JP7183357B2 - 神経変性疾患の処置における使用のための幹細胞由来のドパミン作用性細胞を生成するための方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年２月２５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／３００，０００号；および２０１５年６月１９日に出願された米国仮特許出願６２／１８２，０５１号；および２０１５年４月９日に出願された米国仮特許出願番号第６２／１４５，４６７号に基づく利益を主張しており、これら仮出願の開示は、全体が参考として本明細書によって援用される。

背景
本出願は、ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称「Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ＿ＬＣＴＩ＿２０００４０ＵＳＰ３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１６年２月１０日、ファイルサイズ８，７８１バイト）中の資料を参考として援用する。

本開示は、ヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ）からある特定の望ましいドパミン作用性細胞を生成するための方法および分子量マーカーに基づいて脳への移植後にそれらの表現型成熟を推定するための方法に関する。次いで、これらのドパミン作用性細胞は、幹細胞ベースの治療において、例えば、神経変性疾患（パーキンソン病を含む）を処置するために使用され得る。上記方法を実施するためのキットもまた開示される。非常に一般的には、上記幹細胞は、ラミニン－１１１（または他の組換え生成されるラミニン）の基材上で培養され、種々の細胞培養培地に曝されて、以前に得られたより遙かに効率的に、ドパミン作用性細胞を生じる。

ラミニンは、基底板に主に存在するヘテロトリマー糖タンパク質のファミリーである。それらは、一方の側にある隣接する細胞レセプターとの結合相互作用を介して、および他のラミニン分子もしくは他のマトリクスタンパク質（例えば、コラーゲン、ニドゲンまた
はプロテオグリカン）への結合によって、機能する。ラミニン分子はまた、細胞の挙動および機能に強く影響を及ぼし得る重要なシグナル伝達分子である。ラミニンは、細胞／組織表現型を維持すること、ならびに組織修復および発生において細胞増殖および分化を促進することの両方において重要である。

ラミニンは、共通の構造組織化を有する大きなマルチドメインタンパク質である。ラミニンタンパク質分子は、１個のα鎖サブユニット、１個のβ鎖サブユニット、および１個のγ鎖サブユニットを含み、全てが、コイルドコイルドメインを通じてトリマーの中で一緒に結合している。１２種の公知のラミニンサブユニット鎖が、天然の組織において少なくとも１５種のトリマーラミニンタイプを形成し得る。このトリマーラミニン構造内には、他のラミニンおよび基底板分子、ならびに膜結合レセプターに対して結合活性を有する同定可能なドメインが存在する。図１は、３種のラミニン鎖サブユニットを別個に示す。例えば、ドメインＶＩ、ＩＶｂ、およびＩＶａは、球構造を形成し、ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩｌＩａ（これらは、システインリッチＥＧＦ様エレメントを含む）は、ロッド様の構造を形成する。この３種の鎖のドメインＩおよびＩＩは、三重螺旋のコイルドコイル構造（長腕）の形成に関与する。

５種の異なるα鎖、３種のβ鎖および３種のγ鎖がヒト組織中に存在し、少なくとも１５種の異なる組み合わせにおいて見出された。これらの分子は、それらの歴史上の発見に基づいてラミニン－１～ラミニン－１５といわれるが、もう一つの命名法は、それらの鎖の組成に基づくアイソフォーム、例えば、α１、β１およびγ１の鎖を含むラミニン－１１１（ラミニン－１）を記載する。ラミニンの４つの構造上規定されるファミリーグループが同定されている。５種の同定されたラミニン分子の第１のグループは、全てβ１鎖およびγ１鎖を共有し、それらのα鎖の組成（α１～α５鎖）に変化がある。５種の同定されたラミニン分子（ラミニン－５２１を含む）の第２のグループは、全てβ２鎖およびγ１鎖を共有し、繰り返すが、それらのα鎖の組成に変化がある。同定されたラミニン分子の第３のグループは、１種の同定されたメンバー、ラミニン－３３２（鎖の組成は、α３β３γ２）を有する。同定されたラミニン分子の第４のグループは、１種の同定されたメンバー、ラミニン－２１３（γ３鎖が新たに同定された（α２β１γ３））を有する。

ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、種々の疾患（例えば、脊髄損傷および心臓損傷、Ｉ型糖尿病およびパーキンソン病のような神経変性障害）の再生医療の発展が期待されている。幹細胞は、特定の細胞がそれからその後由来する未分化細胞である。胚性幹細胞は、広範な自己再生能力、および全３種の胚葉の細胞へと分化する潜在能力を有する多能性を有する。それらは、治療目的のために有用であり、組織置換療法、薬物スクリーニング、機能ゲノミクスおよびプロテオミクスのための無制限の細胞供給源を提供し得る。

神経変性疾患に対する幹細胞ベースの治療および処置は、まもなく臨床試験に手が届くと期待されている。しかし、標準化された適正製造基準（ＧＭＰ）グレードのヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞ベースの、移植の際に成体の脳の中で成熟し、かつ機能する前駆細胞を生成することに、大きなハードルが残っている。細胞が未成熟な前駆細胞として移植され、機能的に組み込まれたニューロンへの完全な成熟には、インビボで６ヶ月もしくはこれより長い期間が必要であるので、移植された細胞は、移植前に機能性に関して評価することができず、未成熟前駆細胞の収量および成熟を信頼性高く推定するマーカーは存在しない。

機能的特性を推定するマーカーの代用物として、現場は、ある特定のニューロンサブタイプの生成に発生的に関連している遺伝子およびタンパク質の発現によって、移植された前駆細胞を評価することに頼ってきた。これらマーカーが最終分化および機能成熟を予測するか否かは不確実であることから、上記前駆細胞は、従って、バッチ間変動および治療
効力を制御するために、長期にわたるインビボ機能評価を経て利用されなければならない。これは、より大きな患者コホートのために細胞を生成するために、および標準化された幹細胞生成物をクリニックに送り出すために、顕著なハードルを課し得る。

細胞発生プロセスの間に行われる必要があるインビボ研究を減らすことは、従って、移植前に幹細胞生成物のインビボ性能を推定し得る検証されたマーカーセットを同定するために必要である。前駆細胞ステージにおいてインビボ移植転帰を推定できることはまた、変わりやすい入力ソースからの（例えば、患者由来細胞またはＨＬＡハプロタイプが決定されたドナーのｈＰＳ細胞バンクからの）標準化された細胞生成物の生成をもたらし得る。

パーキンソン病は、中脳ドパミン（ｍｅｓＤＡ）ニューロンの特異的タイプの比較的限局した変性に起因して、幹細胞ベースの治療に関する特に興味深い標的である。パーキンソン病のための細胞補充療法が成功し得るという概念実証は、胎児細胞を使用する多くの臨床試験において得られてきた。

近年の開発は、腹側中脳の底板からｍｅｓＤＡニューロンの発生および細胞個体発生論のよりよい理解を生じた。そしてこの知識は、ｈＰＳ細胞から腹側中脳前駆細胞の形成を生じる研究グレードの分化プロトコルへと実体化された。より古いプロトコルとは対照的に、腹側中脳起源のこれらのドパミン作用性ニューロンは、パーキンソン病の動物モデルにおいて生存し、成熟し、そして適切な機能特性を獲得することが示されてきた。さらに、これらプロトコルから生成された移植片は、細胞の過剰増殖または腫瘍形成を生じないので、それらを幹細胞補充療法に適切な候補細胞にする。

現在の腹側中脳分化プロトコルにおいて、中脳底板マーカーＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、ＯＴＸ２、およびＣＯＲＩＮは、移植する前にインビトロで前駆細胞のｍｅｓＤＡ正体を確認するために一般に使用されるが、新たな研究から、これらおよびいくつかの他の一般に使用される腹側中脳マーカーはまた、視床下核の間脳前駆細胞において共発現されることが明らかにされた。従って、それらは、富化されたｍｅｓＤＡニューロンの生成のプロトコルにおいて次善（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）のマーカーであるようである。なぜならそれらは、ｍｅｓＤＡドメインに明らかに特異的ではないからである。

米国仮特許出願番号第６２／３００，０００号 米国仮特許出願６２／１８２，０５１号 米国仮特許出願番号第６２／１４５，４６７号

再生医療目的で、およびヒト神経細胞をモデル化するために、多能性幹細胞を、化学的に規定された、ゼノフリーで病原体なしの下で、およびこれら細胞の、再生能のある神経細胞への再現性のある分化のために誘導し、かつ培養することを可能にする方法を開発することが望まれている。望ましいことには、このような方法は、多量のこのような分化した細胞を提供するはずである。さらに、動物モデルにおいて移植された前駆細胞の成功裡の移植転帰を推定するための方法を開発することは、望ましい。

要旨
本開示は、ある特定の幹細胞由来の望ましいドパミン作用性細胞を生成するための方法、ならびに移植後にそれらの機能性を評価するための方法を提供する。これらのドパミン作用性細胞は、次いで、幹細胞ベースの治療において、例えば、神経変性疾患（パーキンソン病を含む）を処置するために使用され得る。さらなる局面において、本開示は、胚性幹細胞からドパミン作用性細胞を生成するためのキットを提供する。

本開示はまた、単一細胞懸濁物で、細胞の同質性、細胞培養プレートもしくは他の細胞支持体からの幹細胞の除去を促進する単層培養で、ある特定の所望の幹細胞を培養し、そ
して単一細胞懸濁物中の幹細胞を、幹細胞培養の拡大およびこのような細胞の大規模生成を可能にする有意な希釈率で継代および拡大するために再度プレートするための方法を提供する。

いくつかの局面において、本開示は、多能性幹細胞を、ラミニン－１１１またはラミニン－１２１の基材上にプレートする工程、および上記細胞を、いくつかの異なる細胞培養培地を使用して培養する工程であって、ドパミン作用性細胞、特に、尾側化した（ｃａｕｄａｌｉｚｅｄ）ドパミン作用性前駆細胞を得る工程を記載する。上記細胞は、プレートする前に、ＥＤＴＡとともに継代され得る。

種々の実施形態において、６種程度の多くの異なる細胞培養培地が使用され得る。他には、わずか３種または４種の異なる培地が使用される必要がある。

上記幹細胞は、Ｎ２培地（Ｎ２Ｍ）、ＴＧＦ－βインヒビター、ノギン、ソニックヘッジホッグタンパク質、およびＧＳＫ３インヒビターを含む一次培地中で培養され得る。ＲＯＣＫインヒビターは、最初の２４～７２時間の間に培地に添加されてもよい。

上記一次培地は、次いで、除去され得、二次培地が添加され、上記二次培地は、Ｎ２培地および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。上記ＦＧＦは、ＦＧＦ８ｂであり得る。上記二次培地は、プレートして約１５６時間～約２２８時間後に添加され得る。

上記二次培地は、次いで、除去され得、上記幹細胞は、再度プレートされ得る。この再度プレートする工程は、上記プレートする工程の約２５２時間～約２７６時間後に起こり得る。

上記再度プレートする工程は、Ｂ２７培地、ＲＯＣＫインヒビター、上記ＦＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびアスコルビン酸を含む三次培地を使用して起こり得る。

上記幹細胞は、次いで、四次培地中で培養され得、この四次培地は、Ｂ２７培地、上記ＦＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびアスコルビン酸を含む。上記幹細胞は、最初のプレートする工程（再度プレートする工程ではない）後の約３７２時間～約３９６時間まで、上記四次培地中で培養され得る。言い換えると、上記再度プレートされた幹細胞は、約１０８時間～約１３２時間の期間にわたって四次培地中で培養される。

いくつかの他の実施形態において、上記第１の培地は、神経誘導培地（ＮＩＭ）またはＮ２培地、ＲＯＣＫインヒビター、ＴＧＦ－βインヒビター、ＧＳＫ３インヒビター、ならびに必要に応じてソニックヘッジホッグタンパク質およびノギンタンパク質を含む。

いくつかの実施形態によれば、上記第２の培地は、（ｉ）ＮＩＭまたはＮ２培地；ＴＧＦ－βインヒビター、およびＧＳＫ３インヒビター、ならびに必要に応じて、ソニックヘッジホッグタンパク質およびノギンタンパク質を含む。上記第２の培地は、上記第１の培地のＲＯＣＫインヒビターを含まない。上記第２の培地は、プレートする工程の約３６時間～約６０時間後に添加され得る。

いくつかの他の実施形態によれば、上記第３の培地は、神経増殖培地（ＮＰＭ）およびＴＧＦ－βインヒビター；ならびに必要に応じて、上記ＧＳＫ３インヒビターおよびソニックヘッジホッグタンパク質を含む。上記第３の培地は、最初のプレートする工程の約８４時間～約１０８時間後に添加され得、最初のプレートする工程の約１５６時間～約１８０時間後に交換され得る。上記第３の培地は、最初のプレートする工程の約１５６時間～
約２２８時間後に除去され得る。

さらなる実施形態において、上記第４の培地は、（ｉ）神経増殖培地（ＮＰＭ）またはＮ２培地；および（ｉｉ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。上記第４の培地は、最初のプレートする工程の約１５６時間～約２２８時間後に添加され得る。上記第４の培地は、約３６時間～約１０８時間の曝露後に、すなわち、最初のプレートする工程の約２５２時間～約２７６時間後に除去され得る。上記細胞は、次いで、ラミニン－１１１、ラミニン－１２１、ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、またはラミニン－５１１で被覆した第２のプレート上に再度プレートされる。

第５の培地が使用され得、上記第５の培地は、Ｂ２７培地；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；アスコルビン酸（ＡＡ）；グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。上記第５の培地は、最初のプレートする工程の約３２４時間～約３４８時間後に交換され得る。約１４日間～１６日間、すなわち、約３３６時間～約３８４時間の後に、上記前駆細胞が得られる。さらなる時間が望ましい場合、第６の細胞培養培地が使用され得、上記第６の培地は、Ｂ２７培地；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；アスコルビン酸（ＡＡ）；グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ｃＡＭＰアゴニスト（例えば、ジブチリル－ｃＡＭＰ）およびγ－セクレターゼインヒビター（ＤＡＰＴ）を含み；かつ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含まない。

