CN108624497B - 细胞密度控制仪及其方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞密度控制仪及其方法、应用,所述的细胞密度控制仪包括激光光源和沿着激光光路依次设置的准直透镜、筛网及细胞培养平台,细胞培养平台上设置温度控制装置,能够感应细胞培养平台的温度,当温度达到设定温度后关闭激光光源;细胞培养平台设置有容纳传统细胞培养板或培养皿的凹槽及固定装置,激光光源投射到准直透镜后,准直透镜将激光平行出射,平行激光经过筛网后,将激光遮挡为间隔相同的大量的平行光带投射在培养板上。利用高温导致细胞受损死亡的原理,将细胞密度控制在设定水平,为进一步明确细胞增殖能力、提高细胞质粒转染成功率提供更加可靠的手段和依据。
Description
技术领域
本发明涉及细胞表型学、细胞生物学、光热学技术领域,进一步涉及细胞密度控制仪及其方法、应用。
背景技术
细胞增殖实验(MTT法)可以监测贴壁细胞增殖速度变化情况,被广泛应用于细胞活性实验基础研究领域。细胞增殖能力增强往往是肿瘤细胞发生发展过程中的特征性表现,通过干扰细胞的增殖能力有利于控制肿瘤的生长,减慢肿瘤患者病情的发展及恶化。因此,细胞增殖实验是医学基础研究领域的重要手段,具有广泛的实用价值。
质粒转染实验目的是将携带目的基因的质粒转移进入宿主细胞胞内,并在宿主细胞中发挥相应作用的方法。该实验是明确目的基因在细胞功能表型及生理变化中发挥何种作用的重要手段之一。实验中除转染试剂浓度、质粒浓度外,细胞密度的严格控制在提高质粒转染效率中起到关键作用。
目前细胞增殖实验包括克隆形成实验及MTT比色法,前者是将散在单个细胞种植于培养平板中,观察单个细胞形成细胞克隆群(>50个细胞)的能力。后者是将贴壁细胞消化为悬浮细胞后经严格细胞计数种植于平板中进行培养,间隔不同时间段加入MTT(商品名:噻唑蓝),作用4小时后更换液体为二甲基亚砜(DMSO),通过酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值来判断细胞增殖能力。该实验原理是活细胞可以将MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒,而死细胞无此功能。MTT比色法检测结果较为客观,准确性好易于操作被广泛应用。细胞接种过程中需要达到组间数量一致,细胞密度最佳状态是影响MTT比色法实验结果的关键,传统的细胞接种法需要实验者在无菌条件下进行熟练、快速、准确的计数操作,是MTT比色法成败的关键。
质粒转染实验是将细胞按一定数量接种于培养平板中,待贴壁后加入转染试剂如脂质体Lip2000及转染质粒,无血清状态下作用6小时后换完全培养基。48小时后可进行细胞功能学实验。虽然质粒转染方法已被广泛应用,但转染过程中不同种类的细胞、细胞密度、转染试剂及质粒种类的差异均对转染效率产生较大影响,需要反复多次验证从而达到最理想转染效果。
然而传统技术存在如下技术缺陷:
(1)细胞能否达到分布均匀,密度理想一致、细胞状态是否良好是提高实验成功率及保证可重复性的关键环节。这对操作者实验技能的要求较高,由于传统计数法极易受到人为因素影响,细胞分布的不均匀会使结果产生较大偏差,实验可重复性差。
(2)传统细胞计数法较为耗时,反复消化、吹打、离心细胞的过程对细胞损伤较大,特别是原代培养细胞,传代可能导致细胞大量死亡。而质粒瞬转后的细胞每增加一次传代,转染效率明显下降,严重影响对目的基因发挥作用的观察研究。
目前市场上推广的智能细胞计数仪虽然可以减少主观计数误差,也存在技术缺陷:仅对选定的小范围视野内的细胞进行计数,如选取多点进行计数加了耗时依然存在误差可能;对一些溶液中残渣的识别能力有限,影响计数结果;专用细胞载玻片为消耗品,增加了细胞实验的成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种细胞密度控制仪及其方法、应用。
