JP7125977B2 - 底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞の単一細胞タンパク質発現プロファイリングの方法 - Google Patents

底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞の単一細胞タンパク質発現プロファイリングの方法 Download PDF

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Description

本発明に繋がる研究は、助成金契約第６０２２７８号として、欧州連合の第７次フレームワークプログラムＦＰ７／２００７－２０１３からの資金を受けている。
技術分野
本発明は、ヒト底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞の単一細胞レベルにおけるタンパク質発現プロファイルを解析する方法に関する。
中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは神経伝達物質であるドーパミンを分泌し、認知、記憶処理、運動制御、および運動等の様々な脳の機能において中心的な役割を果たしている。
これらは３つの明確な核、すなわち、黒質緻密部（Ａ９群）、腹側被蓋領域（Ａ１０群）、および赤核後部野（Ａ８群）に見出される。中脳の黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるＡ９群の細胞体は、尾状核被殻、背外側線条体を刺激して黒質線条体経路を形成し、これが、投射するドーパミン作動性ニューロンからのドーパミンの制御放出によって運動機能を調節する。黒質におけるＡ９ドーパミン作動性ニューロンの変性は、ドーパミン系の機能不全および障害パーキンソン病（ＰＤ）として記載されるいくつかの運動徴候に主として関わっている。ＰＤには他のニューロンのサブタイプの変性も関与しているが、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンの損失がＰＤの症状に主として関わっており、細胞置換療法の一次的な目標となっている。
胎児発生の間、これらのＤＡニューロンの前駆体は、発生する中脳の腹側神経管で形成される。いわゆる底板領域からの前駆細胞は、転写因子ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＯＴＸ２の発現を特徴とする。これらの細胞はＤＡ ＳＮｐｃニューロン（Ａ９群）およびＤＡ腹側被蓋領域ニューロン（Ａ１０群）を生じる。胎児中脳から切除してパーキンソン患者の線条体に移植した胎児細胞は、線条体を機能的に再刺激し、ドーパミン作動性ニューロンの機能を復活させることが示された（Ｂａｒｋｅｒ、２０１３；Ｋｅｆａｌｏｐｏｕｌｏｕ、２０１４）。しかし、胎児ＤＡ前駆体が入手困難であることと、この組織を用いることへの倫理的および運搬上の懸念があることから、これに代わる細胞源の必要性が強調された。
過去数年間において、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の腹側中脳（ｍｅｓ）ドーパミン作動性（ＤＡ）前駆細胞への分化の成功のために重要な因子が同定され、治療に関連するｍｅｓＤＡニューロン発生のインビトロ分化プロトコルのための種々のプロトコルをもたらしたが（Ｋｒｉｋｓ、２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１２；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１３；Ｇｒｅａｌｉｈ、２０１４；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１７）、それは、交接後６～７．５週のヒト胚の腹側中脳の複雑な組成と類似しているので、ＰＤの場合における臨床使用のための最も有望な細胞集団である（ＥＰ３０６１８０９）。
様々な研究によって、胚幹細胞から分化したｍｅｓＤＡ前駆細胞が、ｉ）サブタイプ特異的成熟、ｉｉ）ラットパーキンソンモデルにおける統合および投射の能力、ｉｉｉ）ＤＡ放出の調節、およびｉｖ）パーキンソン症状の機能の回復に関して、ヒト胎児腹側中脳由来の細胞と同じ特徴を有することが示唆されている（Ｇｒｅａｌｉｓｈ、２０１４；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１２）。
プロトコルは、中脳へと運命付ける尾部化パターニングのためのＷＮＴシグナル伝達を誘導するグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の化学的阻害による神経変換および領域形成のための二重のＳＭＡＤ阻害ならびに腹側へと運命付けるパターニングのためのソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達の活性化に基づいている（Ｋｉｒｋｂｙ、２０１３）。
プロトコルはドーパミン作動性ニューロン前駆細胞の産生のために最適化されているが、製造された細胞のロット間の相違は避けられない。分化のプロセスは高度に複雑で微妙な手順であり、実験結果は僅かな変動（たとえば使用者による取扱いの変動、細胞密度、分化の開始の前の細胞株、継代数および培養条件等の出発時の細胞組成の変動、ならびに増殖因子の能力等）に影響され得るので、インビトロで分化した細胞培養は、望ましくない細胞の運命または分化のステージを有する細胞を含む可能性があることが知られている。
したがって、ＧＭＰグレードのＰＳＣ／ｉＰＳＣ由来のｍｅｓＤＡニューロンの産生における１つのニーズは、細胞のロットの同一性および純度を決定することを可能にする包括的な細胞産生物の特徴解析のための信頼できるインビトロアッセイの設定である。さらに、アッセイは、生着して中脳ドーパミン作動性ニューロンに成熟する細胞の能力と相関し、かつ潜在的な腫瘍源性を明らかにしなければならない。
通常、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、およびＯＴＸ２等の中脳底板マーカーが、移植前に細胞のアイデンティティを確認するために用いられている。最近、ＫｉｒｋｂｙらはｑＲＴ－ＰＣＲによる細胞移植の成功を予測することができる１セットのインビトロマーカーを同定した（Ｋｉｒｋｂｙら、２０１７）。ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、およびＯＴＸ２に加えて、移植の成功の結果の予測マーカーはＥＮ１、ＥＴＶ５、ＣＮＰＹ１、ＰＡＸ８、およびＳＰＲＹ１であった。さらに、ＥＰＨＡ３、ＦＥＺＦ１、およびＷＮＴ７Ｂ等の間脳ドメインマーカーは、移植の結果に負に相関していた。しかし、発現は大量の細胞（ｂｕｌｋ ｏｆ ｃｅｌｌｓ）についてｍＲＮＡレベルで解析されていた。これにはいくつかの欠点がある。第１に、遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、それがタンパク質として発現されまたは存在する可能性のみを反映することは周知である。多数の転写後調節機構、翻訳後修飾、ならびにタンパク質およびｍＲＮＡの異なる安定性および代謝回転に基づけば、ｍＲＮＡの実際のタンパク質への変換は起こり得ることも、起こり得ないこともあり、起きたとしても、所定のタンパク質の多数の異なった、僅かに変化した形態をもたらし得る。さらに、遺伝子のｍＲＮＡは所定の時点には検出されないこともある一方、対応するタンパク質は数週間または数か月もまだ存在することがある。したがって、対応するｍＲＮＡを検出することによってある形態のタンパク質の存在を、ネガティブでもポジティブでも、決定的に予測することは可能ではない。重要なことは、調節ＲＮＡおよびリボザイムを除いて、細胞の状態およびその環境に影響を及ぼす機能を発揮するのはタンパク質のみであって、その対応するｍＲＮＡではないということである。
第２に、大量の細胞についての測定は単一細胞の真の状態を反映せず、むしろ単一細胞には存在しない可能性がある平準化された結果を産生する。しかし、所与の混合物中のある割合の細胞のみが対象の細胞または危険に曝されている細胞である可能性があるので、大量解析は、細胞混合物中における細胞の様々な表現型の真のかつ定量的表現を可能にする感度および識別力を有しない。さらに、ＰＣＲに基づく手法を用いる方法は時間がかかり、汚染を招きやすい。
要するに、単一細胞のタンパク質レベルでの定量的な読み出しを可能にし、対象に移植した後の底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞の細胞プロセッシングおよび生着の成功を予測できる方法へのニーズがある。
本発明は、ＧＭＰ条件の下でも用いることができる、単一細胞レベルでの底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞のタンパク質プロファイリングのための新規でユーザーに優しい標準化された方法について記載する。予期しないことに、本発明者らは、細胞表現型の明確な表現を可能にするタンパク質レベルのマーカーの組合せを発見した。陽性および陰性の底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞マーカーに特異的な抗体－蛍光色素コンジュゲート等の抗原結合分子は、たとえば細胞産生物の同一性の同定のための、分化した底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞の単一細胞の定量的な標準化されたタンパク質プロファイリングをはじめて可能にする約２．５時間以内のフローサイトメトリーアッセイにおいて用いられる。
