JP2020529586A - 底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞の単一細胞タンパク質発現プロファイリングの方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞の単一細胞レベルにおけるタンパク質発現プロファイルを解析する方法に関する。
・FOXA2(80〜100%、優先的には90〜100%)
・OTX2(80〜100%、優先的には90〜100%)
・PAX6(10%未満、優先的には5%未満)
・NKX6.1(10%未満、優先的には5%未満)
・任意選択でNKX2.1(5〜90%、優先的には5〜70%)
・任意選択でOCT3/4(0.1%未満)(細胞がOCT3/4陽性細胞から産生された場合)
・KI−67(10〜90%)
・IAP(80〜100%、優先的には90〜100%)
・SOX1(10%未満、優先的には5%未満)
a)前記細胞組成物の細胞またはその試料の細胞を抗原FOXA2、OTX2、PAX6、およびNKX6.1に特異的な抗原結合分子と接触させることにより、前記細胞組成物または前記試料の細胞を標識するステップ、
b)前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定するステップであって、前記細胞のタンパク質発現プロファイルが、
前記細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がFOXA2について陽性、
前記細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がOTX2について陽性、
前記細胞の10%未満、優先的には5%未満がPAX6について陽性、および
前記細胞の10%未満、優先的には5%未満がNKX6.1について陽性
であれば、前記細胞組成物の細胞をヒト底板mesDA前駆細胞として適格とするステップ
を含む方法を提供する。
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の0.1%未満がOCT3/4について陽性である、ことをさらに含む。
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の5〜90%、優先的には5〜70%がNKX2.1について陽性である、ことをさらに含む。
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の10〜90%がKI−67について陽性である、ことをさらに含む。
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がIAPについて陽性である、ことをさらに含む。
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の10%未満、優先的には1%未満がSOX1について陽性である、ことをさらに含む。
ステップa)においてKI−67に特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の10〜90%がKI−67について陽性であり、
ステップa)においてIAPに特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がIAPについて陽性であり、
ステップa)においてSOX1に特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の5%未満、優先的には1%未満がSOX1について陽性である、ことをさらに含む。
他に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語「ヒト底板mesDA前駆細胞を含む細胞組成物」は、ヒト底板mesDA前駆細胞、およびたとえば他の神経アイデンティティを有する他の細胞を任意の比で含む(完全な)細胞組成物またはその試料を意味する。
本発明の第1の実施形態では、ヒト底板mesDA前駆細胞を含んでいることが予想される細胞組成物から、1つの試料またはいくつかの試料を取り出す。細胞組成物の細胞を、たとえば実施例1に記載した胚様体(EB)に基づくプロトコルを用いて、ヒトiPS細胞からヒト底板mesDA前駆細胞にインビトロで分化した。
前記試料の細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がFOXA2について陽性である。
前記試料の細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がOTX2について陽性である。
前記試料の細胞の10%未満、優先的には5%未満がPAX6について陽性である。
前記試料の細胞の10%未満、優先的には5%未満がNKX6.1について陽性である。
また任意選択で、
前記試料の細胞の0.1%未満がOCT3/4について陽性であり、および/または
前記試料の細胞の5〜90%、優先的には5〜70%がNKX2.1について陽性であり、および/または
前記試料の細胞の10〜90%がKI−67について陽性であり、および/または
前記試料の細胞の80〜100%、優先的には90〜100%がIAPについて陽性であり、および/または
前記試料の細胞の10%未満、優先的には5%未満がSOX1について陽性である。
ヒト胚幹細胞を底板mesDA前駆細胞に分化させた。プロトコルはKirkbyら、2012、2013を改変した。分化のために、ヒト胚幹細胞をTrypLE(Life Technologies、12563−029)で収穫した。単一細胞を低付着プレートに播種し(2×106/2ml/6ウェル)、DMEM−F12:MACS Neuro(1:1)、N2サプリメント(1:100、Gibco、17052−48)、NeuroBrew−21(ビタミンAなし)(1:50、Miltenyi Biotec 130−097−263)、2mM L−グルタミン中でEBを形成させた。最初の2日間はROCKインヒビター(チアゾビビン 2μM、Miltenyi Biotec 130−104−461)を加えた。4日目に、ポリオルニチン(PO、15μg/ml、Sigma P3655)、フィブロネクチン(FN、5μg/ml、BIOPUR AG 11−50−1104)およびラミニン(LN、5μg/ml、Sigma L20−20)でコートしたプラスチック器具に細胞を播種した。0日目から9日目まで、以下の神経誘導因子およびパターニング因子が存在した。