失活羧基、环氧乙烷、环丁烯砜基(sulfolene group)、亲水丙烯酰胺等。
E.分层表面/厚度
如上重复所述，上述反应性基团可以直接偶联到基质表面或通过一个或多个能在预期反应性基团和所述基质材料的固有或天然表面之间提供一种或多种中间分子层的中间连接基团来进行偶联。再次重申，所述表面的每种组分，反应性或非反应性的，都可以来自一个或多个组分层而提供所需要的终表面组分。
例如，最简单的形式中，反应性和非反应性基团都可以直接偶联到基质的天然表面，而得到本发明的低密度反应性表面。或者，表面上可以加入一层或多层连接基团，得到多层表面，然后再偶联上反应性和非反应性基团而得到预期表面。这些情况中，都只在最终层的淀积中进行反应性和非反应性基团的分配。
在更复杂的配置中，在终表面层上分配反应性和非反应性基团可以发生在为表面选择和淀积较早层时。换句话说，第一低密度反应层可用来指示后续或预期低密度反应层的淀积。例如，包括低密度非特异性结合基团的第一层可用作淀积具有低密度催化基团的后续层的模板(例如当催化基团与结合基团偶联时)。还有其它方面，这类分配可以发生于多层，以更好地协调淀积过程。例如，第一分配层，如包括结合基团和非结合基团的混合物，可以置于含有进一步分配(apportionment)的另外一层的下面。这类复合层尤其适于淀积在非反应性表面上包括许多不同类型反应性基团，如各种酶、各种核酸、各种抗体等的本发明表面。
如上所述，在有些情况下，表面的固有特性可能会使反应性或中间(intermediate)基团偶联其上，许多情况下，所述表面必须首先衍生来提供反应性基团，可以就这样使用或进一步偶联中间连接基团。在许多情况下，可以通过将预期反应性基团作为所述衍生化合物的组分而提供，来使所述衍生过程与反应性基团的偶联同时发生。这种情况下，所述带有感兴趣的反应性基团的衍生剂会以相对低的密度偶联到表面。通常，如以下更详细所述，可以通过提供带有与衍生剂比例合适的感兴趣反应性基团的衍生剂来实现，该反应性基团除了能够改良表面外，基本上无反应性。
在或选配置中，可以用任何上述反应性基团衍生整个表面，来提供中间连接基团可以耦合的反应性表面。这种情况下，然后使所述呈比例的带有感兴趣的反应性基团的连接基团和非反应性连接基团的中间连接基团与反应性表面接触，在终表面上得到预期密度的感兴趣反应性基团。应该意识到，根据最终基团与中间基团的偶联水平，可提供比预期终反应基团密度更高的中间反应性或偶联基团。例如，如果预期(或甚至计划)所述终反应基团将以每1连接/10个中间基团的比例与中间偶联基团偶联，那么这类中间反应基团可以高10倍的水平存在。通常，当采用这类中间反应性基团时，它们的密度将比终反应基团高约1-1000倍，通常为约1-100倍和有些情况下比终反应基团如酶的密度高约1-10倍。
这类“分层”表面的例子如图2所示，提供了具有初始或固有表面202的基质200，经处理或衍生后能提供可以偶联其它化学物质的整体反应性表面204。反应性表面204上偶联有接头/间隔层206，所述接头/间隔层206还带有最末层208。最末层208含有在最末层208的剩余部分分散排列的相对低密度的反应性基团210。各层数量、种类和顺序可以根据本文所述本发明各方面进行变化而获得预期终表面。
II.基质和表面的制备方法
可以采用许多方法来制备本发明表面。在至少第一种方式中，所采用的本发明方法对表面进行成比例或稀释处理得到预期密度。具体说，简单的表面改良步骤是采用至少两种不同的表面改良剂的混合物，其中第一种改良剂除了偶联到表面的部分外，还包括感兴趣的反应性基团，从而，将第一种改良剂偶联到表面能同时以保留其反应性的配置提供所述反应性基团。所述第二种改良剂或稀释剂除了能够偶联到表面外，与应用所述表面的环境不反应。
该过程的示意图如图3所示，与图1和2所示的图类似。如图所示，首先将基质302上的表面，即玻璃或二氧化硅基表面304进行衍生，如，采用硅烷化学来提供整个反应性表面304。然后用能够偶联到反应性表面304的表面改良剂306和308的混合物处理所述反应性表面304。所述试剂混合物包括一定浓度带有感兴趣反应性基团306的试剂和一定浓度提供非反应性基团308的试剂。这两种试剂的存在比例能使试剂结合到所述反应性表面304上时实现该表面上反应性基团306的预期密度。例如，当两种改良剂偶联到反应性表面的结合动力学相同时，反应性试剂306比非反应性试剂308为1∶10时能有效得到的密度比为：所述反应性表面304上每偶联1个反应性基团306，则该表面上就偶联10个非反应性基团308。接触和偶联到所述反应性表面304后，终基质表面310则以预期相对密度带上了预期反应性基团(由试剂306所提供)。尽管应该意识到试剂和得到的基团可以具有不同的化学结构，为了便于讨论，仍采用相同的图形和数字符号来说明位于表面上的所述表面改良剂和基团。
