KR20160040288A

KR20160040288A - 전안부 조직의 제조 방법

Info

Publication number: KR20160040288A
Application number: KR1020167005956A
Authority: KR
Inventors: 요시키 사사이; 지카후미 오조네; 유코 마루야마
Original assignee: 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
Priority date: 2013-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2016-04-12
Also published as: JP6546089B2; EP3031906B1; CA2920600A1; KR102297580B1; US11274277B2; JPWO2015020091A1; JP2019193647A; EP3031906A4; JP6873438B2; CN105518123B; CA2920600C; AU2014303443B2; EP3031906A1; SG11201600813VA; CN105518123A; AU2014303443A1; WO2015020091A1; US20160186136A1

Abstract

본 발명은, 다능성 줄기 세포의 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하고, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직의 자체 조직화를 유도함으로써 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 포함한 세포 응집체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP4 이다. 또 다른 구현예에서, 현탁 배양의 전부 또는 일부가, 섬유아세포 증식 인자의 존재 하에 행해진다. 제조되는 세포 응집체는 신경 망막 조직을 추가로 포함할 수 있다.

Description

전안부 조직의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING ANTERIOR EYE SEGMENT TISSUE}

본 발명은, 시험관내 (in vitro) 에 대해, 다능성 줄기 세포 (pluripotent stem cell) 로부터 전안부 조직으로의 분화를 유도하는 기술에 관한 것이다.

지금까지 본 발명자들은 SFEBq 법 (특허 문헌 1) 을 사용하여, 다능성 줄기 세포의 응집체를 무혈청 배지 중에서 현탁 배양함으로써 다능성 줄기 세포로부터 신경 망막 조직과 색소 상피 조직을 포함하는 망막 선구 조직을 발생시키고, 눈의 원기인 안배를 자체 조직화에 의해 시험관내 형성시키는 것에 성공하고 있다 (특허 문헌 2, 비특허 문헌 1 및 2). 그러나, 망막과 함께 안구를 구성하는 각막, 수정체 등의 전안부 (anterior eye segment) 조직을 현탁 배양에 의해 시험관내로 다능성 줄기 세포로부터 유도하는 것은 보고되어 있지 않다.

비특허 문헌 3 에는 인간 iPS 세포를 PA6 피더층 상에서 접착 배양함으로써 각막 상피 세포를 유도하는 것이 보고되고 있다. 그러나, 미결정 인자로의 오염이 방지되어야 하므로, 피더 세포의 존재 하 배양은 바람직하지 않다. 또한, 각막 등의 입체 구조는 구축되지 않았다. 이 문헌에 기재된 방법에서는 각막 상피 세포의 유도에 12 주의 장기간을 필요로 한다. 또한 이 문헌에 대해서는, BMP4 처리에 의해 iPS 세포로부터의 각막 상피 세포로의 분화가 억제된 것이 기재되어 있다.

비특허 문헌 4 에는, 인간 ES 세포를 BMP4, BMP7 및 FGF2 의 존재 하에서 접착 배양함으로써 수정체 선구 세포를 유도한 것이 기재되어 있다. 비특허 문헌 5 에는, 마우스 iPS 세포를 PA6 피더층 상에서 접착 배양함으로써 각막 상피를 유도한 것이 기재되어 있다. 비특허 문헌 6 에는, 인간 ES 세포를 피더 세포의 존재 하 접착 배양함으로써 각막 실질 세포를 유도한 것이 기재되어 있다. 비특허 문헌 7 에는, 인간 ES 세포를 접착 배양에 의해 각막형 세포로 유도한 것이 기재되어 있다. 그러나, 이러한 문헌 중 어느 것에도 다능성 줄기 세포를 현탁 배양하여 각막, 수정체 등의 전안부 조직을 입체적으로 형성시킨 것은 개시되어 있지 않다.

WO 2009/148170 WO 2011/055855

Nakano et al., Cell Stem Cell, 10(6): 771-785, 2012 Eiraku et al., Nature, 472(7341): 51-56, 2011 Hayashi et al., PLOS ONE, 7(9): e45435, 2012 Yang et al., FASEB J., 24: 3274-3283, 2010 Yoshida et al., PLOS ONE, 6(12): e28856, 2011 Chan et al., PLOS ONE, 8(2): e56831, 2013 Ahmad et al., Stem Cells, 25: 1145-1155, 2007

본 발명의 목적은, 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직이나 이의 선구 조직으로의 선택적인 분화를 유도하는, 실용성이 높은 방법을 개발하는 것이다.

본 발명자들은 집중적으로 연구한 결과, 인간 다능성 줄기 세포의 응집체를 현탁 배양 하에 BMP4 로 처리함으로써 전안부 조직 (수정체 및 각막) 의 자체 조직화가 유도될 수 있으며 각막 및 수정체의 입체 형성이 효율적으로 실시될 수 있다는 것을 발견했다. 본 발명자들이 개발한 입체 망막의 자체 조직화 유도법 (SFEBq 법) 의 초기 과정에 대해 BMP4 처리를 적용하여, 응집체 내에 형성되는 망막 상피 조직 응집체 표면에 표면 외배엽을 자체 조직화적으로 형성시켜, 생체의 배아 중 관찰할 수 있는 "망막에 의한 표면 외배엽으로부터 전안부 선구 조직 (수정체 플라코드 (placode) 및 각막 플라코드) 으로의 분화 유도" 를 자발적으로 일으키게 하는데 성공했다. 그 결과, 내부에 망막을, 그리고 표면에 비후한 수정체 및 각막 상피 선구 조직을 자체 조직화시킨 현탁 응집체를 입체 형성시킬 수 있었다.

이들은 또한 상기 현탁 응집체 배양을 계속함으로써, 수정체 플라코드 (placode) 를 자발적으로 응집체 내부에 함입시키고, 수정체 소포를 형성시키는데 성공했다.

성체의 각막은 표면에서 내부로의 상피, 실질 (stroma) 및 내피의 3 개 층으로 이루어진다. 상기의 응집체를 장기 배양함으로써, 성체의 각막 상피에서 관찰되는 마커 단백질 다수를 발현시키는 데 성공했다. 게다가 실질 및 내피는, 표면 외배엽으로부터가 아니라 신경능 세포 유래의 간엽 세포로부터 발생하는 것으로 알려져 있지만, 상기의 응집체를 장기 배양하는 경우, 망막 조직 및 각막 상피 조직에 추가로, 간엽 세포도 응집체 내에 발생시킬 수 있어, 그 결과 각막 상피 층 및 간엽 세포층 (실질 및 내피에 상응함) 모두를 조합으로 가지는 입체 각막을 형성시킬 수 있다는 것을 발견했다.

본 발명자들은 상기 발견에 근거해 더욱 연구하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 아래와 같다:

[1] 다능성 줄기 세포의 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하는 것을 포함하는, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법.

[2] [1] 에 있어서, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하기 전에, 다능성 줄기 세포의 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 부재 하에 현탁 배양하는 방법.

[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 인 방법.

[4] [3] 에 있어서, BMP4 의 농도가 1 ~ 5 nM 인 방법.

[5] [1] ~ [4] 중 어느 하나에 있어서, 현탁 배양의 전부 또는 일부를 섬유아세포 증식 인자의 존재 하에서 실시하는 제조 방법.

[6] [1] ~ [5] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포인 방법.

[7] [1] ~ [6] 중 어느 하나에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 유래의 것인 방법.

[8] [1] ~ [7] 중 어느 하나에 있어서, 현탁 배양을 피더 세포의 부재 하에 실시하는 방법.

[9] [1] ~ [8] 중 어느 하나에 있어서, 세포 응집체가 신경 망막 조직을 추가로 포함하는 방법.

[10] [1] ~ [9] 중 어느 하나에 있어서, 전안부 조직이 각막 및/또는 수정체인 방법.

[11] [1] ~ [10] 중 어느 하나에 있어서, 세포 응집체가 전안부 조직의 부분 구조로서 각막 상피를 포함하고, 간엽 조직, 또는 그로부터 유래하는 각막 실질 및/또는 각막 내피를 추가로 포함하는 방법.

[12] [11] 에 있어서, 각막 상피가 계층화된 방법.

[13] [1] ~ [12] 중 어느 하나에 있어서, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 세포 응집체로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.

[14] [13] 에 있어서, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 신경 망막 조직과 함께 분리하는 방법.

[15] [1] ~ [12] 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는 세포 응집체.

[16] [13] 또는 [14] 의 방법에 의해 수득되는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직.

본 발명에 의하면, 대량 처리를 가능하게 하는 현탁 배양 하에서, 수정체, 각막 등과 같은 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직이 입체적으로 형성될 수 있다.

본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 종래의 방법에서는 이룰 수 없는 고효율로, 수정체, 각막 등과 같은 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 유도할 수 있다. 한 구현예에서, 96 웰 플레이트와 같은 비교적 작은 체적의 배양 구획 중에서 응집체가 형성되는 경우, 각막 선구 조직을 80% 이상의 효율로 포함하는 응집체를 형성할 수 있으며 수정체 선구 조직을 20% 이상의 효율로 포함하는 세포 응집체를 수득할 수 있다.

본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포로부터 종래의 방법에서는 이룰 수 없는 "단기간" 으로 수정체, 각막 등과 같은 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 유도할 수 있다. 한 구현예에서 본 발명에 의하면, 분화 배양 개시로부터 약 3 주 내에 다능성 줄기 세포로부터 수정체 및 각막 상피가 유도될 수 있는데, 이는 종래에는 2 배 이상의 시간을 필요로 하는 것이다.

본 발명에 의하면, 생체의 눈에 공존하는 망막, 수정체 및 각막을 다능성 줄기 세포로부터 인접하게 입체 형성시킬 수 있다. 따라서, 생체에서와 유사한 비인공적 조직 발생을 위한 배양 환경이 재현될 수 있다.

본 발명에 의하면, 각막 상피 및 이에 인접하는, 각막 내피 및 각막 실질을 형성하는 신경능 유래 간엽 조직을 응집체 내에서 동시에 형성시켜, 상피, 실질 및 내피의 선구 조직을 층상으로 가지는 각막 선구 조직을 생성시킬 수 있다.