SB431542(10μM、Miltenyi Biotec 130−105−336)、LDN193189(100nM、Miltenyi Biotec 130−103−925)、CHIR99021(0.8μM、Miltenyi Biotec 130−103−926)、hSHH−C24−II(200ng/ml、Miltenyi Biotec 130−095−727)。2日目から9日目まで、培地にプルモルファミン(0.5μM、Miltenyi Biotec 130−104−465)を加えた。分化の11日目に、細胞をTrypLEで単一細胞に解離し、MACS Neuro培地、NeuroBrew−21(ビタミンAなし)(1:50)、BDNF(20ng/ml、Miltenyi Biotec 130−096−285)、GDNF(10ng/ml、Miltenyi Biotec 130−096−290)およびアスコルビン酸(200μM、Sigma A5960)中、10,000細胞/μlの液滴で、乾燥したPO/LN/FNコートプレートに再播種した。
ヒト胚幹細胞(hES細胞)を底板mesDA前駆細胞に分化させた。プロトコルはKirkbyら、2012、2013を改変し、一方、EBに基づくプロトコルを完全付着培養に改変した(図2)。分化のために、hES細胞をTrypLE(Life Technologies、12563−029)で収穫した。単一細胞を、12ウェルあたり90,000個の細胞密度(23684個/cm2)で、DMEM−F12:MACS Neuro(1:1)、N2サプリメント(1:100、Gibco、17502−48)、NeuroBrew−21(ビタミンAなし)(1:50、Miltenyi Biotec 130−097−263)、2mM L−グルタミンを含む神経誘導培地(培地1)中、Laminin−111(Biolamina、LN111)上に播種した。最初の2日間はROCKインヒビター(チアゾビビン 2μM、Miltenyi Biotec 130−104−461)を加えた。4日目に、DMEM−F12:MACS Neuro(1:1)、N2サプリメント(1:200)、NeuroBrew−21(ビタミンAなし)(1:100)、および2mM L−グルタミンを含む神経増殖培地(培地2)に培地を交換した。0日目から9日目まで、以下の神経誘導因子およびパターニング因子が存在した。SB431542(10μM、Miltenyi Biotec 130−105−336)、ノギン(100ng/ml、Miltenyi Biotec 130−103−456)、CHIR99021(0.7μM、Miltenyi Biotec 130−103−926)、hSHH−C24−II(600ng/ml、Miltenyi Biotec 130−095−727)。9日目に、FGF8b(100ng/ml、Miltenyi Biotec 130−095−740)を加えた。分化の11日目に、細胞をTrypLEで単一細胞に解離し、MACS Neuro培地、NeuroBrew−21(ビタミンAなし)(1:50)、2mM L−グルタミン(培地3)中、800,000細胞/cm2の密度で、Laminin−111でコートしたプレートに再播種した。さらに、BDNF(20ng/ml、Miltenyi Biotec 130−096−286)およびアスコルビン酸(200μM、Sigma A5960)を加えた(図2)。
− 抗FoxA2−APC、
− 抗Otx2−FITC、
− 抗Pax6−PE、
− 抗Nkx6.1−AlexaFluoro647。
実施例2に記載した分化プロトコルに従って、人工多能性ヒト幹細胞(iPS細胞)を底板mesDA前駆細胞に分化させた。0日目から9日目まで、以下の神経誘導因子およびパターニング因子が存在した。SB431542(10μM、Miltenyi Biotec 130−105−336)、ノギン(100ng/ml、Miltenyi Biotec 130−103−456)、CHIR99021(1μM、Miltenyi Biotec 130−103−926)、hSHH−C24−II(400ng/ml、Miltenyi Biotec 130−095−727)。分化の11日目に、細胞をTrypLEで単一細胞に解離し、MACS Neuro培地、NeuroBrew−21(ビタミンAなし)(1:50)、2mM L−グルタミン(培地3)中、800,000細胞/cm2の密度で、Laminin−111でコートしたプレートに再播種した。さらに、FGF8b(100ng/ml、Miltenyi Biotec、130−095−740)、BDNF(20ng/ml、Miltenyi Biotec 130−096−286)およびアスコルビン酸(200μM、Sigma A5960)を加えた。
実施例2に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。細胞を腹側前脳、背側前脳、および腹側後脳の同一性に向けてパターン化するため、パターン化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130−103−926)およびhSHH−C24−II(Miltenyi Biotec 130−095−727)を種々の濃度で適用した。
A 腹側前脳:CHIR99021:0μM、hSSH−C24−II:800ng/ml
B 背側前脳:CHIR99021:0μM、hSSH−C24−II:0ng/ml
C 腹側後脳:CHIR99021:4μM、hSSH−C24−II:800ng/ml
− 抗FoxA2−APC、抗Otx2−FITC、抗IAP−PE
− 抗Pax6−PE、抗Oct3/4−APC、抗Ki−67−FITC
− 抗Nkx6.1−AlexaFluor647、抗Nkx2.1−AlexaFluor488、抗Sox1−PE
実施例2に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。それぞれ0.7μMおよび600ng/mlの濃度のパターン化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130−103−926)およびhSHH−C24−II(Miltenyi Biotec 130−095−727)を適用した。
− 抗FoxA2−APC、抗Otx2−FITC
− 抗Pax6−PE、抗Oct3/4−APC
− 抗Nkx6.1−AlexaFluor647、抗Nkx2.1−AlexaFluor488