在一种相关但可选的典型方法中，初始衍生步骤中使用不同表面衍生剂的混合物来得到具有低密度反应性的基质表面。例如，可以使用含有第一硅烷试剂和被覆盖或用其它方式使其丧失反应性的硅烷试剂(羟硅烷、甲硅烷、氟代烷硅烷等)的硅烷试剂混合物来初始衍生二氧化硅基表面，所述第一硅烷试剂偶联到表面时包含反应性基团如氨硅烷。参阅图3，例如，所述初始衍生步骤可以使用不带有其它反应性部分的硅烷混合物，如可以通过覆盖、封闭或其它方式使它们丧失反应性，和包括感兴趣反应性基团的硅烷。用这种混合物进行衍生能产生包含低密度反应性层，如类似于层310而非整体反应性层304的基质表面。
如上所述，在上述任何情况下，先以相对低密度偶联到表面的所述感兴趣的反应性基团可以是用于预期终端应用的最终预期反应性基团，或者可以是能够连接最终反应性基团的中间连接基团。举例如下，图3中所示的所述低密度反应性表面310，还可以进一步用感兴趣的具体反应性基团如酶312处理，使酶312偶联到反应性基团306上。还可以例如通过加入接头部分、反应性基团306的特异性结合伴侣等而另外处理所述酶，使它更易于偶联反应性基团。举例如下，所述反应性基团可以包括特异性结合对的一员，如抗生物素，而酶312包括所述结合对的互补成员，如生物素。然后将酶312(最终预期反应性基团)偶联到已有或中间反应性基团306上，包括在有助于互补结合对成员间的亲和作用的条件下，使酶接触表面。
应该意识到，可以从许多不同方向到达所述提供低密度反应性表面的方法，而仍然能得到相似的结果。例如，参阅上图3，如它所示，用来将酶312偶联到基质表面302的所述表面改良反应性基团306首先经表面改良非反应性基团308稀释，得到低密度模板来偶联酶(或其它感兴趣的反应性基团)。
或者，将表面改良反应性基团306的亚组与酶312预偶联，然后以适当稀释度用反应性表面结合剂306(或者，非反应性表面改良剂308)稀释，当偶联到反应性表面304时能得到预期密度。
该过程的例子如图4所示，基本均匀地生物素化具有衍生表面404的基质400，得到基本均匀的生物素化表面406。然后利用中间性(intermediate)抗生物素/链球菌抗生物素键414(下文中为了表述简便用抗生物素指代)将带有偶联生物素部分412的酶410偶联到生物素化表面406。在一个方面，可以用抗生物素414均匀处理所述生物素化表面406，得到均匀抗生物素表面。然后，为了提供相对低密度的酶410，任选将生物素化酶410/412与不含酶的生物素416以一定比例混合，当所述混合物偶联到整个生物素化表面406时，该比例能有助于得到预期酶密度。或者，与用抗生物素414来处理生物素化表面406并施用生物素化酶410/412和游离生物素416的混合物不同，可以使生物素化酶410/412与过量的抗生物素414以预期比例混合，将它们用于生物素化表面406后能得到同样低密度的经由抗生物素/生物素键偶联到生物素化表面406的酶。这种情况下，单纯为了举例，假设与生物素化酶偶联的抗生物素和非组合抗生物素偶联到生物素化表面的速率相同，则些物质的1:10混合物能在表面上产生酶比非组合抗生物素约为1:10的密度。应该意识到为了便于举例，该假设已经简化，实际的结合速率可能会有显著差异，但通常可以通过常规实验容易地校准。
重申，尽管以经由生物素/抗生物素/生物素键联结到衍生表面的酶来进行描述，应该意识到大量不同键、不同的反应基团、不同的表面和不同的混合/稀释顺序等都可用来实现本发明的表面。
在另一个可选方面，本发明通过从居间空位(intervening space)位阻排除反应性基团而在表面上提供相对低密度的反应性部分。该方法利用其它分子或分子组分在表面上创建所述反应性部分不能偶联的排除带。这类分子或组分可以是反应性部分的联结分子或反应性部分的组分，或者它们可以含有独立(separate)的分子组分。举例如下，带有单个或少许反应性部分的相对大的分子，如，无序聚合物、蛋白质、聚氨基酸、大有机物质如登龙(dendron)等，可用作它们所携带的反应性部分之间的空间隔离物(参见例如，Hong等，(2003)Langmuir 2357-2365)。
