WO2018047702A1 - 細胞培養方法、当該細胞培養方法によって培養された目的細胞、及び、細胞培養装置 - Google Patents

細胞培養方法、当該細胞培養方法によって培養された目的細胞、及び、細胞培養装置 Download PDF

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cells
laser light
cell
unnecessary
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松田　浩一
陽平 寺井
友哉 水谷
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シンフォニアテクノロジー株式会社
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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
    • C12M31/02—Means for providing, directing, scattering or concentrating light located outside the reactor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a technique for culturing a target cell while removing the unnecessary cell when the cell in the culture solution contains the target cell to be cultured and an unnecessary cell other than the target cell.
  • the influence of heat due to the laser light reaches the target cells around the unnecessary cells, which may reduce the quality of the target cells.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and it is an object of the present invention to suppress the adverse effect of laser light heat on target cells when unwanted cells are peeled off by laser light.
  • the present invention provides the target cell while removing the unnecessary cell when the target cell to be cultured and the unnecessary cell other than the target cell are contained in the cells present in the culture solution placed in the culture vessel.
  • a method of culturing a cell wherein a laser beam irradiation step of irradiating the unnecessary cell with a laser beam to separate the unnecessary cell adhered to the culture vessel from the culture vessel, and the laser beam
  • a culture step for culturing the target cell which is performed following the irradiation step, and a culture for replacing the culture solution containing the unnecessary cells detached from the culture vessel, which is performed subsequent to the culture step, with a new one.
  • a liquid exchange step is performed.
  • the present invention provides a method in which the cells existing in the culture solution placed in a culture vessel contain target cells to be cultured and unnecessary cells other than the target cells while removing the unnecessary cells.
  • a cell culture apparatus for culturing a target cell the laser light irradiation apparatus for irradiating the unnecessary cells with laser light in order to separate the unnecessary cells adhered to the culture container from the culture container,
  • the culture container containing the unnecessary cells irradiated with the laser light by a laser light irradiation device is accommodated, and after culturing the target cell in the culture part, the culture cell is cultured from the culture container.
  • a culture medium exchange device for exchanging the culture medium containing the detached unnecessary cells with a new one.
  • the culture solution after irradiating unnecessary cells with laser light, the culture solution is not exchanged immediately, but the culture solution is exchanged after interposing the culture process.
  • the irradiation of laser light it is only necessary that the detachment of unnecessary cells proceeds during the culturing process. And can be made relatively small. In this way, by reducing the energy of the laser light that irradiates unnecessary cells, the adverse effect of the heat of the laser light on the target cells can be suppressed.
  • the energy of the laser light is adjusted so that separation of the unnecessary cells irradiated with the laser light from the culture container is completed during the culture process. Good.
  • the target cells cultured by the cell culture method according to the present invention have reduced adverse effects due to the heat of the laser beam, it is possible to suppress degradation of the quality of the target cells and to improve the production efficiency of the target cells. Can be improved.
  • the laser light irradiation device includes a stage on which the culture vessel is placed, and an imaging unit that takes an image of the cells in the culture vessel placed on the stage. And an irradiation control unit that controls irradiation of the unnecessary cells with the laser beam based on the image captured by the imaging unit.
  • the laser light irradiation device further includes a stage driving unit that moves the stage, and the irradiation control unit controls the stage driving unit to control the culture container. It is good to move and irradiate the said unnecessary cell with the said laser beam.
  • FIG. 1 is a front view schematically showing a cell culture device according to the present embodiment
  • FIG. 2 is a block diagram showing an electrical configuration of the cell culture device
  • FIG. 3 is an enlarged view of a laser light irradiation device.
  • FIG. 4 is an enlarged view of the culture medium exchange device.
  • the cell culture device 1 includes a culture shelf 2 (culture unit), a transport device 3, a laser light irradiation device 4, and a culture medium exchange device 5 provided inside a housing 6. It has become.
  • the operations of the transport device 3, the laser light irradiation device 4, and the culture medium exchange device 5 are controlled by the control device 7.
  • the internal environment of the housing 6 is maintained at a predetermined temperature and humidity suitable for cell culture, and is in a sterilized state or a state close to a sterilized state in which no bacteria that impede cell growth are present.
  • the culture shelf 2 is configured to accommodate a plurality of culture containers P. When culturing cells, the culture vessel P containing cells is stored in the culture shelf 2 for a predetermined time.
  • the transfer device 3 is a device for moving the culture vessel P between the culture shelf 2, the laser beam irradiation device 4, and the culture medium exchange device 5.
  • the transfer device 3 includes a telescopic arm 31 that can support the culture vessel P, an elevating mechanism 32 that includes a ball screw that elevates and lowers the arm 31, and a rotation motor 33 that rotates the arm 31 in a horizontal plane.
  • the operations of the arm 31, the lifting mechanism 32, and the rotary motor 33 are controlled by the control device 7 (see FIG. 2).
  • the transfer device 3 appropriately expands and contracts the arm 31 and appropriately moves the arm 31 up and down by a lifting mechanism 32 and a rotary motor 33 to bring the culture vessel P placed on the tip of the arm 31 into a desired position. Can be moved.
  • the laser light irradiation device 4 is a device for irradiating unnecessary cells in the culture vessel P with laser light.
  • FIG. 5 is a schematic view showing the inside of the culture vessel P.
  • a culture solution L is placed in a culture vessel P made of a transparent material such as glass, and cells C are cultured in a state of being adhered to the bottom surface of the culture vessel P.
  • the cell C includes a target cell Ca to be cultured and an unnecessary cell Cb other than the target cell Ca.
  • the cell culture device 1 can irradiate the unnecessary cells Cb with the laser beam irradiation device 4 to reduce the adhesion function of the unnecessary cells Cb and peel off the unnecessary cells Cb from the bottom surface of the culture vessel P.