実施例2に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。それぞれ0.7μMおよび600ng/mlの濃度のパターン化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130−103−926)およびhSHH−C24−II(Miltenyi Biotec 130−095−727)を適用した。
− 抗FoxA2−APC、抗Otx2−FITC、抗IAP−PE
− 抗Pax6−PE、抗Oct3/4−APC、抗KI−67−FITC
− 抗Nkx6.1−AlexaFluor647、抗Nkx2.1−AlexaFluor488、抗Sox1−PE
実施例2に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。それぞれ0.7μMおよび600ng/mlの濃度のパターン化因子CHIR99021(Miltenyi Biotec 130−103−926)およびhSHH−C24−II(Miltenyi Biotec 130−095−727)を適用した。
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Claims (14)
- ヒト底板mesDA前駆細胞を含む細胞組成物を分析するインビトロの方法であって、
a)前記細胞組成物の細胞またはその試料の細胞を抗原FOXA2、OTX2、PAX6、およびNKX6.1に特異的な抗原結合分子と接触させることにより、前記細胞組成物または前記試料の細胞を標識するステップ、
b)前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定するステップであって、前記細胞のタンパク質発現プロファイルが、
前記細胞の80〜100%がFOXA2について陽性、
前記細胞の80〜100%がOTX2について陽性、
前記細胞の10%未満がPAX6について陽性、および
前記細胞の10%未満がNKX6.1について陽性
であれば、前記細胞組成物の細胞をヒト底板mesDA前駆細胞として適格とするステップ
を含む方法。 - ステップa)において、前記細胞がOCT3/4陽性細胞に由来する場合は、前記細胞をさらに抗原OCT3/4に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップb)において、前記細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
前記細胞の0.1%未満がOCT3/4に陽性である
ことをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - ステップa)において、前記細胞をさらに抗原NKX2.1に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップb)において、前記細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
前記細胞の5〜90%がNKX2.1について陽性である
ことをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - ステップa)において、前記細胞をさらに、抗原KI−67、IAP、およびSOX1からなる群から選択される抗原に特異的な少なくとも1つの抗原結合分子と接触させ、ステップb)において、前記細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
ステップa)においてKI−67に特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞の10〜90%がKI−67について陽性であり、
ステップa)においてIAPに特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞の80〜100%がIAPについて陽性であり、
ステップa)においてSOX1に特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞の10%未満がSOX1について陽性である、
ことをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抗原結合分子が蛍光色素にコンジュゲートされており、前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定する前記ステップが、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学法によって行なわれる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 底板mesDA前駆細胞を含む前記細胞組成物が、底板mesDA前駆細胞に変換され得る細胞からインビトロ分化プロセスによって産生される、または産生過程にある、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 底板mesDA前駆細胞に変換され得る前記細胞が、ヒトiPS細胞、ヒト胚幹細胞、またはダイレクトリプログラミングされたヒト体細胞からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記抗原結合分子が抗体またはその抗原結合断片である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 抗原FOXA2、OTX2、PAX6、およびNKX6.1に特異的な抗原結合分子を含む、ヒト底板mesDA前駆細胞のタンパク質プロファイルを解析するためのキット。
- 抗原Oct3/4に特異的な抗原結合分子をさらに含む、請求項9に記載のキット。
- 抗原NKX2.1に特異的な抗原結合分子をさらに含む、請求項9または10に記載のキット。
- 抗原KI−67、IAP、およびSOX1に特異的な抗原結合分子をさらに含む、請求項9から11のいずれか一項に記載のキット。
- 前記抗原結合分子が抗体またはその抗原結合断片である、請求項9から12のいずれか一項に記載のキット。
- 前記抗原結合分子が蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項9から13のいずれか一項に記載のキット。
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