或者，可以对表面部位提供一种或多种表面联结分子以排除该部位被带有反应性部分的表面联结分子结合。举例如下，在零模式波导或其它结构性界限的情况下，可以选择性地在界限分界处部分(wall portion)而不是界限观察区表面，提供一组表面联结分子。分界处存在所述表面联结分子能有效减小界限的横截面大小从而能使任何偶联到观察区的分子都局限于该区中央附近。该情况的示意图如图5所示。如所示，零模式波导502包括其上具有包层(cladding layer)506的底层基质504。所述包层506包含波导核心508，构成通过它设置的孔径。尽管这种核心的横截面大小可以改变，优选方面中，直径约为20-200nm。通过使排除分子510联结到分界处表面，能通过有效排除分界处上分子510的长度(如长度512所示)，而有效减小波导核心内用于结合反应性基团如酶的基质表面的半径(如长度514所示)。同样，由于用来制作包层，如层506的材料通常是与下层基质不同的材料，如，金属像铝、金或铬，或硅而非二氧化硅，可以利用它们不同的表面特性来选择性地将排除分子510偶联到分界处表面。就金属包层材料如铝、铬或金而言，选择能优先结合包层表面而并非底层玻璃或二氧化硅基表面的表面结合基团。例如，含有金属或金属螯合基团的排除分子可以与金属包层联结，但不会与底层玻璃或二氧化硅基基质联结。这类基团的例子包括偶联有大分子如聚合物、无序聚合物、聚氨基酸、蛋白质等的硫醇基，如与包层上的薄金层联结的巯十一烷酸(mercaptoundecanoic aicd)，或与包层材料上的镍层联结的氮川乙酸(nitriloacetic acid)。然后这些大分子能遮蔽存在于整个表面上的活性基团，提供相对低密度的可接近的反应性基团，或者提供只够单个催化性反应性基团(如酶)局限于观察区表面上特定区域内的足够空间。
在还有其它可选方面，可以通过表面结构内的各层相互作用获得低密度的反应性基团。具体说，有些情况下，偶联到表面的第一反应层与后续层的相互作用可能造成某些亚组的后续层上的感兴趣反应性基团失去反应性。这种情况下，该作用能以与稀释步骤相同的方式进行有效操作，可用来完成本发明目的。例如，第一反应层可以含有一定区域的通过如PEG接头偶联到表面的生物素基团。据观察看来，抗生物素或链球菌抗生物素层淀积于生物素层能引起某些亚组的抗生物素层一定程度的饱和。不受具体操作理论的局限，认为底层生物素接头可能会引起抗生物素层一些程度的饱和，得到非反应性抗生物素亚组，如PEG/抗生物素键可能能够具有充分的构象弹性而允许表面结合的生物素/接头基团结合到各抗生物素分子上的多个识别位点，而其它抗生物素分子维持未被底层饱和的状态。实际上，这样处理的表面成为了功能性稀释的抗生物素表面，其中一部分表面具有反应性(如，未饱和抗生物素)而其余表面被封闭(如，饱和抗生物素)。
可以利用构象弹性接头，或具有各种长度的接头，如较短和较长接头的混合物来制备各种活性亚层，设计出部分封闭重叠层的亚层，在终表面上获得预期密度的反应性基团。
除了上述方式，应该意识到尽管描述了许多涉及用不同组分的混合物来创建本发明表面的方法，在许多情况下，还预期可以将所需材料合成混合物，以保证所使用的各组分比例合适。如此合成呈比例的混合物能防止不同合成反应(就合成方案差异和批次差异而言)引起的用于生产所述表面的组成元素的表面结合差异性。例如，通过将两种或多种前体主链(如带有反应性或非反应性末端，能与单个硅烷前体反应)组合而合成混合的反应性和非反应性基团，如混合硅烷，能够确保表面上最终硅烷混合物的均匀反应性。
III.基质和表面的示例性用途
本发明的选择性反应性表面有各种不同的用途，它可以用来使各种分子或它们的反应彼此隔开。例如，可以采用FACS或其它珠子分类方法容易地分析带有单个或少许反应性分子的珠形基质，以查明如组合化学文库、定向进化文库或噬菌体展示文库中的预期反应性基团。本发明所述表面改良技术可用于这类系统。