セットは、抗原結合分子、たとえば本明細書に開示したｍｅｓＤＡニューロンの陽性および陰性マーカー（陽性マーカー：ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＣＤ４７、ＮＫＸ２．１；陰性マーカー：ＯＣＴ３／４、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６．１、ＫＩ－６７）のいくつかまたは全てに特異的なモノクローナル抗体クローンからなる。これらの細胞マーカーのいくつかまたは全てについて陽性または陰性である細胞のパーセンテージは、細胞の表現型および純度の明確な図を表わす。
本発明者らは、発生中の胚の中脳の基底板ならびに後脳で発現されるマーカーＮＫＸ６．１が、分化した幹細胞の集団における後脳前駆体の運命（ｈｉｎｄｂｒａｉｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｆａｔｅｓ）の存在を検出するための驚くほど有効なマーカーであることをさらに発見した。したがって、ＮＫＸ６．１は、側部の中脳および後脳の細胞を中脳の底板パターン化細胞と識別する陰性マーカーとして働く。さらに驚くべきことに、本発明者らは、マーカーＮＫＸ２．１がフローサイトメトリーによってタンパク質レベルで評価するとＰＣＲと比較して異なった発現をすることを発見した。ＮＫＸ２．１のｍＲＮＡは底板中脳ドーパミン作動性ニューロンには存在しないが、本発明者らは、ヒトｍｅｓＤＡ前駆細胞への変換の後、かなりのパーセンテージのＮＫＸ２．１陽性細胞が依然として存在することを発見した。したがって、タンパク質レベルでのＮＫＸ２．１の定量によって、底板中脳前駆体の培養におけるバッチ間の変動の可能性をモニタリングすることができる。
まとめると、本発明者らは、本明細書に開示したマーカーの定量および組合せならびにそれぞれのパーセンテージによって、細胞置換療法におけるＰＤに罹患した患者への細胞投与の前に、インビトロで産生された底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞の適格性を認めることが可能になることをはじめて示す。
・ＦＯＸＡ２（８０～１００％、優先的には９０～１００％）
・ＯＴＸ２（８０～１００％、優先的には９０～１００％）
・ＰＡＸ６（１０％未満、優先的には５％未満）
・ＮＫＸ６．１（１０％未満、優先的には５％未満）
・任意選択でＮＫＸ２．１（５～９０％、優先的には５～７０％）
・任意選択でＯＣＴ３／４（０．１％未満）（細胞がＯＣＴ３／４陽性細胞から産生された場合）
この組合せは、以下の３つのマーカーの少なくとも１つ（または全て）に拡張することができる。
・ＫＩ－６７（１０～９０％）
・ＩＡＰ（８０～１００％、優先的には９０～１００％）
・ＳＯＸ１（１０％未満、優先的には５％未満）
ヒト胎児脳の概略図およびマーカー発現である。神経管は吻尾軸および背腹軸に沿って異なった領域に再分割することができる。神経管の最も吻側の部分は前脳と呼ばれ、中脳がこれに続き、最も尾側の部分が後脳を形成する。神経管の最も腹側の部分は底板と呼ばれる。異なった脳の領域の細胞は特定のマーカー発現によって特性解析される（前脳：ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、ＮＫＸ２．１）、腹側中脳：ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ２．１、後脳：ＮＫＸ６．１）。 図式的な分化のプロトコルである。ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞は定義されたプロトコルによって底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化する。プロトコルは、吻尾パターニングのためのＷＮＴシグナル伝達を誘導するＣＨＩＲ９９０２１によるグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害による神経変換および領域形成のための二重のＳＭＡＤ阻害ならびに腹側化パターニングのためのソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ－Ｃ２４ＩＩ）の活性化に基づいている（Ｋｉｒｋｂｙ、２０１２、２０１３）。神経誘導（培地１）、神経増殖（培地２）、および神経分化（培地３）について異なった培地が最適化されている。示されたプロトコルは付着分化プロセスに従う。用いた細胞株に応じてプロトコルは改変することができ、たとえばチアゾビビンの代わりにＹ－２７６３２を加え、１日目ならびに１１日目にＹ－２７６３２を加えることができる。 底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化したヒト胚幹細胞のＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ６．１、およびＰＡＸ６の発現のフローサイトメトリー解析である。 底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化した人工多能性幹細胞のＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ６．１、およびＰＡＸ６の発現のフローサイトメトリー解析である。 分化１６日後の、腹側前脳、背側前脳、または腹側後脳の細胞に向けてパターン化された、多能性幹細胞由来の神経前駆体培養物のＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ６、ＯＣＴ３／４、ＮＫＸ２．１、ＩＡＰ、ＫＩ－６７、およびＳＯＸ１の発現のフローサイトメトリー解析である。 底板ｍｅｓＤＡ細胞に向けて分化した多能性幹細胞培養物における分化４日、８日、１１日、および１６日後のＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ６、ＯＣＴ３／４、およびＮＫＸ２．１の発現のフローサイトメトリー解析である。 分化１１日後の底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞のＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ６．１、およびＰＡＸ６の発現の免疫細胞化学解析である。
本発明は、本明細書に開示した細胞マーカーに関して細胞の発現プロファイルを決定することによる、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞およびおそらくその他の細胞を含む細胞組成物またはその試料の中の前記細胞の同定のために用いることができる細胞マーカーを開示する。
第１の態様では、本発明は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む細胞組成物を分析するインビトロの方法であって、
ａ）前記細胞組成物の細胞またはその試料の細胞を抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な抗原結合分子と接触させることにより、前記細胞組成物または前記試料の細胞を標識するステップ、
ｂ）前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定するステップであって、前記細胞のタンパク質発現プロファイルが、
前記細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＦＯＸＡ２について陽性、
前記細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＯＴＸ２について陽性、
前記細胞の１０％未満、優先的には５％未満がＰＡＸ６について陽性、および
前記細胞の１０％未満、優先的には５％未満がＮＫＸ６．１について陽性
であれば、前記細胞組成物の細胞をヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とするステップ
を含む方法を提供する。
前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
抗原は転写因子であり、前記細胞組成物または前記試料の細胞は、前記抗原結合分子と接触させる前に固定剤および界面活性剤で処理してもよく、したがって前記細胞組成物または前記試料の細胞（ステップａ）は、固定され、透過処理された細胞であってもよい。
前記細胞組成物または前記試料の細胞と抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な蛍光色素コンジュゲート抗原結合分子との接触は連続的に行なってもよく、たとえばまずＦＯＸＡ２に特異的な蛍光色素コンジュゲート抗原結合分子を前記細胞組成物またはその試料の細胞と接触させ、続いてＦＯＸＡ２に特異的な前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定し、本明細書に開示した次のマーカーに特異的な次の蛍光色素コンジュゲート抗原結合分子を続けるなどする。第１の抗原に特異的な抗原結合分子は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合分子を前記細胞組成物またはその試料の細胞と接触させる前に前記細胞組成物またはその試料の細胞から除去するなどしてもよいなど。あるいは、本方法のステップａ）で提供される細胞組成物またはその試料は、いくつかのサブ試料に再分割され、本明細書に開示したマーカーの１つに特異的な各抗原結合分子が、１つのサブ試料の細胞と接触させられる。あるいは、用いられる抗原結合分子が標識された細胞の並行検出を可能にする蛍光色素等の識別可能な検出部分にコンジュゲートされている場合には、本明細書に開示したマーカーに特異的ないくつかまたは全ての抗原結合分子について、ステップａ）で提供された同じ細胞組成物もしくはその試料または本方法のサブ試料は同時に使用される。