  • the cells By removing unnecessary cells Cb, the cells can be cultured in a pure state of only the target cells Ca. Furthermore, by removing the unnecessary cells Cb, the nutrient contained in the culture medium L can be suppressed from being consumed by the unnecessary cells Cb, and the target cells Ca can be efficiently cultured, and the target cells Ca can proliferate. A large area can be secured.
  • the laser beam irradiation device 4 has the same basic configuration as a microscope, and is disposed below the stage 41 and a stage 41 made of a transparent member on which the culture vessel P can be placed. And an objective lens 42.
  • the stage 41 is a so-called XY moving stage configured to be movable in the horizontal direction (left-right direction and front-rear direction) by a stage moving mechanism 43 (stage driving unit, see FIG. 2).
  • the laser beam irradiation device 4 is provided with a camera 44 (imaging unit) capable of capturing an image of the cell C observed through the objective lens 42, and the camera 41 captures an image above the stage 41.
  • a light 45 is provided to compensate for the amount of light required. The operations of the camera 44 and the light 45 are controlled by the control device 7 (see FIG. 2).
  • an image of the cell C is captured by the camera 44 while the stage 41 is moved by the stage moving mechanism 43, so that an enlarged image can be obtained in the entire region of the cell C adhered to the bottom surface of the culture vessel P. Obtainable.
  • the image data of the cells C photographed by the camera 44 is sequentially sent to the control device 7.
  • the control device 7 performs image processing on the image data of the cell C, detects the unnecessary cell Cb, acquires its position information, and stores the position information in the storage unit 7a (see FIG. 2).
  • the laser light irradiation device 4 includes a laser light generator 46 that generates laser light mainly composed of infrared light, a collimator lens 47 for making the laser light parallel light, and transmits visible light and reflects laser light. And a dichroic mirror 48.
  • the laser light generated by the laser light generator 46 enters the objective lens 42 via the collimating lens 47 and the dichroic mirror 48. Then, the focal point of irradiation is adjusted to the position of the unnecessary cell Cb by the objective lens 42, so that the unnecessary cell Cb can be irradiated with the laser light.
  • the laser beam irradiation device 4 has an irradiation control unit 49 (see FIG. 2) for controlling the operation of the stage moving mechanism 43 and the laser beam generator 46.
  • the irradiation control unit 49 receives the position information of the unnecessary cell Cb from the storage unit 7a of the control device 7, and controls the stage moving mechanism 43 and the laser light generator 46 based on the position information. Specifically, the irradiation controller 49 controls the stage moving mechanism 43 based on the position information of the unnecessary cells Cb, and moves the stage 41 so that the unnecessary cells Cb are positioned on the optical axis of the objective lens 42. Subsequently, by operating the laser light generator 46, the unnecessary cells Cb are irradiated with laser light. By repeating these controls, unnecessary cells Cb existing in the entire region of the cell C can be irradiated with laser light.
  • the culture medium exchange device 5 is an apparatus for exchanging the culture medium L, which has consumed nutrients by culturing the cells C, with a new one.
  • the culture medium exchange device 5 includes a storage part 51 in which a new culture liquid L is stored, a supply pipe 52 that guides the culture liquid L in the storage part 51 to the culture container P, and a supply pipe 52.
  • a suction pump 53 provided in the middle of the culture vessel P
  • a support base 54 that supports the culture vessel P
  • a swing mechanism 55 that swings the support base 54 in the vertical plane.
  • the discharge pipe 56 and a suction pump 57 provided in the middle of the discharge pipe 56 are provided.
  • fluctuation mechanism 55 is controlled by the control apparatus 7 (refer FIG. 2).
  • the upper surface of the culture container P shall be opened.
  • the culture vessel P When exchanging the culture solution L, first, as shown in FIG. 4A, the culture vessel P is placed on the support base 54 in a horizontal state. Next, as shown in FIG. 4 (b), the support 54 is slightly swung by the rocking mechanism 55, and the suction pump 56 is inserted into the portion where the culture medium L is accumulated, and the suction pump By activating 57, the culture solution L in the culture vessel P is discarded via the discharge pipe 56. When the culture medium L is discarded, the support base 54 and the culture container P are returned to the horizontal state by the swing mechanism 55. And by operating the suction pump 53, the new culture solution L in the storage part 51 is supplied to the culture container P, and replacement
  • the discharge pipe 56 is configured to be movable or extendable so that its tip can be taken in and out of the culture solution L. Moreover, there is a possibility that dust and bacteria may adhere to the tip portion when the tip portion of the discharge pipe 56 is taken in and out of the culture solution L. Therefore, it is preferable that the distal end portion of the discharge pipe 56 is configured to be detachable from other portions. Or the front-end
  • FIG. 6 is a flowchart showing the procedure of the culture method.
  • the cell C (mainly target cell Ca) is cultured by storing the culture vessel P in the culture shelf 2 for a predetermined time (culture step, step S11).
  • the predetermined time referred to here is determined based on the time that the nutrient contained in the culture solution L in the culture vessel P is consumed by the cells C. That is, when the predetermined time elapses, most of the nutrients of the culture solution L are consumed, and it is time to replace the culture solution L.
  • This predetermined time may be a fixed time, or may be a time that is appropriately changed in accordance with a change in the time until the nutrients are lost depending on the amount of the culture solution L and the growth state of the cells C.
  • step S12 it is determined whether or not the culture of the target cell Ca is completed. This determination is made, for example, by the operator viewing the target cell Ca. However, this determination may be made based on whether or not the culturing step has been performed a predetermined number of times, and other determination methods may be employed.
  • step S12 If the culture of the target cell Ca has not been completed in step S12, the culture container P is taken out from the culture shelf 2 by the transport device 3 and placed on the support 54 of the culture medium exchange device 5. Subsequently, the support base 54 is swung by the swing mechanism 55 and the suction pump 57 is operated to discard the old culture solution L in the culture vessel P. Further, by operating the suction pump 53 after returning the support base 54 to the original position, a new culture medium L is supplied from the reservoir 51 to the culture vessel P, and the replacement of the culture medium L is completed (culture medium replacement). Process, step S13).