或者，可以在特定酶系统中进行单分子分析来监控单个反应和该反应的效应物。这类分析包括在诊断或治疗方面具有重要性的酶试验，如激酶、磷酸酶、蛋白酶、核酸酶、聚合物等的试验。
在优选方面，所述表面可与基质上光学隔离部位的低密度DNA聚合酶偶联来实时分析测序反应，在合成反应发生时监控和鉴别合成反应的序列。本发明表面的尤其优选应用的例子参见以其全文纳入本文作参考的公开的美国专利申请号2003/0044781，和具体来讲，这类方法在零模式波导结构中的应用参见以其全文纳入本文作参考的美国专利号6,917,726。具体说，当各反应，即各聚合酶的数据能与其它酶数据区分开时，对来自上述测序方法的测序数据的分析就更加容易了。通过提供低密度存在于表面上的酶，提供了物理隔离，从而能够将一种酶与另一种酶光学分离。在最优选的方面，在每种零模式波导的观察表面上提供单个酶分子，使各波导能提供单个酶分子的反应数据。由于难以确保所有波导或其它观察区均有单个酶，需要选择密度，使许多波导包括单个酶，而有些能包括2或3或更多酶。
应该意识到，本发明高度限定的表面可以具有非常广泛的应用、技术和工业用途。例如，在其它用途中，本发明表面可用于任何需要精确控制表面功能性水平来控制这类表面的物理特性的各种用途中。例如，在许多用途中，精确控制表面上的离子基团可以精确控制这类离子基团对表面与其环境相互作用的影响。例如，在用于通过电泳和/或电渗流运输材料的系统中，如在微流体管中，如管道、毛细管等中，精确控制表面的ζ电势对材料在这种管道中的电渗流迁移率有广泛影响，从而能够影响系统，如电泳应用，的相对效力。
此外，用于大表面积管道如毛细管或管道中时，可能会希望可以将表面功能性维持在某种低水平而防止材料和表面间发生多余的相互作用。例如，当为毛细管电泳提供动态包被时，可能希望所述包被材料和表面之间能发生某些水平的相互作用，而希望分析物和表面之间几乎没有或没有相互作用。
在还有其它用途中，可以将本发明表面用于微调医疗植入物和移植物的表面改良，通过更精确控制表面改良水平而来增强这类设备的生物相容性。
可以通过用含有反应性/联结位点和被遮盖的或非反应性联结位点的混合分子层包被所述基质表面来产生示例性的本发明修饰表面。就二氧化硅基基质表面而言，示例性混合层组合物包括硅烷-PEG-X，其中，针对非反应性或遮盖位点，X可以是-OH或CH2，和羧基、环氧化物、胺、生物素、谷胱甘肽、Ni-NTA或其它公知结合基团(参见例如，G.T.Hermanson的《生物结合技术(Bioconjugate Techniques)》(学术出版社1996)。为了获得具有相对低密度的反应性/联结位点的表面，对所采用的混合物的遮盖/非反应性分子的摩尔含量和反应性分子的摩尔含量进行选择，得到预期比例或密度的终表面。通过各组分与表面的结合动力学分析，以及预期终表面上的反应性比非反应性基团的终比例来确定该比例。此外，当采用汽相淀积方法时，淀积蒸汽中的相对浓度尤其重要，因此，还要把淀积室中各组分的蒸汽压考虑进去。
改良表面的示意图如图6所示。如图所示为包括其上偶联有硅烷-PEG-OH和硅烷-PEG-环氧化物分子的上表面的玻璃基质，其中非反应性硅烷-PEG-羟基分子的数目要远远多于携带有反应性环氧化物的基团。相关方面，所述环氧化物部分可用来连接特异性结合分子，如生物素、抗生物素、链球菌抗生物素、结合肽、抗体、抗原、谷胱甘肽、GST，这些特异性结合分子又可用来偶联其它分子，如催化性分子，像酶，或者这类催化性分子可以经由环氧化物基团直接偶联。应该意识到，零模式波导在各种应用中的功能性要求作为观察对象的所述反应性基团相对接近所述波导的底面。因此，针对零模式波导应用的合适联结方案通常使感兴趣反应性基团位于相关的波导观察体积内，所述体积部分取决于所使用的光波波长。某些方面，离底面的距离优选约为0-20nm。就本发明优选表面而言，能获得预期水平反应性基团而其它地方是非反应性的所述表面厚度的范围通常为0.8-约20nm和更优选约为1-10nm。这类表面在优选光学界限的观察体积内存在反应性基团，而且足以抵抗干扰作用。
如上所述，在优选方面，本发明基质可与光学监测系统联用来监控发生于这些低密度表面的具体反应。具体说，这些系统通常采用荧光检测系统，该荧光检测系统包括激发源、将激发辐射指向待观察表面和将来自基质的发射光聚焦到检测器的光具组(optical train)。这类系统的一个例子参见以其全文纳入作参考的2005年8月11日提交的美国专利申请号11/201,768。