本发明的技术方案如下:
一种细胞密度控制仪,包括激光光源和沿着激光光路依次设置的准直透镜、筛网及细胞培养平台,细胞培养平台上设置温度控制装置,能够感应细胞培养平台的温度,当温度达到设定温度后关闭激光光源;细胞培养平台设置有容纳传统细胞培养板或培养皿的凹槽及固定装置,激光光源投射到准直透镜后,准直透镜将激光平行出射,平行激光经过筛网后,将激光遮挡为间隔相同的大量的平行光带投射在培养板上;筛网包括多个缝隙间隔条,筛网呈百叶窗形,通过改变缝隙间隔条的倾斜角度,可调节缝隙宽度达到调节筛网透光率的目的。
所述的细胞密度控制仪,还设置有控制缝隙间隔条绕自身轴线旋转的第一转动装置和控制筛网绕垂直于筛网的轴线旋转的第二转动装置。
所述的细胞密度控制仪,所述的缝隙间隔条为避光耐热材质,缝隙间隔条在第一转动装置的驱动下绕自身轴线旋转。
所述的细胞密度控制仪,激光光源选用超短脉冲激光,波长为1064nm,功率为100mW。
所述的细胞密度控制仪,筛网含有数千根长方形缝隙间隔条,缝隙间隔条间隔距离为100微米,构成百叶窗结构。
一种利用任一所述的细胞密度控制仪进行细胞密度控制的方法,接种细胞,待细胞贴壁生长达到最佳生长密度80-90%,吸去细胞培养液,迅速放置于培养板平台上进行固定,通过激光照射,瞬间达到致死温度,终止照射,使接受激光投射部位的细胞死亡裂解,通过两次激光照射,存活的细胞即呈现为均匀分布的散在点状细胞集团。
所述的方法,打开激光光源后,根据需要的培养密度调整缝隙间隔条的角度获得需要的缝隙宽度,培养板上的细胞经第一次激光照射达到设定温度后温度控制装置切断激光光源的电路,受到照射的带状条纹范围内的细胞死亡,未受到照射的带状范围内的细胞存活,这样培养板上形成死细胞条带与活细胞条带,且死细胞条带与活细胞条带平行间隔分布,然后沿垂直轴转动筛网90°,打开激光光源,对培养板进行第二次照射,达到设定温度后温度控制装置切断激光光源的电路,再次形成与上述死细胞条带与活细胞条带垂直的死细胞条带与活细胞条带,这样最终存活的细胞即呈现为均匀分布的散在点状细胞集团。
所述的细胞密度控制方法的应用,应用于细胞增殖实验、质粒转染实验中。
通过上述技术方案可知本发明的细胞控制仪器及其应用所体现的有益效果在于:
(1)本发明是电热学法,可以通过高温导致细胞受损死亡的原理,将细胞密度控制在设定水平,为进一步明确细胞增殖能力、提高细胞质粒转染成功率提供更加可靠的手段和依据;
(2)本发明可直接使用增殖状态最佳(80-90%)的贴壁细胞进行后续实验,增加了试验成功率。
(3)本发明可以严格精确的控制细胞密度,培养板中各小室的细胞密度达到组间一致性,为实验的客观性、提高成功率及可重复性提供保证。可以同时进行多组平行实验,极大的提高了实验通量。
附图说明
图1是本发明实施例细胞控制仪器的总体结构图
图2是本发明实施例激光筛网的结构图;
图3是本发明实施例温度感应调控电路装置的结构图;
1光源,2激光筛网,3温度感应器,4细胞培养板,5电路,6细胞培养板小室,7光线遮挡部位(细胞存活),8光线照射部位(细胞死亡),9电源。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明进一步详细说明。
如图1所示,一种细胞密度控制仪,包括激光光源和沿着激光光路依次设置的准直透镜、筛网及细胞培养平台,细胞培养平台上设置有温度控制装置,能够感应细胞培养平台的温度,当温度达到设定温度后关闭激光光源。细胞培养平台设置有容纳传统细胞培养板(或培养皿)的凹槽及固定装置,激光光源投射到准直透镜后,准直透镜将激光平行出射,平行激光经过筛网后,将激光遮挡为间隔相同的大量的(可达到数千个以上)平行光带投射在培养板上。筛网包括多个缝隙间隔条,呈百叶窗形,通过改变缝隙间隔条的倾斜角度,可调节缝隙宽度达到调节筛网透光率的目的。