高確率の成功裡の移植転帰を有する尾側化したドパミン作用性前駆細胞を提供するための方法もまた、本明細書で開示され、この方法は、胚性幹細胞を、ラミニン－１１１、ラミニン－１２１、ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、またはラミニン－５１１で被覆した第１の基材上にプレートする工程であって、ドパミン作用性前駆細胞を生成する工程；尾側腹側中脳マーカーを発現するドパミン作用性前駆細胞を同定する工程；および上記同定されたドパミン作用性前駆細胞を、上記基材上の他のドパミン作用性前駆細胞から単離する工程であって、高確率の成功裡の移植転帰を有する上記尾側化したドパミン作用性前駆細胞を得る工程を包含する。

上記方法は、上記尾側化したドパミン作用性前駆細胞を哺乳動物の脳へと移植する工程をさらに包含し得る。上記哺乳動物は、ヒトであり得る。この移植する工程は、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）の処置のために行われ得る。

腹側中脳前駆細胞を同定する工程は、ＯＴＸ２、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａ／Ｂの共発現によって規定され得る。腹側中脳ドメイン内のドパミン作用性前駆細胞を同定する工程は、高レベルのＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＷＮＴ１、ＣＮＰＹ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、ＰＡＸ５、ＦＧＦ８、ＳＰ５、またはＴＬＥ４を発現する細胞を同定する工程によって行われ得る。より詳細には、ドパミン作用性細胞を同定する工程は、高レベルのＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＰＡＸ８、ＣＮＰＹ１、およびＥＴＶ５を発現する細胞を同定する工程によって行われ得る。

腹側中脳培養物内のドパミン作用性前駆細胞を同定する工程は、高レベルのＥＰＨＡ３、ＦＥＺＦ１、ＷＮＴ７Ｂ、ＢＡＲＨＬ１、ＢＡＲＨＬ２、ＦＯＸＧ１、ＳＩＸ３、ＨＯＸＡ２、ＧＢＸ２、またはＰＡＸ６を発現する細胞を排除する工程およびごく低～中程度レベルのＣＯＲＩＮおよびＦＯＸＰ２を発現する細胞を同定する工程をさらに包含し得る。

本開示はまた、ドパミン作用性細胞をインビトロで生成するためのキットを記載する。このキットは、ラミニン－１１１、ラミニン－１２１、ラミニン－５２１、ラミニン－４２１、またはラミニン－５１１の被覆を有する細胞培養プレート；細胞培養培地；ＧＳＫ
３インヒビター；ソニックヘッジホッグタンパク質；ＲＯＣＫインヒビター；ＴＧＦ－βインヒビター；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；およびアスコルビン酸（ＡＡ）を含む。

本開示のこれらおよび他の非限定的な特徴は、以下でより詳細に開示される。

特許または出願ファイルは、少なくとも１枚のカラー仕上げの図面を含む。この特許または特許出願の公報のカラー図面付きコピーは、請求および必要料金を支払えば、当局によって提供される。