  • the culture vessel P is taken out from the culture solution exchange device 5 by the transfer device 3 and placed on the stage 41 of the laser light irradiation device 4. Then, the unnecessary light Cb is irradiated with laser light by the laser light irradiation device 4 (laser light irradiation step, step S14).
  • the process returns to the culture process of step S11, and the cycle of the culture process ⁇ the culture solution exchange process ⁇ the laser light irradiation process ⁇ the culture process is repeated until the culture of the target cell Ca is completed.
  • FIG. 7 is a flowchart showing details of the laser light irradiation process.
  • the stage 41 is moved by the stage moving mechanism 43 so that the cell C enters the field of view of the objective lens 42 (step S21).
  • an image of the cell C is taken by the camera 44 (step S22).
  • Image data captured by the camera 44 is sent to the control device 7.
  • the control device 7 performs image processing on the sent image data, thereby detecting unnecessary cells Cb and acquiring positional information of the unnecessary cells Cb, and storing the positional information in the storage unit 7a (step S23).
  • the control device 7 determines whether or not imaging of the entire area of the cell C has been completed (step S24), and repeatedly executes steps S21 to S23 until imaging of the entire area is completed.
  • the irradiation control unit 49 of the laser light irradiation device 4 receives the position information of the unnecessary cell Cb from the storage unit 7a of the control device 7. Based on the position information of the unnecessary cell Cb, the stage moving mechanism 43 is controlled to move the stage 41 so that the unnecessary cell Cb is positioned on the optical axis of the objective lens 42 (step S25). Subsequently, the laser light generator 46 is operated to irradiate unnecessary cells Cb with laser light (step S26).
  • the irradiation control unit 49 determines whether or not the unnecessary cells Cb in the entire region have been irradiated with the laser light (step S27), and steps S25 to S25 are performed until the irradiation of all the unnecessary cells Cb is completed. S26 is repeatedly executed.
  • the unnecessary cells Cb irradiated with the laser light are peeled off from the bottom surface of the culture vessel P during the culture process subsequent to the laser light irradiation process. And the unnecessary cell Cb which peeled from the culture container P and was floating in the culture solution L is discarded with the old culture solution L at the culture solution exchange process following a culture process.
  • FIG. 8 is a graph schematically showing the relationship between the energy of the laser light and the time required for the cells to detach. As shown in FIG. 8, the larger the laser beam energy, the shorter the time required for cell detachment, and the smaller the laser light energy, the longer the time required for cell detachment.
  • the energy of the laser beam is E0 or more, the cells are detached almost simultaneously with the laser beam irradiation.
  • the unnecessary cells Cb are immediately detached by irradiating such intense laser light, and immediately after that, the unnecessary cells Cb detached with the old culture solution L are discarded.
  • the adverse effect of the heat of the laser light may reach the target cell Ca.
  • the culture process is performed instead of the culture solution exchange process following the laser light irradiation process, it is not necessary to immediately peel off the unnecessary cells Cb by the laser light. It is sufficient that the unnecessary cells Cb are peeled off. That is, by securing a long time required for peeling off the unnecessary cells Cb, the energy of the laser beam can be reduced, and adverse effects on the target cells Ca can be suppressed.
  • the laser beam energy is adjusted so that the laser beam having the energy E2 larger than the energy E1 corresponding to the predetermined time t1 is irradiated and the time t2 required for the peeling is shorter than the predetermined time t1. ing.
  • the energy of the laser light is adjusted so that the detachment of the unnecessary cells Cb irradiated with the laser light is completed during the predetermined time t1 of the culture process.
  • the culture medium L is not replaced immediately after the unnecessary cells Cb are irradiated with the laser light, but the culture medium L is replaced after interposing the culture process. .
  • unnecessary cells Cb need only be peeled off during the culturing process after laser light irradiation, the energy of the laser light is greatly increased as in the case where unnecessary cells Cb are peeled off from the culture vessel P immediately after irradiation. There is no need to do this, and it can be made relatively small.
  • the energy of the laser beam irradiated to the unnecessary cell Cb can be reduced, the adverse effect of the heat of the laser beam on the target cell Ca can be suppressed.
  • the energy of the laser beam is adjusted so that the detachment of the unnecessary cells Cb irradiated with the laser beam from the culture vessel P is completed during the culture process.
  • the target cell Ca cultured by the cell culturing method according to the present embodiment has reduced adverse effects due to the heat of the laser beam, it is possible to suppress a decrease in the quality of the target cell Ca and to reduce the target cell Ca.
  • the production efficiency can be improved.
  • the laser light irradiation device 4 includes a stage 41 on which the culture vessel P is placed, and a camera 44 (imaging unit) that takes an image of the cells C in the culture vessel P placed on the stage 41. ) And an irradiation control unit 49 that controls the irradiation of the unnecessary cells Cb with the laser light based on the image photographed by the camera 44. According to such a configuration, a series of operations from detection of unnecessary cells Cb to irradiation with laser light can be automated, and unnecessary cells Cb can be efficiently removed.
  • the laser beam irradiation device 4 further includes a stage moving mechanism 43 (stage driving unit) that moves the stage 41, and the irradiation control unit 49 controls the stage moving mechanism 43 to control the culture vessel.
  • P is moved so that unnecessary cells Cb are irradiated with laser light.
  • the unnecessary cell Cb in the entire region can be peeled without changing the irradiation position of the laser beam. Therefore, it is possible to avoid the complexity of the optical system for irradiating the laser beam, and the irradiation accuracy of the laser beam can be improved.
  • the cell culture device 1 automatically executes each of the culture process, the culture solution exchange process, and the laser light irradiation process.
  • an operator may perform some of these steps.