本发明还设置有控制缝隙间隔条绕自身轴线旋转的第一转动装置和控制筛网绕垂直于筛网的轴线旋转的第二转动装置,所述第一转动装置和第二转动装置采用本领域常规技术手段实现即可,在此不再赘述。
所述的缝隙间隔条为避光耐热材质,缝隙间隔条可以受控制的在第一转动装置的驱动下绕自身轴线旋转,同时筛网本身也可受控制的在第二转动装置驱动下绕垂直于筛网的轴线旋转。
温度控制装置中接受激光照射的温度感应探头与传统培养板吸光产热率相同。当接手激光照射时与培养板温度同步上升,在温度达到100℃时,可自动切断电路连接,关闭激光光源。
根据本发明的另一方面,还提供利用以上装置进行细胞密度控制的方法,包括:
在传统培养板内接种细胞,待细胞贴壁生长达到最佳生长密度80-90%,吸去细胞培养液,迅速放置于本装置培养板平台上进行固定,通过激光照射,瞬间达到致死温度,终止照射,使接受激光投射部位的细胞死亡裂解,通过两次激光照射,存活的细胞即呈现为均匀分布的散在点状细胞集团。加入培养液使温度快速降低,减少热扩散,轻柔吹吸将死亡细胞移除,进行后续MTT比色法实验或质粒转染实验。
具体来说,打开激光光源后,根据需要的培养密度调整缝隙间隔条的角度获得需要的缝隙宽度,培养板上的细胞经第一次激光照射达到设定温度后温度控制装置切断激光光源的电路,受到照射的带状条纹范围内的细胞死亡,未受到照射的带状范围内的细胞存活,这样培养板上形成死细胞条带与活细胞条带,且死细胞条带与活细胞条带平行间隔分布,然后沿垂直轴转动筛网90°,打开激光光源,对培养板进行第二次照射,达到设定温度后温度控制装置切断激光光源的电路,再次形成与上述死细胞条带与活细胞条带垂直的死细胞条带与活细胞条带,这样最终存活的细胞即呈现为均匀分布的散在点状细胞集团。
在本发明的一个示例性实施例中,提供了一种用于控制细胞密度的装置。请参照图2。本实施例中,细胞培养板由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,简称PDMS)制作,其上形成有6到96个小室阵列,该材料在100℃以下不会发生变形、燃烧,导热能力较差有利于防止热扩散影响临近细胞。
请参照图2,本发明装置培养板固定器凹槽尺寸与细胞培养板尺寸一致,可根据常用培养板(长方形)及培养皿(圆形)底座形状设计不同形状凹槽及弹簧固定片,确保培养板位置固定,不易移动。培养板为向上开口的长方形大室,内含多孔底板为圆型的小室。本装置在结构上,完全适应现有的多孔板平台。
可以理解的是,培养板小室的底面形状不局限于长方形,其也可以是圆形,三角形等其他规则或不规则图形。并且,培养板小室的数量也可以是96、48、24、12、6等其他标准规格多孔板的孔的数量,或者是设计者规定的其他数量。
如图2所示,激光光源选用超短脉冲激光,波长为1064nm,功率为100mW。优点:可瞬间使光波照射部位温度升高,达到100℃。几乎不存在热扩散对邻近细胞的损伤。光源投射横截面可以限定大小,尺寸及形状,适用于单孔、多孔同时照射,便于后续实验需求。光源投射时间由温度感应器控制激光电路开闭,见图3。
如图2所示筛网含有数千根长方形缝隙间隔条,缝隙间隔条间隔距离为100微米,构成百叶窗结构。根据缝隙间隔条沿水平轴转动的角度不同,穿过筛网的光柱横截面积发生改变。
如图3的温度感应装置可控制光源电路开闭,采用一般的热电偶灵敏控制温度,当温度感应器温度达到100℃时,切断光源电路,终止照射,避免了细胞过度受热碳化,与培养板发生粘连,以及培养板发生变形,影响细胞增殖迁移。
上述实施例以可以严格控制贴壁细胞生长密度后进行细胞增殖实验及细胞质粒转染实验为例进行说明,而事实上,本发明还可以应用于其他需要控制细胞密度的生物实验中,如不宜频繁传代的原代培养细胞实验,慢病毒转染细胞实验等。其大通量、易于调控、客观精确的特点具有独特的优势。