본 발명에 의하면, 표면층으로서 편평 상피, 및 심층으로서 입방 상피를 포함하는 성숙 각막에 특징적인 상피의 계층 구조를 가지는 각막 상피를 형성시킬 수 있다.

본 발명에 의하면, 각막 선구 조직을 응집체의 표면층에 선택적으로 형성시킬 수 있으며 FACS 등을 사용하지 않아도 고순도로 각막 선구 세포를 분리할 수 있다.

[도 1A] 도 1A 는 BMP4 첨가 조건 하에 SFEBq 법에 의해 수득되는 인간 ES 세포 응집체 (제 14 일) 의 표면층에 신경 망막과 상이한 Rx::venus 음성, E-카드헤린 양성의 상피 세포층이 형성되는 것을 나타낸다.
[도 1B] 도 1B 는 BMP4 첨가 조건 하에 SFEBq 법에 의해 수득되는 인간 ES 세포 응집체 (제 24 일) 의 표면층에 형성된 상피 세포층이 판-사이토케라틴 (pan-cytokeratin) 양성인 것을 나타낸다.
[도 1C] 도 1C 는 BMP4 첨가 조건 하에 SFEBq 법에 의해 수득되는 인간 ES 세포 응집체 (제 24 일) 의 표면층에, 상피 세포층이 비후화된 L-Maf 양성 수정체 플라코드형 조직이 형성되는 것을 나타낸다.
[도 2] 도 2 는 BMP4 첨가 조건 하에 SFEBq 법에 의해 수득되는 인간 ES 세포 응집체 (제 55 일) 의 표면층에 형성된 상피 조직이, 각막 상피에 특징적인 사이토케라틴 3 (CK3), 사이토케라틴 12 (CK12) 및 사이토케라틴 14 (CK14) 를 발현하는 것을 나타낸다.
[도 3A] 도 3A 는 BMP4 첨가 조건 하에 SFEBq 법에 의해 수득되는 인간 ES 세포 응집체 (제 33 일) 의 표면층에서의 비후화된 각막 상피와 신경 망막 조직 사이의 간엽 세포 응집층에 있어서의 PDGFR-알파의 발현을 나타낸다.
[도 3B] 도 3B 는 BMP4 첨가 조건 하에 SFEBq 법에 의해 수득되는 인간 ES 세포 응집체 (제 53 일) 의 표면층에서의 비후화된 각막 상피와 신경 망막 조직 사이의 간엽 세포 응집층에 있어서의 Pitx2 및 ABCG2 의 발현을 나타낸다.
[도 3C] 도 3C 는 간엽 세포 응집층의 가장 내부에 형성된 상피화 내피 세포층의 형태를 나타낸다.
[도 4A] 도 4A 는 bFGF 첨가군에 대해 관찰된 수정체 소포형 소포를 나타내며, 생체내에서의 수정체 발생에서 관찰되는 전후축을 따른 형태적 극성 (전방 부분에서 얇고 후방 부분에서 두꺼움) 을 가지는 수정체 조직의 형성이 관찰된다.
[도 4B] 도 4B 는 bFGF 비첨가군에 대해 관찰된 수정체 소포형 소포를 나타낸다. bFGF 첨가군에 대해 관찰된 조직 극성은 명확하지 않다.
[도 5A] 도 5A 는 계층화한 각막 상피에 있어서의 CK3 의 발현을 나타낸다.
[도 5B] 도 5B 는 계층화한 각막 상피에 있어서의 CK12 의 발현을 나타낸다.
[도 5C] 도 5C 는 계층화한 각막 상피에 있어서의 CK15 의 발현을 나타낸다.
[도 5D] 도 5D 는 계층화한 각막 상피에 있어서의 Na-K ATPase 의 발현을 나타낸다.

본 발명은, 다능성 줄기 세포의 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하는 것을 포함하는, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직, 및 신경 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 세부 사항을 설명한다.

(1) 다능성 줄기 세포

"다능성 줄기 세포" 란, 생체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 능력 (분화 다능성) 및 세포 분열을 거쳐 동일한 분화력을 가지는 딸세포를 생성하는 능력 (자가 복제능) 을 모두 겸비하는 세포를 말한다.

분화 다능성은, 평가 대상 세포를 누드 마우스에 이식하고, 3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 의 각각의 세포를 포함한 테라토마 형성 유무를 시험하여 평가할 수 있다.

다능성 줄기 세포의 예는 배아 줄기 세포 (ES 세포), 배성 생식 세포 (EG 세포), 유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 등을 포함하며, 분화 다능성 및 자가 복제능을 모두 겸비하는 세포인 한, 이것들로 한정되지 않는다. 본 발명에서는, 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포가 바람직하게 사용된다.

배아 줄기 세포 (ES 세포) 는, 예를 들면 착상 이전의 초기 배아, 해당 초기 배아를 구성하는 내부 세포 덩어리, 단일 할구 등을 배양함으로써 확립될 수 있다 (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)). 초기 배아로서 체세포의 핵을 핵-이식하여 제작된 초기 배아를 사용할 수 있다 (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira IRITANI et al. (Tanpakushitsu Kakusan Koso, 44, 892 (1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000), Tachibana et al. (Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press)). 초기 배아로서 단성단위생식 (parthenogenetic) 배아를 또한 사용할 수 있다 (Kim et al. (Science, 315, 482-486 (2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985 (2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)).

ES 세포와 체세포의 세포 융합에 의해 수득한 융합 ES 세포도, 본 발명의 방법에 사용되는 배아 줄기 세포에 포함된다.

배아 줄기 세포는 적절한 기관으로부터 입수할 수 있으며, 시판 제품을 구입할 수도 있다. 예를 들면, 인간 배아 줄기 세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은 쿄토 대학 재생 의과 학연 연구소 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University) 로부터 입수 가능하다.

배성 생식 세포 (EG 세포) 는, 시원 생식 세포를 LIF, bFGF, SCF 등의 존재 하에 배양함으로써 확립될 수 있다 (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).

유도 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 란, 체세포 (예를 들면 섬유아세포, 피부 세포, 림프구 등) 를 핵 초기화 인자와 접촉시켜 인위적으로 분화 다능성 및 자가 복제능을 획득한 세포를 말한다. iPS 세포는 체세포 (예를 들면 섬유아세포, 피부 세포 등) 에 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 로 구성된 핵 초기화 인자를 도입하는 것을 포함하는 방법으로 최초로 발견되었다 (Cell, 126: p. 663-676, 2006). 그 후, 많은 연구자에 의해 초기화 인자의 조합에 있어서나 인자의 도입법에 대해 다양한 개선이 진행되고 있으며, 다양한 유도 다능성 줄기 세포 제조법이 보고되고 있다.

핵 초기화 인자는, 섬유아세포 등과 같은 체세포로부터 분화 다능성 및 자가 복제능을 가지는 세포를 유도할 수 있는 물질(들) 이면, 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산 (벡터에 혼입된 형태 포함), 또는 저분자 화합물과 같은 임의 물질로부터 구성될 수 있다. 핵 초기화 인자가 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산인 경우, 바람직하게는 이하의 조합이 예시된다 (이하, 단백질성 인자의 명칭만을 기재한다).

(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (여기서, Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체가능하다. Klf4 는 Klf1, Klf2 또는 Klf5 로 대체가능하다. 게다가 c-Myc 는 T58A (활성형 변이체), N-Myc 또는 L-Myc 로 대체가능하다.)

(2) Oct3/4, Klf4, Sox2

(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc

(4) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28

(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28

(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, bFGF

(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, SCF

(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, bFGF

(9) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SCF

이러한 조합 중에서, 수득한 iPS 세포를 치료 용도에 사용하는 것을 고려하는 경우, Oct3/4, Sox2 및 Klf4 의 3 인자의 조합이 바람직하다. 한편, iPS 세포를 치료 용도에 사용하는 것을 고려하지 않는 경우 (예를 들면, 약물 발견 스크리닝 등의 연구 도구로서 사용), Oct3/4, Klf4, Sox2 및 c-Myc 로 이루어지는 4 인자, 또는 이에 Lin28 또는 Nanog 를 첨가한 5 인자가 바람직하다.

자가 이식 용도에는 iPS 세포가 바람직하게 사용된다.

염색체상의 유전자를 공지의 유전자 공학법에 의해 개질하여 수득한 다능성 줄기 세포도 본 발명에서 사용할 수 있다. 다능성 줄기 세포는 공지의 방법에 의해 인-프레임 (in-frame) 방식으로 분화 마커를 인코딩하는 유전자에서 표지 유전자 (예를 들면 GFP 과 같은 형광 단백질) 가 녹인 (knock in) 되는 세포일 수 있으며, 상기 세포는 지표로서 표지 유전자의 발현을 사용하여 대응 분화 단계에 도달한 것으로 식별가능할 수 있다.

다능성 줄기 세포로서는, 예를 들면 온혈 동물 다능성 줄기 세포, 바람직하게는 포유동물의 다능성 줄기 세포를 사용할 수 있다. 포유동물로서는, 예를 들면 마우스, 래트, 햄스터 및 기니피그와 같은 설치류, 및 토끼를 포함하는 실험 동물; 돼지, 소, 염소, 말 및 양과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 애완동물; 인간, 원숭이, 오랑우탄 및 침팬지와 같은 영장류를 포함한다. 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 다능성 줄기 세포이며, 가장 바람직하게는 인간 다능성 줄기 세포이다.

다능성 줄기 세포는 자체 공지 방법에 의해 유지 배양될 수 있다. 예를 들면, 임상 응용의 관점에서는 다능성 줄기 세포는 Knockout^TM 혈청 대체물 (KSR) 등과 같은 혈청 대체물을 사용한 무혈청 배양, 또는 무-피더 세포 배양에 의해 바람직하게 유지된다.

본 발명에서 사용되는 다능성 줄기 세포는 바람직하게는 단리된다. "단리" 란, 목적으로 하는 세포 또는 성분 이외의 인자를 제거하는 조작이 이루어져 상기 세포 또는 성분이 더 이상 자연 상태로 존재하지 않는 것을 의미한다. "단리된 인간 다능성 줄기 세포" 의 순도 (총 세포수에 대한 인간 다능성 줄기 세포수의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 가장 바람직하게는 100% 이다.