前記方法は、ステップａ）において、前記細胞組成物または前記その試料の前記細胞がＯＣＴ３／４陽性細胞に由来する場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞をさらに抗原ＯＣＴ３／４に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の０．１％未満がＯＣＴ３／４について陽性である、ことをさらに含む。
前記抗原ＯＣＴ３／４に特異的な前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
前記方法は、ステップａ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞をさらに、抗原ＮＫＸ２．１に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の５～９０％、優先的には５～７０％がＮＫＸ２．１について陽性である、ことをさらに含む。
前記抗原ＮＫＸ２．１に特異的な前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
前記方法は、ステップａ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞をさらに抗原ＫＩ－６７に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の１０～９０％がＫＩ－６７について陽性である、ことをさらに含む。
前記抗原ＫＩ－６７に特異的な前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
前記方法は、ステップａ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞をさらに抗原ＩＡＰに特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＩＡＰについて陽性である、ことをさらに含む。
前記抗原ＩＡＰに特異的な前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
前記方法は、ステップａ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞をさらに抗原ＳＯＸ１に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の前記タンパク質発現プロファイルにおいてさらに、
前記細胞組成物または前記その試料の細胞の１０％未満、優先的には１％未満がＳＯＸ１について陽性である、ことをさらに含む。
前記抗原ＳＯＸ１に特異的な前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
前記方法は、ステップａ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞をさらに、抗原ＫＩ－６７、ＩＡＰ、およびＳＯＸ１からなる群から選択される抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
ステップａ）においてＫＩ－６７に特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の１０～９０％がＫＩ－６７について陽性であり、
ステップａ）においてＩＡＰに特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＩＡＰについて陽性であり、
ステップａ）においてＳＯＸ１に特異的な抗原結合分子が用いられる場合は、前記細胞組成物または前記その試料の細胞の５％未満、優先的には１％未満がＳＯＸ１について陽性である、ことをさらに含む。
前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
前記方法は、前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞組成物または前記その試料の細胞のパーセンテージを決定する前記ステップが、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学法によって行なわれる。
前記方法は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む前記細胞組成物が、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得るヒト細胞からインビトロ分化プロセスによって産生される、または産生過程にある。
前記底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得る前記ヒト細胞は、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト胚幹細胞、またはダイレクトリプログラミングされたヒト体細胞からなる群から選択されてもよい。
前記抗原結合分子は抗体またはその抗原結合断片であってもよい。
別の態様では、本発明は抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な抗原結合分子を含む、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞のタンパク質プロファイルを解析するためのキットを提供する。
前記キットは、抗原Ｏｃｔ３／４に特異的な抗原結合分子をさらに含む。
前記キットは、抗原ＮＫＸ２．１に特異的な抗原結合分子をさらに含む。
前記キットは、抗原ＫＩ－６７に特異的な抗原結合分子をさらに含む。
前記キットは、抗原ＩＡＰに特異的な抗原結合分子をさらに含む。
前記キットは、抗原ＳＯＸ１に特異的な抗原結合分子をさらに含む。
前記キットは、抗原ＫＩ－６７、ＩＡＰ、およびＳＯＸ１に対する抗原からなる群から選択される抗原に特異的な、少なくとも１つの抗原結合分子をさらに含む。
前記抗原結合分子は、蛍光色素にコンジュゲートされていてもよい。
ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得る多能性幹細胞等の細胞を含む出発細胞組成物からのヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞の産生は当該技術で周知であり、たとえばＫｒｉｋｓ、２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１２；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１３；Ｇｒｅａｌｉｓｈ、２０１５；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１７に開示されている。
定義
他に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語「ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む細胞組成物」は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞、およびたとえば他の神経アイデンティティを有する他の細胞を任意の比で含む（完全な）細胞組成物またはその試料を意味する。
ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む前記細胞組成物は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得るヒト細胞からインビトロ分化プロセスによって産生される、または産生過程にあってもよい。
前記細胞組成物のヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得るヒト細胞、たとえばヒトｉＰＳ細胞、ヒト胚幹細胞、またはダイレクトリプログラミングされたヒト体細胞から、たとえばＫｒｉｋｓ、２０１１；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１２；Ｌａｄｅｗｉｇ、２０１２；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１３；Ｇｒｅａｌｉｓｈ、２０１５；Ｋｉｒｋｅｂｙ、２０１７等の、当該分野で周知の分化またはダイレクトリプログラミングのプロトコルを用いて得られたものでもよい。本明細書に開示した本方法は、幹細胞をヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とされる細胞に分化するこのプロセス中、細胞の状態をモニタリングおよび／または同定するために用いてもよい。
ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む細胞組成物を解析する場合における用語「解析する」は、たとえば細胞組成物または試料の細胞の本明細書に開示した発現プロファイルを決定することによって、前記細胞組成物または前記試料中のヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を同定することを意味する。