  • the control apparatus 7 acquires the positional information of the unnecessary cell Cb by performing image processing of the image data image
  • the operations of the stage moving mechanism 43 and the laser light generator 46 are controlled based on the positional information of the cell Cb.
  • the irradiation control unit 49 of the laser light irradiation device 4 has sufficient processing capability
  • the irradiation control unit 49 may perform image processing to acquire position information of the unnecessary cells Cb.
  • the stage moving mechanism 43 moves the stage 41 on which the culture vessel P is placed, so that the entire area of the cell C is photographed by the camera 44 or the unnecessary cell Cb in the entire area of the cell C.
  • the laser beam was irradiated.
  • the entire region of the cell C may be photographed by the camera 44, or the unnecessary cell Cb may be irradiated with laser light in the entire region of the cell C.
  • the entire region of the cell C is subjected to photographing with the camera 44 and laser light irradiation.
  • this is not indispensable, and only a part of the cell C may be photographed or irradiated with laser light.
  • the upper surface of the culture vessel P is opened.
  • a lid for closing the opening may be provided.
  • the lid is removed when the culture medium L is replaced.

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Abstract

レーザー光によって不要細胞を剥離させる場合に、レーザー光の熱が目的細胞に及ぼす悪影響を抑える。培養容器に入れられた培養液中に存在する細胞に、培養対象である目的細胞と目的細胞以外の不要細胞とが含まれる場合に、不要細胞を除去しながら目的細胞を培養するための細胞培養方法であって、培養容器に接着している不要細胞を培養容器から剥離させるため、不要細胞にレーザー光を照射するレーザー光照射工程と、レーザー光照射工程に続いて実行される、目的細胞を培養する培養工程と、培養工程に続いて実行される、培養容器から剥離した不要細胞を含む培養液を新しいものに交換する培養液交換工程と、を備える。

Description

細胞培養方法、当該細胞培養方法によって培養された目的細胞、及び、細胞培養装置
　本発明は、培養液中の細胞が培養対象である目的細胞と目的細胞以外の不要細胞とを含む場合に、不要細胞を除去しながら目的細胞を培養するための技術に関する。
　例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の培養を行う際には、培養対象としている目的細胞とは異なる細胞に変化（分化）した不要細胞を除去しつつ、目的細胞を培養していく必要がある。培養中の細胞が培養容器に接着している場合、不要細胞を除去するためには、不要細胞を培養容器から剥離する必要がある。このような剥離作業は、従来、作業者が顕微鏡で細胞を観察しながら不要細胞を確認し、所定の器具を用いて不要細胞を培養容器から剥離していた。
　しかしながら、このような作業は緻密であり、作業者の負担が大きいため、これに代わってレーザー光を用いて不要細胞を剥離する方法が考えられる。不要細胞にレーザー光を照射することで、細胞が有する接着機能が弱くなり、不要細胞が培養容器から自然に剥離する。この場合、レーザー光の照射に続いて、剥離した不要細胞を含む古い培養液が新しい培養液に交換された後、目的細胞の培養が続けられる。
　しかしながら、レーザー光を用いた不要細胞の剥離方法では、レーザー光による熱の影響が不要細胞の周りの目的細胞にも及んでしまい、目的細胞の品質を低下させるおそれがあった。
　本発明は、上述の課題を鑑みて、レーザー光によって不要細胞を剥離させる場合に、レーザー光の熱が目的細胞に及ぼす悪影響を抑えることを目的とする。
　本発明は、培養容器に入れられた培養液中に存在する細胞に、培養対象である目的細胞と前記目的細胞以外の不要細胞とが含まれる場合に、前記不要細胞を除去しながら前記目的細胞を培養するための細胞培養方法であって、前記培養容器に接着している前記不要細胞を前記培養容器から剥離させるため、前記不要細胞にレーザー光を照射するレーザー光照射工程と、前記レーザー光照射工程に続いて実行される、前記目的細胞を培養する培養工程と、前記培養工程に続いて実行される、前記培養容器から剥離した前記不要細胞を含む前記培養液を新しいものに交換する培養液交換工程と、を備えることを特徴とする。