以下は、図面の簡単な説明であり、これは、本明細書で開示される例示的実施形態を例証する目的で示されるのであって、上記実施形態を限定する目的で示されるのではない。

図１は、ラミニンアルファ（α）鎖、ベータ（β）鎖、およびガンマ（γ）鎖の構造モチーフを示す。Ｎ末端、内部、およびＣ末端の球状ドメインは、白い楕円形として示される。コイルドコイル形成ドメイン（ＩおよびＩＩ）は、白い矩形として示される。ロッド様構造（ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩｌＩａ）は、グレーの矩形として示される。 図２は、具体的成分を同定して、本開示のいくつかの方法が、所望の効果を達成するために上記幹細胞に適用される場合の本開示のいくつかの方法の図示である。これは、ＧＭＰに適した分化プロトコルである。 図３は、代替の細胞培養培地（ＮＩＭおよびＮＰＭ）が使用される本開示の他の方法の別の図示である。この図中のＮＤＭ培地は、Ｂ２７Ｍと等価である。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ａは、インビボ成熟後の選択された動物から撮影された一連の画像である。ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）含有量について脳を染色したところ、移植片の種々の転帰が明らかにされた。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ｂは、３３のバッチにわたる個々の動物におけるドパミン作用性（ＤＡ）細胞収量の定量である。ｙ軸は、移植された１００，０００個の細胞あたりのＴＨ＋細胞数であり、０から２０，０００までは４，０００の間隔で、次いで、３０，０００から５０，０００までは上で２０，０００の間隔で線を引いている。図４Ｂ～４Ｄに関しては、細胞含有量を、１００，０００個の移植された細胞に対して正規化し、水平のバーは、各バッチの平均を示す。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ｃは、ＨｕＮｕ＋免疫染色に基づいて３３動物群にわたる個々の動物の移植片容積の定量である。ｙ軸は、移植された１００，０００個の細胞あたりの移植片容積（立方ミリメートル単位）であり、０から７まで１の間隔で線が引かれている。図４Ｂ～４Ｄに関しては、細胞含有量を、１００，０００個の移植された細胞に対して正規化し、水平のバーは、各バッチの平均を示す。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ｄは、３３群にわたる個々の動物に由来する移植片のＤＡ細胞密度（すなわち、総ＴＨ＋細胞数／ｍｍ^３ 移植片容積）の定量である。ｙ軸は、０から１５，０００まで３，０００の間隔で線が引かれている。図４Ｂ～４Ｄに関しては、細胞含有量を、１００，０００個の移植された細胞に対して正規化し、水平のバーは、各バッチの平均を示す。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ｅは、実施例６の研究の模式的まとめである。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ｆは、各移植実験における平均ＴＨ＋細胞含有量（すなわち、ＤＡ収量）に対してプロットした１６日目（移植の日）の移植された細胞集団におけるＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１ＡおよびＣＯＲＩＮの遺伝子発現の図示である。ＬＭＸ１Ａグラフに関して、ｙ軸は、０から６，０００まで２，０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１０，０００まで２，５００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝０．１５、ｐ＝０．５０。ＦＯＸＡ２グラフに関して、ｙ軸は、０から１，５００まで５００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１０，０００まで２，５００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝－０．３８、ｐ＝０．０８。ＣＯＲＩＮグラフに関して、ｙ軸は、０から１５，０００まで５，０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１０，０００まで２，５００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝－０．１７、ｐ＝０．３７。 図４Ａ～４Ｇは、一般的なｍｅｓＤＡマーカーと相関しない腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのバッチが変動しやすい転帰を与えることを図示する一連の画像およびグラフである。ラットの三十三（３３）群を、６－ＯＨＤＡでの一側のドパミン作用性病変に供し、ＶＭパターン形成したｈＥＳＣの２８種の異なるバッチを移植した。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図４Ｇは、各移植実験における平均ＴＨ＋細胞含有量（すなわち、ＤＡ収量）に対してプロットした１６日目（移植の日）の移植された細胞集団におけるＴＨ、ＮＵＲＲ１およびＡＡＤＣの遺伝子発現の図示である。スピアマン相関分析（腹側中脳細胞のみ）の結果を、各グラフにおいてＲおよびｐ値として示し、相関の傾向を、線形回帰直線によって示す。ＴＨグラフに関して、ｙ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝－０．１８、ｐ＝０．５３。ＮＵＲＲ１グラフに関して、ｙ軸は、０から４，０００まで１，０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝０．１１、ｐ＝０．７０。ＡＡＤＣグラフに関して、ｙ軸は、０から６００まで２００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝０．３１、ｐ＝０．２８。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ａは、６週間および＞１６週間でのＤＡ高群およびＤＡ低群へと分けたＤＡ収量の図示である。関連する１６日目のＲＮＡサンプルでの実験のみが、高いまたは低い、のいずれかとして分類された。移植片のドパミン作用性機能は、アンフェタミン誘導性回転（ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｏｔａｔｉｏｎ）を通じて、長期間成熟（＞１６週間）を伴う移植片において評価した（「－」は、機能回復の欠如を示し、「＋」は、機能回復を示し、ＮＤは決定されない、を示す）。ｙ軸は、移植された１００，０００個の細胞あたりのＴＨ＋細胞の数であり、０から１０，０００まで５，０００の間隔で線を引かれている。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｂは、ＰＣ４軸上のＤＡ低およびＤＡ高サンプルの示されたクラスター化から１６日目の細胞サンプルのＲＮＡ配列決定分析からの結果のＰＣＡプロットである。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｃは、ＤＡ高 対 ＤＡ低細胞サンプルからのＲＮＡ配列決定データのＤｅｓｅｑ２分析の結果のリストである（以下の図５Ｉ中の四角で囲まれたデータ点を参照のこと）。このリストは、最高のｌｏｇ２倍数変化（ｌｏｇ２ ＦＣ）および＜０．００１のｐ値を有する１２遺伝子を示す。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｄは、ＥＮ１ ｍＲＮＡレベルのグラフであり、図５Ｅは、ＰＡＸ８ ｍＲＮＡレベルのグラフである（ともに、１６日目の移植された細胞バッチのｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される）。ＥＮ１グラフに関して、ｙ軸は、０から１５，０００まで５，０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。ＰＡＸ８グラフに関して、ｙ軸は、０から１５０まで５０の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。図５Ｄ～５Ｅの両方に関して、スピアマン相関分析は、各グラフにおいてＲおよびｐ値として示され、相関は、線形回帰直線で可視化される。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｄは、ＥＮ１ ｍＲＮＡレベルのグラフであり、図５Ｅは、ＰＡＸ８ ｍＲＮＡレベルのグラフである（ともに、１６日目の移植された細胞バッチのｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される）。ＥＮ１グラフに関して、ｙ軸は、０から１５，０００まで５，０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。ＰＡＸ８グラフに関して、ｙ軸は、０から１５０まで５０の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から８，０００まで２，０００の間隔で線が引かれている。図５Ｄ～５Ｅの両方に関して、スピアマン相関分析は、各グラフにおいてＲおよびｐ値として示され、相関は、線形回帰直線で可視化される。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｆは、ＴＨ＋含有量、移植片容積およびＴＨ＋密度およびＭＨＢ遺伝子のＲＮＡレベルおよび一般的腹側中脳マーカーとの間の正の相関を示すＲＮＡ配列決定相関分析の図式によるまとめである。正の相関は、ｐ＜０．０５を有するスピアマン相関分析によって規定される。ｑＲＴ－ＰＣＲによって検証された遺伝子は、太字で示される。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｇは、ＭＨＢ遺伝子の共調節を示す細胞バッチにおけるＲＮＡレベルのスピアマン距離分析の図示であるのに対して、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ｂ、ＣＯＲＩＮ、ＬＭＸ１Ａ、およびＯＴＸ２は、ＭＨＢ遺伝子クラスターと対にならないかまたは負の関係で対になる。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｈは、移植された細胞の成熟形態を示す推定マーカーの高発現を有する異なる細胞バッチからＴＨ＋ニューロンの５つの代表的画像を示す。スケールバー：５０μｍ。 図５Ａ～５Ｉは、移植された細胞のＲＮＡ配列決定分析から、移植片ＴＨ＋含有量と中脳後脳境界（ＭＨＢ）のマーカーとの間には正の相関があることが明らかになることを示す一連の画像およびグラフである。全ての移植片は、Ｈ９細胞に由来した。図５Ｉは、ＤＡ高およびＤＡ低細胞サンプルからのＲＮＡ配列決定データのＤｅｓｅｑ２分析後の推定マーカーのグラフ分析である。マーカーを、正規化された計数の平均と比較して、ｌｏｇ２倍数変化にも基づいてブロットした。この図面の中のボックスは、上記の図５Ｃに列挙される遺伝子を示す。 図６Ａ～６Ｆは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物が間脳ＳＴＮという最終結果の細胞を含むことを示す一連の画像およびグラフである。図６Ａは、移植された細胞（１６日目）における間脳マーカーＦＥＺＦ１、ＷＮＴ７Ｂ、およびＥＰＨＡ３のＲＮＡレベルと、移植片中のＴＨ＋含有量との間の負の相関を示す一連の３つのグラフである。ＦＥＺＦ１グラフに関して、ｙ軸は、０から８まで２の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１０，０００まで２，５００の間隔で線が引かれている。Ｒ＝－０．６３、ｐ＝０．０１５。ＷＮＴ７Ｂグラフに関して、ｙ軸は、０から０．６まで０．２の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１０，０００まで２，５００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝－０．５４、ｐ＝０．０２４。ＥＰＨＡ３グラフに関して、ｙ軸は、０から２０まで５の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１０，０００まで２，５００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝－０．６３、ｐ＝０．０１５。 図６Ａ～６Ｆは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物が間脳ＳＴＮという最終結果の細胞を含むことを示す一連の画像およびグラフである。図６Ｂは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物（１６日目）の免疫染色の一連の画像であり、ＳＴＮドメインという最終結果（ＢＡＲＨＬ１＋／ＦＯＸＡ２＋およびＰＩＴＸ２＋／ＬＭＸ１Ａ／Ｂ＋細胞）の存在を示す。 図６Ａ～６Ｆは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物が間脳ＳＴＮという最終結果の細胞を含むことを示す一連の画像およびグラフである。図６Ｃは、間脳ＳＴＮ領域および側方中脳ドメインにおける発現ドメインの模式的全体像である。 図６Ａ～６Ｆは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物が間脳ＳＴＮという最終結果の細胞を含むことを示す一連の画像およびグラフである。図６Ｄは、ＢＡＲＨＬ１＋／ＰＩＴＸ２＋細胞およびＢＡＲＨＬ１＋／ＰＩＴＸ２－細胞の存在を示す１８週齢の移植片の一連の共焦点画像である。 図６Ａ～６Ｆは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物が間脳ＳＴＮという最終結果の細胞を含むことを示す一連の画像およびグラフである。図６Ｅは、移植日での低（左）または高（右）ＢＡＲＨＬ１ ＲＮＡレベルを有する細胞バッチに由来する移植片中のＢＡＲＨＬ１＋細胞含有量の一連の例示的画像である。 図６Ａ～６Ｆは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物が間脳ＳＴＮという最終結果の細胞を含むことを示す一連の画像およびグラフである。図６Ｆは、移植の時点でのＢＡＲＨＬ１ ＲＮＡレベルおよびＢＡＲＨＬ２ ＲＮＡレベル（ｑＲＴ－ＰＣＲ）と成熟移植片中のＢＡＲＨＬ１＋細胞数との間の正の相関を示す一連の図示である。ＢＡＲＨＬ１グラフに関して、ｙ軸は、０から１５００まで５００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１５，０００まで５，０００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝０．８９、ｐ＝０．０３。ＢＡＲＨＬ２グラフに関して、ｙ軸は、０から５０００まで１０００の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から１５，０００まで５，０００の間隔で線が引かれている。スピアマン相関：Ｒ＝０．８９、ｐ＝０．０３。図６Ａおよび６Ｆに関して、スピアマン相関分析の結果は、各グラフにおいてＲおよびｐ値として示され、相関は、線形回帰直線で可視化される。 図６Ｇは、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ培養物（４２日目、図６Ｂに類似）の免疫染色の一連の８枚の画像であり、ＳＴＮという最終結果を有する培養物の最終インビトロ分化を示す。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ａは、０～９日目までＦＧＦ８ｂで処置してｈＥＳＣを分化させた後のｑＲＴ－ＰＣＲ分析（１０日目）後に、ＦＯＸＧ１、ＳＩＸ３、ＧＢＸ２、およびＨＯＸＡ２のｍＲＮＡの図示である。ＦＯＸＧ１グラフに関して、ｙ軸は、０から８００まで２００の間隔で線が引かれている。ＳＩＸ３グラフに関して、ｙ軸は、０から１０００まで２００の間隔で線が引かれている。ＧＢＸ２グラフに関して、ｙ軸は、０から１５０まで５０の間隔で線が引かれている。ＨＯＸＡ２グラフに関して、ｙ軸は、０から３００まで１００の間隔で線が引かれている。全４つのグラフに関して、ｘ軸は、ＦＧＦ８ｂの量を示し、０、１００、または３００ｎｇ／ｍＬのいずれかである。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ｂは、０～９日目までＦＧＦ８ｂで処理した培養物中のＰＩＴＸ２＋かつＮＫＸ２．１＋細胞のパッチ、およびＬＭＸ１－細胞のパッチを示す一連の４枚の免疫染色画像（１６日目）である。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ｃは、ＬＭＸ１＋／ＦＯＸＡ２＋腹側中脳表現型が、７～１６日目または９～１６日目までＦＧＦ８ｂで処理した培養物中で維持されることを図示する、一連の９枚の免疫染色画像である。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ｄは、９～１６日目までＦＧＦ８ｂで処理した１６日目の培養物がＢＡＲＨＬ１＋細胞およびＦＯＸＡ２細胞の低下したレベルを有することを図示する一連の６枚の免疫染色画像である。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ｅは、９～１６日目までＦＧＦ８ｂで処理した１６日目の培養物がＰＩＴＸ２の低下したレベルを有するが、ＥＮ１細胞の増大したレベルを有することを図示する一連の６枚の免疫染色画像である。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ｆは、図７Ｄ～７Ｅのグラフによる定量である。ｙ軸は、０～１００％まで２０の間隔で線が引かれている。 図７Ａ～７Ｉは、ｈＥＳＣへのＦＧＦ８の時宜を得た送達が、細胞最終結果を、間脳から尾側腹側中脳前駆細胞へと切り替えさせることを示す一連の画像およびグラフである。インビトロ研究は、Ｈ９株およびＲＣ１７株両方のデータを使用した。図７Ｇは、ＰＣＲ分析後に、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２およびＥＮ１の１６日目でのｍＲＮＡレベルの図示である。ｙ軸上の表示は、下から上へと、１、４、１６、６４、２５６、および１０２４である。 図７Ｈは、ＦＯＸＡ２＋前駆細胞の変化しないパーセンテージを示す、コントロールおよびＦＧＦ８ｂ処理した腹側中脳パターン形成培養物（１６日目）のＦＡＣＳプロットである。ＶＭに関して、その値は、９４．６±２．７％（平均±ＳＥＭ）である。ＶＭ＋ＦＧＦ８に関して、その値は、９５．４±１．３％である。コントロールに関して、その値は、０．３±０．２％（ｎ＝３）である。 図７Ｉは、コントロールおよびＣＯＲＩＮ＋前駆細胞の低下したパーセンテージを示すＦＧＦ８ｂ処理した腹側中脳パターン形成培養物（１６日目）のＦＡＣＳプロットである。ＶＭに関して、その値は、５２．９±４．５％である。ＶＭ＋ＦＧＦ８に関して、その値は、２８．１±１．８％である。コントロールに関して、その値は、０．０％（ｎ＝３）である。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ａは、種々のラミニンサブタイプ上でのｈＥＳＣの神経分化を図示する一連の７枚の画像である。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｂは、多能性培地中のＬＮ－１１１上でのｈＥＳＣの培養が、剥離および球状物の形成をどのようにして生じたか、それに対して多能性細胞がＬＮ－５２１マトリクスに効率的に付着したかを示す一対の画像である。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｃは、ドパミン作用性細胞の収量がいずれの基材上でもほぼ等しいことを示す、ＬＮ－１１１被覆基材の使用をＬＮ－１２１被覆基材と比較するグラフである。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｄは、補充されたＮ２培地中のＬＮ－１１１マトリクス上の低密度ｈＥＳＣの播種が、分化の７日後に、コンフルエントな神経化される培養物を生じたことを図示する一連の４枚の画像である。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｅは、ＬＮ－１１１上の３日間の分化にわたるＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧのｍＲＮＡレベルのダウンレギュレーションのグラフである。ｙ軸は、０．０から１．０まで０．２の間隔で線が引かれ、ｘ軸は、０から３まで１の間隔で線が引かれている。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｆは、基礎培地の種々の組み合わせ（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＮｅｕｒｏｂａｓａｌとＮ２サプリメント、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、およびＤＭＥＭ／Ｆ１２＋）にわたる細胞収量のグラフである。ｙ軸は、１１日目の細胞数（１００万個単位）であり、０から２００まで５０間隔で線が引かれている。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｇは、研究グレードのＥＢベースのプロトコルからの細胞収量と、図２に示されるＧＭＰ適合ＬＮ－１１１プロトコルからの細胞収量とのグラフによる比較である。ｙ軸は、細胞数（１００万個単位）であり、０から５００まで１００の間隔で線が引かれている。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｈ～８Ｋは、図２のＧＭＰプロトコルによって生成された腹側中脳前駆細胞の最終成熟（４５日目）が、電気生理学的に活性なニューロンを生じたことを示す。図８Ｈは、脱分極電流注入で誘導される活動電位の代表的トレースを示すグラフである。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｈ～８Ｋは、図２のＧＭＰプロトコルによって生成された腹側中脳前駆細胞の最終成熟（４５日目）が、電気生理学的に活性なニューロンを生じたことを示す。図８Ｉは、いくつかの腹側中脳細胞がディッシュ中のシナプス統合を示す自発性のシナプス後電流を示したことを図示するグラフである。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｈ～８Ｋは、図２のＧＭＰプロトコルによって生成された腹側中脳前駆細胞の最終成熟（４５日目）が、電気生理学的に活性なニューロンを生じたことを示す。図８Ｊは、ドパミン作用性表現型に特徴的な短時間の膜脱分極後の反跳性脱分極（ｒｅｂｏｕｎｄ ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）のグラフ例である。 図８Ａ～８Ｋは、ＧＭＰ適合性ラミニンマトリクス上でのｈＥＳＣの分化が、高収量および高純度の腹側中脳前駆細胞を生じることを示す一連の画像およびグラフである。ＲＣ１７細胞を使用した。図８Ｈ～８Ｋは、図２のＧＭＰプロトコルによって生成された腹側中脳前駆細胞の最終成熟（４５日目）が、電気生理学的に活性なニューロンを生じたことを示す。図８Ｋは、拡大スケールでの図８Ｊからのそれぞれのトレースを示す挿入図である。 図９Ａ～９Ｅは、ＧＭＰ適合性プロトコルからのｈＥＳＣの分化が、尾側腹側中脳からの推定マーカーを再現可能に高発現する腹側中脳細胞バッチを生じることを示す一連の画像およびグラフである。図９Ａは、ＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２の非常に高い重なり合いを示す、ＧＭＰプロトコルに従って分化した培養物を撮影した一連の３枚の免疫染色画像である。 図９Ａ～９Ｅは、ＧＭＰ適合性プロトコルからのｈＥＳＣの分化が、尾側腹側中脳からの推定マーカーを再現可能に高発現する腹側中脳細胞バッチを生じることを示す一連の画像およびグラフである。図９Ｂは、フローサイトメトリーによるＯＴＸ２／ＦＯＸＡ２二重標識の一連の２枚のＦＡＣＳプロット（複製実験（ｎ＝３）の平均（％）±ＳＥＭ）である。両方のプロットに関して、ｙ軸（ＯＴＸ２－ＡＰＣ）は対数であり、底の値は、１０^０であり、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、および１０^７へと進む。ｘ軸（ＦＯＸＡ２－ＰＥ）も対数であり、最も左の値は１０^０であり、１０^２、１０^４、および１０^６へと進む。 図９Ａ～９Ｅは、ＧＭＰ適合性プロトコルからのｈＥＳＣの分化が、尾側腹側中脳からの推定マーカーを再現可能に高発現する腹側中脳細胞バッチを生じることを示す一連の画像およびグラフである。図９Ｃは、研究グレードの胚様体プロトコルまたはＧＭＰグレードＬＮ－１１１プロトコルのいずれかに従って分化させたヒトＥＳＣの遺伝子発現レベルのグラフによる図示である。腹側前脳（ｖＦＢ）および腹側後脳（ｖＨＢ）に向かう分化を、コントロールとして含めた。値はカラーコード化され、各遺伝子の最高発現（＝１０００）を有するサンプルに対して正規化した。 図９Ａ～９Ｅは、ＧＭＰ適合性プロトコルからのｈＥＳＣの分化が、尾側腹側中脳からの推定マーカーを再現可能に高発現する腹側中脳細胞バッチを生じることを示す一連の画像およびグラフである。図９Ｄ～９Ｅは、尾側ＶＭマーカーの高レベルを含むバッチに由来するさらなる移植片の１０枚の代表画像である。図９Ｄの画像は、移植されたＨ９細胞の画像であり、図９Ｅは、ＲＣ１７細胞を示し、両方とも、ＧＭＰグレードプロトコルを介して生成した。 図９Ａ～９Ｅは、ＧＭＰ適合性プロトコルからのｈＥＳＣの分化が、尾側腹側中脳からの推定マーカーを再現可能に高発現する腹側中脳細胞バッチを生じることを示す一連の画像およびグラフである。図９Ｄ～９Ｅは、尾側ＶＭマーカーの高レベルを含むバッチに由来するさらなる移植片の１０枚の代表画像である。図９Ｄの画像は、移植されたＨ９細胞の画像であり、図９Ｅは、ＲＣ１７細胞を示し、両方とも、ＧＭＰグレードプロトコルを介して生成した。 図１０は、パーキンソン病の動物モデルにおける行動回復のグラフによる図示である。一側性の６－ＯＨＤＡ病変を受けたラットを、ＬＮ－１１１ ＧＭＰプロトコルに従って分化させたＲＣ１７細胞での移植の前後に、アンフェタミン誘導性回転に関して評価した。動物の一方の群（ｍｅｓＤＡ ＲＣ１７、緑色の点）に、９～１６日目までＦＧＦ８ｂの存在下で分化させた細胞を移植して、中脳ドパミン（ｍｅｓＤＡ）ドメインの尾側化したＶＭ細胞を生じさせた。この群は、アンフェタミン誘導性回転の改善および過剰補償によって（２２週目までに）証明されるように、機能回復を示した。他の群（ＳＴＮ ＲＣ１７、赤色の点）に、ＦＧＦ８ｂの非存在下で分化させた細胞を移植して、ＳＴＮドメインの吻側ＶＭ細胞を生じさせた。ｍｅｓＤＡ群とは対照的に、ＳＴＮ群は、アンフェタミン誘導性回転の機能回復を示さなかった。

詳細な説明
本明細書で開示される組成物および方法のより完全な理解は、添付の図面を参照することによって得られ得る。これらの図面は、本開示を示す便宜および容易さに基づいて模式的に表しているに過ぎず、従って、例示的実施形態の範囲を規定することも限定することも意図しない。

具体的用語が、明瞭性の目的で以下の説明において使用されるが、これらの用語は、図面での例証のために選択された実施形態の特定の構造にのみ言及することが意図され、本開示の範囲を規定することも限定することも意図されない。図面および以下に続く説明において、類似の番号表示が類似の機能の構成要素をいうことは、理解されるべきである。

単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかに他のことを必然的に決めなければ、複数形を含む。

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含み得る。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」，「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る、できる（ｃａｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」およびこれらの変形は、本明細書で使用される場合、指定された成分／工程の存在を要求しかつ他の成分／工程の存在を許容する、開放系の移行語、用語または文言であることが意図される。しかし、このような説明は、挙げられた成文／工程「からなる」および「から本質的になる」（これは、これらから生じ得る任意の不純物とともに、挙げられた成分／工程のみの存在を許容し、かつ他の成分／工程を除く）として組成物またはプロセスを記載するとも解釈されるはずである。