試料は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む（完全な）細胞組成物、たとえば１つまたは複数のアリコートから取り出してもよい。次いで、本明細書に開示した方法は、ステップａ）の前に、「前記細胞組成物から試料を用意する」ステップを含んでもよい。
用語「前記細胞、すなわち、前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞組成物の細胞またはその試料の細胞のパーセンテージを決定するステップ」は、本明細書で用いられる場合、細胞組成物中または細胞組成物から取り出された試料中の、それぞれの抗原についてたとえば蛍光標識された細胞の量を決定することを意味し、たとえば前記細胞組成物または前記試料中で１０個のうち９個の細胞が抗原ＦＯＸＡ２で標識されている場合には、細胞組成物または試料の細胞の９０％がＦＯＸＡ２について陽性であり、同じ細胞組成物または試料中で１０個のうち８個の細胞が抗原ＯＴＸ２で標識されている場合には、同じ細胞組成物または試料の細胞の８０％がＯＴＸ２についても陽性である。いくつかまたは全ての細胞がマーカーについて二重陽性であるかどうかは、決定には無関係である。
用語「ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とする」は、本明細書で用いられる場合、ＰＤに罹患した対象に移植した後に線条体を機能的に再刺激して、パーキンソン症状を少なくとも部分的に回復させるまでにドーパミン作動性ニューロンの機能を復活させることができるエクスビボ細胞を意味する。
用語「ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む細胞組成物が、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得るヒト細胞からインビトロ分化プロセスによって産生される、または産生過程にある」は、底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞への分化の成功のために重要な因子を含む分化プロトコルが適用された、または適用される細胞集団の細胞を意味する。したがって、このプロセスによって多能性細胞をヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化させることが可能になるが、このプロセスは望ましくない細胞の運命または分化ステージにある細胞を含むことがある。
ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得るヒト細胞は、ＯＣＴ３／４陽性ヒトｉＰＳ細胞、ＯＣＴ３／４陽性ヒト胚幹細胞、またはＯＣＴ３／４陰性のダイレクトリプログラミングされたヒト体細胞であってもよい。ヒト胚幹細胞は、たとえばＷＯ０３／０４６１４１に開示されているように、破壊せずに胚から単離することができる。
用語「多能性幹細胞」は、本明細書で用いられる場合、自己再生することができ、胎児胚葉の内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかならびにこれに由来する細胞に分化する可能性を有する細胞を意味する。これらの基準は胚幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）について当てはまる。優先的にはこれらの細胞はヒトである。当該分野において、「プライム状態の」多能性幹細胞、「ナイーブ状態の」多能性幹細胞、または「リセット段階の」多能性幹細胞と称される異なった多能性の程度が知られている。
用語、胚幹細胞（ＥＳＣ）は、本明細書で用いられる場合、移植前の早期の段階における胚盤胞の内部細胞集団由来の多能性幹細胞を意味する。ＥＳＣは自己再生することができ、胎児胚葉の内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかならびにこれに由来する細胞に分化する可能性を有する。ＥＳＣは多能性マーカーＯＣＴ３／４の発現を示す。
用語「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、本明細書で用いられる場合、より低い能力を有する細胞、すなわち、より分化した細胞、典型的には体細胞から多能性の状態に変換することによって産生された多能性細胞を意味し、得られた細胞は自己再生することができ、胎児胚葉の内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかならびにこれに由来する細胞に分化する潜在能力を有する。ｉＰＳＣは多能性マーカーＯＣＴ３／４の発現を示す。リプログラミングは、核移植、細胞融合、または因子誘導リプログラミング（すなわち、限定されるものではないが、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８等の１つまたは複数のリプログラミング因子の発現誘導）などの当該分野で既知の方法によって達成することができる。リプログラミング因子は、核酸として、またはウイルス形質導入もしくはトランスフェクションによるタンパク質として導入してもよい。様々な培養条件およびリプログラミング因子の組合せによって、「プライム状態の」多能性幹細胞、「ナイーブ状態の」多能性幹細胞、または「リセット段階の」多能性幹細胞と称される異なった多能性の程度が生じる。
用語「ヒト底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞（ｍｅｓＤＡ）」は、本明細書で用いられる場合、ＦＯＸＡ２（８０～１００％）、ＯＴＸ２（８０～１００％）、ＰＡＸ６（１０％未満）、ＮＫＸ６．１（１０％未満）の発現を特徴とするインビトロ分化細胞を意味する。この組成物は、交接後６～７．５週のヒト胚の腹側中脳に存在するｍｅｓＤＡ前駆体と同様のプロファイルを有する高純度のｍｅｓＤＡ前駆細胞を反映しており、ＰＤ治療における臨床使用のための最も有望な細胞集団である。
細胞は、限定されるものではないが、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、リプログラミング可能な体細胞等の様々な出発細胞組成物からインビトロで得られたものでもよい。
用語「分化」は、本明細書で用いられる場合、細胞の分化を意味し、発生生物学で用いられる用語であり、専門性の低い細胞がより専門性の高い細胞型になるプロセスを記述する。インビトロでは、幹細胞の分化は自発的に起こることがあり、または特別の培養培地、サイトカイン、レセプターアンタゴニストまたは小分子等の分化誘導物質を培養培地に添加することによって意図的に誘導される。また、培養マトリックス、すなわち、細胞培養用具のコーティングを用いて、細胞と接触する様々なタンパク質または化学物質を提供することによって、分化のプロセスを偏らせることができる。
用語「マーカー」は、本明細書で用いられる場合、ある細胞型によって特異的に発現される細胞抗原を意味する。マーカーは、本明細書に開示したＦＯＸＡ２、ＩＡＰ、ＮＫＸ２．１、およびＯＴＸ２等の陽性選択マーカーであってよく、または本明細書で用いたＯＣＴ３／４、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＮＫＸ６．１、ＫＩ－６７等の陰性選択マーカーであってよい。
用語「発現」は、本明細書で用いられる場合、細胞中のプロモーターによって促進される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
「タンパク質発現プロファイル」または細胞集団もしくは細胞組成物もしくはその試料の細胞の「タンパク質シグネチュア」は、これらの細胞によってどの遺伝子が発現されるかを示す。
用語「蛍光色素にコンジュゲートされた抗原結合分子」は、本明細書で用いられる場合、抗原結合分子、たとえば抗体またはその抗原結合断片の蛍光色素へのカップリングまたはコンジュゲーションを意味する。いくつかの場合には、コンジュゲーションは抗原結合分子の蛍光色素への直接的なカップリングまたは結合である。他の場合には、コンジュゲーションは抗原結合分子の蛍光色素への、たとえばビオチンとストレプトアビジンを介する間接的なカップリングまたは結合である。抗原は抗原結合分子（たとえば一次抗体）に結合し、次いでコンジュゲートされた蛍光色素を有する第２の分子（たとえば二次抗体）が抗原結合分子に結合してもよい。
解析の方法には、たとえばフローサイトメトリーに基づく方法または蛍光顕微鏡法が含まれる。
フローサイトメトリーは、たとえば細胞を流体の流れの中に懸濁して電子検出装置に通過させることにより、たとえば細胞の分類およびバイオマーカーの検出において採用される、レーザーまたはインピーダンスに基づく生物物理学的技術である。これにより、１秒あたり数千個までの粒子の物理的および化学的な特性の同時かつ多パラメーターの解析が可能になる。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ(商標)）は、フローサイトメトリーの特殊型である。それにより、それぞれの細胞の特定の光散乱および蛍光特性に基づいて、生物学的細胞の不均一な混合物を一度に１個、２つ以上の容器に分類する方法が提供される。
