JP2005102612A - 細胞着床方法及び細胞組織作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、(A)該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、(B)光固定化した前記細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程とを行う細胞着床方法。更に細胞の増殖や分化により細胞シートや細胞組織を作製し回収する方法。
【選択図】 なし
Description
上記課題を解決するための本願第1発明の構成は、光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、(A)該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、(B)光固定化した前記細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程とを行う、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第2発明の構成は、前記第1発明に係る光固定化材料が光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料である、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第3発明の構成は、前記第2発明に係る化学構造がアゾ基を有する色素構造である、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第4発明の構成は、前記第1発明〜第3発明のいずれかに係る細胞着床要素が、細胞外基質タンパク質、細胞表面に露出した特定の抗原に対して特異的に結合する抗体又はこれを備えた物質、細胞表面に露出した特定の抗体に対して特異的に結合する抗原又はこれを備えた物質、特定の細胞膜レセプタータンパク質に対して特異的に結合するリガンド又はこれを備えた物質、多糖類(糖鎖等を包含する概念である)と結合するタンパク質又はこれを備えた物質、の内の1種以上である、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第5発明の構成は、前記第1発明〜第4発明のいずれかに係る光固定化工程において、細胞着床要素として特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す1種類又は2種類以上の細胞着床要素を固定化することにより、前記着床工程において細胞着床要素に対して接触させる複数種類の細胞又は細胞群の内から1種類又は2種類以上の特定された細胞又は細胞群を選択的に着床させる、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第6発明の構成は、前記第1発明〜第5発明のいずれかに係る光固定化工程における細胞着床要素の光固定化を特定のパターニングに従って行うことにより、細胞又は細胞群を当該パターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第7発明の構成は、前記第6発明に係る細胞着床要素の光固定化のパターニングを細胞レベルのサイズで区画して設定する、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第8発明の構成は、前記第6発明又は第7発明に係る光固定化工程と着床工程とを2サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルにおいて、光固定化工程における細胞着床要素の光固定化のパターニングの設定と、着床工程で用いる細胞又は細胞群の種類とを互いに異ならせることにより、2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第9発明の構成は、前記第6発明又は第7発明に係る光固定化工程を2サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す2種類以上の細胞着床要素を順次固定化した後、着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第10発明の構成は、前記第6発明又は第7発明に係る光固定化工程と着床工程とを2サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す2種類以上の細胞着床要素をそれぞれ固定化すると共に、各サイクルの着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
上記課題を解決するための本願第11発明の構成は、光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、
(A)該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、
(B)光固定化した前記細胞着床要素に対して一定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程と、
(C)着床させた前記細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作製し、これを採取する回収工程とを行う、細胞組織作製方法である。
第1発明の細胞着床方法においては、着床基材の少なくとも表層部に光固定化材料を用いて細胞着床要素を光固定化し、この細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる。従って、光固定化工程で用いる光照射装置以外の特段の装置を要しないし、光照射以外の特別な操作を要しないので、安価な装置により簡易に実行することができる。しかも、プロセスとしては光固定化工程と細胞又は細胞群の着床工程が分離しており、かつ光固定化工程では光照射と言うマイルドな手段を用いるので、着床対象たる細胞やこれに含まれるタンパク質の性質を損なう恐れがない。
光固定化材料としては、基本的には、光変形を起こし得る材料であれば良いが、第2発明のように、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料を用いることが、より好ましい。