本出願の明細書および特許請求の範囲の中の数値は、値を決定するために本出願において記載されるタイプの従来の測定技術の実験誤差未満程度、述べられた値から異なる有効数字および数値の同じ数字に換算される場合に、同じである数値を含むと理解されるはずである。

本明細書で開示される全ての範囲は、記載される端点を含み、独立して組み合わせ可能である（例えば、「２～１０」の範囲は、端点、２および１０を含み、そして全ての中間の値を含む）。

用語「約」は、その値の基本的な機能を変化させずに変動し得る任意の数値を含むために使用され得る。範囲とともに使用される場合、「約」はまた、上記２つの端点の絶対値によって規定される範囲を開示する。例えば、「約２～約４」は、範囲「２～４」も開示する。用語「約」は、示された数字の±１０％に言及し得る。

本開示に関し得るいくつかの周知の参考文献としては、以下が挙げられる： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編， １９９１． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編，（１９９０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら， １９９０． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， 第２版（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ． １９８７． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ｐｐ． １０９－１２８， Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ編， Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．）、またはＡｍｂｉｏｎ １９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， Ｔｅｘ．）。

本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－５２１」とは、α５鎖、β２鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン－５２１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン－５２１の両方を包含すると解釈されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－１１１」とは、α１鎖、β１鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成される得タンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン－１１１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン－１１１の両方を包含すると解釈されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－１２１」とは、α１鎖、β２鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン－１２１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン－１２１の両方を包含すると解釈されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－４２１」とは、α４鎖、β２鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えラミニン－４２１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン－４２１の両方を包含すると解釈されるべきである。

本明細書で使用される場合、用語「ラミニン－５１１」とは、α５鎖、β１鎖およびγ１鎖を一緒に結合することによって形成されるタンパク質をいう。この用語は、組換えは
、ラミニン－５１１および天然に存在する供給源に由来するヘテロトリマーラミニン－５１１の両方を包含すると解釈されるべきである。

用語「無傷の（ｉｎｔａｃｔ）」とは、α鎖、β鎖、およびγ鎖のドメインのうちの全てから構成されるタンパク質であって、これら３つの鎖が一緒に結合して、ヘテロトリマー構造を形成するものに言及する。上記タンパク質は、別個の鎖、フラグメント、または機能的ドメインへと分解されない。用語「鎖」とは、ラミニンタンパク質のα鎖、β鎖、またはγ鎖の実体に言及する。用語「フラグメント」とは、別の分子またはレセプターに対する結合活性を有する１個、２個、または３個の機能的ドメインを含む任意のタンパク質フラグメントをいう。しかし、鎖は、フラグメントとは見做されないはずである。なぜなら各鎖は、３個を超えるこのようなドメインを有するからである。同様に、無傷のラミニンタンパク質は、フラグメントとは見做されないはずである。機能的ドメインの例としては、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＧドメインが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「自己再生」とは、幹細胞が細胞分裂の多くのサイクルを経て、未分化のまま残る能力（すなわち、多能性）をいう。多能性自体は、幹細胞が任意の細胞タイプへと分化する能力をいう。用語「増殖」とは、幹細胞が分裂する能力をいう。生存は、分化していようが未分化であろうが、幹細胞が生きる能力をいい、幹細胞がその分裂するかまたは分化する能力を維持することを要求しない。

略語「ＤＡ」とは、ドパミンをいう。それは、ドパミンを生成し得る細胞またはドパミン生成細胞を生じ得る細胞をいうために、本明細書で一般に使用される。

ラミニン基材と本開示の細胞培養培地との組み合わせは、臨床グレードのドパミン作用性細胞を提供する細胞培養システムを生じる。特に、上記方法は、より多くのドパミン作用性細胞を開示する。

本開示は、幹細胞を培養して、再生治療のために分化した神経細胞を得るためのより効率的な方法に関する。特に、ラミニンは、多能性幹細胞のためのマトリクス／基材として使用され、代替のマトリクスを含む培養より分化した細胞を生じる。わずか１種のラミニンが、このマトリクス／基材として使用され得るか、またはこのマトリクス／基材は、具体的なラミニン（これらは、ラミニン－１１１（ＬＮ－１１１）、ＬＮ－１２１、ＬＮ－５２１、ＬＮ－４２１、またはＬＮ－５１１である）を含み得る。ラミニン－１１１は、通常は、上皮および真皮乳頭、内皮細胞、膵臓、末梢神経、および胎盤において見出され得る。

本開示はまた、細胞、特に、幹細胞に栄養を提供するために使用される種々の細胞培養培地に関する。この点に関して、幹細胞は、代表的には、培養するために２つのものが必要である：（１）幹細胞の構造的支持体を提供する基材または被覆；および（２）幹細胞に栄養を提供する細胞培養培地。その基材または被覆（１）は、一般に、例えば、ペトリ皿またはある種の他の容器上に配置される。ラミニン－１１１基材と組み合わせて適切な時間間隔で種々の細胞培養培地を適用すると、多数の、ドパミンを生成する分化した神経細胞（すなわち、ドパミン作用性細胞）が生じる。

本明細書で開示される方法および材料とともに使用され得る幹細胞は、人口多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、胎児幹細胞、羊膜幹細胞、および一般に任意の多能性幹細胞であり得る。

上記方法は、多くの異なる表現型の神経細胞を得るために改変され得る。これら神経細胞は、幹細胞ベースの治療（哺乳動物患者の脳へと移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ａ
ｎｄ ｇｒａｆｔｅｄ）されて、種々の神経変性疾患を処置することが挙げられる）のために使用され得る。パターン形成因子（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）の非存在下では、終脳という最終結果の神経細胞が得られる。神経前駆細胞の前後軸（ｒｏｓｔｒｏ－ｃａｕｄａｌ）および背腹軸（ｄｏｒｓａｌ－ｃｅｎｔｒａｌ）パターン形成は、パターン形成因子の用量依存性添加によって制御され得る。これら方法は、図２（これは、タイムラインおよび本明細書で開示される細胞培養培地中の種々の成分の列挙を提供する）を参照して記載される。ここで認められるように、多能性幹細胞は、ラミニン－１１１を被覆したプレートに播種され、１６日間の期間にわたって培養される。培養培地は、１６～２５日間の期間にわたって特定の間隔で投与される、培地、分化因子、およびパターン形成因子の種々の組み合わせを含み得る。

最初に、４種の異なる細胞培養培地が例証される。これらは、複数の異なる細胞培養培地に達するために、分化因子および／またはパターン形成因子の添加によって改変される。それら４種の培地は、神経誘導培地（ＮＩＭ）、Ｎ２培地（Ｎ２Ｍ）、神経増殖培地（ＮＰＭ）、およびＢ２７培地（Ｂ２７Ｍ）として本明細書で言及される。

ＮＩＭ、Ｎ２Ｍ、ＮＰＭ、およびＢ２７Ｍは、一連の一般的な成分から作製する。これらの一般的な成分としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている（カタログ番号１０５６５および２１３３１））が挙げられる。ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、一般に、表１に列挙される以下の成分を含む：

別の一般的な成分は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（これは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（カタログ番号１３０－０９３－５７０）またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号１３７１２－０１）からＭＡＣＳ神経培地として市販されている）である。Ｎ２サプリメントは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号Ａ１３７０７－０１）から１００×濃度で市販されている。ビタミンＡを含まないＢ２７サプリメントは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号１２５８７－０１０）から、またはＭＡＣＳ ＮｅｕｒｏＢｒｅｗ－２１としてＭｉｌｔｅｎｙｉ（カタログ番号１３０－０９７－２６３）から得られ得る。

上記ＮＩＭ、Ｎ２Ｍ、ＮＰＭ、およびＢ２７Ｍ培地は、これらの一般的成分の複数容積部と他の添加剤とを混合することによって作製される。

神経誘導培地（ＮＩＭ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの５０：５０混合物を１容積部（ｐｂｖ）；１×Ｎ２サプリメント（１：１００）を１部；および１×Ｂ２７サプリメント（１：５０）を１部と；２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび必要に応じて０．２％ペニシリン／ストレプトアビジン（必要であれば）の添加とから形成される。

Ｎ２培地（Ｎ２Ｍ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの５０：５０混合物を１容積部（ｐｂｖ）；および１×Ｎ２サプリメントを１部と；２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび必要に応じて０．２％ペニシリン／ストレプトアビジン（必要であれば）の添加とから形成される。ＮＩＭと比較して、Ｎ２Ｍは、Ｂ２７サプリメントを全く含まない。

神経増殖培地（ＮＰＭ）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌの５０：５０混合物を１部；０．５×Ｎ２サプリメント（１：２００）を１部；および必要に応じて０．５×Ｂ２７サプリメント（１：１００）を１部と；２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび必要に応じて０．２％ペニシリン／ストレプトアビジン（必要であれば）の添加とから形成される。Ｎ２サプリメントおよびＢ２７サプリメントは、ＮＩＭおよびＢ２７Ｍと比較して、ＮＰＭ中でより希釈される。Ｂ２７が存在する場合、これは、ＮＰＭ－Ｂといわれ得る。

Ｂ２７培地（Ｂ２７Ｍ）は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を１部；および１×Ｂ２７サプリメント（１：５０）を１部；と２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび必要に応じて０．２％ペニシリン／ストレプトアビジン（必要であれば）の添加とから形成される。Ｂ２７Ｍは、Ｎ２サプリメントを全く含まない。

本開示で使用される分化因子としては、ＴＧＦ－βインヒビター；組換えヒトノギン；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；アスコルビン酸（ＡＡ）；グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）（例えば、ジブチリル環状アデノシン一リン酸（ｄｂ－ｃＡＭＰ）；およびγ－セクレターゼインヒビター（例えば、ＤＡＰＴ）が挙げられる。特定の実施形態において、ＴＧＦ－βインヒビターは、ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ＃３０１８３６－４１－９）である。ノギンは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号６０５７－ＧＭＰ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ（カタログ番号１３０－１０３－４５６）から得られ得る。ＢＤＮＦ（カタログ番号１３０－０９６－２８６）およびＧＤＮＦ（カタログ番号１３０－０９８－４４９）は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉから得られ得る。

本開示で使用されるパターン形成因子としては、ＧＳＫ３インヒビター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびソニックヘッジホッグタンパク質が挙げられる。特定の実施形態において、ＧＳＫ３インヒビターは、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ＃２５２９１７－０６－９）である。他の特定の実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ８ｂである。さらに他の実施形態において、特定のソニックヘッジホッグタンパク質は、ＳＨＨ－Ｃ２４ＩＩである。

特定の実施形態において、ＲＯＣＫインヒビターは、上記方法のうちのある特定の部分のために使用され得る。ＲＯＣＫインヒビターは、Ｙ２７６３２（ＣＡＳ＃１２９８３０－３８－２）であり得る。ノギンタンパク質およびγ－セクレターゼ（例えば、ＤＡＰＴ）がまた、使用され得る。

次に、分化の前に、細胞は、ＳｔｅｍＰｒｏ培地またはｉＰＳＢｒｅｗ（カタログ番号１３０－１０４－３６８）中、Ｃｅｌｌｓｔａｒｔまたはラミニン－５２１上で維持され得る。上記細胞はまた、分化を開始する４～６日前にＥＤＴＡとともに継代され得る。健康な多能性幹細胞が使用されるべきである。

図２および図３をここで参照すると、分化プロトコルは、０日目に始まり、１６日間継続する。１６日後に、上記細胞は、移植のために調製され得る。０日目に、多能性幹細胞は、ラミニン－１１１、ＬＮ－１２１、ＬＮ－５２１、ＬＮ－４２１、および／またはＬＮ－５１１の基材上にプレートされる。この基材は、完全にラミニン－１１１から、完全にＬＮ－１２１からなり得るか、またはＬＮ－１１１およびＬＮ－１２１の組み合わせ、または同様に他の挙げられるラミニンの組み合わせであり得る。基材はまた、他の基本因子を含み得る。特定の実施形態において、上記ラミニンは、無傷のラミニンからなる、すなわち、３個全ての鎖を完全に含む。基材が、他の特定の実施形態において、特定されたラミニンのフラグメントからなり得ることもまた、企図される。幹細胞は、約１０，００
０細胞／ｃｍ^２の密度でプレートされ得る。

この１６～２５日の期間の間にラミニン被覆基材上で幹細胞を分化させるための少なくとも２つの異なるプロトコル／方法は、本明細書で企図される。一方のプロトコルは、図２で図示され、他方のプロトコルは、図３で図示される。

図２のプロトコルでは、４種の異なる細胞培養培地が幹細胞に適用される。それら４種の細胞培養培地の組成は、ここで記載される。これら細胞培養培地は、一次細胞培養培地、二次細胞培養培地、三次細胞培養培地、および四次細胞培養培地と本明細書でいわれる。