　また、本発明は、培養容器に入れられた培養液中に存在する細胞に、培養対象である目的細胞と前記目的細胞以外の不要細胞とが含まれる場合に、前記不要細胞を除去しながら前記目的細胞を培養するための細胞培養装置であって、前記培養容器に接着している前記不要細胞を前記培養容器から剥離させるため、前記不要細胞にレーザー光を照射するレーザー光照射装置と、前記レーザー光照射装置によって前記レーザー光が照射された前記不要細胞を含む前記培養容器を収容し、前記目的細胞を培養する培養部と、前記培養部で前記目的細胞を培養した後、前記培養容器から剥離した前記不要細胞を含む前記培養液を新しいものに交換する培養液交換装置と、を備えることを特徴とする。
　本発明によれば、不要細胞へのレーザー光の照射後、すぐに培養液が交換されるのではなく、培養工程を間に挟んでから培養液の交換が行われる。つまり、レーザー光の照射後、培養工程の間に不要細胞の剥離が進行すればよいので、レーザー光のエネルギーを、照射後すぐに不要細胞を培養容器から剥離させる場合のように大きくする必要はなく、比較的小さくすることができる。このように、不要細胞に照射するレーザー光のエネルギーを小さくできることで、レーザー光の熱が目的細胞に及ぼす悪影響を抑えることができる。
　また、本発明に係る細胞培養方法において、前記レーザー光のエネルギーは、前記レーザー光が照射された前記不要細胞の前記培養容器からの剥離が、前記培養工程の間に完了するように調整されるとよい。
　このようにレーザー光のエネルギーを調整することで、培養工程の後に培養液を交換する際には、不要細胞の剥離が完了していることになるので、不要細胞の除去を効率的に行うことができる。
　また、本発明に係る細胞培養方法によって培養された目的細胞は、レーザー光の熱による悪影響が抑えられていることから、目的細胞の品質の低下を抑えることができるとともに、目的細胞の生産効率を向上させることができる。
　また、本発明に係る細胞培養装置において、前記レーザー光照射装置は、前記培養容器が載置されるステージと、前記ステージに載置された前記培養容器内の前記細胞の画像を撮影する撮影部と、前記撮影部によって撮影された前記画像に基づいて、前記不要細胞への前記レーザー光の照射を制御する照射制御部とを有するとよい。
　このような構成によれば、不要細胞の検出からレーザー光の照射までの一連の作業を自動化することができ、不要細胞の除去を効率的に行うことができる。
　また、本発明に係る細胞培養装置において、前記レーザー光照射装置は、前記ステージを移動させるステージ駆動部をさらに有し、前記照射制御部は、前記ステージ駆動部を制御することによって前記培養容器を移動させ、前記不要細胞に前記レーザー光を照射するとよい。
　このような構成によれば、ステージを移動させることによって不要細胞の位置を変更できるので、レーザー光の照射位置を変化させなくても、全領域の不要細胞を剥離させることができる。したがって、レーザー光を照射するための光学系が複雑となることを回避でき、レーザー光の照射精度を向上させることができる。
本実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す正面図である。 細胞培養装置の電気的構成を示すブロック図である。 レーザー光照射装置の拡大図である。 培養液交換装置の拡大図である。 培養容器の内部を示す模式図である。 培養方法の手順を示すフローチャートである。 レーザー光照射工程の詳細を示すフローチャートである。 レーザー光のエネルギーと細胞が剥離するまでに要する時間との関係を模式的に示すグラフである。
　（細胞培養装置の構成）
　以下、本発明に係る細胞培養装置の実施形態の一例について、図面を参照しつつ説明する。図１は、本実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す正面図であり、図２は、細胞培養装置の電気的構成を示すブロック図であり、図３は、レーザー光照射装置の拡大図であり、図４は、培養液交換装置の拡大図である。なお、以下では、図１に示した方向を適宜参照しながら説明を行う。
　図１に示すように、細胞培養装置１は、培養棚２（培養部）、搬送装置３、レーザー光照射装置４、及び、培養液交換装置５が、筐体６の内部に設けられた構成となっている。搬送装置３、レーザー光照射装置４、及び、培養液交換装置５の動作は、制御装置７によって制御される。筐体６の内部環境は、細胞の培養に適した所定の温度及び湿度に維持されるとともに、細胞の生育を妨げる菌が存在しない無菌状態又は無菌状態に近い状態とされている。
　培養棚２は、複数の培養容器Ｐを収容可能に構成されている。細胞を培養する際には、細胞を収容している培養容器Ｐが培養棚２に所定時間収容される。
　搬送装置３は、培養棚２、レーザー光照射装置４、及び、培養液交換装置５との間で相互に培養容器Ｐを移動させるための装置である。搬送装置３は、培養容器Ｐを支持可能な伸縮自在のアーム３１と、アーム３１を昇降させるボールねじ等からなる昇降機構３２と、アーム３１を水平面内で回転させる回転モータ３３とを有する。アーム３１、昇降機構３２及び回転モータ３３の動作は、制御装置７によって制御される（図２参照）。搬送装置３は、アーム３１を適宜伸縮させるとともに、アーム３１を昇降機構３２及び回転モータ３３によって適宜昇降及び回転させることによって、アーム３１の先端部に載置された培養容器Ｐを所望の位置に移動させることができる。
　レーザー光照射装置４は、培養容器Ｐ内の不要細胞にレーザー光を照射するための装置である。ここで、図５は、培養容器Ｐの内部を示す模式図である。図５に示すように、ガラス等の透明材料からなる培養容器Ｐの中には培養液Ｌが入れられており、細胞Ｃが培養容器Ｐの底面に接着した状態で培養されている。細胞Ｃには、培養対象である目的細胞Ｃａと、目的細胞Ｃａ以外の不要細胞Ｃｂとが含まれる。細胞培養装置１は、レーザー光照射装置４で不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射することで、不要細胞Ｃｂの接着機能を低下させ、培養容器Ｐの底面から不要細胞Ｃｂを剥離させることが可能となっている。不要細胞Ｃｂを除去することによって、目的細胞Ｃａだけの純粋な状態で培養することができる。さらに、不要細胞Ｃｂを除去することによって、培養液Ｌに含まれる養分が不要細胞Ｃｂによって消費されることを抑え、目的細胞Ｃａを効率的に培養することができるとともに、目的細胞Ｃａが増殖可能な領域を確保することができる。