光固定化材料としては、第2発明に言う化学構造としてアゾ基を有する色素構造を含む材料が、細胞着床要素に対する固定化力が特に大きく、好ましい。
細胞着床要素としては、最も一般的なものが、コラーゲンI、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ポリリシン等のいわゆる細胞外基質タンパク質又はこれを備えた物質である。これらのタンパク質の細胞一般に対する接着作用は良く知られている。
第5発明の細胞着床方法においては、不特定の多数種類の細胞又は細胞群を含む試料液から特定の1種類又は2種類以上の細胞又は細胞群を選択的に着床させることを以て、これらのスクリーニングと、更に解析等を行うことができる。
第6発明のように、細胞又は細胞群を一定のパターニングに従って着床させることにより、一般的に細胞アレイや細胞チップと呼ばれる、細胞又は細胞群を決まった位置に集積した検査ツールを構成することができ、例えば医薬品開発におけるいわゆるハイスループットスクリーニング等への有効利用を期待することができる。
第7発明のように、細胞着床要素の光固定化のパターニングを細胞レベルのサイズで区画して設定することにより、細胞の解析等や細胞間相互作用の解析等を極めて精密に行うことができる。
第8発明によって、同一の着床基材上で2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させると言う選択的細胞パターニングの第1の技法が提供される。
第9発明によって、同一の着床基材上で2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させると言う選択的細胞パターニングの第2の技法が提供される。
第10発明によって、同一の着床基材上で2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させると言う選択的細胞パターニングの第3の技法が提供される。この第3の技法によれば、とりわけ高い精度で選択的細胞パターニングを行うことができる。
第11発明においては、細胞がパターニングされたり多種の細胞が着床したりすることにより、1種又は多種の細胞が多層又は多重に積層又は集積された細胞シートや細胞組織を作製することができる。細胞が積層又は集積するための初期の段階で、必要な細胞種(例えば、幹細胞)とそのパターニングとの選択により、生物体内の組織に近い細胞塊を作製することもできる。
本発明に係る細胞着床方法においては、まず光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、次に該着床基材の表面に細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程を行い、更に光固定化したこの細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程を行う。
着床基材は、細胞着床要素を光固定化するためのベース材であって、後述する光固定化材料からなり、あるいは少なくとも表層部に光固定化材料を用いたものである限りにおいて、その形態、材質、用途等を限定されない。例えば、比較的小さなチップの形態、カラム等の充填するための粒体等の形態、いわゆる細胞培養床の形態、簡便なアッセイ等に用いる小サイズの試験紙等の形態、顕微鏡観察等に用いられるスライドガラスの如き形態、等が挙げられる。
着床基材の少なくとも表層を構成する光固定化材料とは、光変形(光照射によって誘起される変形)を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す材料である。光固定化材料の好ましい例示として、光照射によってアブレーション、フォトクロミズム、分子の光誘起配向等を起こす成分(光反応性成分)を材料中に含み、結果的に材料の体積、密度、自由体積等が変化して光変形が誘起されるような誘起又は無機の材料を挙げることができる。
本発明に係る細胞着床要素とは、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す物質を言う。以下の各種の細胞着床要素の内、特定の条件を満たす細胞又は細胞群に対して特異的に接着性又は結合性を示すものが、とりわけ利用価値が大きい。
光照射を行う照射光としては、光固定化材料との組み合わせにおいてミスマッチングがない限り、伝搬光、近接場光又はエバネッセント光等の任意の照射光を利用できる。伝搬光としては、自然光、レーザー光等を利用できる。伝搬光、近接場光又はエバネッセント光として、その偏光特性を利用できる。照射光の波長や光源は限定されないが、波長に関しては、光固定化材料の吸収効率の高い波長が好ましい。細胞着床要素が例えば紫外光(波長300〜400nm)により不活性化、劣化等の影響を受ける恐れがある場合には、照射光として可視光(波長400〜600nm)を用い、かつ可視光の照射により細胞着床要素の光固定化が可能な光固定化材料を用いることが好ましい。照射光の照射時間は必要に応じて任意に設定すれば良い。尖頭出力の高いパルス光を使用することもできる。
着床工程においては、着床基材の表面に光固定化した前記細胞着床要素に対して、不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる。
光固定化工程における細胞着床要素の光固定化を特定のパターニングに従って行うことにより、細胞又は細胞群を当該パターニングに従って着床基材に着床させることが、とりわけ好ましい。このような光固定化のパターニングは、細胞レベルのサイズで区画して設定することができるし、又、そうすることが特に好ましい場合がある。「細胞レベルのサイズ」とは、例えば、光固定化のパターニングが0.1μm〜1000μm程度のオーダーで設定されていることを言う。
細胞組織作製方法の発明においては、前記した光固定化工程と着床工程に加えて、「回収工程」、即ち、着床させた細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作製し、これを採取する工程が付加される。光固定化工程と着床工程との実施形態は、前記と同様である。
高分子光固定化材料の合成を常法に従い行った。まず、公知のジアゾカップリング法を用いて下記の「化5」に示す化合物を合成した。次に、公知の酸クロリド反応により、下記の「化6」に示す化合物を合成した。これらの化合物においては、アゾベンゼン構造部分が光反応性成分を構成している。