(2) 본 발명의 방법으로 분화 유도될 수 있는 조직

본 발명의 제조 방법에 의하면, 다능성 줄기 세포의 응집체에 있어, 다능성 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화를 유도함으로써 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 포함하는 세포 응집체를 수득할 수 있다.

전안부란, 안구의 거상연에 대한 전방 부분을 나타낸다. 전안부 조직이란, 전안부를 구성하는 조직을 나타내며, 각막, 수정체, 홍채, 모양체, 전후방, 모양소대, 전방 초자체 및 전방 공막, 및 외안부의 결막 및 눈꺼풀 등과 같은 조직 및 이의 부분 구조가 포함된다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 응집체에 함유된 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직은 바람직하게는, i) 각막, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직, 및/또는 ii) 수정체, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 포함한다.

각막은, 안구벽의 외부층의 전방 약 1/6 을 차지하는 투명한 시계 접시형 조직이다. 각막의 부분 구조의 예는 각막 상피, 보맨 막, 각막 실질, 데스메 막, 각막 내피 등을 포함지만 이것들로 한정되지 않는다. 각막은 일반적으로, 체표측으로부터 순서대로, 각막 상피, 보맨 막, 각막 실질, 데스메 막, 및 각막 내피로 이루어지는 5 개 층으로 구성된다. 각막, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직이 유도된 것은 마커의 발현에 의해 확인될 수 있다. 각막, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직의 마커의 예는 판-사이토케라틴 (각막 상피 선구 조직), E-카드헤린 (각막 상피 선구 조직), 사이토케라틴 3 (각막 상피), 사이토케라틴 12 (각막 상피), 사이토케라틴 14 (각막 상피), p63 (각막 상피), ZO-1 (각막 상피), PDGFR-α (각막 실질, 각막 내피, 또는 이의 선구 조직), Pitx2 (각막 실질 및 각막 내피의 선구 조직), ABCG2 (각막 실질 및 각막 내피의 선구 조직) 등을 포함한다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 응집체에 함유된 각막 상피의 선구 조직은 판사이토케라틴 양성 및 E-카드헤린 양성의 상피 세포층이다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 응집체에 함유된 각막 상피는 사이토케라틴 3 양성, 사이토케라틴 12 양성, 사이토케라틴 14 양성, p63 양성 및 ZO-1 양성의 상피 구조이다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 응집체에 함유된 각막 실질 및 각막 내피의 선구 조직은 간엽 세포의 응집층이다. 한 구현예에서, 간엽 세포의 응집층은 PDGFR-α 양성, 또는 Pitx2 양성 및 ABCG2 양성이다. 각막 실질과 각막 내피는 모두 간엽 세포에서 유래하지만, 각막 내피는 상피화 내피 세포층-유사 형태를 나타낸다. 상기 마커 발현 분석에 추가하여 형태학적인 관찰을 실시하는 것으로, 각막 실질 (또는 이의 선구 조직) 과 각막 내피 (또는 이의 선구 조직) 를 구별하고 각막 내피 또는 이의 선구 조직이 유도된 것을 확인하는 것이 가능해진다.

수정체는, 밖으로부터 안구에 들어온 빛을 굴절시키고 망막에 초점을 맞추는 렌즈의 역할을 하는 조직이다. 수정체의 부분 구조의 예는 수정체 상피, 수정체 핵, 수정체낭 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 수정체의 선구 조직의 예는 수정체 플라코드, 수정체 소포 등을 포함한다. 수정체 플라코드란, 비후한 표면 외배엽 세포층으로 구성된 수정체 선구 조직이다. 배 발생에서는, 이는 안포와 표면 외배엽의 접촉에 의해, 해당 접촉 영역이 비후해짐으로써 형성된다. 수정체 소포란, 수정체 플라코드의 함입에 의해 형성되는 소포이다. 수정체, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직이 유도된 것은 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 수정체, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직의 마커의 예는 L-Maf (수정체 선구 조직), α, β 및 γ 결정질 (수정체) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다. 한 구현예에서, 수정체 플라코드는 L-Maf 양성의 비후한 표면 외배엽 세포층이다. 한 구현예에서, 수정체 소포는 L-Maf 양성의 소포이다.

신경 망막이란, 빛을 감지하는 망막 부위를 말하며, 적어도 1 종의 망막 세포를 포함한다. 망막 세포로서는, 망막을 구성하는 임의의 세포를 언급할 수 있으며 특히 한정되지 않는다. 이의 예는 광수용기, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포 등을 포함한다. 망막 세포가 유도된 것은 세포 마커의 발현에 의해 확인할 수 있다. 망막 세포 마커의 예는 Rx (망막의 선구 세포), PAX6 (선구 세포), Crx (광수용기의 선구 세포), Chx10 (쌍극 세포), L7 (쌍극 세포), Tuj1 (신경절 세포), Brn3 (신경절 세포), 칼레티닌 (Calretinin) (아마크린 세포), 칼빈딘 (Calbindin) (수평 세포), 로돕신 (Rhodopsin) (광수용기), 리커버린 (recoverin) (광수용기), RPE65 (색소 상피 세포), Mitf (색소 상피 세포) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포 응집체에 함유된 신경 망막 조직은 Rx 양성, Chx10 양성의 표피 조직이다.

(3) 다능성 줄기 세포 응집체의 형성

다능성 줄기 세포 응집체는, 분산된 다능성 줄기 세포를 배양기에 대하여 비접착성의 조건 하에 배양 (즉, 현탁 배양) 하고 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성시킴으로써 수득할 수 있다.

상기 응집체 형성에 사용하는 배양기로서는, 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 (bag) 및 롤러 보틀을 포함한다. 비접착성의 조건 하 배양을 가능게 하기 위하여, 배양기는 세포-비접착성인 것이 바람직하다. 유용한 세포-비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이 세포-비접착성이 되도록 인공적으로 처리된 배양기, 세포 접착성이 향상되도록 인공적으로 처리 (예를 들면, 세포외 기질 등으로의 코팅 처리) 되어 있지 않은 배양기 등을 포함한다.

응집체 형성에 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 사용하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 것이면 특히 한정되지 않으며 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, 햄 F-12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지, 이의 혼합 배지 등일 수 있다.

다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않기 위해, 응집체 형성에 사용되는 배지는 바람직하게는 무혈청 배지이다. 무혈청 배지란, 무조정 또는 미정제 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 정제된 혈액 유래 성분 및 동물 조직 유래 성분 (예를 들면, 사이토카인) 을 함유하는 배지는 무혈청 배지에 해당한다.

응집체 형성에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 선구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티오글리세롤, 또는 그의 균등물 등을 적절히 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들면 WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 본 발명의 방법을 보다 간편하게 실시하기 위해서, 시판 혈청 대체물을 사용할 수 있다. 이러한 시판 혈청 대체물로서는, 예를 들면 녹아웃 혈청 대체물 (Knockout Serum Replacement) (KSR, Invitrogen 사제), 화학 합성 (chemically defined) 지질 농축물 (Gibco 사제) 및 Glutamax (Gibco 사제) 를 포함한다.

응집체 형성에 사용되는 배지는, 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 한, 다른 첨가물을 함유할 수 있다. 첨가물의 예는, 인슐린, 철 공급원 (예를 들면 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들면 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들면 글루코오스 등), 유기산 (예를 들면 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질 (예를 들면 알부민 등), 아미노산 (예를 들면 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들면 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류 (예를 들면 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생제 (예를 들면 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들면 HEPES 등) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다.

응집체 형성에 사용되는 배지는, 후술하는 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도에 대해 사용되는 배지일 수 있다.

다능성 줄기 세포 응집체의 형성을 위해서, 다능성 줄기 세포를 계대 배양으로부터 회수하고 단일 세포 상태 또는 그에 가까운 상태까지 분산시킨다. 다능성 줄기 세포는 적절한 세포 해리액으로 분산된다. 세포 해리액의 예는 EDTA; 트립신, 콜라게나아제 IV, 메탈로프로테아제 등과 같은 프로테아제 등을 단독으로 또는 적절한 조합으로 포함한다. 그 중에서도 세포 독성이 낮은 것이 바람직하고, 이러한 세포 해리액의 예는 시판되는 DISPASE (EIDIA), TrypLE (Invitrogen), Accutase (MILLIPORE) 등을 포함한다. 그 중에서도, 세포를 단일 세포 상태에 가깝게 해리시키는 경우에도 다능성 줄기 세포 (특히 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 일으키기에 어려우므로, Accutase 가 바람직하게 사용된다. 분산된 다능성 줄기 세포는 상기 배지에 현탁된다.

분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포 (특히, 인간 다능성 줄기 세포) 의 세포사를 억제하기 위해서, Rho-관련 이중 나선 (coiled-coil) 키나아제 (ROCK) 의 저해제를 배양 개시부터 첨가하는 것이 바람직하다 (JP-A-2008-99662). ROCK 저해제의 예는, Y-27632 ((+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜) 시클로헥산카르복사미드 디히드로클로라이드) 등을 포함한다. 현탁 배양에 사용되는 ROCK 저해제의 농도는, 분산에 의해 유도되는 다능성 줄기 세포의 세포사를 억제할 수 있는 농도이다. 예를 들면, Y-27632 에 대해, 이러한 농도는 통상 약 0.1 내지 200 μM, 바람직하게는 약 2 내지 50 μM 이다.