IV.实施例
实施例1：硅烷-PEG20-牛物素/抗生物素表面
生物联结生命科学公司(BioLink LifeSciences，北卡罗莱纳州加里市)合成了三甲氧基硅烷PEG20-生物素分子，其中“20”指乙二醇单位的重复数目。前体试剂为商品化购得。
将基质在1微克PEG20-生物素/克溶剂中培育4小时制成PEG20-生物素表面。所述溶剂中含有甲醇、1重量％的水和0.1％吐温20非离子表面活性剂。经椭圆光度法测量得到的所述PEG20-生物素包被(coat)厚度为t＝1.1nm，水接触角(经5秒滴落淀积测得)是θ＝35度。
在稀释的甲醇溶液(约1g甲醇中含有1mg PEG20-生物素)中，所述PEG20-生物素在熔融石英载玻片和含有天然氧化物(约2nm)的Si基质上形成薄包被，其厚度根据溶剂组合物和室温下的培育时间而变化。据观察，当包被厚度(经椭圆光度法测量)达到1nm或更厚时，通常所述表面会表现出非常好的直接结合(如生物素-抗生物素)特异性和高度排斥蛋白质的非特异性结合。据发现，包被厚度超过2nm后不再有进一步改进，而低于0.8nm的膜相比1nm或更厚的膜，其蛋白质结合特异性较低。对PEG20-生物素改良的Si表面(具有天然氧化物)进行椭圆光度法测量，发现与Alexa488标记的链球菌抗生物素(干燥)偶联时，其层厚度约为3-4.3nm厚。
设计试验样板(panel)来证明和定量这些观察现象。所述板由熔融石英载玻片(约25mm×75mm)上的4个独立区域组成。每个方块为6mm×6mm，与其它区域通过塑料窗框上的聚二甲基硅氧烷(pdms)垫圈分隔，所述塑料窗框形成96-孔式样(施莱歇尔和施库尔生物科学公司(Schleicher and Schuell Biosicences)销售的Fast 
Figure A200680035888D0023104404QIETU
)。通常，每个四分体或孔中需要约70μL溶液。
用荧光标记的链球菌抗生物素(Alexa-488)或
Figure A200680035888D0023104414QIETU
，或标记的链球菌抗生物素或
Figure A200680035888D0023104414QIETU
来探询PEG20-生物素表面的阳性或阴性对照与过量的生物素预培育，来检测特异性比非特异性相互作用。然后，在不同的离子强度缓冲条件下，如，“低盐”(约25mM)和“高盐”(约150mM)，用标记的Φ29聚合酶来探询所述试验板来确定非特异性联结蛋白质的水平(或表面“排斥”蛋白质的水平)。
将PEG20-生物素表面的链球菌抗生物素(或
Figure A200680035888D0023104414QIETU
)的结合特异性和聚合物排斥特性，与裸熔融石英载玻片的联结性进行比较。所有载玻片均用
Figure A200680035888D0023104506QIETU
进行严格清洁，接着用氧等离子(oxygen plasma)清洁(中度力、5分钟@2000毫托，Harrick xx)。用荧光扫描仪对所述蛋白质结合的载玻片进行扫描。通常设置在550V进行光电倍增管放大(photomultiplier gain)，像素分辨率为100μm。
培育条件如下：将A488-SA(分子探针/英创公司(Invitrogen))溶解于缓冲液。所述A488-SA与生物素预培育。采用商品化标记试剂盒用A488标记Φ-29聚合酶。在加有150mM KCl的25mM tris、1mM和5mM β-巯基乙醇(βME)中稀释酶。该溶液通常培育1小时。然后，用缓冲液，然后是水冲洗每孔，用气枪吹干。
当用Φ29聚合酶进行刺激，然后用荧光标记抗体表位进行染色时，证明经PEG20-生物素改良的熔融石英和Si基质具有高水平的蛋白质“排斥”性，在低和高盐条件下均得到相当于生物素封闭的、荧光标记链球菌抗生物素或
Figure A200680035888D0023104414QIETU
的荧光强度。具体说，结果显示，该荧光强度比阳性对照(A488-SA)或未处理熔融石英上的蛋白质吸附的荧光强度低大于100倍以上。