　レーザー光照射装置４は、図３に示すように、顕微鏡と同様の基本構成を有しており、培養容器Ｐを載置可能な透明部材からなるステージ４１と、ステージ４１の下方に配置された対物レンズ４２とを有する。ステージ４１は、ステージ移動機構４３（ステージ駆動部、図２参照）によって水平方向（左右方向及び前後方向）に移動可能に構成されたいわゆるＸＹ移動ステージである。また、レーザー光照射装置４には、対物レンズ４２を介して観察される細胞Ｃの画像を撮影可能なカメラ４４（撮影部）が設けられており、ステージ４１の上方には、カメラ４４による撮影に必要な光量を補うためのライト４５が設けられている。なお、カメラ４４及びライト４５の動作は、制御装置７によって制御される（図２参照）。
　このような構成により、ステージ４１をステージ移動機構４３によって移動させつつ、カメラ４４で細胞Ｃの画像を撮影することで、培養容器Ｐの底面に接着している細胞Ｃの全領域において拡大画像を得ることができる。なお、カメラ４４で撮影された細胞Ｃの画像データは、制御装置７に順次送られる。制御装置７は、細胞Ｃの画像データに画像処理を施すことによって、不要細胞Ｃｂを検出してその位置情報を取得し、当該位置情報を記憶部７ａ（図２参照）に記憶する。
　レーザー光照射装置４は、主に赤外光からなるレーザー光を生成するレーザー光生成器４６と、レーザー光を平行光とするためのコリメートレンズ４７と、可視光を通過させるとともにレーザー光を反射させるダイクロイックミラー４８とを有する。レーザー光生成器４６で生成されたレーザー光は、コリメートレンズ４７及びダイクロイックミラー４８を経て、対物レンズ４２に入射する。そして、対物レンズ４２によって照射の焦点が不要細胞Ｃｂの位置に合わせられることによって、レーザー光を不要細胞Ｃｂに照射することができる。
　レーザー光照射装置４は、ステージ移動機構４３及びレーザー光生成器４６の動作を制御するための照射制御部４９（図２参照）を有する。照射制御部４９は、制御装置７の記憶部７ａから不要細胞Ｃｂの位置情報を受け取り、当該位置情報に基づいてステージ移動機構４３及びレーザー光生成器４６を制御する。具体的には、照射制御部４９は、不要細胞Ｃｂの位置情報に基づいてステージ移動機構４３を制御し、不要細胞Ｃｂが対物レンズ４２の光軸上に位置するようにステージ４１を移動させる。続いて、レーザー光生成器４６を作動させることによって、不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射する。これらの制御を繰り返すことで、細胞Ｃの全領域に存在する不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射することができる。
　培養液交換装置５は、細胞Ｃの培養によって養分が消費された培養液Ｌを新しいものに交換するための装置である。培養液交換装置５は、図４に示すように、新しい培養液Ｌが貯留されている貯留部５１と、貯留部５１内の培養液Ｌを培養容器Ｐに導く供給管５２と、供給管５２の途中に設けられた吸引ポンプ５３と、培養容器Ｐを支持する支持台５４と、支持台５４を鉛直面内で揺動させる揺動機構５５と、培養容器Ｐから培養液Ｌを排出するための排出管５６と、排出管５６の途中に設けられた吸引ポンプ５７とを有する。なお、吸引ポンプ５３、５７及び揺動機構５５の動作は、制御装置７によって制御される（図２参照）。また、培養容器Ｐの上面は開口しているものとする。
　培養液Ｌを交換する際には、まず、図４（ａ）に示すように、水平状態の支持台５４に培養容器Ｐが載置される。次に、図４（ｂ）に示すように、揺動機構５５によって支持台５４を少し揺動させ、培養液Ｌが溜まっている部分に排出管５６の先端部を入れた状態で、吸引ポンプ５７を作動させることにより、培養容器Ｐ内の培養液Ｌが排出管５６を介して廃棄される。培養液Ｌの廃棄が終わると、揺動機構５５によって支持台５４及び培養容器Ｐが水平状態に戻される。そして、吸引ポンプ５３を作動させることにより、貯留部５１内の新しい培養液Ｌが培養容器Ｐに供給され、培養液Ｌの交換が完了する。
　なお、排出管５６は、その先端部を培養液Ｌに出し入れできるように移動可能又は伸縮可能に構成されている。また、排出管５６の先端部が培養液Ｌに出し入れされることで、先端部に塵芥や細菌が付着するおそれがある。そこで、排出管５６の先端部は、その他の部分から着脱自在に構成されていると好適である。あるいは、排出管５６の先端部をガラス等の耐熱性の高いもので構成し、先端部を熱や紫外線で消毒するようにしてもよい。
　（培養方法の手順）
　以上のように構成された細胞培養装置１を用いた目的細胞Ｃａの培養方法について説明する。図６は、培養方法の手順を示すフローチャートである。
　まず、培養棚２に培養容器Ｐを所定時間収容しておくことによって、細胞Ｃ（主に目的細胞Ｃａ）を培養する（培養工程、ステップＳ１１）。ここで言う所定時間とは、培養容器Ｐ内の培養液Ｌに含まれる養分が細胞Ｃによって消費される時間に基づいて決められる。つまり、上記所定時間が経過することで、培養液Ｌの養分の大部分が消費され、培養液Ｌの交換をすべき時期となる。この所定時間は、一定の時間でもよいし、養分がなくなるまでの時間が培養液Ｌの量や細胞Ｃの生育状況によって変化することに合わせて適宜変更される時間でもよい。
　培養工程が終わると、目的細胞Ｃａの培養が終了したか否かを判断する（ステップＳ１２）。この判断は、例えば、作業者が目的細胞Ｃａを目視することによって判断する。ただし、この判断は、培養工程を予め定めた所定回数実行したか否かによって行ってもよいし、さらに他の判断方法を採用してもよい。
　ステップＳ１２において目的細胞Ｃａの培養が終了していない場合は、搬送装置３によって培養容器Ｐを培養棚２から取り出し、培養液交換装置５の支持台５４に載置する。続いて、揺動機構５５によって支持台５４を揺動させるとともに吸引ポンプ５７を作動させることで、培養容器Ｐ内の古い培養液Ｌを廃棄する。さらに、支持台５４を元の位置に戻してから吸引ポンプ５３を作動させることで、貯留部５１から新しい培養液Ｌが培養容器Ｐに供給され、培養液Ｌの交換が完了する（培養液交換工程、ステップＳ１３）。