분산된 다능성 줄기 세포의 현탁액을 상기 배양기에 시딩하고, 분산시킨 다능성 줄기 세포를 세포 배양기에 대해 비접착성인 조건 하에 배양함으로써, 복수의 다능성 줄기 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 이러한 경우, 분산된 다능성 줄기 세포를 10-cm 디쉬와 같은 비교적 큰 배양기에 시딩하여 1 개의 배양 구획 중에 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 동시에 형성시킬 수 있다. 그러나, 응집체의 크기 및 그 안에 포함된 다능성 줄기 세포의 수가 큰 가변적일 수 있으며, 이러한 차이는 응집체간의 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 수준의 차이를 초래하여, 결과적으로 분화 유도의 효율을 저하시킬 수 있다. 따라서, 분산된 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시켜 1 개의 배양 구획 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 분산된 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시키는 방법의 예는 이하의 방법을 포함한다:

(1) 비교적 작은 체적 (예를 들면, 1 ml 이하, 500 ㎕ 이하, 200 ㎕ 이하, 100 ㎕ 이하) 의 배양 구획 중에, 분산된 다능성 줄기 세포를 동봉하여 상기 구획 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 방법. 바람직하게는, 분산된 다능성 줄기 세포를 동봉한 후, 배양 구획을 정치시킨다. 배양 구획의 예는, 멀티-웰 플레이트 (384-웰, 192-웰, 96-웰, 48-웰, 24-웰 등), 마이크로포어, 챔버 슬라이드 등에 있어서의 웰, 튜브, 현적법에 있어서의 배지의 액적 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다. 상기 구획에 동봉된 분산 다능성 줄기 세포는 중력으로 인해 1 개 장소에 침전되거나, 세포가 서로 접착되어 1 개의 배양 구획에서 1 개의 응집체가 형성된다. 멀티-웰 플레이트, 마이크로포어, 챔버 슬라이드, 튜브 등의 바닥 형상은 분산된 다능성 줄기 세포가 1 개 장소에 침전되는 것이 촉진되도록 U-바닥 또는 V-바닥인 것이 바람직하다.

(2) 원심분리 튜브에 분산된 다능성 줄기 세포를 넣어 이를 원심분리하여 1 개 장소에 다능성 줄기 세포를 침전시킴으로써 상기 튜브 중에 1 개의 응집체를 형성시키는 방법.

1 개의 배양 구획 중에 시딩하는 다능성 줄기 세포의 수는 1 개의 배양 구획 당 1 개의 응집체가 형성되고 본 발명의 방법에 따라 상기 응집체에서 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도가 가능한 것이면 특히 한정되지 않는다. 일반적으로, 1 개의 배양 구획에 있어서 약 1 x 10³ ~ 약 5 x 10⁴ 개, 바람직하게는 약 1 x 10³ ~ 약 2 x 10⁴ 개, 보다 바람직하게는 약 2 x 10³ ~ 약 1.2 x 10⁴ 개의 다능성 줄기 세포를 시딩한다. 그리고, 다능성 줄기 세포를 신속히 응집시킴으로써, 1 개의 배양 구획 당 일반적으로 약 1 x 10³ ~ 약 5 x 10⁴ 개, 바람직하게는 약 1 x 10³ ~ 약 2 x 10⁴ 개, 보다 바람직하게는 약 2 x 10³ ~ 약 1.2 x 10⁴ 개의 다능성 줄기 세포로 구성된 1 개의 세포 응집체가 형성된다.

응집체 형성까지의 시간은, 1 개의 구획 당 1 개의 응집체가 형성되고 본 발명의 방법에 의해 상기 응집체에서 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도가 가능한 것인 한, 적절하게 결정될 수 있다. 이 시간을 단축시킴으로써, 목적으로 하는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 효율적 분화 유도가 예측되며, 따라서 상기 시간은 짧은 것이 바람직하다. 바람직하게는 24 시간 이내, 보다 바람직하게는 12 시간 이내, 한층 더 바람직하게는 6 시간 이내, 가장 바람직하게는 2 ~ 3 시간 내에 다능성 줄기 세포의 응집체가 형성된다. 이 응집체 형성까지의 시간은, 세포 응집을 위한 도구, 원심분리 조건 등을 선택함으로써 당업자에 의해 적절히 조정될 수 있다.

응집체 형성시의 배양 온도 및 CO₂ 농도와 같은 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO₂ 농도는 예를 들면 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.

또한, 동일 배양 조건 하의 복수 배양 구획을 준비하고, 각 배양 구획에서 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 형성시킴으로써, 질적으로 균일한 다능성 줄기 세포 응집체 집단을 수득할 수 있다. 다능성 줄기 세포의 응집체가 질적으로 균일한지 여부는, 응집체 덩어리의 크기 및 그 안의 세포수, 거시적 형태, 조직학적 염색에 의해 분석된 바와 같은 미시적 형태 및 그 균질성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균질성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체간의 재현성 등을 기초로 하여 평가할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용하는 다능성 줄기 세포 응집체 집단은, 응집체 내에 균일한 수의 다능성 줄기 세포를 함유한다. 특정의 매개변수에 있어서 다능성 줄기 세포 응집체의 집단이 "균일" 하다는 것은, 집단에서의 전체 응집체 중 90% 이상이 상기 응집체 집단에서 상기 매개변수의 평균치 ±10%, 바람직하게는 ±5% 의 범위 내에 있는 것을 의미한다.

(4) 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직의 유도

본 발명의 제조 방법은, 다능성 줄기 세포 응집체를 BMP4 와 같은 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하는 것을 포함한다. 다능성 줄기 세포 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 인자를 함유하는 배지 중에서 현탁 배양함으로써, 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화가 유도되고, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 함유하는 세포 응집체가 제조된다.

본 발명에 의하면, 다능성 줄기 세포 응집체를 현탁 배양 조건 하에 BMP4 와 같은 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리하여 전안부 조직의 자체 조직화가 유도되고, 그로써 각막, 수정체 등과 같은 전안부 조직, 이의 부분 구조, 이의 선구 조직이 입체적으로 형성될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 의하면, 다능성 줄기 세포 응집체를 현탁 배양함으로써 신경 망막의 자체 조직화가 유도된다. 이 과정에서 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질로 처리함으로써, 응집체 내에 형성되는 망막 상피 조직 응집체의 표면에 표면 외배엽이 자체 조직화 방식으로 형성되고, 생체내 배아 발생 과정에서 관찰되는 "망막에 의한 표면 외배엽으로부터의 전안부 조직의 선구 조직 (수정체 플라코드, 각막 플라코드 등) 의 분화 유도" 가 시험관내 자발적으로 초래될 수 있다. 그 결과, 세포 응집체 내부에서 신경 망막이 자체 조직화되고, 이의 표면에서 전안부 조직, 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직 (예를 들면, 수정체 플라코드, 각막 상피 선구 조직) 이 자체 조직화된다. 즉, 한 구현예에서, 본 발명에 의해 수득한 세포 응집체는 신경 망막 조직을 추가로 포함한다. 이러한 방식으로, 세포 응집체의 표면층을 구성하는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직, 및 신경 망막 조직을 세포 응집체의 내부에 포함하는 세포 응집체 (이때 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직은 신경 망막 조직과 인접함) 가 수득된다.

다능성 줄기 세포의 응집체를 "현탁 배양함" 은, 다능성 줄기 세포 응집체를 배양기에 대해 비접착성인 조건 하에서 배지 중에서 배양하는 것을 말한다. 이것에 의해, 종래의 접착 배양에서 이루기 어려운 입체 형성이 가능하게 된다.

현탁 배양에 사용한 배지는 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질을 함유한다. 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질은 골형성 인자와 수용체와의 결합시 신호가 전달되는 경로를 활성화시키는 임의의 물질이다. 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 예는 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 등을 포함한다. 바람직하게는, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP4 이다. 이하, 주로 BMP4 를 기재하지만, 본 발명에서 사용되는 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질은 BMP4 로 한정되지 않는다. BMP4 는 공지된 사이토카인이며, 이의 아미노산 서열도 공지된다. 본 발명에 사용하는 BMP4 는 포유동물의 BMP4 이다. 포유동물의 예는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등과 같은 설치류, 토끼 등과 실험 동물; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등과 같은 가축; 개, 고양이 등과 같은 애완동물; 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등과 같은 영장류를 포함한다. BMP4 는 바람직하게는 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 BMP4 이며, 가장 바람직하게는 인간 BMP4이다. 인간 BMP4 란, BMP4 가 인간 신체 내에서 자연적으로 발현된 BMP4 의 아미노산 서열을 가지는 것을 의미한다. 인간 BMP4 의 대표적인 아미노산 서열의 예는, NCBI 등록 번호 NP_001193.2 (2013 년 6 월 15 일 갱신), NP_570911.2 (2013 년 6 월 15 일 갱신), NP_570912.2 (2013 년 6 월 15 일 갱신), 이러한 아미노산 서열의 각각으로부터 N-말단 신호 서열 (1-24) 을 제거하여 수득한 아미노산 서열 (성숙형 인간 BMP4 아미노산 서열) 등을 포함한다.

배지 중의 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 농도는, 응집체에서 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화를 유도할 수 있는 범위 내에서 적절히 결정될 수 있다. 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질로서 BMP4 를 사용하는 경우, 그 농도는 일반적으로 0.1 ~ 50 nM, 바람직하게는 1 ~ 5 nM 이다. BMP4 농도는 배양 기간 동안 일정하게 유지될 수 있거나 변동될 수 있다. 예를 들면, BMP4 의 농도를 먼저 3 ~ 7 nM, 바람직하게는 4 ~ 6 nM, 보다 바람직하게는 약 5 nM 로 설정한 후, 0 ~ 3 nM, 바람직하게는 0.5 ~ 2 nM, 보다 바람직하게는 약 1 nM 로 설정할 수 있다.

골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서의 배양은, 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 그 선구체가 유도될 때까지의 기간 전체에 걸쳐 실시할 필요는 없고, 단지 그 일부의 기간에 실시하는 것이 필요하다. 예를 들면, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 의 존재 하에 현탁 배양하기 전, 다능성 줄기 세포 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 의 부재 하에 현탁 배양한다. 한 구현예에서, 다능성 줄기 세포 응집체 형성 후 1 ~ 5일 동안, 바람직하게는 1 ~ 3 일 동안 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 의 부재 하에 다능성 줄기 세포 응집체를 현탁 배양하고, 그 후 배지를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지로 전환한 다음 현탁 배양을 지속할 수 있다.