一次細胞培養培地は、Ｎ２Ｍ、ＴＧＦ－βインヒビター；およびＧＳＫ３インヒビターを含む。Ｂ２７サプリメントは存在しない。特定の実施形態において、一次細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。ＴＧＦ－βインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、および特に、約１０μＭの濃度で存在する。具体的実施形態において、ＴＧＦ－βインヒビターは、ＳＢ４３１５４２である。ＧＳＫ３インヒビターは、約０．２μＭもしくはこれより高い濃度で存在する。具体的実施形態において、ＧＳＫ３インヒビターは、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの実施形態において、一次細胞培養培地は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）タンパク質（例えば、ＳＨＨ－Ｃ２４ＩＩ）をさらに含む。存在する場合、ＳＨＨタンパク質は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ（約１００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２００ｎｇ／ｍｌを含む）の量で存在する。ノギンはまた、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し得る。ノギンはまた、ＴＧＦ－βインヒビターとして作用する。さらに特定の実施形態において、一次細胞培養培地は、これらの列挙された成分（ＳＨＨおよびノギンを含む）からなる。ＲＯＣＫインヒビターは、プレートする工程の後の最初の２４時間～７２時間の間に培地中に存在する。具体的実施形態において、ＲＯＣＫインヒビターは、Ｙ－２７６３２である。ＲＯＣＫインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、および特に、約１０μＭの濃度で存在する。望ましい場合、ＲＯＣＫインヒビターを含む一次細胞培養培地（「一次－Ａ」）は、ＲＯＣＫインヒビターを含まない一次細胞培養培地（「一次－Ｂ」）とは異なる培地と見做され得る。

二次細胞培養培地は、Ｎ２Ｍおよび線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。特定の実施形態において、二次細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。Ｂ２７サプリメントは存在しない。ＦＧＦは、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。特定の実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ８ｂである。

三次細胞培養培地は、Ｂ２７Ｍ、ＲＯＣＫインヒビター、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびアスコルビン酸（ＡＡ）、ならびに必要に応じてグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。Ｂ２７がこの培地中には存在するが、Ｎ２は存在しないことに注意されたい。特定の実施形態において、三次細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。ＦＧＦは、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。特定の実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ８ｂである。ＢＤＮＦは、約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。ＡＡは、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭ、および特に、約０．２ｍＭの濃度で存在する。ＲＯＣＫインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、および特に、約１０μＭの濃度で存在する。ＧＤＮＦは、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得るが、通常は、排除される。

四次細胞培養培地は、Ｂ２７Ｍ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびアスコルビン酸（ＡＡ）、ならびに必要に応じてグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む。Ｂ２７はこの培地中に存在するが、Ｎ２は存在しないことに注意されたい。特定の実施形態において、四次細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。ＦＧＦは、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。特定の実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ８ｂである。ＢＤＮＦは、約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。ＡＡは、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭ、および特に、約０．２ｍＭの濃度で存在する。ＧＤＮＦは、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１０ｎｇ／ｍｌの量で存在し得るが、通常は、排除される。四次細胞培養培地は、三次細胞培養培地と概して同一であるが、ＲＯＣＫインヒビターを含まない。

次に、図２の分化プロトコルが記載される。幹細胞は、約１０，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレートされ得る。幹細胞がラミニン被覆基材（上記で記載されるとおり）上に最初にプレートされた後、一次細胞培養培地は、約１５６時間～約２２８時間（すなわち、約７日間～約９日間）の期間にわたって適用される。一次細胞培養は、定期的に交換され得る。一次細胞培養培地は、次いで、除去され、二次細胞培養培地が基材に添加される。

この点に関して、二次細胞培養培地は、ＦＧＦを含み、種々の量のＦＧＦおよびＦＧＦ添加のタイミング（すなわち、７～９日間）は、得られる細胞の前後軸パターン形成を制御し得る。二次細胞培養培地は、次いで、最初のプレートする工程の約２５２時間～約２７６時間（すなわち、約１１日間）後に除去される。言い換えると、細胞は、約３６時間～約６０時間の期間（すなわち、約２～４日間）にわたって二次細胞培養培地に曝される。

次いで、細胞は、単一細胞への解離を通じて再度プレートされ、ＲＯＣＫインヒビターを含む三次細胞培養培地に曝される。再度プレートする工程のときの細胞密度は、約５０万個細胞／ｃｍ^２～約１００万個細胞／ｃｍ^２であり得る。三次細胞培養培地がごく短期間、すなわち、約４８時間以下にわたって、再度プレートする工程の間に使用されることが企図される。細胞は、次いで、最初のプレートする工程後の約３２４時間～約３９６時間まで（すなわち、約１４～１６日間）、四次細胞培養培地に曝される。言い換えると、細胞は、約１０８時間～約１３２時間（すなわち、約５日間）の期間にわたって四次細胞培養培地に曝される。約１４～１６日後、細胞密度は、約１７８万個細胞／ｃｍ^２程度の高さであり得る。約１６日～約２５日後に、神経細胞は、低温貯蔵または移植の準備ができている。所望の細胞の正体は、本明細書でさらに記載されるように、所望のマーカーの発現によって検証され得る。

ここで図３を参照すると、６種の異なる細胞培養培地は、この２５日間の期間の間に幹細胞およびラミニン被覆基材に適用される。それら６種の細胞培養培地の組成は、ここで記載される。

第１の細胞培養培地は、ＮＩＭまたはＮ２Ｍ；ＲＯＣＫインヒビター；ＴＧＦ－βインヒビター；およびＧＳＫ３インヒビターを含む。特定の実施形態において、第１の細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。種々の添加剤は、先に上記で記載される具体的添加剤の任意の組み合わせであり得る。ＲＯＣＫインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、および特に、約１０μＭの濃度で存在する。ＴＧＦ－βインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、および特に、約１０μＭの濃度で存在する。ＧＳＫ３インヒビターは、約０．２μＭもしくはこれより高い濃度で存在する。本明細書でさらに説明されるように、ＧＳＫ３インヒビターの量／濃度は、得られる神経細胞のタイプに影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、第１の細胞培養培地は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）タンパ
ク質をさらに含む。存在する場合、ＳＨＨタンパク質は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ（約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２００ｎｇ／ｍｌを含む）の量で存在する。ノギンはまた、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し得る。ノギンはまた、ＴＧＦ－βインヒビターとして作用する。さらに特定の実施形態において、第１の細胞培養培地は、これらの列挙された成分（ＳＨＨおよびノギンを含む）からなる。

第２の細胞培養培地は、ＮＩＭまたはＮ２Ｍ；ＴＧＦ－βインヒビター；およびＧＳＫ３インヒビターを含む；しかし、第１の細胞培養培地には存在したＲＯＣＫインヒビターを含まない。特定の実施形態において、第２の細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。これら添加剤の量は、上記で記載されるとおりである。いくつかの実施形態において、第２の細胞培養培地は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）タンパク質をさらに含む。存在する場合、ＳＨＨタンパク質は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ（約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２００ｎｇ／ｍｌを含む）の量で存在する。ノギンはまた、この第２の細胞培養培地中に約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２００ｎｇ／ｍｌの量で存在し得る。特定の実施形態において、第２の細胞培養培地は、これらの列挙された成分（ＳＨＨおよびノギンを含む）からなる。

第３の細胞培養培地は、（ｉ）ＮＰＭまたはＮ２Ｍ；および（ｉｉ）ＴＧＦ－βインヒビターを含む。ＴＧＦ－βインヒビターは、約５μＭ～約１５μＭ、および特に、約１０μＭの濃度で存在する。ノギンはまた、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在し得る。いくつかの実施形態において、第３の細胞培養培地は、ＧＳＫ３インヒビターおよびＳＨＨタンパク質をさらに含む。存在する場合、ＧＳＫ３インヒビターは、約０．２μＭもしくはこれより高い濃度で存在する。存在する場合、ＳＨＨタンパク質は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ（約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２００ｎｇ／ｍｌを含む）の量で存在する。特定の実施形態において、第３の細胞培養培地は、ＮＰＭまたはＮ２Ｍ、ＴＧＦ－βインヒビター、ＧＳＫ３インヒビター、およびＳＨＨタンパク質からなる。

第４の細胞培養培地は、（ｉ）ＮＰＭまたはＮ２Ｍ；および（ｉｉ）ＦＧＦを含む。ＦＧＦは、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。

第５の細胞培養培地は、Ｂ２７Ｍ；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；アスコルビン酸（ＡＡ）；グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；およびＦＧＦを含む。特定の実施形態において、第５の細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。ＢＤＮＦは、約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。ＡＡは、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭ、および特に、約０．２ｍＭの濃度で存在する。ＧＤＮＦは、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。ＦＧＦは、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１００ｎｇ／ｍｌの量で存在する。

第６の細胞培養培地は、神経成熟のために使用され得；Ｂ２７Ｍ；ＢＤＮＦ；アスコルビン酸（ＡＡ）；ＧＤＮＦ；ｄｂ－ｃＡＭＰ；およびγ－セクレターゼを含む。特定の実施形態において、第６の細胞培養培地は、これらの列挙された成分からなる。ＢＤＮＦは、約５ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約２０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。ＡＡは、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭ、および特に、約０．２ｍＭの濃度で存在する。ＧＤＮＦは、約２ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、および特に、約１０ｎｇ／ｍｌの量で存在する。ｄｂ－ｃＡＭＰは、約２００μＭ～約８００ｍＭ、および特に、約５００μＭの濃度で存在する。γ－セクレターゼは、約０．１μＭ～約５μＭ、および特に、約１μＭ
の濃度で存在する。

幹細胞がラミニン被覆基材上に最初にプレートされた後、第１の細胞培養培地は、約３６時間～約６０時間、および特に、約４８時間（すなわち、２日間）の期間にわたって適用される。第１の細胞培養培地は、次いで、除去され、第２の細胞培養培地が基材に添加される。第２の細胞培養培地は、最初のプレートする工程の約８４時間～約１０８時間後に（すなわち、ほぼ４日目）に除去され、第３の細胞培養培地と交換される。第３の細胞培養培地は、最初のプレートする工程の約１５６時間～約１８０時間後に交換され得る。次いで、第３の細胞培養培地は、最初のプレートする工程の約１５６時間～約２２８時間後（すなわち、最初のプレートする工程の約７～９日後）に除去される

この点に関して、得られる細胞の前後軸（ｒｏｓｔｏ－ｃａｕｄａｌ）パターン形成は、第１から第３の細胞培養培地を使用するこの最初の期間の間に、ＧＳＫ３インヒビターの用量依存性添加によって制御され得る。いくつかの実施形態において、０．２μＭ～０．４μＭのＧＳＫ３インヒビターは、間脳という最終結果に行き着くためにこれら細胞培養培地において使用される。他の実施形態において、０．６μＭ～０．８μＭのＧＳＫ３インヒビターが、中脳という最終結果に行き着くために使用される。さらに他の実施形態において、１μＭ～２μＭのＧＳＫ３インヒビターが、菱脳前部という最終結果に行き着くように使用され得る。なおさらなる実施形態において、４μＭより多くのＧＳＫ３インヒビターが、菱脳後部という最終結果に行き着くように使用され得る。

同様に、神経前駆細胞の背腹軸（ｄｏｒｓｏ－ｖｅｎｔｒａｌ）パターン形成は、ＳＨＨタンパク質の用量依存性添加によって制御され得る。いくつかの実施形態において、ＳＨＨタンパク質が培養物に全く添加されない場合、細胞は、翼板という最終結果に行き着くように富化される。他の実施形態において、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨタンパク質は、基板という最終結果に行き着くように富化するために添加され得る。さらに他の実施形態において、２００ｎｇ／ｍＬより多くのＳＨＨタンパク質は、底板という最終結果に行き着くように富化するために添加され得る。蓋板という最終結果に行き着くように富化するために、ＴＧＦ－βインヒビターもノギンも、第３の細胞培養培地（ほぼ４日目に適用）には全く存在しないはずである。これは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の活性化を可能にする。

いくつかの実施形態において、パルモルファミンおよびＳＨＨタンパク質は、より強力な腹側化を得るために、第２のおよび第３の細胞培養培地に添加され得る。パルモルファミンは、約０．１μＭ～約１μＭ、および特に、約０．５ｍＭの濃度で存在するべきである。

続いて、第３の細胞培養培地は、最初のプレートする工程の約１５６時間～約２２８時間後に、第４の細胞培養培地と交換される。上記で考察されるように、第４の細胞培養培地中のＦＧＦの量およびタイミングは、前駆細胞の前後軸パターン形成を制御し得る。第４の細胞培養培地は、次いで、最初のプレートする工程の約２５２時間～約２７６時間後に（すなわち、最初のプレートする工程の約１１日後に）除去される。この時点で、細胞は、第２のラミニン被覆基材上に再度プレートされ得、そして第５の細胞培養培地が添加される。細胞は、最初のプレートする工程後の約３２４時間～約３９６時間まで（すなわち、約１４日目～１６日目）、第５の細胞培養培地中で培養される。第５の細胞培養培地は、最初のプレートする工程の約３２４時間～約３４８時間後に同様に交換され得る。

約１４～１６日後、第１～第５の細胞培養培地を使用するこれらのプロセスの細胞の正体は、ＦＯＸＧ１、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、およびＨＯＸＡ２を含む局所マーカー（ｒｅｇｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒｓ）の発現によって検証され得る。約１６日～
約２５日後に、神経細胞は、低温貯蔵または移植の準備ができている。成熟神経表現型を必要とする長期研究のために細胞が使用されようとしている場合には、それらは、第６の細胞培養培地中で培養され得る。得られた神経細胞が、大量に得られる。

図２および図３の細胞培養培地は、互いに比較され得る。図２の一次細胞培養培地は、図３の第２の細胞培養培地に類似である。図２の二次細胞培養培地は、図３の第４の細胞培養培地に類似である。図２の四次細胞培養培地（Ｂ２７Ｍ）は、図３の第５の細胞培養培地（ＮＤＭ）に類似である。

以下の実施例は、本開示をさらに例証する目的である。実施例は、例証するに過ぎず、そこで示される材料、条件、またはプロセスパラメーターに対する開示に従って作製されるデバイスを限定することを意図しない。

ラミニン－１１１でのプレート被覆

分化を開始する前に、ＰＢＳおよびＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋（総容積３００μＬ）中の約１μｇ／ｃｍ^２ラミニン－１１１を、２４ウェルプレート上に被覆した。数個のウェルに関しては、ラミニン－１１１およびＰＢＳをウェルの中に直接混合した。このプレートを振盪して、均質な被覆を担保した。次いで、このプレートをパラフィルムで覆い、使用前に４℃で約１～約７日間静置した。