免疫細胞化学法（ＩＣＣ）は、たとえば特定のタンパク質または抗原に結合する特定の一次抗体を用いて、細胞中のタンパク質または抗原の局在を解剖学的に可視化するために用いられる一般的な実験室的手法である。一次抗体によって、これが蛍光色素に直接コンジュゲートされる場合、またはたとえばコンジュゲートされた蛍光色素を有する二次抗体に結合している場合に、蛍光顕微鏡下にタンパク質を可視化することができる。ＩＣＣによって、特定の試料中の細胞が問題の抗原を発現しているか否かを評価することができる。
用語「抗原結合分子」は、本明細書で用いられる場合、細胞の所望の標的分子、すなわち、抗原に、好ましくは結合し、または特異的である任意の分子を意味する。用語「抗原結合分子」は、たとえば抗体またはその抗原結合断片を含む。
用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を意味し、これらは当業者に周知の方法で産生することができる。抗体は任意の種、たとえばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトのものであってもよい。
用語「抗体」は、未変性の分子およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体等の抗体断片（抗原結合断片）の両方を含む。さらに、用語「抗原結合分子」は、細胞の所望の標的分子に優先的に結合する抗体またはその抗原結合断片以外の任意の分子を含む。好適な分子には、限定なしに、所望の標的分子に結合するアプタマーとして知られるオリゴヌクレオチド、炭水化物、レクチン、または他の任意の抗原結合タンパク質（たとえば受容体－リガンド相互作用）が含まれる。抗体と蛍光色素との間の連結（カップリング）は、共有結合でも非共有結合でもよい。非共有連結はたとえばビオチン－アビジンを介する。抗体を蛍光色素にカップリングする方法は当業者には周知である。
用語「特異的に結合する」または「～に特異的な」は、抗原結合分子、たとえば抗体またはその抗原結合断片に関しては、本明細書に開示したように細胞組成物または試料中の特定の抗原を認識してこれに結合するが、前記細胞組成物または前記試料中の他の抗原は実質的に認識せず、これと結合しない抗原結合分子（抗原結合ドメインに対する抗体またはその断片の場合）を意味する。１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体またはその断片の抗原結合ドメインは、別の種からのその抗原にも結合し得る。この異種間反応性は、本明細書で用いられる「～に特異的」の定義に反しない。ある抗原に特異的に結合する抗体またはその断片の抗原結合ドメインは、前記抗原の様々なバリアント（アレレバリアント、スプライスバリアント、アイソフォーム、その他）にも実質的に結合し得る。この交差反応性は、抗原に対して特異的であるとの抗原結合ドメインの定義に反しない。
フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、ヒトではＦＯＸＡ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ホメオボックスタンパク質ＯＴＸ２は、ヒトではＯＴＸ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ペアードボックスタンパク質ＰＡＸ６は、ヒトではＰＡＸ６遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ホメオボックスタンパク質ＮＫＸ６．１（ＮＫＸ６－１も）は、ヒトではＮＫＸ６－１遺伝子によってコードされるタンパク質である。
Ｏｃｔ－３／４（オクタマー結合転写因子３／４、Ｏｃｔ－３またはＯｃｔ－４としても知られている）は、ヒトではＰＯＵ５Ｆ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ＮＫ２ホメオボックス１（ＮＫＸ２－１、ＮＫＸ２．１、またはＴＴＦ－１）は、ヒトではＮＫＸ２－１遺伝子によってコードされるタンパク質である。
抗原ＫＩ－６７は、Ｋｉ－６７またはＭＫＩ６７としても知られており、ヒトではＭＫＩ６７遺伝子によってコードされるタンパク質（モノクローナル抗体 抗Ｋｉ－６７によって同定される抗原）である。
ＩＡＰ（インテグリン関連タンパク質）はＣＤ４７（分化のクラスター４７）としても知られており、ヒトではＣＤ４７遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質である。
ＳＯＸ１は、ＨＭＧ（高移動性群）ＤＮＡ結合ドメインにおける転写因子をコードする遺伝子であり、神経発生において一次的に機能する。
実施形態
本発明の第１の実施形態では、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含んでいることが予想される細胞組成物から、１つの試料またはいくつかの試料を取り出す。細胞組成物の細胞を、たとえば実施例１に記載した胚様体（ＥＢ）に基づくプロトコルを用いて、ヒトｉＰＳ細胞からヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞にインビトロで分化した。
分化状態をモニタリングするため、分化の手順を開始した後のいくつかの時点、たとえば４、６、８、１１、１４、１６、および／または１８日目に、前記細胞組成物から前記試料を取り出す。固定および透過処理の後、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗原結合分子に試料の細胞を接触させ、それにより前記試料の細胞を標識する。任意選択で、抗原ＯＣＴ３／４、ＮＫＸ２．１、ＫＩ－６７、ＩＡＰ、ＳＯＸ１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた以下の抗原結合分子の１つ、それ以上、または全てにも、前記試料を接触させる。試料の細胞のタンパク質発現プロファイルを、たとえばフローサイトメトリーによって決定する。
以下のタンパク質発現プロファイルを示す試料の細胞は、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞としての試料の細胞として適格とされる。
前記試料の細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＦＯＸＡ２について陽性である。
前記試料の細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＯＴＸ２について陽性である。
前記試料の細胞の１０％未満、優先的には５％未満がＰＡＸ６について陽性である。
前記試料の細胞の１０％未満、優先的には５％未満がＮＫＸ６．１について陽性である。
また任意選択で、
前記試料の細胞の０．１％未満がＯＣＴ３／４について陽性であり、および／または
前記試料の細胞の５～９０％、優先的には５～７０％がＮＫＸ２．１について陽性であり、および／または
前記試料の細胞の１０～９０％がＫＩ－６７について陽性であり、および／または
前記試料の細胞の８０～１００％、優先的には９０～１００％がＩＡＰについて陽性であり、および／または
前記試料の細胞の１０％未満、優先的には５％未満がＳＯＸ１について陽性である。
前記試料の細胞は、その試料が取り出された前記細胞組成物中の細胞の組成を反映している。したがって、たとえば分化プロセス後１６日目に取り出された試料が上に示したタンパク質発現プロファイルを示すならば、その細胞組成物の細胞はヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とされ、たとえばパーキンソン病について治療を必要とする患者に移植してもよい。これらの細胞は、移植後に線条体に統合されてドーパミン作動性ニューロンの機能を復活させる可能性を有する底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とされる。
本発明の別の実施形態では、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含んでいることが予想される細胞組成物から、１つの試料またはいくつかの試料を取り出す。細胞組成物の細胞を、たとえば実施例１に記載したＥＢに基づくプロトコルを用いて、ヒトｉＰＳ細胞からヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞にインビトロで分化させた。
分化状態をモニタリングするため、分化手順を開始した後のいくつかの時点、たとえば４、６、８、１１、１４、１６、および／または１８日目に、前記細胞組成物から前記試料を取り出す。試料の細胞を再分割し、底板ｍｅｓＤＡ分化前駆細胞のタンパク質発現プロファイリングについて記載したマーカーの組合せと接触させる。
たとえば、抗原ＦＯＸＡ２に特異的でＡＰＣにカップリングした抗体の染色を、ＩＡＰに特異的でＰＥにカップリングした抗体およびＯＴＸに特異的でＦＩＴＣにカップリングした抗体と組み合わせる。さらに、ＰＡＸ６、ＯＣＴ３／４、ＫＩ－６７、およびＮＫＸ２．１、ＮＫＸ６．１、ＳＯＸ１を組み合わせる一方、組み合わせた抗体を様々な蛍光色素とコンジュゲートする。
本発明の１つの実施形態では、細胞組成物の細胞を、たとえば実施例２に記載した付着分化プロトコルを用いて、ｉＰＳ細胞またはヒト胚幹細胞等のヒト多能性幹細胞からヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞にインビトロで分化させる。