以48孔培养板上进行MTT实验为例,比较细胞经密度控制仪处理后或经传统人工细胞计数铺板后在培养第一天时测定490nm波长处光吸收值来评价两种方法所得的单位面积下存活细胞数量的变异系数是否存在差异及那种方法具有更好的可靠性。各孔间细胞数量越一致,变异系数越接近0,可靠性越好。
传统人工铺板法均值为0.4995,标准差0.02825,变异系数0.05656;
细胞密度控制仪处理法均值为0.5019,标准差为0.003736,变异系数0.007444。
单样本变异系数的检验由Miller在1991年提出。检验所指定的总体变异系数为(σ/μ)。
1.建立检验假设:
H0:σ/μ=(σ/μ)0=0.02825
2.计算统计量:u值
故接受H0,拒绝H1,两种实验方式所得吸光度值的变异系数存在明显差异。细胞经密度控制仪处理后变异系数(0.007444),明显小于传统人工计数铺板(0.05656)。
综上所述,本发明提供了一种用于控制贴壁细胞生长密度的细胞密度控制仪,通过对激光照射面积及照射时间的精确调控,因此细胞密度达到预期效果,结果可靠性强,可重复性高,具有较好的应用前景。此外,其一次可以实现多组的平行实验,通量高,从而大大降低了实验成本。
应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种细胞密度控制仪,其特征在于,包括激光光源和沿着激光光路依次设置的准直透镜、筛网及细胞培养平台,细胞培养平台上设置温度控制装置,能够感应细胞培养平台的温度,当温度达到设定温度后关闭激光光源;细胞培养平台设置有容纳传统细胞培养板或培养皿的凹槽及固定装置,激光光源投射到准直透镜后,准直透镜将激光平行出射,平行激光经过筛网后,将激光遮挡为间隔相同的大量的平行光带投射在培养板上;筛网包括多个缝隙间隔条,筛网呈百叶窗形,通过改变缝隙间隔条的倾斜角度,可调节缝隙宽度达到调节筛网透光率的目的。
2.根据权利要求1所述的细胞密度控制仪,其特征在于,还设置有控制缝隙间隔条绕自身轴线旋转的第一转动装置和控制筛网绕垂直于筛网的轴线旋转的第二转动装置。
3.根据权利要求1所述的细胞密度控制仪,其特征在于,所述的缝隙间隔条为避光耐热材质,缝隙间隔条在第一转动装置的驱动下绕自身轴线旋转。
4.根据权利要求1所述的细胞密度控制仪,其特征在于,激光光源选用超短脉冲激光,波长为1064nm,功率为100mW。
5.根据权利要求1所述的细胞密度控制仪,其特征在于,筛网含有数千根长方形缝隙间隔条,缝隙间隔条间隔距离为100微米,构成百叶窗结构。
6.一种利用权利要求1-5任一所述的细胞密度控制仪进行细胞密度控制的方法,其特征在于,接种细胞,待细胞贴壁生长达到最佳生长密度80-90%,吸去细胞培养液,迅速放置于培养板平台上进行固定,通过激光照射,瞬间达到致死温度,终止照射,使接受激光投射部位的细胞死亡裂解,通过两次激光照射,存活的细胞即呈现为均匀分布的散在点状细胞集团。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,打开激光光源后,根据需要的培养密度调整缝隙间隔条的角度获得需要的缝隙宽度,培养板上的细胞经第一次激光照射达到设定温度后温度控制装置切断激光光源的电路,受到照射的带状条纹范围内的细胞死亡,未受到照射的带状范围内的细胞存活,这样培养板上形成死细胞条带与活细胞条带,且死细胞条带与活细胞条带平行间隔分布,然后沿垂直轴转动筛网90°,打开激光光源,对培养板进行第二次照射,达到设定温度后温度控制装置切断激光光源的电路,再次形成与上述死细胞条带与活细胞条带垂直的死细胞条带与活细胞条带,这样最终存活的细胞即呈现为均匀分布的散在点状细胞集团。
8.权利要求6或7所述的细胞密度控制方法的应用,其特征在于,应用于细胞增殖实验、质粒转染实验中。
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