ＣＨＩＲ９９０２１の希釈

ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ ＣＨＩＲ９９０２１ストックを調製した。このストックを、アリコートに分け（５～１０μＬ／バイアル）、－２０℃で貯蔵した。このアリコートは、廃棄する前に３回まで融解され得る。

培養にあたっての使用に関して、ＣＨＩＲ９９０２１をＮ２Ｍ中に１：１００希釈して、細胞培養培地に添加する前に１００μＭ溶液を得た。

実施例１
材料および方法

神経誘導培地（ＮＩＭ）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）およびノギン（１００ｎｇ／ｍＬ）を合わせて、分化培地を作った。およそ２５０μＬの培地が、分化の１ｃｍ^２あたりに必要とされた。腹側中脳という最終結果へとパターン形成するために、０．６～１．０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１および２００ｎｇ／ｍＬ Ｓｈｈ－Ｃ２４ＩＩを、上記培地に添加した。

コロニーは、多能性であるようであり、何らかの分化したコロニーを、分化を開始する前に培養物から除去した。ＳｔｅｍＭＡＣＳ ｉＰＳＢｒｅｗ培地を吸引し、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄した。ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）を上記細胞に添加し、上記細胞を室温で約７分間インキュベートした。そのプレートを、ときどき揺すって、上記細胞がＥＤＴＡ中に沈むのを担保した。

１０ｍＬ洗浄培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２と０．１％アルブミン、または増殖培地に類似の他の培地）を、１５ｍＬチューブに調製した。ＥＤＴＡを除去し、１ｍＬ洗浄培地を、上記プレートに移した。

コロニーを、ピペットで上記ディッシュから直ぐに取り出し、均質なサイズを生じるように微細化したと同時に、単一の細胞への解離を回避した。次いで、それらコロニーを１５ｍＬチューブに洗浄培地とともに移した。細胞懸濁物を混合し、１ｍＬ懸濁物を、計数するために１．５ｍＬチューブに移した。そのチューブを、４００×ｇで５分間遠心分離した。

上記１．５ｍLチューブから培地を吸引し、細胞を１００μＬアクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）中に再懸濁した。その細胞を、インキュベーター中で７分間静置して、単一細胞懸濁物を得た。９００μＬ洗浄培地をこの１．５ｍＬチューブに添加し、細胞を、ピペットで解離させた。次いで、細胞を計数して、懸濁物中の細胞総数を概算した。およそ１０，０００細胞／ｃｍ^２が、分化を開始するために必要とされ、４００×ｇで５分間遠心分離する前に、懸濁物から新しいチューブへと移した。

この洗浄培地を吸引し、ＮＩＭ、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、ノギン（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＨＩＲ９９０２１（０．７μＭ）およびＳＨＨ－Ｃ２４ＩＩ（２００ｎｇ／ｍｌ）の混合分化培地中で再懸濁して、５０，０００細胞／ｍＬの細胞懸濁物を得た。ラミニン－１１１を被覆プレートから吸引し、この細胞懸濁物を、上記被覆プレート上に１０，０００ 細胞／ｃｍ^２（およそ２５０μＬ培地／ｃｍ^２）で播種した。このプレートを、徹底的に振盪しぐるぐると動かして、均質な細胞プレーティングを得た。

約４８時間後（２日目）、上記培地を、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）およびノギン（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む新しい神経誘導培地（ＮＩＭ）へと交換した。腹側中脳という最終結果へとパターン形成するために、０．６～１．０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１および２００ｎｇ／ｍＬ ＳＨＨ－Ｃ２４ＩＩを、上記培地に添加した。その同じ容積の分化培地を、分化を開始するために使用される容積として使用した。

約４８時間後（すなわち、プレートしてから約９６時間、４日目）、上記培地を、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）およびノギン（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む神経増殖培地（ＮＰＭ）へと交換した。腹側中脳という最終結果へとパターン形成するために、０．６～１．０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１および２００ｎｇ／ｍＬ Ｓｈｈ－Ｃ２４ＩＩを、上記培地に添加した。およそ３５０μＬ培地を、１ｃｍ^２あたりに添加した。

約７２時間後（すなわち、プレートしてから約１６８時間、７日目）、上記培地を、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）およびノギン（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＮＰＭに更新した。腹側中脳という最終結果へとパターン形成するために、０．６～１．０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１および２００ｎｇ／ｍＬ Ｓｈｈ－Ｃ２４ＩＩを、上記培地に添加した。およそ３５０μＬ培地を、１ｃｍ^２あたりに添加した。

約４８時間後（すなわち、プレートしてから約２１６時間、９日目）、上記培地を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ８ｂ）（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＮＰＭに交換した。およそ５００μＬ培地を、１ｃｍ^２あたりに添加した。

約４８時間後（すなわち、プレートしてから約２６４時間、１１日目）、上記細胞を、新しい１２ウェルラミニン－１１１被覆プレート上に再度プレートした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、プレート中で振盪して、全ての死細胞および浮遊細胞を除去した。およそ３００μＬアクターゼを各ウェルに添加した。細胞を、インキュベーター中で１０分間静置し、ときどき振盪して、上記細胞がアクターゼ中に沈むことを担保した。

１５ｍＬチューブを、１０ｍＬ ＮＰＭで調製した。１０分後、上記細胞を１ｍＬピペ
ットで解離して、単一細胞懸濁物を得、ＮＰＭを含む上記１５ｍＬチューブに移した。細胞を、４００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、その培地を吸引し、その細胞ペレットを１．５ｍＬチューブ中の１ｍＬ ＮＰＭ中に移して再懸濁した。１０μＬ細胞懸濁物を計数するために除去した。この懸濁物を１：１０～１：５０希釈した。計数する間に、細胞を４００×ｇで５分間遠心分離した。

その培地を吸引し、Ｂ２７培地（Ｂ２７Ｍ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（２０ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（ＡＡ）（０．２ｍＭ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）中に、１７０万個細胞／ｍＬの密度へと細胞を再懸濁した。ラミニン－１１１を上記被覆プレートから吸引し、上記細胞を、８００，０００細胞／ｃｍ^２の密度において上記プレート上へと播種した。このプレートを、徹底的に振盪しぐるぐると動かして、インキュベートする前に上記細胞の均質なプレーティングを得た。

７２時間後（すなわち、プレートする工程の約３３６時間後、１４日目）、上記細胞上の培地を、Ｂ２７Ｍ、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＡＡ（０．２ｍＭ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）で更新した。およそ５００μＬ培地を１ｃｍ^２あたりに添加した。

４８時間後（すなわち、プレートする工程の約３８４時間後、１６日目）、上記細胞は、低温貯蔵および／または移植の準備ができていた。

前駆細胞表現型の検証

細胞の類似のプレートを、ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、およびＦＧＦ８ｂを含むＢ２７Ｍ中で、１４日目（すなわち、プレートする工程の３３６時間後）まで維持し、次いで、ＲＮＡ分析のために採取したか、または免疫細胞化学のために固定した。１４日目に、上記細胞の領域の正体を、局所マーカー（例えば、ＦＯＸＧ１、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、およびＨＯＸＡ２）のそれらの発現によって明らかに同定した。

実施例２
材料および方法

実施例１で開示される同じ材料およびプロトコルを、以下を変更して２４ウェルプレートに対して使用する：

プレートを、ＰＢＳおよびＣａ^２＋／Ｍｇ^２＋（７００μＬ／ｃｍ^２）中のラミニン－１１１（１μｇ／ｃｍ^２）で被覆した。ラミニン－１１１被覆プレート上に細胞懸濁物を播種するために、１ｃｍ^２あたりおよそ２５０μＬを要した（５００μＬ／ウェル）。分化を開始するために、２４ウェルプレートのうちの６ウェルに関して、合計で１２０，０００細胞を要した。

プレートする工程の９６時間および１６８時間後を目印にして、およそ６００μＬ培地を、各ウェルに添加した。プレートする工程の２１６時間後を目印にして、およそ７００μＬ培地を、各ウェルに添加した。

いくつかの細胞株は、再度プレートする工程を生き延びるために、培地への１０μＭ Ｙ－２７６３２の添加を要した。再度プレートする工程の間に、およそ１５０μＬアクターゼを各ウェルに添加した。３３６時間を目印にして、およそ７００μＬ培地を、各ウェルに添加した。

実施例３
移植用の細胞の調製（１６～２５日目）

実施例１および２で開示される同じ材料およびプロトコルを使用する。

細胞を、何らさらなる操作もなしに、移植の日までＢ２７Ｍ、ＢＡＧ（ＢＤＮＦ＋ＡＡ＋ＧＤＮＦ）、およびＦＧＦ８ｂ中で維持した。培地を、２～３日ごとに更新した。細胞は、１６日目に移植に最も適していたが、２６日目までは移植できた。移植用の細胞は、培地中にＤＡＰＴもｄｂ－ｃＡＭＰも受容しなかった。なぜならこれは、時期尚早の神経成熟および解離の際の細胞死の増大を生じさせるからである。

実施例４
長期最終神経成熟

実施例１および２で開示される同じ材料およびプロトコルを使用する。

成熟神経表現型の長期研究のための細胞を、１６日目～２５日目の間に、再度プレートして、培養物の高すぎる密度および細胞の解離を回避した。細胞をＢ２７ＭおよびＢＡＧ（ｄｂ－ｃＡＭＰおよびＤＡＰＴを含まない）中で、再度プレートする日まで維持した。再度プレートする工程を、１１日目（すなわち、最初のプレートする工程の２６４時間後）に使用したのと同じ手順を使用して行い、細胞を、再度プレートする工程の後、Ｂ２７Ｍ、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ）、ｄｂ－ｃＡＭＰ（５００μＭ）、およびＤＡＰＴ（１μＭ）中で維持した。

後の時点で再度プレートする工程は、成熟神経細胞に対するストレスに起因して回避されるべきである。分化の後期ステージでは、ニューロンは、プレートから解離し始める可能性がある。これは、細胞培養培地にラミニンおよびフィブロネクチン（ＦＮ）を添加することによって弱められ得る。成熟ドパミン作用性表現型は、４５日目以降に出現し始めるに過ぎない。

実施例５
過去６年間に、５００匹を超えるラットに、ｈＥＳ細胞由来ｍｅｓＤＡ前駆細胞の３１種の異なるバッチを、種々の異なる研究部位において脳内に移植した。移植実験計画の全体像を、以下の表２～３に示す。移植部位に関して：Ｓｔｒ．＝線条体、ＳＮ＝黒質。ラット宿主系統に関しては、ＳＤ＝Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、ＬＨ＝Ｌｉｓｔｅｒ－ｈｏｏｄｅｄ、Ａｔ＝Ａｔｈｙｍｉｃ Ｃｒｌ：ＮＩＨ－Ｆｏｘｎ１ｒｎｕ。免疫抑制に関しては、Ｃｉｃｌｏ＝シクロスポリンの毎日の腹腔内注射（１０ｍｇ／ｋｇ）、移植前日から開始。

図４Ｅでそのスキームが例証される全ての実験において、ｈＥＳＣを、１６日間にインビトロで分化させ、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣの種々の異なるバッチを、６－ＯＨＤＡで一側性ドパミン作用性病変に供したラットに移植した。図４Ａは、上記細胞がインビボで成熟し、脳をＴＨで染色した後の移植片の一連の写真である。全ての腹側中脳パターン形成細胞バッチを、移植する（ｇｒａｔｉｎｇ）前に、腹側中脳マーカーであるＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２、およびＯＴＸ２の高発現について慣用的に評価したが、移植片サイズおよびドパミンニューロンの数に関するインビボ転帰は、実験間で変動した。

これらの実験からバッチ間変動性のレベルを決定するために、移植した１００，０００細胞あたりの各動物のＴＨ＋ニューロンの総数（ＤＡ収量）を、定量した。これを図４Ｂにグラフで図示する。移植片サイズは、免疫染色後のＨｕＮｕ＋細胞容積（ｍｍ^３）に基づいた。移植片容積の図示は、図４Ｃに示される。全ての定量に関して、値を、移植した１００，０００細胞あたりで報告した。これは、全ての移植片に関してＤＡ密度（ＴＨ＋／ｍｍ^３）の概算を可能にした。これを図４Ｄに示す。これらの定量的評価から、かなり
の実験間変動性が明らかになった。

一般的に使用されるｍｅｓＤＡ前駆細胞の目印がインビボでの成熟後の移植片中のＴＨ＋含有量をどの程度インビトロで推定するかを決定するために、ＲＮＡサンプルを、移植日に上記で挙げた各個々の細胞バッチから集め（全て、高レベルのＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ共発現細胞を含む）、分析した。再度プレートした同じ細胞に由来するＲＮＡサンプルはまた、さらなるインビトロ成熟の後に分析した。

図４Ｆは、１６日目（すなわち、移植の日）での移植した細胞集団中のＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＣＯＲＩＮの遺伝子発現に対してプロットした、各移植実験における平均ＴＨ＋細胞含有量を示す一連のグラフである。同様に、図４Ｇはまた、１６日目での移植した細胞集団を代表する一連のグラフであるが、そのグラフは、ＴＨ、ＮＵＲＲ１、およびＡＡＤＣの遺伝子発現を示す。スピアマン相関（腹側中脳細胞のみ）の結果は、各グラフ中のＲおよびｐ値として示され、相関の傾向を、線形回帰直線によって示す。

一般に使用されるｍｅｓＤＡマーカーであるＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、およびＣＯＲＩＮの発現は移植片のドパミン作用性分化に必要とされることが見出された。しかし、移植の時点でのＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａの発現レベルは、移植片中のＤＡ収量と有意に相関しなかった。これは、ＦＯＸＡ２／ＬＭＸ１Ａ共発現細胞内で、さらなるマーカーが、インビボ転帰を推定するために必要とされることを示唆する。