細胞のタンパク質発現プロファイルを、いくつかの時点の後で、上述のように決定する。前記試料の細胞は、その試料が取り出された前記細胞組成物中の細胞の組成を反映している。したがって、たとえば分化プロセス後１６日目に取り出された試料が本発明に記載したタンパク質発現プロファイルを示すならば、その細胞組成物の細胞は、移植後に線条体に統合されてドーパミン作動性ニューロンの機能を復活させる可能性を有する底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とされる。
本発明の別の実施形態では、細胞組成物の細胞を、たとえば実施例２に記載した付着分化プロトコルを用いて、ヒトＥＳ細胞からヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞にインビトロで分化させた。
完全な細胞組成物を、底板ｍｅｓＤＡ分化前駆細胞のタンパク質発現プロファイリングについて本明細書に開示したマーカーの組合せと接触させる。
たとえば、抗原ＦＯＸＡ２に特異的でＡＰＣにカップリングした抗体の染色を、ＩＡＰに特異的でＰＥにカップリングした抗体およびＯＴＸに特異的でＦＩＴＣにカップリングした抗体と組み合わせる。さらに、ＰＡＸ６、ＫＩ－６７、およびＮＫＸ２．１、ＮＫＸ６．１、ＳＯＸ１を組み合わせる一方、組み合わせた抗体を様々な蛍光色素とコンジュゲートする。
細胞組成物の細胞の染色が本明細書に開示したタンパク質発現プロファイルを生じるならば、分化のプロトコルによって治療に関連するｍｅｓＤＡニューロンの産生が可能になることが示される。
本発明の１つの実施形態では、細胞組成物の細胞は、当技術で既知の方法（プロトコル）によって、ＯＣＴ３／４陰性ヒト体細胞からヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞にダイレクトリプログラミングされる。
分化状態をモニタリングするため、分化の手順を開始した後のいくつかの時点、たとえば４、６、８、１１、１４、１６、および／または１８日目に、前記細胞組成物から前記試料を取り出す。試料の細胞を再分割し、底板ｍｅｓＤＡ分化前駆細胞のタンパク質発現プロファイリングについて記載したマーカーの組合せと接触させる。
たとえば、抗原ＦＯＸＡ２に特異的でＡＰＣにカップリングした抗体の染色を、ＩＡＰに特異的でＰＥにカップリングした抗体およびＯＴＸに特異的でＦＩＴＣにカップリングした抗体と組み合わせる。さらに、ＰＡＸ６、ＫＩ－６７、およびＮＫＸ２．１、ＮＫＸ６．１、ＳＯＸ１を組み合わせる一方、組み合わせた抗体を様々な蛍光色素とコンジュゲートする。
本発明の別の実施形態では、たとえば実施例２に記載した付着分化プロトコルを用いて底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を産生させ、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗原結合分子を用いて、分化の１６日後に免疫細胞化学法によって解析する。
実施例１：胚葉体（ＥＢ）形成に基づくヒト胚幹細胞の底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞への分化およびインビトロ１６日後のフローサイトメトリーを用いられる単一細胞タンパク質プロファイリング
ヒト胚幹細胞を底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化させた。プロトコルはＫｉｒｋｂｙら、２０１２、２０１３を改変した。分化のために、ヒト胚幹細胞をＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２５６３－０２９）で収穫した。単一細胞を低付着プレートに播種し（２×１０６／２ｍｌ／６ウェル）、ＤＭＥＭ－Ｆ１２：ＭＡＣＳ Ｎｅｕｒｏ（１：１）、Ｎ２サプリメント（１：１００、Ｇｉｂｃｏ、１７０５２－４８）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（ビタミンＡなし）（１：５０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９７－２６３）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン中でＥＢを形成させた。最初の２日間はＲＯＣＫインヒビター（チアゾビビン ２μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０４－４６１）を加えた。４日目に、ポリオルニチン（ＰＯ、１５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｐ３６５５）、フィブロネクチン（ＦＮ、５μｇ／ｍｌ、ＢＩＯＰＵＲ ＡＧ １１－５０－１１０４）およびラミニン（ＬＮ、５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｌ２０－２０）でコートしたプラスチック器具に細胞を播種した。０日目から９日目まで、以下の神経誘導因子およびパターニング因子が存在した。ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０５－３３６）、ＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２５）、ＣＨＩＲ９９０２１（０．８μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）、ｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）。２日目から９日目まで、培地にプルモルファミン（０．５μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０４－４６５）を加えた。分化の１１日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、ＭＡＣＳ Ｎｅｕｒｏ培地、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（ビタミンＡなし）（１：５０）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９６－２８５）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９６－２９０）およびアスコルビン酸（２００μＭ、Ｓｉｇｍａ Ａ５９６０）中、１０，０００細胞／μｌの液滴で、乾燥したＰＯ／ＬＮ／ＦＮコートプレートに再播種した。
分化プロセスの１１日目に単一細胞タンパク質発現プロファイリングを行なった。そのため、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させ、それにより前記試料の細胞を標識した。
手短かに述べると、細胞を固定し、ＦｏｘＰ３緩衝液セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９３－１４２）を用いて透過処理した。次いで、０．５×１０Ｅ６個の細胞を用いて、様々な蛍光色素に連結したＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーによって陽性細胞のパーセンテージを決定して、細胞が本発明によるヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞としてそれらを適格とするタンパク質発現プロファイルを示すか否かを解析した。
実施例２：ヒト胚幹細胞の底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞への付着分化およびインビトロ１６日後のフローサイトメトリーを用いる単一細胞タンパク質プロファイリング
ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）を底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化させた。プロトコルはＫｉｒｋｂｙら、２０１２、２０１３を改変し、一方、ＥＢに基づくプロトコルを完全付着培養に改変した（図２）。分化のために、ｈＥＳ細胞をＴｒｙｐＬＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２５６３－０２９）で収穫した。単一細胞を、１２ウェルあたり９０，０００個の細胞密度（２３６８４個／ｃｍ２）で、ＤＭＥＭ－Ｆ１２：ＭＡＣＳ Ｎｅｕｒｏ（１：１）、Ｎ２サプリメント（１：１００、Ｇｉｂｃｏ、１７５０２－４８）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（ビタミンＡなし）（１：５０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９７－２６３）、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含む神経誘導培地（培地１）中、Ｌａｍｉｎｉｎ－１１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ、ＬＮ１１１）上に播種した。最初の２日間はＲＯＣＫインヒビター（チアゾビビン ２μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０４－４６１）を加えた。４日目に、ＤＭＥＭ－Ｆ１２：ＭＡＣＳ Ｎｅｕｒｏ（１：１）、Ｎ２サプリメント（１：２００）、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（ビタミンＡなし）（１：１００）、および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含む神経増殖培地（培地２）に培地を交換した。