응집체의 현탁 배양에 사용되는 배지는 동물 세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 사용하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는 동물 세포의 배양에 사용할 수 있는 것이면 특히 한정되지 않으며 BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066 배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, 햄 F-12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지, 및 이의 혼합 배지 등일 수 있다.

다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않기 위해, 응집체의 현탁 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 무혈청 배지이다.

응집체의 현탁 배양에 사용되는 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 선구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'-티오글리세롤, 또는 이러한 균등물 등을 적절하게 포함하는 것일 수 있다. 이러한 혈청 대체물은 예를 들면, WO98/30679 에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 본 발명의 방법을 보다 간편하게 실시하기 위해서, 시판 혈청 대체물을 사용할 수 있다. 걸리는 시판의 혈청 대체물로서는, 예를 들면 녹아웃 혈청 대체물 (KSR) (Invitrogen 사제), 화학 합성 지질 농축물 (Gibco 사제) 및 Glutamax (Gibco 사제) 를 포함한다.

응집체의 현탁 배양에 사용되는 배지는 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않는 한, 다른 첨가물을 함유할 수 있다. 첨가물의 예는, 인슐린, 철 공급원 (예를 들면 트랜스페린 등), 미네랄 (예를 들면 나트륨 셀레네이트 등), 당류 (예를 들면 글루코오스 등), 유기산 (예를 들면 피루브산, 락트산 등), 혈청 단백질(예를 들면 알부민 등), 아미노산 (예를 들면 L-글루타민 등), 환원제 (예를 들면 2-메르캅토에탄올 등), 비타민류 (예를 들면 아스코르브산, d-비오틴 등), 항생제 (예를 들면 스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 완충제 (예를 들면 HEPES 등) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다.

한 구현예에서, 다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도에 악영향을 주지 않기 위해서, 응집체의 부유 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는, 혈청 대체물 (KSR 등) 을 첨가한, 증식 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지 (gfCDM) 이다. 여기서의 "증식 인자" 는 Fgf, Wnt, Nodal, Notch, Shh 등과 같은 패턴 형성 인자 (골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 제외); 인슐린 및 지질-풍부 알부민이 포함된다. 증식 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지의 예는 [Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008] 에 개시된 gfCDM 를 포함한다. gfCDM 는 1 x 화학 합성 지질 농축물, 모노티오글리세롤 (450 μM), 정제된 BSA 및 인간 아포-트랜스페린 (150 ㎍/ml 최종) 을 함유하는 IMDM 과 햄 F-12 와의 1:1 혼합 배지이다.

응집체의 현탁 배양에 사용하는 배양기는 특히 한정되지 않는다. 이러한 배양기는 예를 들면, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티-디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백 및 롤러 보틀을 포함한다. 비접착성의 조건 하에서의 배양이 가능하게 하기 위해, 배양기는 세포비접착성인 것이 바람직하다. 유용한 세포비접착성 배양기는, 배양기의 표면이 세포비접착성이 되도록 인공적으로 처리되어 있는 배양기, 세포 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리 (예를 들면, 세포외 기질 등에 의한 코팅 처리) 되어 있지 않은 배양기 등을 포함한다.

다능성 줄기 세포로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화 유도가 가능한 한, 피더 세포의 존재 하 또는 부재 하에 응집체의 현탁 배양을 실시할 수 있다. 미결정 인자로의 오염을 방지하기 위해, 피더 세포의 부재 하에 응집체의 현탁 배양을 실시하는 것이 바람직하다.

응집체의 현탁 배양을 위한, 배양 온도, CO₂ 농도 및 O₂ 농도와 같은 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면 약 30 내지 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO₂ 농도는 예를 들면 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. O₂ 농도는 예를 들면 약 20 내지 40% 이다.

바람직한 구현예에서, 다능성 줄기 세포 응집체의 질적으로 균일한 집단을 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 현탁 배양한다. 다능성 줄기 세포 응집체의 질적으로 균일한 집단을 사용하여, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직으로의 분화의 정도에 대한 응집체간 차이를 최소한으로 억제할 수 있고, 목적으로 하는 분화 유도의 효율을 향상시킬 수 있다. 다능성 줄기 세포 응집체의 질적으로 균일한 집단의 현탁 배양은 하기 구현예를 포함한다.

(1) 복수의 배양 구획을 준비하고, 1 개의 배양 구획에 1 개의 다능성 줄기 세포의 응집체가 포함되도록 다능성 줄기 세포 응집체의 질적으로 균일한 집단을 시딩한다 (예를 들면, 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 넣음). 각 배양 구획에서, 1 개의 다능성 줄기 세포 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 현탁 배양한다.

(2) 1 개의 배양 구획에 복수의 다능성 줄기 세포 응집체가 포함되도록 다능성 줄기 세포 응집체의 질적으로 균일한 집단을 시딩한다 (예를 들면, 10 cm 디쉬에 복수의 다능성 줄기 세포의 응집체를 넣음). 상기 배양 구획에서, 복수의 다능성 줄기 세포 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 현탁 배양한다.

본 발명의 방법에 구현예 (1) 및 (2) 중 임의의 것을 이용할 수 있으며, 배양 동안 구현예가 변경될 수 있다 (구현예 (1) 로부터 구현예 (2) 로, 또는 구현예 (2) 로부터 구현예 (1) 로). 응집체간의 상호작용을 방지하고 안정한 분화 유도를 달성하기 위해서는, 구현예 (1) 이 바람직하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 방법에 있어서 세포 응집체 내에 전안부 조직의 자체 조직화가 유도되므로, 시간의 경과에 따라 세포 응집체 내에 포함된 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직의 분화 단계가 진행된다. 따라서, 목적으로 하는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직에 따라 적절하게 배양 기간 및 배양 조건을 조절하는 것이 바람직하다. 하기 (5) ~ (11) 에서, 본 발명의 한 구현예를 시계열에 따라 설명하지만, 이것들은 본 발명의 예시이며 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

(5) 신경 망막 조직의 유도

다능성 줄기 세포 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 현탁 배양하는 경우, 응집체의 내부에 신경 망막 조직이 유도된다. 신경 망막 조직의 유도는 신경 망막 조직 마커 (예를 들면, Rx, Chx10) 의 발현이나 신경상피형 구조 (다열 원주 상피) 의 형성을 지표로서 사용하여 확인할 수 있다. 신경 망막 조직의 유도에 필요한 기간은, 배양 조건이나 다능성 줄기 세포가 유래하는 포유동물의 종류에 따라 변동하며, 일반적으로 명시할 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양 개시로부터, 예를 들면 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 일 내에는, 응집체의 내부에 신경 망막 조직이 유도된다.

(6) 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드의 유도

상기 (5) 에서 수득하는, 내부에 신경 망막 조직을 포함한 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 계속하여 현탁 배양하는 경우, 신경 망막 조직 외부에 외배엽성 상피 세포층이 형성되고, 신경 망막 조직이 상기 외배엽성 상피 세포층으로부터 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드로의 분화를 유도하여 세포 응집체의 표면층에 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 형성된다. 상기 응집체에 대해서는, 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 세포 응집체의 표면층을 구성하여, 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되고 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 신경 망막 조직과 인접하여 존재한다. 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드의 유도는, 각막 상피 선구 조직 마커 (예를 들면, 판사이토케라틴, E-카드헤린) 및 수정체 플라코드 마커 (예를 들면, L-Maf) 의 발현이나, 비후한 상피 세포층의 형성을 지표로서 사용하여 확인할 수 있다. 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드의 유도에 필요한 기간은 배양 조건이나 다능성 줄기 세포가 유래하는 포유동물의 종류에 따라 변동하며, 일반적으로 명시될 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양 개시로부터, 예를 들면 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28 일 내에는, 세포 응집체의 표면층에 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 형성된다. 배양한 복수의 세포 응집체로부터 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 형성된 것이 확인된 세포 응집체를 선택함으로써, 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드, 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 상피 선구 조직 및/또는 수정체 플라코드가 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체를 수득할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 각막 선구 조직을 예를 들면 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상의 효율로 포함한 세포 응집체의 집단을 형성할 수 있으며, 수정체 선구 조직을 예를 들면 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상의 효율로 포함한 세포 응집체의 집단을 수득할 수 있다.

(7) 각막 상피의 유도

상기 (6) 에서 수득하는, 각막 상피 선구 조직 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피 선구 조직이 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 상피 선구 조직이 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체를, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 추가로 현탁 배양함으로써, 각막 상피 선구 조직의 각막 상피로의 추가 분화가 유도된다. 그 결과, 각막 상피 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 상피가 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체가 형성될 수 있다. 각막 상피의 유도는, 각막 상피 마커 (예를 들면, 사이토케라틴 3, 사이토케라틴 12, 사이토케라틴 14, p63, ZO-1) 나 각막 상피 줄기 세포 마커 (예를 들면, 사이토케라틴 15) 를 지표로서 사용하여 확인할 수 있다. 각막 상피의 유도에 필요한 기간은 배양 조건이나 다능성 줄기 세포가 유래하는 포유동물의 종류에 따라 변동하며, 일반적으로 명시될 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양 개시로부터 예를 들면 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 일 내에는, 세포 응집체의 표면층에 각막 상피가 형성된다. 배양한 복수의 세포 응집체로부터 각막 상피가 형성된 것이 확인된 세포 응집체를 선택함으로써, 각막 상피 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 상피가 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체를 수득할 수 있다.

각막 상피 선구 조직의 각막 상피로의 추가 분화를 유도하기 위한 추가 현탁 배양에 사용되는 배지로서는, 상기 (4) 에서 기재한 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양용 배지를 연속하여 사용할 수 있다. 기초 배지로서 각막 상피나 표피 상피의 세포의 배양에 적합한 것으로 개질된 배지를 채용할 수 있다. 이러한 배지의 예는 CnT-30 배지 (CELLnTEC 사제), 합성 (Defined) K-SFM 배지 (Gibco/Invitrogen 사제) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다.