図４Ｆおよび図４Ｇは、前駆細胞の、ニューロンへの長期化したインビトロ成熟が、移植片でのそれらの相当するインビボ成熟を示したか否かの評価を表す。移植のために使用した細胞がまた３９～４５日間（わずか１６日間の代わりに）にわたって並行した最終分化にインビトロで供されたさらなる実験において、ＤＡマーカーであるＴＨ、ＮＵＲＲ１、およびＡＡＤＣの発現レベルが、移植後のＤＡ収量に統計的に有意な相関を何ら示さないことが見出された。

実施例６
移植後のＤＡ収量（すなわち、成功裡の移植転帰）と正に相関する潜在的マーカーの先入観のない検索を可能にするために、全般的な遺伝子発現プロファイリングを、ＲＮＡ配列決定を使用して、移植の日に集めた細胞サンプルについて行った。

偏りのない遺伝子発現分析のために、移植実験を、移植片中のＴＨ＋細胞の総数に基づいてＤＡ高群およびＤＡ低群に分けた。バッチ間のＴＨ＋含有量のグラフ比較を、図５Ａに示す。移植片のドパミン作用性機能を、アンフェタミン誘導性回転またはＰＥＴ画像化を通じて、長期成熟（すなわち、１６週間より長い）を伴う移植片において評価した。「－」記号は、機能回復の欠如を示し、「＋」記号は、機能回復を示し、「ＮＤ」は決定されない、を示す。

重要なことには、機能回復の欠如を伴う全ての長期の移植片は、ＤＡ低群にあったのに対して、ＤＡ高群は、機能回復を媒介し得る治療的潜在性を伴う細胞を含んだ。

ＤＡ高細胞バッチおよびＤＡ低細胞バッチが、別個の遺伝子発現プロフィールによって同定され得るか否かを理解するために、偏りのない主成分分析（ＰＣＡ）を、全ての選択された１６日目ＲＮＡ配列決定サンプルに対して行った。図５Ｂで示されるように、ＤＡ高サンプルのクラスター化は、正のＰＣ１軸を認め、これらは、ＦＧＦ８、ＰＡＸ５、ＥＮ２、およびＣＮＰＹ１のような遺伝子を含み、そのうちの全てが、中脳－後脳境界（ＭＨＢ）形成にとって重要であることが示された。

この２群間で明らかに異なる発現プロフィールが存在したので、Ｄｅｓｅｑ２分析を行って、ＤＡ高サンプルとＤＡ低サンプルとの間で全ての差次的に発現される遺伝子を同定した。図５Ｉは、ＤＡ高細胞サンプルおよびＤＡ低細胞サンプルからのＲＮＡ配列決定データのＤｅｓｅｑ２分析後の、推定マーカーのグラフ分析である。マーカーを、正規化した計数の平均と比較して、ｌｏｇ２倍数変化に基づいてプロットした。この分析から見えてくる上位１２個のランク付けした遺伝子から、繰り返すと、インビボでのＤＡ収量と正に関連付けられる、尾側腹側中脳およびＭＨＢ領域において発現する遺伝子の高い代表が見出された（すなわち、ＰＡＸ５、ＦＧＦ８、ＳＰＲＹ１、ＥＮ１、ＥＮ２、ＳＰ５、ＥＴＶ４、ＣＮＰＹ１、ＴＬＥ４、およびＥＴＶ５）。これらの発現プロフィールは、図５Ｃに示される。これらの１２の遺伝子は、最高の倍数変化およびｐ値＜０．００１を有するものである。

これらの選択したマーカーの推定値を評価するために、直接スピアマン相関分析を、ＰＣＡおよびＤｅｓｅｑ２分析から選択した遺伝子のＲＮＡ発現レベルに対して、移植転帰（すなわち、ＴＨ＋含有量）間で行った。図５Ｄ～５Ｅは、ＥＮ１およびＰＡＸ８に関するスピアマン相関分析の結果を具体的に示す。スピアマン相関分析の結果をＲおよびｐ値として示し、相関を線形回帰直線で可視化した。ＲＮＡ配列決定データセットを検証するために、遺伝子相関の部分セットを、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して評価した（４回のさらなる移植実験を含み、図５Ｅとして具体的に表示される）

ＴＨ＋含有量、移植片容積、ＤＡ密度およびＭＨＢ遺伝子のＲＮＡレベルと一般的腹側中脳マーカーとの間のＲＮＡ配列決定相関分析のまとめを、図５Ｆに示す。模式図は、ｐ＜０．０５でのスピアマン相関分析によって規定される正の相関のみを示す。ｑＲＴ－ＰＣＲによって検証した遺伝子を、太字で示す。

これらの相関を、一般に使用される腹側中脳マーカー（すなわち、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＰ２、ＣＯＲＩＮ、およびＯＴＸ２）の相関と比較した。

分析から、ＤｅＳｅｑ２によって同定された尾側腹側中脳マーカーのうちの大部分は、図５Ｇで示されるように、移植片サイズおよび移植片の総ＴＨ含有量と正の相関を示すことが示された。図５Ｇは特に、細胞バッチ中のＲＮＡレベルのスピアマン距離分析の図示であり、これは、ＭＨＢ遺伝子の共調節を示す。マーカーＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＷＮＴ１、ＥＴＶ５、およびＣＮＰＹ１は、ＤＡ密度（ＴＨ＋／ｍｍ^３）と正に相関した。これらは、より範囲が広くかつより幅広く発現される腹側中脳マーカーであるＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＰ１、およびＦＯＸＰ２と対比をなした。これらは、いくつかの分析によって、移植片サイズと総ＤＡ収量の両方に対して負の相関を示した。このことは、それらがＭＨＢ遺伝子クラスターと対にならないか負の関係で対になっている可能性があることを示す。ＬＭＸ１ＡおよびＯＴＸ２は、ＤＡ密度に対してのみ正の相関を示したが、移植片のＤＡ収量に対しては示さなかった。

ＲＮＡ配列決定分析において同定された遺伝子が共調節される遺伝子ネットワークの一部を形成するか否かを調べるために、スピアマン相関分析を、腹側中脳パターン形成細胞のうちの２９バッチにおいて他に対する各候補遺伝子の発現値について行った。図５Ｇで認められるように、ＤＡ高収量と関連したＭＨＢ遺伝子の全ては、共調節のパターンを示した。特に、ＭＨＢマーカーであるＳＰＲＹ１およびＥＴＶ４／５ならびに尾側腹側中脳マーカーであるＥＮ１およびＣＮＰＹ１は、この分析においてクラスター化し、このことは、遺伝子間での強い共調節を示唆する。しかし、ＬＭＸ１ＡおよびＯＴＸ２は、これら遺伝子でほとんどまたは全く、正の共調節を示さなかった。ＣＯＲＩＮ、ＬＭＸ１Ｂ、ＦＯＸＡ２、およびＦＯＸＰ２は、尾側遺伝子のうちのいくつかの負に相関した。これは、これら一般に使用されるマーカーが、尾側腹側中脳表現型と特異的に関連していないこと
、およびそれらが腹側中脳のより吻側のドメインにおいて高レベルで発現され得ることを示す。ｍｅｓＤＡ神経発生に関与すると報告された他の腹側中脳マーカー、すなわち、ＭＳＸ１、ＳＯＸ６、およびＰＢＸ１は、１６日目の腹側中脳パターン形成前駆細胞において分析した場合に、移植片のＤＡ密度に何ら相関を示さなかった。図５Ｈは、推定マーカーの高発現を有する異なる細胞バッチからのＴＨ＋ニューロンの一連の５枚の代表的画像であり、これは、移植した細胞の成熟形態を明らかにする。

実施例７
ＲＮＡ配列決定発現値を使用して、１６日目での移植片における間脳マーカーであるＦＥＺＦ１、ＷＮＴ７Ｂ、およびＥＰＨＡ３とＤＡ収量との間には、図６Ａで示されるように、強い負の相関が見出された。この相関は、腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣのうちのいくつかのバッチがＢＡＲＨＬ１^＋を含み、ＰＩＴＸ２^＋ＳＴＮ前駆細胞が前側ＬＭＸ１Ａ^＋／ＦＯＸＡ２^＋ドメインから由来するか否かの調査に至った。

ＢＡＲＨＬ１^＋およびＰＩＴＸ２^＋の両方を、１６日目に分化した細胞バッチ中で検出した。図６Ｂは、１６日目での腹側中脳パターン形成ｈＥＳ細胞培養物の免疫染色後の一連の画像である。これは、ＳＴＮドメインという最終結果（すなわち、ＢＡＲＨＬ１^＋／ＦＯＸＡ２^＋およびＰＩＴＸ２^＋／ＬＭＸ１^＋細胞）の存在を明らかにする。図６Ｃは、間脳ＳＴＮ領域および側方中脳ドメインにおけるＰＩＴＸ２およびＢＡＲＨＬ１の発現ドメインの模式的全体像である。図６Ｇは、分化の４２日目での図６Ｂの細胞培養物を示す。

図６Ｂ～６Ｃで示されるように、ＢＡＲＨＬ１^＋細胞は、ＦＯＸＡ２^＋またはＦＯＸＡ２^－のいずれかであることができた。このことは、分化した前駆細胞バッチにおける間脳底板細胞および側方細胞集団の両方の存在を示す。ＦＯＸＡ２^＋／ＢＡＲＨＬ１^＋／ＭＡＰ２^＋ニューロンおよびＰＩＴＸ２^＋／ＬＭＸ１Ａ／Ｂ^＋細胞は最終分化したｈＥＳ細胞培養物中に存在することがさらに見出された。このことは、これら前駆細胞がＳＴＮという最終結果へ分化したことを示す。

図６Ｄは、１８週齢移植片の共焦点画像化後の一連の画像である。腹側中脳パターン形成細胞を移植した動物において、ＢＡＲＨＬ１^＋細胞の変動性の存在が検出され、これらの細胞は、ＰＩＴＸ２^＋（腹側間脳ＳＴＮという最終結果を示す）またはＰＩＴＸ２^－（他の側方という最終結果を示す）のいずれかであった。移植の日に低いまたは高いＢＡＲＨＬ１ＲＮＡレベルを有する細胞バッチに由来した移植片中のＢＡＲＨＬ１^＋細胞含有量の例示的画像を、図６Ｅに示す。

これらのマーカーが、移植片中の非ドパミン作用性の側方および前後軸の夾雑細胞の量を推定するために使用され得るか否かを調査するために、ＢＡＲＨＬ１^＋細胞の数を、移植実験のうちのいくつかで定量した。相関分析から、移植片中のＢＡＲＨＬ１^＋細胞の密度は、図６Ｄおよび６Ｆで示されるように、移植の日での分化した細胞バッチ中のインビトロでのＢＡＲＨＬ１およびＢＡＲＨＬ２の発現レベルと正に相関することが示された。スピアマン相関分析の結果は、各グラフにおいてＲおよびｐ値として示され、相関は、線形回帰直線で可視化される。

これらの結果は、前駆細胞培養物中のＢＡＲＨＬ１およびＢＡＲＨＬ２が、インビトロおよびインビボの両方で腹側中脳パターン形成ｈＥＳＣ中のいくつかの一般に存在する夾雑集団を同定および定量するためのマーカーとして使用され得ることを意味した。

実施例８
腹側中脳パターン形成ｈＥＳ細胞前駆細胞の変動性の転帰を考慮して、分化プロトコル
におけるパターン形成が腹側中脳の尾側ドパミン作用性ドメインに向かって最適化され得るか否かを次に調査した（なぜならこのドメインのマーカーは、インビボでのＤＡ高収量と相関したからである）。尾側腹側中脳に位置する細胞は、ＭＨＢの近位にあり、マウスおよびニワトリモデルでの研究から、この領域におけるｍｅｓＤＡ前駆細胞の発生は、ＦＧＦ８（ＭＨＢから分泌される増殖因子）の活性に依存することが示された。さらに、ＦＧＦ８の高発現は、上記の図５Ｃで認められるように遺伝子発現分析においてＤＡ高群に相関することが見出された。

図７Ａは、０～９日目までの腹側中脳パターン形成の間に外因性ＦＧＦ８ｂで処理した分化中のｈＥＳＣの１０日目でのｑＲＴ－ＰＣＲ分析後に作った一連のグラフである。その分析から、腹側間脳（ＣＨＩＲ＝０．４μＭ）または腹側中脳（ＣＨＩＲ＝０．８μＭ）の培養物中の前脳マーカーおよび後脳のマーカーの誘導が示される。

ＦＧＦ８ｂをＳＨＨおよびＧＳＫ３ｉと一緒に分化培地に添加して、神経誘導およびパターン形成（０～９日目）の早期の間に正統なＷＮＴシグナル伝達を活性化すると、間脳パターン形成培養物中の前脳マーカーであるＦＯＸＧ１およびＳＩＸ３の、ならびに中脳パターン形成培養物中の後脳マーカーであるＨＯＸＡ２およびＧＢＸ２の有意なアップレギュレーションが誘導されることを見出した。これは、ＦＧＦ８ｂでの早期パターン形成が、いくつかの非腹側中脳前駆細胞という最終結果を有する培養物の夾雑を引き起こすことを示した。図７Ｂは、１６日目での免疫染色後の一連の画像である。これは、０～９日目までＦＧＦ８ｂで処理した培養物中のＰＩＴＸ２^＋細胞とＮＫＸ２．１^＋細胞のパッチ、およびＬＭＸ１Ａ－細胞のパッチを明らかにする。

対照的に、細胞のＦＯＸＡ２^＋／ＬＭＸ１Ａ^＋表現型は、腹側中脳に向かって最初のパターン形成が完了した（７～１６日目または９～１６日目）後にＦＧＦ８ｂを細胞に添加した場合に、図７Ｃで示されるように、維持された。