０日目から９日目まで、以下の神経誘導因子およびパターニング因子が存在した。ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０５－３３６）、ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－４５６）、ＣＨＩＲ９９０２１（０．７μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）、ｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（６００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）。９日目に、ＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７４０）を加えた。分化の１１日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、ＭＡＣＳ Ｎｅｕｒｏ培地、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（ビタミンＡなし）（１：５０）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（培地３）中、８００，０００細胞／ｃｍ２の密度で、Ｌａｍｉｎｉｎ－１１１でコートしたプレートに再播種した。さらに、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９６－２８６）およびアスコルビン酸（２００μＭ、Ｓｉｇｍａ Ａ５９６０）を加えた（図２）。
分化プロセスの１６日目に単一細胞タンパク質発現プロファイリングを行なった。そのため、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させ、それにより前記試料の細胞を標識した。
手短かに述べると、細胞を固定し、ＦｏｘＰ３緩衝液セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９３－１４２）を用いて透過処理した。次いで、以下の抗体コンジュゲートを用いて細胞を染色した。ここでそれぞれの染色に０．５×１０Ｅ６個の細胞を用いた。
－ 抗ＦｏｘＡ２－ＡＰＣ、
－ 抗Ｏｔｘ２－ＦＩＴＣ、
－ 抗Ｐａｘ６－ＰＥ、
－ 抗Ｎｋｘ６．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒｏ６４７。
フロー解析により、ＦＯＸＡ２で９２．６％、ＯＴＸ２で９３．１％、ＰＡＸ６で０．８３％、ＮＫＸ６．１で２．６％の陽性細胞が示された。
まとめると、細胞は、本発明によるヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞としてそれらを適格とするタンパク質発現プロファイルを示した（図３）。
実施例３：人工多能性幹細胞の底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞への付着分化およびインビトロ１６日後のフローサイトメトリーを用いる単一細胞タンパク質プロファイリング
実施例２に記載した分化プロトコルに従って、人工多能性ヒト幹細胞（ｉＰＳ細胞）を底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に分化させた。０日目から９日目まで、以下の神経誘導因子およびパターニング因子が存在した。ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０５－３３６）、ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－４５６）、ＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）、ｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（４００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）。分化の１１日目に、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、ＭＡＣＳ Ｎｅｕｒｏ培地、ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１（ビタミンＡなし）（１：５０）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（培地３）中、８００，０００細胞／ｃｍ２の密度で、Ｌａｍｉｎｉｎ－１１１でコートしたプレートに再播種した。さらに、ＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９５－７４０）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９６－２８６）およびアスコルビン酸（２００μＭ、Ｓｉｇｍａ Ａ５９６０）を加えた。
分化プロセスの１６日目に単一細胞タンパク質発現プロファイリングを行なった。そのため、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させ、それにより前記試料の細胞を標識した。
フロー解析により、ＦＯＸＡ２で９３．８％、ＯＴＸ２で９４．４％、ＰＡＸ６で１．３％、ＮＫＸ６．１で１．２％の陽性細胞が示された。
まとめると、細胞は、本発明によるヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞としてそれらを適格とするタンパク質発現プロファイルを示した（図４）。
実施例４：様々な濃度のＣＨＩＲによるヒト胚幹細胞の付着分化およびインビトロ１６日後のフローサイトメトリーを用いる単一細胞タンパク質プロファイリング
実施例２に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。細胞を腹側前脳、背側前脳、および腹側後脳の同一性に向けてパターン化するため、パターン化因子ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）およびｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）を種々の濃度で適用した。
Ａ 腹側前脳：ＣＨＩＲ９９０２１：０μＭ、ｈＳＳＨ－Ｃ２４－ＩＩ：８００ｎｇ／ｍｌ
Ｂ 背側前脳：ＣＨＩＲ９９０２１：０μＭ、ｈＳＳＨ－Ｃ２４－ＩＩ：０ｎｇ／ｍｌ
Ｃ 腹側後脳：ＣＨＩＲ９９０２１：４μＭ、ｈＳＳＨ－Ｃ２４－ＩＩ：８００ｎｇ／ｍｌ
分化プロセスの１６日目に単一細胞タンパク質発現プロファイリングを行なった。そのため、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、固定して、ＦｏｘＰ３緩衝液セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９３－１４２）を用いて透過処理した。次いで、細胞を３つのサブ試料に再分割して、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＮＫＸ６．１、ＯＣＴ３／４、ＮＫＸ２．１、ＩＡＰ、ＫＩ－６７、ＳＯＸ１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させた。ここでそれぞれの染色に０．５×１０Ｅ６個の細胞を用いた。
３つの抗原結合分子の同時染色のため、以下の抗体蛍光色素を組み合わせた。
－ 抗ＦｏｘＡ２－ＡＰＣ、抗Ｏｔｘ２－ＦＩＴＣ、抗ＩＡＰ－ＰＥ
－ 抗Ｐａｘ６－ＰＥ、抗Ｏｃｔ３／４－ＡＰＣ、抗Ｋｉ－６７－ＦＩＴＣ
－ 抗Ｎｋｘ６．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、抗Ｎｋｘ２．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、抗Ｓｏｘ１－ＰＥ
様々な試料中でＦＯＸＡ２の発現が８０％未満、背側前脳および後脳試料でＰＡＸ６の発現が１０％超、腹側前脳試料のＮＫＸ２．１の発現が９０％超、腹側後脳試料でＯＴＸ２が８０％未満、ならびにＮＫＸ６．１の発現が１０％超で、細胞は底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞表現型を示さず、移植には適格ではないことが明らかに示された（図１、図５）。
実施例５：ヒト胚幹細胞の底板中脳ドーパミン作動性前駆細胞への付着分化およびインビトロ４、８、１１、および１６日後のフローサイトメトリーを用いる単一細胞タンパク質プロファイリング
実施例２に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。それぞれ０．７μＭおよび６００ｎｇ／ｍｌの濃度のパターン化因子ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）およびｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）を適用した。