　培養液交換工程が終わると、搬送装置３によって培養容器Ｐを培養液交換装置５から取り出し、レーザー光照射装置４のステージ４１に載置する。そして、レーザー光照射装置４によって、不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射する（レーザー光照射工程、ステップＳ１４）。レーザー光照射工程が終わると、ステップＳ１１の培養工程に戻り、目的細胞Ｃａの培養が終わるまで、培養工程→培養液交換工程→レーザー光照射工程→培養工程のサイクルが繰り返される。
　図７は、レーザー光照射工程の詳細を示すフローチャートである。まず、対物レンズ４２の視野内に細胞Ｃが入るように、ステージ移動機構４３によってステージ４１を移動させる（ステップＳ２１）。続いて、カメラ４４で細胞Ｃの画像を撮影する（ステップＳ２２）。カメラ４４で撮影した画像データは制御装置７に送られる。制御装置７は、送られてきた画像データに画像処理を施すことによって、不要細胞Ｃｂを検出するとともに不要細胞Ｃｂの位置情報を取得し、当該位置情報を記憶部７ａに記憶する（ステップＳ２３）。次に、制御装置７は、細胞Ｃの全領域の撮影が終了したか否かを判断し（ステップＳ２４）、全領域の撮影が終了するまで、ステップＳ２１～Ｓ２３を繰り返し実行する。
　細胞Ｃの全領域の撮影が終了すると、レーザー光照射装置４の照射制御部４９は、制御装置７の記憶部７ａから不要細胞Ｃｂの位置情報を受け取る。そして、不要細胞Ｃｂの位置情報に基づいて、不要細胞Ｃｂを対物レンズ４２の光軸上に位置させるべく、ステージ移動機構４３を制御し、ステージ４１を移動させる（ステップＳ２５）。続いて、レーザー光生成器４６を作動させ、不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射する（ステップＳ２６）。次に、照射制御部４９は、全領域の不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射し終えたか否かを判断し（ステップＳ２７）、全ての不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射し終えるまで、ステップＳ２５～Ｓ２６を繰り返し実行する。レーザー光が照射された不要細胞Ｃｂは、レーザー光照射工程に続く培養工程の間に培養容器Ｐの底面からの剥離が進行する。そして、培養容器Ｐから剥離し培養液Ｌに浮遊している不要細胞Ｃｂは、培養工程に続く培養液交換工程で古い培養液Ｌとともに廃棄される。
　（レーザー光のエネルギー調整）
　図８は、レーザー光のエネルギーと細胞が剥離するまでに要する時間との関係を模式的に示すグラフである。図８に示すように、レーザー光のエネルギーが大きいほど細胞の剥離までに要する時間は短くなり、レーザー光のエネルギーが小さいほど細胞の剥離までに要する時間は長くなる。レーザー光のエネルギーがＥ０以上の場合は、レーザー光の照射と略同時に細胞が剥離する。従来の細胞培養方法では、このような強いレーザー光を照射することによって、不要細胞Ｃｂを即座に剥離させ、その直後に、古い培養液Ｌとともに剥離した不要細胞Ｃｂを廃棄していた。
　しかしながら、このような強いレーザー光を照射すると、レーザー光の熱の悪影響が目的細胞Ｃａにも及ぶおそれがあった。この点、本実施形態では、レーザー光照射工程に続いて、培養液交換工程ではなく培養工程を実行しているため、レーザー光によって即座に不要細胞Ｃｂを剥離させる必要はなく、培養工程の間に不要細胞Ｃｂの剥離が進行すればよい。つまり、不要細胞Ｃｂの剥離に要する時間を長く確保することによって、レーザー光のエネルギーが小さくて済み、目的細胞Ｃａへの悪影響を抑えることができる。
　とは言え、あまりにもレーザー光のエネルギーが弱すぎると、剥離に要する時間が、培養工程が継続される所定時間ｔ１よりも長くなってしまい、培養工程の間に不要細胞Ｃｂが剥離しないおそれがある。そこで、本実施形態では、所定時間ｔ１に対応するエネルギーＥ１よりも大きなエネルギーＥ２のレーザー光を照射し、剥離までに要する時間ｔ２が所定時間ｔ１よりも短くなるようにレーザー光のエネルギーが調整されている。換言すると、レーザー光のエネルギーは、レーザー光が照射された不要細胞Ｃｂの剥離が、培養工程の所定時間ｔ１の間に完了するように調整されている。
　（効果）
　以上のように、本実施形態では、不要細胞Ｃｂへのレーザー光の照射後、すぐに培養液Ｌが交換されるのではなく、培養工程を間に挟んでから培養液Ｌの交換が行われる。つまり、レーザー光の照射後、培養工程の間に不要細胞Ｃｂの剥離が進行すればよいので、レーザー光のエネルギーを、照射後すぐに不要細胞Ｃｂを培養容器Ｐから剥離させる場合のように大きくする必要はなく、比較的小さくすることができる。このように、不要細胞Ｃｂに照射するレーザー光のエネルギーを小さくできることで、レーザー光の熱が目的細胞Ｃａに及ぼす悪影響を抑えることができる。また、培養液Ｌを交換してからカメラ４４による撮影が行われるので、撮影時には剥離した不要細胞Ｃｂが培養液Ｌ中に浮遊しておらず、良好な状態での撮影が可能となる。このため、不要細胞Ｃｂの認識精度を向上させることができる。
　また、本実施形態では、レーザー光のエネルギーは、レーザー光が照射された不要細胞Ｃｂの培養容器Ｐからの剥離が、培養工程の間に完了するように調整されている。このようにレーザー光のエネルギーを調整することで、培養工程の後に培養液Ｌを交換する際には、不要細胞Ｃｂの剥離が完了していることになるので、不要細胞Ｃｂの除去を効率的に行うことができる。
　また、本実施形態に係る細胞培養方法によって培養された目的細胞Ｃａは、レーザー光の熱による悪影響が抑えられていることから、目的細胞Ｃａの品質の低下を抑えることができるとともに、目的細胞Ｃａの生産効率を向上させることができる。
　また、本実施形態では、レーザー光照射装置４は、培養容器Ｐが載置されるステージ４１と、ステージ４１に載置された培養容器Ｐ内の細胞Ｃの画像を撮影するカメラ４４（撮影部）と、カメラ４４によって撮影された画像に基づいて、不要細胞Ｃｂへのレーザー光の照射を制御する照射制御部４９とを有するよう構成されている。このような構成によれば、不要細胞Ｃｂの検出からレーザー光の照射までの一連の作業を自動化することができ、不要細胞Ｃｂの除去を効率的に行うことができる。