(8) 각막 상피의 계층화

상기 (7) 에서 수득하는, 각막 상피 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 상피가 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체를, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 추가 현탁 배양함으로써, 각막 상피의 계층화가 유도된다. 그 결과, 계층화한 각막 상피 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되는, 세포 응집체가 형성될 수 있다. 각막 상피의 계층화는, 표면층이 편평 상피이고 심층은 입방 상피인 성숙 각막에 특징적인 상피의 계층 구조를 현미경 관찰함으로써 확인할 수 있다. 각막 상피의 계층화에 필요한 기간은 배양 조건이나 다능성 줄기 세포가 유래하는 포유동물의 종류에 따라 변동하며, 일반적으로 명시될 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양 개시로부터 예를 들면 75, 80, 84, 90 또는 95 일 내에는, 세포 응집체의 표면층에 계층화한 각막 상피가 형성된다. 배양한 복수의 세포 응집체로부터 계층화한 각막 상피가 형성된 것이 확인된 세포 응집체를 선택함으로써, 계층화한 각막 상피 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되는, 세포 응집체를 수득할 수 있다.

각막 상피의 계층화를 유도하기 위한 추가 현탁 배양에 사용되는 배지로서는, 상기 (4) 에서 기재한 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양용 배지를 연속하여 사용할 수 있다. 기초 배지로서, 각막 상피나 표피 상피의 세포의 배양에 적합하도록 개질된 배지를 채용할 수 있다. 이러한 배지의 예는 CnT-30 배지 (CELLnTEC 사제), 합성 K-SFM 배지 (Gibco/Invitrogen 사제) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다.

추가 현탁 배양에 사용되는 배지는 섬유아세포 증식 인자를 함유할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 구현예에서, 세포 응집체의 현탁 배양은 전부 또는 일부가 섬유아세포 증식 인자의 존재 하에서 수행된다. 섬유아세포 증식 인자의 예는 섬유아세포를 증식시키는 활성을 가지는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 섬유아세포 증식 인자의 예는 bFGF 를 포함한다. 이하, 주로 bFGF 에 대해 기재하지만, 본 발명에서 사용되는 섬유아세포 증식 인자는 bFGF 로 한정되지 않는다. 섬유아세포 증식 인자 (bFGF 등) 의 첨가에 의해, 각막 상피의 계층화가 촉진된다.

bFGF 는 공지된 사이토카인이며, 그 아미노산 서열도 공지된 것이다. 본 발명에 사용하는 bFGF 는 포유동물 bFGF 이다. 포유동물의 예는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등을 포함하는 설치류, 토끼 등과 같은 실험 동물; 돼지, 소, 염소, 말, 양 등과 같은 가축; 개, 고양이 등과 같은 애완동물; 및 인간, 원숭이, 오랑우탄, 침팬지 등과 같은 영장류를 포함한다. bFGF 는 바람직하게는 설치류 (마우스, 래트 등) 또는 영장류 (인간 등) 의 bFGF 이며, 가장 바람직하게는 인간 bFGF 이다. 인간 bFGF 의 대표적인 아미노산 서열의 예는, NCBI 등록 번호 NP_001997.5 (2013 년 7 월 7 일 갱신) 등을 포함한다.

섬유아세포 증식 인자로서 bFGF 를 사용하는 경우, 각막 상피의 계층화에 사용되는 배지 중의 bFGF 농도는, 각막 상피의 계층화를 촉진하는 한, 특히 한정되지 않는다. 그러나 이는 일반적으로 약 0.1 ~ 1000 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ~ 500 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 2 ~ 200 ng/ml이다.

(9) 간엽 조직의 유도

상기 (6) 또는 (7) 에서 수득하는, 각막 상피 또는 이의 선구 조직, 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 상피 또는 이의 선구 조직이 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 상피 또는 이의 선구 조직이 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체를, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 추가 현탁 배양함으로써, 각막 상피 또는 이의 선구 조직과 신경 망막 조직과의 사이에 간엽 조직이 형성된다. 상기 간엽 조직은 간엽 세포가 조밀하게 응집한 층의 형태를 나타낸다. 성체의 각막은 표면으로부터 내부를 향해 상피, 실질 및 내피의 3 개 층을 포함하며, 실질 및 내피는 표면 외배엽으로부터가 아니라 간엽 세포로부터 발생하는 것이 알려져 있다. 즉, 본 발명에 의하면, 생체내 배아에 있어서의 각막 실질 및 각막 내피의 발생을 세포 응집체 내에서 재현할 수 있다. 추가 배양의 결과에 따르면, 수득한 세포 응집체는 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 간엽 조직, 및 신경 망막 조직을 함유하며, 이때 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 간엽 조직, 및 신경 망막 조직이 세포 응집체의 표면층으로부터 내부를 향해 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 간엽 조직, 및 신경 망막 조직의 순서로 층상 배치된다.

한 구현예에서, 각막 상피 또는 이의 선구 조직과 신경 망막 조직의 사이에 형성된 간엽 조직은 각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직일 수 있다. 상기 구현예에서, 추가 배양의 결과 수득한 세포 응집체는 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 각막 실질 또는 이의 선구 조직, 각막 내피 또는 이의 선구 조직, 및 신경 망막 조직을 포함하며, 이때 이들이 세포 응집체의 표면층으로부터 내부를 향해 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 각막 실질 또는 이의 선구 조직, 각막 내피 또는 이의 선구 조직, 및 신경 망막 조직의 순서로 층상 배치된다. 즉, 세포 응집체 내에서, 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직을 포함하는 각막 또는 이의 선구 조직 (각막형 조직) 이 신경 망막 조직에 인접하게, 그리고 그 외부에 형성된다.

간엽 조직, 또는 각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직의 유도는, 각막 실질, 각막 내피, 또는 이의 선구 조직의 마커, 예컨대 PDGFR-α, Pitx2, ABCG2 등의 발현, 또는 간엽 세포가 조밀하게 응집한 층이라는 형태적인 특징을 지표로서 사용하여 확인할 수 있다. 또한, 각막 내피가 상피화한 내피 세포층과 유사한 형태를 나타내므로, 이러한 형태학적인 특징을 지표로서 사용하여, 각막 실질 (또는 이의 선구 조직) 과 각막 내피 (또는 이의 선구 조직) 를 구별하거나 각막 내피 또는 이의 선구 조직이 유도된 것을 확인할 수 있다.

간엽 조직 (각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직) 의 유도에 필요한 기간은 배양 조건이나 다능성 줄기 세포가 유래하는 포유동물의 종류에 따라 변동하며, 일반적으로 명시할 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양 개시로부터 예를 들면 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 일 내에는, 각막 상피 또는 이의 선구 조직과 신경 망막 조직의 사이에 간엽 조직 (각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직) 이 형성된다. 간엽 조직 (각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직) 이 형성된 것이 확인된 세포 응집체를 선택함으로써, 상기 구현예에서, 각막 상피 (바람직하게는, 계층화한 각막 상피) 또는 이의 선구 조직, 간엽 조직 (각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직), 및 신경 망막 조직을 포함한 세포 응집체를 수득할 수 있다.

간엽 조직을 유도하기 위한 추가 현탁 배양에 사용되는 배지로서는, 상기 (4) 에서 기재한 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양용 배지를 연속하여 사용할 수 있다. 기초 배지로서, 각막 상피나 표피 상피의 세포의 배양에 적합하도록 개질된 배지를 채용할 수 있다. 이러한 배지의 예는 CnT-30 배지 (CELLnTEC 사제), 합성 K-SFM 배지 (Gibco/Invitrogen 사제) 등을 포함하지만, 이것들로 한정되지 않는다.

상기 언급한 구현예에서, 계층화한 각막 상피, 간엽 조직 (각막 실질 또는 이의 선구 조직, 및 각막 내피 또는 이의 선구 조직), 및 신경 망막 조직을 포함하는 세포 응집체의 형성이 요구되는 경우, 추가 현탁 배양에 사용되는 배지는 섬유아세포 증식 인자 (bFGF 등) 를 함유할 수 있다.

섬유아세포 증식 인자로서 bFGF 를 사용하는 경우, 추가 현탁 배양에 사용되는 배지 중의 bFGF 농도는 각막 상피의 계층화를 촉진하는 한, 특히 한정되지 않는다. 그러나 이는 일반적으로, 약 0.1 ~ 1000 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ~ 500 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 2 ~ 200 ng/ml 이다.

(10) 수정체 소포의 유도

상기 (6) 에서 수득하는, 수정체 플라코드 및 신경 망막 조직을 포함하여, 수정체 플라코드가 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 수정체 플라코드가 신경 망막 조직과 인접하는, 세포 응집체를, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질 (BMP4 등) 을 함유하는 배지 중에서 추가 현탁 배양함으로써, 수정체 플라코드의 함입이 유도되고 수정체 소포가 형성된다. 그 결과, 수정체 소포 및 신경 망막 조직을 포함한 세포 응집체가 형성될 수 있다. 수정체 소포의 형성은 수정체 선구 조직 마커 (예를 들면 L-Maf)-양성 소포라는 형태학적 특징을 지표로서 사용하여 확인할 수 있다. 수정체 소포의 형성에 필요한 기간은 배양 조건이나 다능성 줄기 세포가 유래하는 포유동물의 종류에 따라 변동하며, 일반적으로 명시될 수 없다. 그러나 인간 다능성 줄기 세포를 사용하는 경우, 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양 개시로부터 예를 들면 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70 일 내에는, 수정체 소포가 형성된다. 배양한 복수의 세포 응집체로부터 수정체 소포가 형성된 것이 확인된 세포 응집체를 선택함으로써, 수정체 소포 및 신경 망막 조직을 포함한 세포 응집체를 수득할 수 있다.