実施例1に係る高分子光固定化材料12.5mgをピリジン2mLに溶解し、ポア径0.2μmのフィルターでろ過した。ろ液をMASコートスライドガラス(松浪ガラス社製)の表面に滴下し、このスライドガラスを回転数4000r.p.m.でスピンキャストして、スライドガラスの表面に高分子光固定化材料のフィルムを形成することにより、着床基材を作製した。高分子光固定化材料フィルムは約20nmの均一な膜厚であることを吸光度測定により確認した。
実施例2で得た着床基材の表面の特定の部分に対し、コラーゲンIの0.1%PBS(リン酸緩衝食塩液: Phosphate Buffered Saline)溶液1μLを滴下して乾燥させ、青色LED光を30分間照射した。その後、0.1% Tween/PBS溶液にて着床基材上の未固定のコラーゲンIを洗浄・除去し、コラーゲンIを光固定化した着床基材を得た。
実施例2で得た着床基材をコラーゲンIの0.1%PBS溶液中に浸漬させ、その着床基材表面の特定の部分に青色LED光を60分間照射した。その後上記のPBS溶液中から着床基材を取り出して0.1% Tween/PBS溶液にて着床基材上の未固定のコラーゲンIを洗浄・除去することにより、コラーゲンIを光固定化した着床基材を得た。
実施例2で得た着床基材の表面のそれぞれ特定の部分に対し、コラーゲンIの0.1%PBS溶液1μLと、IgE10μg/mL PBS溶液とを滴下して乾燥させ、青色LED光を30分間照射した。その後、0.1% Tween/PBS溶液にて着床基材上の未固定のコラーゲンI及びIgEを洗浄・除去し、コラーゲンI及びIgEを光固定化した着床基材を得た。
実施例2で得た着床基材をコラーゲンIの0.1%PBS溶液中に浸漬させ、その着床基材表面のそれぞれ特定の部分に直径10μm及び30μmの青色レーザー光を30分間照射した。その後上記のPBS溶液中から着床基材を取り出して0.1% Tween/PBS溶液にて未固定のコラーゲンIを洗浄・除去することにより、コラーゲンIを上記2点のスポットで光固定化した着床基材を得た。
Claims (11)
- 光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、
(A)該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、
(B)光固定化した前記細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程と、
を行うことを特徴とする細胞着床方法。 - 前記光固定化材料が光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料であることを特徴とする請求項1に記載の細胞着床方法。
- 前記化学構造がアゾ基を有する色素構造であることを特徴とする請求項2に記載の細胞着床方法。
- 前記細胞着床要素が、細胞外基質タンパク質又はこれを備えた物質、細胞表面に露出した特定の抗原に対して特異的に結合する抗体又はこれを備えた物質、細胞表面に露出した特定の抗体に対して特異的に結合する抗原又はこれを備えた物質、特定の細胞膜レセプタータンパク質に対して特異的に結合するリガンド又はこれを備えた物質、多糖類と結合するタンパク質又はこれを備えた物質の内の1種以上であることを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれかに記載の細胞着床方法。
- 前記光固定化工程において、細胞着床要素として特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す1種類又は2種類以上の細胞着床要素を固定化することにより、前記着床工程において細胞着床要素に対して接触させる複数種類の細胞又は細胞群の内から1種類又は2種類以上の特定された細胞又は細胞群を選択的に着床させることを特徴とする請求項1〜請求項4のいずれかに記載の細胞着床方法。
- 前記光固定化工程における細胞着床要素の光固定化を特定のパターニングに従って行うことにより、細胞又は細胞群を当該パターニングに従って着床させることを特徴とする請求項1〜請求項5のいずれかに記載の細胞着床方法。
- 前記細胞着床要素の光固定化のパターニングを細胞レベルのサイズで区画して設定することを特徴とする請求項6に記載の細胞着床方法。
- 前記光固定化工程と着床工程とを2サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルにおいて、光固定化工程における細胞着床要素の光固定化のパターニングの設定と、着床工程で用いる細胞又は細胞群の種類とを互いに異ならせることにより、2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させることを特徴とする請求項6又は請求項7に記載の細胞着床方法。
- 前記光固定化工程を2サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す2種類以上の細胞着床要素を順次固定化した後、着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させることを特徴とする請求項6又は請求項7に記載の細胞着床方法。
- 前記光固定化工程と着床工程とを2サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す2種類以上の細胞着床要素をそれぞれ固定化すると共に、各サイクルの着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、2種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させることを特徴とする請求項6又は請求項7に記載の細胞着床方法。
- 光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、
(A)該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、
(B)光固定化した前記細胞着床要素に対して一定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程と、
(C)着床させた前記細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作製し、これを採取する回収工程と、
を行うことを特徴とする細胞組織作製方法。
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