分化プロセスの４、８、１１、および１６日目に単一細胞タンパク質発現プロファイリングを行なった。そのため、細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離し、固定して、ＦｏｘＰ３緩衝液セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９３－１４２）を用いて透過処理した。次いで、細胞を３つのサブ試料に再分割して、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＮＫＸ６．１、ＯＣＴ３／４、ＮＫＸ２．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させた。ここでそれぞれの染色に０．５×１０Ｅ６個の細胞を用いた。
３つの抗原結合分子の同時染色のため、以下の抗体蛍光色素を組み合わせた。
－ 抗ＦｏｘＡ２－ＡＰＣ、抗Ｏｔｘ２－ＦＩＴＣ
－ 抗Ｐａｘ６－ＰＥ、抗Ｏｃｔ３／４－ＡＰＣ
－ 抗Ｎｋｘ６．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、抗Ｎｋｘ２．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８
フローサイトメトリー解析により、細胞は、本発明による分化の４日目、８日目、および１６日目に、底板ドーパミン作動性ニューロンとしてそれらを適格とする発現プロファイルと類似していなかったことが示された。分化プロセスの１１日目の細胞のみが、本発明によるヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞としてそれらを適格とするタンパク質発現プロファイルを示した（図６）。
実施例６：ラットにおける移植研究のためのヒト胚幹細胞の付着分化
実施例２に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。それぞれ０．７μＭおよび６００ｎｇ／ｍｌの濃度のパターン化因子ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）およびｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）を適用した。
分化プロセスの１６日目に細胞をＴｒｙｐＬＥで単一細胞に解離した。試料を取り出して細胞を固定し、ＦｏｘＰ３緩衝液セット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９３－１４２）を用いて透過処理した。次いで、細胞を３つのサブ試料に再分割して、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ＮＫＸ６．１、ＯＣＴ３／４、ＮＫＸ２．１、ＩＡＰ、ＫＩ－６７、ＳＯＸ１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させた。ここでそれぞれの染色に０．５×１０Ｅ６個の細胞を用いた。
３つの抗原結合分子の同時染色のため、以下の抗体蛍光色素を組み合わせた。
－ 抗ＦｏｘＡ２－ＡＰＣ、抗Ｏｔｘ２－ＦＩＴＣ、抗ＩＡＰ－ＰＥ
－ 抗Ｐａｘ６－ＰＥ、抗Ｏｃｔ３／４－ＡＰＣ、抗ＫＩ－６７－ＦＩＴＣ
－ 抗Ｎｋｘ６．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、抗Ｎｋｘ２．１－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、抗Ｓｏｘ１－ＰＥ
底板ドーパミン作動性ニューロンとして適格とする発現プロファイルを示した分化した生細胞の試料と、底板ドーパミン作動性ニューロンとして適格とする発現プロファイルと類似しない分化した生細胞の試料を、ラットへの移植研究に用いた。インビボ移植の後、第１の試料は良好な生着およびドーパミン作動性ニューロンの高い収率と相関した一方、第２の試料はインビボでドーパミン作動性ニューロンの顕著に低い収率を生じた。
実施例７：分化１６日後のＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＮＫＸ６．１、およびＰＡＸ６の発現の免疫細胞化学解析
実施例２に記載した付着分化プロトコルに従って、ヒト胚幹細胞を分化させた。それぞれ０．７μＭおよび６００ｎｇ／ｍｌの濃度のパターン化因子ＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－１０３－９２６）およびｈＳＨＨ－Ｃ２４－ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０－０９５－７２７）を適用した。
次いで、分化プロセスの１６日目に免疫細胞化学染色を行なった。そのため、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を用いて透過処理した。そこで、４つのサブ試料を、抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な、蛍光色素にコンジュゲートされた抗体と接触させた。
免疫細胞化学解析により高いパーセンテージのＦＯＸＡ２およびＯＴＸ２陽性細胞が示された一方、細胞はＰＡＸ６およびＮＫＸ６．１に陰性であった（図７）。
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Claims (10)

  1. ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む細胞組成物を分析するインビトロの方法であって、
    ａ）前記細胞組成物の細胞またはその試料の細胞を抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な抗原結合分子と接触させることにより、前記細胞組成物または前記試料の細胞を標識するステップ、
    ｂ）前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定するステップであって、前記細胞のタンパク質発現プロファイルが、
    前記細胞の８０～１００％がＦＯＸＡ２について陽性、
    前記細胞の８０～１００％がＯＴＸ２について陽性、
    前記細胞の１０％未満がＰＡＸ６について陽性、および
    前記細胞の１０％未満がＮＫＸ６．１について陽性
    であれば、前記細胞組成物の細胞をヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞として適格とするステップ
    を含む方法。
  2. ステップａ）において、前記細胞がＯＣＴ３／４陽性細胞に由来する場合は、前記細胞をさらに抗原ＯＣＴ３／４に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
    前記細胞の０．１％未満がＯＣＴ３／４に陽性である
    ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップａ）において、前記細胞をさらに抗原ＮＫＸ２．１に特異的な抗原結合分子と接触させ、ステップｂ）において、前記細胞の前記タンパク質発現プロファイルが、
    前記細胞の５～９０％がＮＫＸ２．１について陽性である
    ことをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記抗原結合分子が蛍光色素にコンジュゲートされており、前記抗原のそれぞれについて前記抗原結合分子で標識された前記細胞のパーセンテージを決定する前記ステップが、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学法によって行なわれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞を含む前記細胞組成物が、底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得る細胞からインビトロ分化プロセスによって産生される、または産生過程にある、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞に変換され得る前記細胞が、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト胚幹細胞、またはダイレクトリプログラミングされたヒト体細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記抗原結合分子が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 抗原結合分子を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法に使用される、ヒト底板ｍｅｓＤＡ前駆細胞のタンパク質プロファイルを解析するためのキットであって、前記抗原結合分子が、
    １）抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な抗原結合分子、または
    ２）抗原ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＮＫＸ６．１に特異的な抗原結合分子と、抗原ＯＣＴ３／４および／またはＮＫＸ２．１に特異的な抗原結合分子、
    である、前記キット。
  9. 前記抗原結合分子が抗体またはその抗原結合断片である、請求項８に記載のキット。
  10. 前記抗原結合分子が蛍光色素にコンジュゲートされている、請求項８または９に記載のキット。
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