对熔融石英和PEG20-生物素表面的非特异性结合Φ29聚合酶的情况进行比较，显示在低离子强度固定条件下熔融石英上呈现高聚合酶表面覆盖率(40-60％)，与熔融石英相比，PEG20-生物素(在低离子强度条件下)的非特异性吸附减少了接近200倍。还显示出，PEG20-生物素对链球菌抗生物素表现出高度结合特异性。当PEG层变为不到1nm厚时，表面的聚合酶排斥特性降低。
接着，用生物素化A488-聚合酶探询带有PEG20-生物素表面的板，由未标记的链球菌抗生物素介导。简单来讲，带有PEG20-生物素表面的载玻片上所有孔均先用链球菌抗生物素进行培养，然后用与过量未标记链球菌抗生物素预培育或未预培育的生物素化A488-标记的聚合酶进行探询，来确定链球菌抗生物素介导的与表面的特异性联结水平。据显示，表面和生物素化蛋白质间的特异性相互作用比非特异性相互作用(其中生物素化蛋白质先用链球菌抗生物素预封闭，再与表面接触)增加了约50倍。
实施例2：硅烷-PEG24-生物素/抗生物素表面
由聚合物源头公司(Polymer Source(加拿大蒙特利尔市多尔瓦尔镇))合成α-生物素基-ω-三甲氧基甲硅烷基封端的聚(乙二醇)(24个单位)(PEG24-生物素)。
通过将PEG24-生物素以0.6毫克PEG24-生物素/克溶剂的浓度溶解于乙醇制备溶液。往混合液中加入少量甲醇(约0.4重量％)将硅烷试剂淀积到Si芯片(带有约2nm的天然氧化物)的速率调节为3-5小时淀积1-1.5nm(通过椭圆光度法)。
经PEG24-生物素改良的熔融石英和Si基质，当用荧光标记的Φ29聚合酶以及生物素封闭的Neutravidin进行刺激时，再次证明了其低水平的非特异性相互作用，同时显示出对Neutravidin和链球菌抗生物素的高水平(特异性)结合。再次重申，已证明本发明表面能够高水平特异性地与预期基团如生物素化蛋白质相互作用，而显示出低水平非特异性地结合于蛋白质，如过量酶，以及潜在干扰性标记分子如，荧光抗生物素(或者类推，在核酸分析的情况下，标记的核苷酸或核苷酸类似物，如果允许它们非特异性地吸附到观察区内，可能会干扰酶反应的检测)。该实验中，所述荧光标记链球菌抗生物素和聚合物预先与未标记蛋白质以1:10的比例混合，使荧光强度和荧光团表面密度之间维持线性关系。
实施例3：调节反应性基团的密度
制备一个系统来检测采用稀释方法调节表面反应性功能基团密度的能力。具体说，采用各种稀释度的PEG24-生物素的N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)葡糖酰胺(TES-G)(商品化试剂(盖利公司(Gelest rnc)，莫理斯威尔(Morrisville)，PA产品#SIT8189-0))溶液来制备PEG24-生物素表面。
通过将2mg试剂稀释于乙醇和0.4％甲醇的1g混合溶剂中来制备TES-G原液。制备浓度为1.5mg/g溶剂(乙醇/甲醇混合物)的PEG24-生物素原液。制备5等份每份10mL，往每等份中以以下递增梯度加入PEG24-生物素原液：0、40μL(0.3％)、80μL(0.6％)、200μL(1.4％)、400μL(2.7％)和800μL(5.4％)。在该5等份中同时培育熔融石英毛坯和Si片15小时。然后将基质从反应溶液中取出，用甲醇洗涤3次，在80℃空气中退火10分钟，在水中洗涤10分钟，同时超声搅拌除去弱结合分子，用氮气枪干燥。通过检测表面上的水接触角来检测表面上PEG24-生物素的含量，其中纯PEG24表面的接触角约为35°。
图7显示水接触角与TES-G中的PEG24-生物素的浓度的曲线图，说明采用稀释方法可以容易地控制活性基团的表面密度。
实施例4：混合功能性PEG24表面
为了提供均一的表面，可以采用结构相似的基团作为结合或反应性基团以及表面的非反应性组分。具体说，为了提供具有除了与其它分子相互作用的能力之外的均一特性(如厚度)的表面，用与上述实施例2中PEG24基团类似的PEG24-甲氧基稀释PEG24-生物素。PEG24-甲氧基由聚合物源头公司(加拿大蒙特利尔市多尔瓦尔镇)定制合成并原样使用。通过室温下使基质在含有0.4％甲醇和0.6mg试剂的乙醇溶液中培育，使PEG24-甲氧基淀积到熔融石英和Si片上。在不同时间间隔将Si基质取出溶液，计算接触角和膜厚。所述淀积速率和膜厚度相当于相似溶剂和浓度条件下淀积的PEG24-生物素膜。