　また、本実施形態では、レーザー光照射装置４は、ステージ４１を移動させるステージ移動機構４３（ステージ駆動部）をさらに有し、照射制御部４９は、ステージ移動機構４３を制御することによって培養容器Ｐを移動させ、不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射するとように構成されている。かかる構成によれば、ステージ４１を移動させることによって不要細胞Ｃｂの位置を変更できるので、レーザー光の照射位置を変化させなくても、全領域の不要細胞Ｃｂを剥離させることができる。したがって、レーザー光を照射するための光学系が複雑となることを回避でき、レーザー光の照射精度を向上させることができる。
　（他の実施形態）
　以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上述の実施形態に限られるものではなく、例えば以下のように、特許請求の範囲に記載した限りにおいて適宜変更が可能なものである。
　例えば、上記実施形態では、培養工程、培養液交換工程及びレーザー光照射工程の各工程が、細胞培養装置１によって自動的に実行されるものとした。しかしながら、これらの工程の一部を作業者が行うようにしてもよい。
　また、上記実施形態では、制御装置７が、カメラ４４で撮影された画像データの画像処理を行うことによって不要細胞Ｃｂの位置情報を取得し、レーザー光照射装置４の照射制御部４９が、不要細胞Ｃｂの位置情報に基づいて、ステージ移動機構４３及びレーザー光生成器４６の動作を制御するものとした。しかしながら、画像処理や各部の制御をどこで実行するかは適宜変更が可能である。例えば、レーザー光照射装置４の照射制御部４９が十分な処理能力を有する場合には、照射制御部４９で画像処理を実行し、不要細胞Ｃｂの位置情報を取得するようにしてもよい。また、制御装置７によって、ステージ移動機構４３及びレーザー光生成器４６の動作を制御するようにしてもよく、この場合には、制御装置７がレーザー光照射装置４の照射制御部としても機能することになる。
　また、上記実施形態では、ステージ移動機構４３が培養容器Ｐが載置されたステージ４１を移動させることで、細胞Ｃの全領域をカメラ４４で撮影したり、細胞Ｃの全領域において不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射するものとした。しかしながら、カメラ４４や対物レンズ４２を移動させることで、細胞Ｃの全領域をカメラ４４で撮影したり、細胞Ｃの全領域において不要細胞Ｃｂにレーザー光を照射するようにしてもよい。
　また、上記実施形態では、レーザー光照射工程において、細胞Ｃの全領域を対象にカメラ４４による撮影とレーザー光の照射を行うものとした。しかしながら、このようにすることは必須ではなく、細胞Ｃの一部の領域のみを対象に撮影やレーザー光の照射を行うようにしてもよい。また、一定時間内で作業できる範囲に対して撮影やレーザー光の照射を行うようにしてもよい。
　また、上記実施形態では、培養容器Ｐの上面が開口しているものとしたが、この開口を塞ぐ蓋を設けてもよい。この場合には、培養液Ｌの交換時に蓋が取り外される。蓋を設けることで、培養容器Ｐ内に異物が混入することを避けることができる。
　１　細胞培養装置
　２　培養棚（培養部）
　３　搬送装置
　４　レーザー光照射装置
　５　培養液交換装置
　４１　ステージ
　４３　ステージ移動機構（ステージ駆動部）
　４４　カメラ（撮影部）
　４９　照射制御部
　Ｃ　細胞
　Ｃａ　目的細胞
　Ｃｂ　不要細胞
　Ｐ　培養容器
　Ｌ　培養液

Claims (6)

  1. 　培養容器に入れられた培養液中に存在する細胞に、培養対象である目的細胞と前記目的細胞以外の不要細胞とが含まれる場合に、前記不要細胞を除去しながら前記目的細胞を培養するための細胞培養方法であって、
    　前記培養容器に接着している前記不要細胞を前記培養容器から剥離させるため、前記不要細胞にレーザー光を照射するレーザー光照射工程と、
    　前記レーザー光照射工程に続いて実行される、前記目的細胞を培養する培養工程と、
    　前記培養工程に続いて実行される、前記培養容器から剥離した前記不要細胞を含む前記培養液を新しいものに交換する培養液交換工程と、
    　を備えることを特徴とする細胞培養方法。
  2. 　前記レーザー光のエネルギーは、前記レーザー光が照射された前記不要細胞の前記培養容器からの剥離が、前記培養工程の間に完了するように調整されることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　請求項１又は２に記載の細胞培養方法によって培養されたことを特徴とする目的細胞。
  4. 　培養容器に入れられた培養液中に存在する細胞に、培養対象である目的細胞と前記目的細胞以外の不要細胞とが含まれる場合に、前記不要細胞を除去しながら前記目的細胞を培養するための細胞培養装置であって、
    　前記培養容器に接着している前記不要細胞を前記培養容器から剥離させるため、前記不要細胞にレーザー光を照射するレーザー光照射装置と、
    　前記レーザー光照射装置によって前記レーザー光が照射された前記不要細胞を含む前記培養容器を収容し、前記目的細胞を培養する培養部と、
    　前記培養部で前記目的細胞を培養した後、前記培養容器から剥離した前記不要細胞を含む前記培養液を新しいものに交換する培養液交換装置と、
    　を備えることを特徴とする細胞培養装置。
  5. 　前記レーザー光照射装置は、
    　前記培養容器が載置されるステージと、
    　前記ステージに載置された前記培養容器内の前記細胞の画像を撮影する撮影部と、
    　前記撮影部によって撮影された前記画像に基づいて、前記不要細胞への前記レーザー光の照射を制御する照射制御部と
    　を有することを特徴とする請求項４に記載の細胞培養装置。
  6. 　前記レーザー光照射装置は、前記ステージを移動させるステージ駆動部をさらに有し、
    　前記照射制御部は、前記ステージ駆動部を制御することによって前記培養容器を移動させ、前記不要細胞に前記レーザー光を照射することを特徴とする請求項５に記載の細胞培養装置。
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