추가 현탁 배양에 사용되는 배지로서는, 상기 (4) 에서 기재한 다능성 줄기 세포 응집체의 현탁 배양용 배지에 섬유아세포 증식 인자를 첨가한 것을 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 한 구현예에서, 세포 응집체 현탁 배양은 전부 또는 일부가 섬유아세포 증식 인자의 존재 하에서 수행된다. 섬유아세포 증식 인자로서는 섬유아세포를 증식시키는 활성을 가지는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 섬유아세포 증식 인자의 예는 bFGF 를 포함한다. 이하, 주로 bFGF 에 대해 기재하지만, 본 발명에서 사용되는 섬유아세포 증식 인자는 bFGF 로 한정되지 않는다. 섬유아세포 증식 인자 (bFGF 등) 의 첨가에 의해, 형성된 수정체 소포가 전후축의 전방 부분에서 얇고 후방 부분에서 두꺼운 것을 특징으로 하는, 생체내에 있어서의 수정체 발생에 대해 관찰되는 것과 공통적인 형태적인 극성을 나타내게 된다. 섬유아세포 증식 인자 (bFGF 등) 를 첨가하지 않고, 상기 (4) 에서 기재한 다능성 줄기 세포 응집체의 부유 배양용 배지를 연속하여 사용함으로써 수정체 플라코드의 함입 및 수정체 소포의 형성이 또한 유도될 수 있으나, 상기 언급한 조직 극성은 명확하게 나타나지 않는다.

섬유아세포 증식 인자로서 bFGF 를 사용하는 경우, 수정체 소포의 형성 유도에 사용되는 배지 중의 bFGF 농도는, 상술한 형태적인 극성을 수정체 소포에게 부여할 수 있는 것인 한, 특히 한정되지 않는다. 그러나 이는 일반적으로 약 0.1 ~ 1000 ng/ml, 바람직하게는 약 0.5 ~ 500 ng/ml, 보다 바람직하게는 약 2 ~ 200 ng/ml 이다.

(11) 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직의 제조

추가 양태에서, 상기 언급한 바와 같이 수득한 세포 응집체로부터 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 분리할 수 있다. 한 구현예에서, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 신경 망막 조직과 함께 분리할 수 있다. 또한 본 발명은 상기 방법에 의해 수득한 세포 응집체, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 제공한다. 예를 들면, 각막 또는 이의 선구 조직 및 신경 망막 조직을 포함하여, 각막 또는 이의 선구 조직이 세포 응집체의 표면층을 구성하고 신경 망막 조직이 세포 응집체의 내부에 포함되며 각막 또는 이의 선구 조직과 신경 망막 조직이 인접하는, 세포 응집체로부터, 각막 또는 이의 선구 조직을 포함한 표면층을 단리할 수 있다. 상기 (8) 에서 수득한 세포 응집체에 대해서는, 각막 또는 이의 선구 조직이 응집체의 표면층에 수동으로 분리가능한 층을 형성하므로, 효소 처리 등이 없이 용이하게 각막 또는 이의 선구 조직을 단리할 수 있다. 또한, 수득한 각막 또는 이의 선구 조직을 효소 등으로 분산시킴으로써, FACS 등을 사용하지 않고도 고순도로 각막 세포 및 각막 선구 세포를 분리할 수 있다. 이에 따라 수득한 각막 또는 이의 선구 조직은 그 자체로, 또는 배양에 의해 시트 형태로 이식에 사용할 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 의해 수득한 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 이식을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 의해 수득한 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직은 전안부 조직의 장해에 근거하는 질환의 치료 약물로서, 또는 손상된 전안부 조직에 대해 해당 조직을 보충하기 위해서 사용할 수 있다. 전안부 조직의 장해에 근거하는 질환 또는 손상된 전안부 조직을 가지는 환자에게, 본 발명에 의해 수득한 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 이식함으로써, 전안부 조직의 장해에 근거하는 질환 또는 전안부 조직에 대한 손상을 치료할 수 있다. 전안부 조직의 장해에 근거하는 질환의 예는, 각막의 장해에 근거하는 질환 (예를 들면, 원추 각막, 수포성 각막증, 각막 백반, 각막헤르페스, 각막 변성증, 라섹, PRK 등과 같은 근시의 레이저 수술의 실패로 인한 각막 손상), 수정체의 장해에 근거하는 질환 (예를 들면, 선천성 백내장, 후천성 백내장) 등을 포함한다.

이식 치료요법에 있어서, 조직 적합성 항원의 차이로 인한 이식편 거절이 종종 문제가 되지만, 이식 수취인의 체세포로부터 확립된 다능성 줄기 세포 (예를 들면, 유도 다능성 줄기 세포) 를 사용함으로써 문제를 해결할 수 있다. 즉, 바람직한 구현예에서, 수취인의 체세포로부터 확립된 다능성 줄기 세포 (예를 들면, 유도 다능성 줄기 세포) 를 본 발명의 방법에서 다능성 줄기 세포로서 사용하고, 수취인에 대해 면역학적 자기 (immunologically self) 인 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 제조하고 상기 수취인에게 이식한다.

추가로, 본 발명에 의해 수득하는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 약물의 스크리닝 및 평가에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 수득하는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직은, 망막, 수정체 및 각막이 인접하여 입체 형성된 것, 및 각막 상피 (바람직하게는 계층화한 각막 상피), 각막 실질 및 각막 내피의 각 선구 조직을 층 형태로 가지는 각막 선구 조직에 의해 입증된 바와 같이, 생체에 있어서 전안부 조직이나 이의 선구 조직과 극히 유사한 고차 구조를 가지므로, 전안부 조직의 장해에 근거하는 질환, 및 손상된 전안부 조직에 대한 치료 약물의 스크리닝, 의약품 및 화장품의 부작용 및 독성 시험 (예를 들면, 각막 자극 시험의 대체 시험), 및 전안부 조직 질환의 신규한 치료 방법의 개발 등에 적용할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 단순한 예시를 나타내는 것에 지나지 않으며 본 발명의 범주를 한정하지 않는다.

실시예

실시예 1: 인간 ES 세포의 현탁 응집체 배양에 의한 수정체 및 각막 선구 조직의 자체 조직화

(방법)

인간 ES 세포 (KhES-1; 망막 특이적 유전자 Rx 에 형광 단백 유전자 Venus 가 녹인됨) 를 트립신 처리에 의해 단일 세포로 분산시키고, SFEBq 법 (Nakano et al, Cell StemCell, 10(6): 771-785, 2012) 에 따라 응집체를 형성시키고 분화 유도를 위한 현탁 응집체 배양을 37℃ 에서 5% CO₂ 존재 하에 실시했다. 분산된 5000 개의 인간 ES 세포를 저세포 흡착성 표면 코팅이 적용된 V 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 분화 유도용의 배양 배지로서 증식 인자를 포함하지 않는 화학 합성 배지 (growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM; Wataya et al, Proc Natl Acad Sci USA, 105(33): 11796-11801, 2008) 에 5% KSR (녹아웃 혈청 대체물 (Knockout Serum Replacement)) 을 첨가한 것을 사용했다. 분화 유도의 최초 3 일간은 분산-유도성 세포사를 억제하기 위해 ROCK 저해제 Y-27632 를 20 μM 첨가하고, 다음 3 일간은 그 농도를 반으로 감소시켰다. 분화 유도 개시 후 제 3 일로부터 제 18 일까지, BMP4 를 5 nM 첨가하고, 그 농도를 제 18 일로부터 제 21 일까지 반으로 감소시켰다. 이러한 응집체를 면역조직염색으로 분석했다.

(결과)

분화 유도 개시 제 9 일로부터, 응집체의 내부에 Rx::venus 의 형광이 강하게 관찰되었다. 분화 유도 개시 제 12 일에는, BMP4 의 첨가 유무에 관계없이 형광이 관찰되었으며, BMP4 처리에 의해 형광은 약 2 배 이상 강해졌다. Rx::venus 양성 조직은 신경상피형 구조 (다열 원주 상피) 를 나타내어, 신경 망막 마커 Chx10 을 발현하며 신경 망막을 형성하는 것으로 발견되었다. 분화 유도 개시로부터 제 14 일에, 응집체의 표면층에 신경 망막과 상이한 Rx::venus 음성 상피 세포층의 형성이 관찰되었다 (도 1A). 분화 유도 개시로부터 제 24 일에는, 시험한 표면에서의 상피 세포층은 비신경 외배엽 상피 마커인 판-사이토케라틴에 양성이고 E-카드헤린에 양성이었다 (도 1B). 이러한 신경 망막의 외부에 비신경 외배엽 상피 조직을 자체 조직화하는 것은, 90% 이상의 응집체에서 양호한 재현성으로 관찰되었다. 상기 표면의 상피 세포층이 매우 또는 중간 정도로 비후하여 (플라코드 형성), 각각 수정체 플라코드 및 각막 상피 선구 조직을 형성한 것이 시사되었다. 수정체 플라코드형 조직은 수정체 선구 조직 마커인 L-Maf 에 양성이었다 (도 1C). 각막 상피 선구 조직은 90% 이상의 응집체에서 형성되었으며, 수정체 플라코드는 50% 의 응집체에서 형성되었다.

실시예 2: 인간 ES 세포로부터 자체 조직화한 각막 선구 조직의 장기 배양에 의한 각막 마커의 발현

(방법)

분화 유도 제 18 일까지 실시예 1 의 배양 조건 하 V 바닥 96 웰 플레이트에서 배양한 후, 현탁 응집체를 세포비흡착성 페트리 디쉬 (직경 6 cm) 에 옮기고, 현탁 배양을 37℃ 에서 5% CO₂, 40% O₂ 존재 하에 실시했다. 배양에 사용한 배양 배지는 제 18 일에서 제 30 일까지는 gfCDM + 5% KSR 에 1 nM BMP4 를 첨가한 배지였고, 제 30 일부터는 하기와 같은 2 개의 배지 (각막 상피 및 표피 상피의 배양을 지지하는 것으로 알려져 있는 시판 배지를 기반으로 함) 중 임의의 것이었으며, 이후 제 55 일에 면역조직염색으로 분석했다.

1) CnT-30 배지 (CELLnTEC) 에 1 nM BMP4 를 첨가한 배양 배지

2) 합성 K-SFM 배지 (Gibco/Invitrogen) 에 10% FBS와 1 nM BMP4 를 첨가한 배양 배지

(결과)

상기의 1) 및 2) 중 임의의 배양 배지를 사용한 배양에서, 인간 ES 세포 응집체의 표면층에 자체 조직화한 상피 선구 조직은 확대 배양할 수 있으며 분화 배양 개시 55 일 후에는 판-사이토케라틴에 양성인 것에 추가로, 각막 상피 특유의 사이토케라틴 3 (CK3), 사이토케라틴 12 (CK12), 사이토케라틴 14 (CK14), p63 및 ZO-1 을 발현하는 상피 구조의 형성이, 80% 이상의 응집체에서 관찰되었다 (도 2). 이 결과로부터, 본 발명의 방법에 의한 자체 조직화로 입체 형성된 표면층의 상피 조직이 각막의 선구 조직인 것이 명확하게 입증되었다.