用4等份板来探询淀积自PEG24-甲氧基和PEG24-生物素混合溶液的硅烷膜。所述PEG24-甲氧基的浓度是0.83mg/g乙醇/甲醇溶剂(0.4％甲醇)，通过混合含有0.67mg/g溶剂的梯度增量的PEG24-生物素原液来制备4等份。以生物素比终甲氧基的摩尔百分比表示的终溶液浓度是0％、0.2％、0.7％和2％。室温下，将Si片和熔融石英载玻片在每等份中均培育3.5小时。然后，将所述基质在甲醇中漂洗3次，空气干燥，在80℃中退火10分钟，用水洗涤，同时超声混合除去弱结合PEG分子。所有样品的膜厚度均接近t＝1.3nm，对应的接触角为42°(无PEG24-生物素)-38°(2％生物素)。在混合表面上结合标记的链球菌抗生物素显示与混合物表面中PEG24-生物素的摩尔百分比增加呈良好相关，而预先封闭的链球菌抗生物素的结合大多没有改变。
实施例5：通过稀释联结介导层将反应性聚合酶低密度淀积到表面
通过在每个波导内提供PEG24-生物素表面，和淀积链球菌抗生物素和生物素化聚合酶的混合物，将本发明方法用于在零模式波导阵列中淀积相对低密度的Φ29DNA聚合酶。调节Neutravidin比生物素化聚合酶的比例，得到预期水平的聚合酶和PEG-24-生物素表面间由Neutravidin介导的联结，还用过量Neutravidin封闭余下表面。
开始时，进行统计学分析来确定聚合酶在链球菌抗生物素中的相对稀释度，获得每个被占据(occupied)波导包含不超过1个聚合酶的可接受概率。具体说，平均密度为μ的泊松统计占据概率(POCC)公式是：POCC＝1-Pμ(0)＝1-e(-μ)。被占据数目小时，POCC＝μ-μ2/2+μ3/6+O(μ4)。因此，采用占据概率作为检测μ的手段会产生顺序误差μ2。因此，每当μ很小时，就可以采用占据概率POCC来测量平均占据数目。当占据概率为0.3时，可以计算出μ的实际值约为0.3567。即，此时，采用占据概率来估计平均占据数目的误差为16％。值得注意的是当平均占据数目为0.3567时，有70％的可能任何波导均为空，25％的可能波导含有1个和刚好1个聚合酶和5％的可能波导含有一个或多个聚合酶。这说明，当占据个数足够低时，采用占据概率来估计平均占据个数是可以接受的。
然后通过提供以50倍过量Neutravidin稀释的生物素化酶来完成。稀释和淀积后，检测得到的波导阵列，发现大致有30％被占据，与概率吻合良好。此外，这些波导内的酶的特异性活性与平面表面产生的特异性活性数据(显示出固定化酶非常高的特异性活性)也吻合地很好，进一步验证了所述统计学方法。
尽管处于说明的目的进行较为详细的描述，应该容易地意识到本领域技术人员知道或能意识到还有许多变体可以实施本发明。除非文中其它地方进行澄清或清楚的表述，本文提供的任何浓度值通常都是在不考虑加入混合物具体组分时或之后发生的任何转变的混合值或百分比。就尚未清晰纳入本文的方面来讲，本说明书涉及的所有公开参考文献和专利文件均以其全文纳入本文作为参考。

Claims (36)

1.一种基质，包含：
其上偶联有第一反应性部分的表面；和
其中所述反应性部分以约1反应性部分/50,000nm2-1反应性部分/100nm2的密度偶联到所述表面。
2.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述反应性部分以约1反应性部分/8000nm2-1反应性部分/300nm2的密度偶联到所述表面。
3.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述反应性部分以约1反应性部分/8000nm2-1反应性部分/1000nm2的密度偶联到所述表面。
4.如权利要求1所述的基质，其特征在于，除反应性部分以外的剩余表面是基本上非反应性的表面。
5.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述反应性部分通过接头基团偶联到表面。
6.如权利要求5所述的基质，其特征在于，所述接头基团包括聚合物。
7.如权利要求5所述的基质，其特征在于，所述接头基团包括聚乙二醇。
8.如权利要求4所述的基质，其特征在于，所述反应性部分通过接头基团偶联到所述表面，所述基本上非反应性的表面包含不带反应性部分的接头基团。
9.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述第一反应性部分包含结合部分。
10.如权利要求9所述的基质，其特征在于，所述结合部分包含非特异性结合部分。
11.如权利要求9所述的基质，其特征在于，所述结合部分包含特异性结合部分。
12.如权利要求11所述的基质，其特征在于，所述结合部分包含特异性结合对的一员。
13.如权利要求9所述的基质，其特征在于，所述结合部分选自抗原、抗体、抗体结合片段、聚核苷酸、结合肽、生物素、抗生物素和链球菌抗生物素。
14.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述第一反应性部分包含催化性部分。
15.如权利要求14所述的基质，其特征在于，所述催化性部分包括催化性金属。
16.如权利要求14所述的基质，其特征在于，所述催化性部分包括酶。
17.如权利要求16所述的基质，其特征在于，所述酶选自核酸聚合酶、连接酶、核酸酶、蛋白酶、激酶和磷酸酶。
18.如权利要求16所述的基质，其特征在于，所述酶包括DNA聚合酶。
19.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述表面包含观察区。
20.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述表面包含光学界限的观察表面。
21.如权利要求19所述的基质，其特征在于，所述观察区包含零模式波导的观察表面。
22.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述基质表面包含二氧化硅。
23.如权利要求1所述的基质，其特征在于，所述基质表面选自玻璃、石英、熔融石英和硅。
24.一种装置，包括：
其上至少具有第一观察区的基质，所述观察区的面积约为100-50000nm2；和1-3个偶联到观察区内的表面的反应性部分。
25.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述观察区被光学不透明包层所界定。
26.如权利要求24所述的装置，其特征在于，所述反应性部分包括酶。
27.如权利要求26所述的装置，其特征在于，所述酶包括DNA聚合酶。
28.一种制备改良表面的方法，包括：
提供具有第一反应性表面的基质；
提供第一和第二表面改良剂的混合物，其中所述第一和第二表面改良剂均能各自偶联到反应性表面，并以选定的第一比率存在于混合物中，从而所述第一和第二表面改良剂以第二比率偶联到反应性表面；
使反应性表面与所述混合物接触，产生其上以第二比率偶联有第一和第二改良剂的改良表面。
29.一种制备改良表面的方法，包括
提供待改良表面；
使所述待改良表面接触表面改良组合物，其中所述表面改良组合物含有：
偶联到预期反应性部分的第一表面改良剂，和不偶联到预期反应性部分的第二表面改良剂；和
所述第一表面改良剂和第二表面改良剂以产生改良表面的比率存在于表面改良组合物中，其中所述反应性部分以约1反应性部分/50,000nm2-1反应性部分/100nm2的密度存在于改良表面上。
30.一种设备，包括其上偶联有反应性部分的表面，其中所述反应性部分以低于1反应性部分/100nm2的密度偶联到所述表面。
31.如权利要求30所述的设备，其特征在于，所述反应性部分以低于1反应性部分/1000nm2的密度偶联到所述表面。
32.如权利要求30所述的设备，其特征在于，所述反应性部分以低于1反应性部分/10000nm2的密度偶联到所述表面。
33.如权利要求30所述的设备，其特征在于，所述反应性部分包括分子结合基团。
34.如权利要求33所述的设备，其特征在于，所述分子结合基团包括特异性分子结合基团。
35.如权利要求34所述的设备，其特征在于，所述特异性分子结合基团选自抗体、抗原、抗生物素、链球菌抗生物素、生物素、聚核苷酸、聚核苷酸类似物、结合肽。
36.一种配置表面以在其上提供所需密度的反应性部分的方法，包括用基本上均匀偶联到所述表面的组合物处理表面，所述组合物包含不含有反应性部分的第一组分和含有反应性部分的第二组分，所述第二组分在组合物中以与第一组分有关的浓度存在，从而能为表面提供所需密度的反应性部分。
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