실시예 3: 상피 조직과 간엽 조직 모두를 가지는 각막 선구 조직의 인간 ES 세포로부터의 자체 조직화

(방법)

실시예 2 에서와 동일한 방식으로, 제 30 일까지 배양을 실시했다. 즉, 인간 ES 세포 응집체를 분화 유도 제 18 일까지 실시예 1 의 배양 조건 하에 V 바닥 96 웰 플레이트에서 배양한 후, 현탁 응집체를 세포비흡착성 페트리 디쉬 (직경 6 cm) 에 옮기고, 현탁 배양을 37℃ 에서 5% CO₂, 40% O₂ 존재 하에 실시했다. 배양에 사용한 배양 배지는 제 18 일부터 제 30 일까지는 gfCDM + 5% KSR 에 1 nM BMP4 를 첨가한 배지였으며, 이후 면역조직염색으로 분석했다. 배양한 응집체의 일부는 제 30 일 이후 제 55 일까지 현탁 배양을 연속하여 실시했다. 후자의 배양에는, 합성 K-SFM 배지 (Gibco/Invitrogen) 에 10% FBS와 1 nM BMP4 를 첨가한 배양 배지를 사용했다.

(결과)

실시예 1 및 2 에서 기재한 바와 같이, 인간 ES 세포 응집체는 표면층에 표면 외배엽 유래의 각막 상피 및 수정체 조직을, 내부에 신경 망막 조직을 가진다. 제 30 일째의 샘플에서는, 중간 정도로 비후화한 각막 상피의 직하 (즉, 각막 상피와 신경 망막 조직의 사이) 에 간엽 세포가 존재하여, 조밀하게 응집한 층을 형성하였으며, 이는 70% 의 응집체에서 확인되었다. 간엽 세포는, 간엽 마커인 PDGFR-알파에 양성 (제 30 일; 도 3A) 이었으며, 초기 각막의 간엽 세포 (신경능 세포 유래) 에서 발현된 Pitx2 및 ABCG2 에 또한 양성 (제 53 일; 도 3B) 이었다. 생체의 각막에서는, 표면의 각막 상피층 아래에 각막 실질이 존재하고, 각막 실질 아래에 각막 내피가 존재하며, 각막 실질과 각막 내피는 각막 상피 아래에 응집하는 신경능 세포 유래 간엽 세포에서 유래한다. 이러한 생체에서와 유사한 상태는 인간 ES 세포 응집체의 표면층 및 그 아래의 층에 유도될 수 있었다. 게다가 간엽 세포의 응집층의 가장 내부 부분은 일부 상피화되어, 내피형 세포층의 형태적인 형성을 시사했다 (도 3C, 화살표). 따라서, 본 발명의 방법에 의해 전안부의 자체 조직화에 있어서 각막 상피 조직이 형성될 뿐만 아니라 각막 실질과 각막 내피를 포함한 각막전층의 선구 조직을 인간 다능성 줄기 세포로부터 입체 형성시킬 수 있다는 것이 나타났다.

실시예 4: 인간 ES 세포 유래의 수정체 플라코드로부터의 결정질 수정체 소포의 자체 조직화

(방법)

실시예 3 의 조건 하에, 분화 유도 개시로부터 제 30 일까지 인간 ES 세포 응집체의 현탁 배양을 지속하였다. 이러한 경우, 제 15 일부터 20 ng/ml bFGF 를 배지에 첨가했다. 다른 배양 조건으로서, 실시예 3 의 조건 하에 30 일 동안 배양한 후, 제 30 일부터 제 55 일까지 gfCDM + 10% KSR 또는 GMEM + 10% KSR 중에서 배양을 실시했다.

(결과)

제 30 일에서의 샘플에 대해, bFGF 의 첨가의 유무에 관계없이, 40% 의 응집체에서 표면층에서의 수정체 플라코드로부터의 함입에 의해 수정체 소포형 소포가 형성되었다. 이 소포는, 수정체 초기 마커 L-Maf 에 양성이었지만, bFGF 의 첨가에 의해 그 발현 수준이 2 배 이상으로 증가했다. bFGF 의 첨가예에서, 생체내 수정체 발생에 있어서 전후축으로 따라 관찰되는 형태적인 극성 (전방 부분에서 얇고, 후방 부분에서 두꺼운 수정체 조직의 형성) 이 수정체 소포형 소포에서 관찰되었으며, 생체내와 가까운 수정체 형성이 확인되었다 (도 4A). bFGF 의 부재 하에 gfCDM + 10% KSR 또는 GMEM + 10% KSR 중에서 제 55 일까지 배양한 경우에도 수정체 소포형 소포의 함입 및 형성이 양호한 재현성으로 관찰되었지만, 상기의 조직 극성은 명확하게 나타나지 않는다 (도 4B). 따라서, 극성 형성은 단지 bFGF 의 가속화된 발생에 의한 것이 아니라, 수정체의 성숙을 향한 발생 프로그램의 질적 촉진에 의한 것이라는 점이 시사되었다.

실시예 5: 계층화한 각막 상피의 자체 조직화

(방법)

분화 유도 제 30 일까지 상기 실시예와 동일한 조건 하에, V 바닥 96 웰 플레이트에서, 인간 ES 세포 응집체를 배양했다. 그 후, 현탁 응집체를 세포비흡착성 페트리 디쉬 (직경 6 cm) 에 옮기고, 현탁 배양을 37℃, 5% CO₂, 40% O₂ 조건 하에서 실시했다. 배양 배지로서는, 제 30 일까지는 gfCDM + 5% KSR 을, 제 30 일부터는 gfCDM + 20% KSR 을 사용했다. 제 3 일부터 제 18 일까지는, 5 nM BMP4 를 첨가했다. 제 24 일에는 BMP4 농도를 반으로 감소시키고 (2.5 nM), 제 30 일부터는 1 nM 로 연속하여 첨가했다. 또한, 배양하는 동안 제 15 일부터 염기성 (basic) FGF 를 20 ng/ml 의 농도로 배지에 첨가했다. 제 84 일에 면역조직염색으로 현탁 응집체를 분석했다.

(결과)

인간 ES 세포 응집체의 표면층에서 자체 조직화된 각막 상피를 발견하였으며, 분화 배양 개시 84 일 후에는 각막 상피 특유의 사이토케라틴 3 (CK3), 사이토케라틴 12 (CK12), 각막 상피 줄기 세포의 마커인 사이토케라틴 15 (CK15) 에 양성인 각막 상피가 발견되었다 (도 5A, 5B 및 5C). 또한, 각막 상피에 발현된 Na-K ATPase 를 또한 염색했다 (도 5D). 이 상피는 표면층은 편평 상피이고 심층은 입방 상피인 성숙 각막에 특징적인 상피의 계층 구조를 가졌다 (도 5B). 이 결과로부터, 본 발명의 방법에 의해 자체 조직화로 형성된 입체 각막 상피 선구 조직이, 더 성숙해지는 경우 계층화를 자발적으로 실시하고, 생체에 가까운 각막 상피에 고유한 조직 구축과 단백질 발현을 나타내는 것이 시사되었다. 또한 각막 상피의 하부에 간엽 응집층이 발견되었으며, 이는 이들이 상피, 실질 및 내피의 각막 전층의 선구 조직인 것을 명확하게 입증하는 것이다.

본 발명에 의하면, 대량 처리를 제공할 수 있는 부유 배양 하에 다능성 줄기 세포로부터, 수정체, 각막 등과 같은 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직이 입체 형성될 수 있다. 따라서 본 발명은, 안과 분야에 있어서의 재생 의료의 실시에 유용하다.

본 발명을 바람직한 구현예를 강조하여 설명해왔으나, 바람직한 구현예가 변경될 수 있다는 것은 당업자에게 있어 자명하다. 본 발명은, 본 발명이 본 명세서에 상세하게 기재된 것들 외 방법에 의해 실시될 수 있다는 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 첨부한 "특허청구범위" 의 취지 및 범주에 포함되는 모든 변경을 포함한다.

특허 및 특허 출원을 포함하는 본원에서 인용된 임의 간행물에 개시된 내용은, 본원에서 개시된 정도로, 그 전체가 참조로 포함된다.

본 출원은 일본에서 출원한 특허 출원 번호 2013-163586 (출원일: 2013 년 8 월 6 일) 을 기초로 하고 있으며, 그 내용은 본 명세서에 모두 포함된다.

Claims

다능성 줄기 세포의 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하는 것을 포함하는, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 포함하는 세포 응집체의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 존재 하에 현탁 배양하기 전에, 다능성 줄기 세포의 응집체를 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질의 부재 하에 현탁 배양하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 골형성 인자 신호 전달 경로 활성화 물질이 BMP4 인 방법.
제 3 항에 있어서, BMP4 의 농도가 1 ~ 5 nM 인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁 배양의 전부 또는 일부를 섬유아세포 증식 인자의 존재 하에서 실시하는 제조 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 유래의 것인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁 배양을 피더 세포의 부재 하에 실시하는 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 응집체가 신경 망막 조직을 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 전안부 조직이 각막 및/또는 수정체인 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 응집체가 전안부 조직의 부분 구조로서 각막 상피를 포함하고, 간엽 조직, 또는 그로부터 유래하는 각막 실질 및/또는 각막 내피를 추가로 포함하는 방법.
제 11 항에 있어서, 각막 상피가 계층화된 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 세포 응집체로부터 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제 13 항에 있어서, 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직을 신경 망막 조직과 함께 분리하는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 세포 응집체.
제 13 항 또는 제 14 항에 따른 방법에 의해 수득되는 전안부 조직 또는 이의 부분 구조, 또는 이의 선구 조직.