図７Ｄ～７Ｆは、ＦＧＦ８ｂで処理した１６日目の培養物に対応する。１００ｎｇ／ｍＬＦＧＦ８ｂの添加は、その培養物を９～１６日目までＦＧＦ８ｂで処理した場合に、腹側中脳前駆細胞の尾側化を引き起こした。図７Ｄ～７Ｅの免疫染色画像で示されるように、その結果は、図７Ｆにおいて定量化され、ＢＡＲＨＬ１^＋およびＰＩＴＸ２^＋レベルは、ともに低下した。しかし、コントロール腹側中脳培養物がＥＮ１発現を完全に欠いたのに対して、ＥＮ１^＋前駆細胞およびＥＮ１ｍＲＮＡは、９～１６日目までＦＧＦ８ｂで処理した培養物において豊富であった。図７Ｅは、ＥＮ１の免疫染色を示す一連の画像である一方で、図７Ｇは、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析後のＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＯＴＸ２、およびＥＮ１のｍＲＮＡレベルを図示する。

まとめると、９～１６日目までのＦＧＦ８ｂでの処理は、ＢＡＲＨＬ１＋／ＦＯＸＡ２＋前駆細胞およびＰＩＴＸ２＋ＳＴＮ前駆細胞のパーセンテージの有意な減少をさらに引き起こした。これは、図７Ｄ～７Ｆに図示される。この低下は、培養物へのＦＧＦ８ｂの後期の添加が、前駆細胞の運命を、前側腹側中脳およびＳＴＮという最終結果から尾側腹側中脳ｍｅｓＤＡ前駆細胞という最終結果に向かってシフトさせることを示した。

フローサイトメトリー分析（図７Ｈ～７ＩにおいてＦＡＣＳプロットとして示される）から、９～１６日目までのＦＧＦ８ｂの添加はＦＯＸＡ２^＋前駆細胞のパーセンテージに影響を及ぼさないが、ＣＯＲＩＮ^＋前駆細胞の数が４７％低下することが示された。これは、図５Ｆ～５Ｇと関連したＲＮＡ配列決定分析におけるＣＯＲＩＮに関して見出された負の相関に従った。これはタンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方でのＣＯＲＩＮ発現は、尾側ｍｅｓＤＡ前駆細胞という最終結果というよりむしろ、吻側腹側中脳／間脳という最終結果とより強く関連することを示す。

実施例９
良好な移植転帰を生じる、尾側化したｍｅｓＤＡ腹側中脳前駆細胞の高収量かつ再現性のある収量のためのＧＭＰ適合性分化プロトコルを開発するために、Ｒｏｓｌｉｎ細胞由来の完全にＧＭＰ由来ｈＥＳ細胞株ＲＣ１７（ｈＰＳ Ｃｒｅｇ ＃ＲＣｅ０２１－Ａ）を使用した。以前の研究グレードの腹側中脳分化プロトコルは、胚様体（ＥＢ）形成またはマトリゲル上での培養の実行工程を有する。その両方は、再現性の困難および規定されていない動物由来成分の含有量、それぞれに起因して、ＧＭＰ適合に問題を引き起こす。

いくつかの異なる全長ラミニンサブタイプを試験したところ、それらのうちの４種（ＬＮ－１１１、ＬＮ－４２１、ＬＮ－５１１、およびＬＮ－５２１）は、プロトコルの０～１１日目までの腹側中脳前駆細胞の接着分化を効率的に支援することが見出された。これは、図８Ａに図示され、これは、７種の試験したラミニンサブタイプにわたって神経細胞の最良の付着および収量を明らかにする一連の画像である。１００％の標準収率に対して、ＬＮ－１１１は１７０％を生じ、ＬＮ－４２１は２９４％を生じ、ＬＮ－５１１は２２３％を生じ、ＬＮ－５２１は２０８％を生じた。ＲＣ１７細胞を、ラミニン－１１１の代わりにラミニン－１２１で被覆したプレート上で行ったことを除いて、本明細書で記載される方法に従って分化させた。図８Ｃは収率を比較し、それらの収率は、互いにほぼ等しい、すなわち、ＬＮ－１２１は、基材としてＬＮ－１１１とほぼ同程度に十分に機能する。

ｈＰＳＣの増殖を効率的に支援するＬＮ－５１１およびＬＮ－５２１とは対照的に、未分化ｈＥＳＣを多能性培地（ｉＰＳ ｂｒｅｗ）中、ＬＮ－１１１上にプレートした場合、その細胞は、培養の４日間の後に球状物を形成し、図８Ｂの画像で示されるように、それは培養ディッシュから容易に解離することが見出された。同数の細胞を、Ｂ２７培地中、ＬＮ－１１１上にプレートした場合、その培養物は、接着性のままであり、７日間の分化の後にコンフルエントになるまで増殖したと同時に、多能性マーカーの急激なダウンレギュレーションを示した。図８Ｄは、０日目、２日目、４日目、および７日目に撮影した一連の画像であり、これらは、Ｂ２７培地中、ＬＮ－１１１マトリクス上での低密度ｈＥＳＣの播種が、コンフルエントな神経化培養物を生じたことを示す一方で、図８Ｅは、３日間の分化にわたって低下する多能性マーカーのｍＲＮＡレベルのグラフ図示である。これは、ＬＮ－１１１は、神経細胞の増殖を選択的に支援するが、多能性幹細胞は支援しないことを示した。これは、発生中の脳でのその広い発現と一致する。

次に、ＧＭＰ適合性基礎培地の種々の組み合わせを、腹側中脳前駆細胞の総収量および純度を最適化する目的で試験した。Ｎ２サプリメントを含むが、Ｂ２７サプリメントは含まないＮｅｕｒｏＢａｓａｌ＋ＤＭＥＭ／Ｆ１２の基礎培地中での０～１１日目までの分化が、１１日目での細胞の最高収量を生じることが見出された。図８Ｆは、分化培地にわたる細胞収量の図示である。

腹側中脳前駆細胞が正確に尾側化することを担保するために、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８ｂを分化の９～１６日目まで細胞に添加した。完全ＧＭＰ適合性のために、プロトコルにおける全ての増殖因子および化学物質は、以下の表４に挙げられるものに切り替えた。

図２で図示されるように、ＧＭＰ適合性プロトコルは、およそ１×１０^６ｈＥＳＣを、ＬＮ－１１１を含む基材上にプレートし、次いでこれを、Ｎ２培地、ＳＢ４３１５４２、ノギン、Ｓｈｈ－Ｃ２４ＩＩ、およびＣＨＩＲ９９０２１で０～９日目に培養する工程からなった。次いで、この最初の培養物を除去し、そのプレートした細胞を、Ｎ２培地およびＦＧＦ８ｂへと９～１１日目に曝したところ、前駆細胞を生じた。この前駆細胞を、次いで、０．８×１０^６／ｃｍ^２において３種の別個のプレートにＲＯＣＫインヒビター（Ｙ－２７６３２）とともに再度プレートした。１１～１６日目に、Ｙ－２７６３２を除去し、各プレートを、Ｂ２７、ＦＧＦ８ｂ、ＢＤＮＦ、およびアスコルビン酸中で培養して、およそ１．７８±０．１３×１０^６／ｃｍ^３の領域を覆う細胞を生じた。この最終収量は、元のＥＢベースの研究グレードの分化プロトコルで得られる収量より４０倍を超えて高かった。

これらの数字に基づいて、３億８０００万個より多くの移植可能な前駆細胞が、１００万個の未分化ｈＥＳＣから出発する場合に１６日間で生成され得ると外挿された。図８Ｇは、ＧＭＰ／ＬＮ－１１１プロトコルから計数した細胞と比較して、ＥＢベースのプロトコルから計数した細胞のグラフでの図示である。

これら前駆細胞をインビトロで最終分化させた後に、パッチクランプ法（ｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）を、分化後４５日目で腹側中脳という最終結果へと分化したｈＥＳＣに対して行った。カバースリップ上で増殖させた細胞を、２８℃において９５％Ｏ_２－５％ＣＯ_２を通気した連続的に流動するＫｒｅｂｓ溶液（１１９ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１．３ｍＭＭｇＳＯ_４、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、２５ｍＭグルコースおよび２６ｍＭＮａＨＣＯ_３）中に沈ませた。１２２．５ｍＭグルコン酸カリウム、１２．５ｍＭＫＣｌ、０．２ｍＭＥＧＴＡ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、２ｍ
ＭＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭＮａ_３ＧＴＰおよび８ｍＭＮａＣｌ（ＫＯＨでｐＨ７．３に調節）を満たしたホウケイ酸ガラスピペット（３～７ＭＯｈｍ）を使用して、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録を行った。データをｐＣｌａｍｐ１０．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で獲得した；電流を０．１ｋＨｚでフィルターにかけ、２ｋＨｚでデジタル化した。丸い細胞体をした神経形態を有する細胞を、全細胞パッチクランプのために選択した。静止膜電位を、電流クランプモード（ｃｕｒｒｅｎｔ－ｃｌａｍｐ ｍｏｄｅ）での慣らし運転（ｂｒｅａｋｉｎｇ－ｉｎ）の直後にモニターした。その後、細胞を、－６０ｍＶ～－８０ｍＶの膜電流で維持し、５００ｍｓ電流を、－２０ｐＡ～＋９０ｐＡまで、１０ｐＡずつ増分して注入して、活動電位を誘導した。反跳性脱分極に関して、細胞を、２０ｐＡの小さな電流の流れとともに注入して、活動電位を誘導した。自発的なシナプス後電流を、同じ内部溶液を使用して静止膜電位で記録した。

細胞がパッチクランプ法によって評価される場合、活動電位を誘発したニューロンを生じることを検証した（１１／１１）。ニューロンの成熟画分（静止膜電位＜－４０ｍＶ）において、７種の細胞のうちの４種が、短時間の脱分極後の反跳活動電位（これは、インビトロで中脳ドパミンニューロンに特徴的である）をさらに示した。図８Ｈは、脱分極電流注入で誘導した活動電位のトレースの代表である。図８Ｉは、いくつかの腹側中脳細胞がディッシュ中でのシナプス統合を示す自発的なシナプス後電流を示したことを図示するグラフである。図８Ｊは、ドパミン作用性表現型に特徴的な短い膜脱分極後の反跳性脱分極の例である。図８Ｋは、拡大したスケールで代表的トレースを示す図８Ｊからの挿入図である。

実施例１０
図３の新たなプロトコルが腹側中脳前駆細胞の純粋な集団を生じることを検証するために、培養物をＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａ／Ｂに関して染色したところ、この２種のタンパク質の高い共局在を見出した。図９Ａは、前駆細胞を免疫染色した後の一連の写真であり、これは、分化した培養物がＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２の非常に高い重なり合いを示したことを図示する。図９Ｂは、フローサイトメトリー分析後の一連のグラフであり、これは、培養物が、分化の１６日目に、平均して９５％ＯＴＸ２^＋／ＦＯＸＡ２^＋前駆細胞を含んだことを示す。

インビボ転帰を推定するバッチ間バリエーションをモニターするために、ｑＲＴ－ＰＣＲパネルを、新たな鍵となる推定マーカー（ＥＮ１、ＳＰＲＹ１、ＰＡＸ８、ＣＮＰＹ１、およびＥＴＶ５）を実行して設計した。ヒト胚性幹細胞を、実施例１０のＧＭＰプロトコルに従って分化させ、次いで、分化の１６日目に、正確な前後軸腹側中脳パターン形成、ならびに任意の夾雑する前脳（ＦＯＸＧ１）、後脳（ＨＯＸＡ２）、または側方（ＰＡＸ６）細胞集団の存在についてモニターするためのマーカーについて評価した。上記パネルにおいて使用した全てのプライマーの特異性は、以下の表５に挙げられる小さく刻んだヒト胎児組織のサンプル中で検証した。

研究グレードのプロトコルと比較して、新たなＧＭＰプロトコルの再現性および正確性を評価するために、３４の研究グレードのおよび４３のＧＭＰ腹側中脳バッチを、その設計したｑＲＴ－ＰＣＲパネルを使用して分析した。

図９Ｃは、この２つのプロトコルに従って分化したｈＥＳＣを比較する画像である。ｈＥＳＣを、分化の１６日目にＲＮＡ発現に関して評価した。腹側前脳（ｖＦＢ）および腹側後脳（ｖＨＢ）に向かう分化は、コントロールとして含めた。値をカラーコード化し、各遺伝子に関して最高の遺伝子発現を有するサンプルに対して正規化した。

細胞の全てのバッチが、ＯＴＸ１、ＯＴＸ２、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、およびＦＯＸＡ２の非常に強い発現を有した一方で、研究グレードプロトコルで生成されたバッチ間では、尾側腹側中脳マーカーＰＡＸ８、ＥＮ１、ＳＰＲＹ１、およびＥＴＶ５の発現においてかなりの変動が存在した。研究グレード細胞バッチは一般に、２つのカテゴリー：（ｉ）高レベルのＥＮ１、ＰＡＸ８，ＥＴＶ５、ＳＰＲＹ１、およびＨＯＸＡ２を有する細胞バッチ；または（ｉｉ）低レベルのＥＮ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、ＳＰＲＹ１、およびＨＯＸＡ２を有する細胞バッチ、に入る傾向にあった一方で、ごく僅かないくらかのバッチが、ＨＯＸＡ２発現の非存在下で、高レベルの尾側腹側中脳マーカー（ＥＮ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、ＳＰＲＹ１）を含んだ。

これら発現パターンは、後脳細胞（ＨＯＸＡ２^＋）の存在が、研究グレードプロトコルによって生成した培養物中の完全な尾側腹側中脳の正体の誘導に必要であったことを示した。なぜなら後脳細胞の非存在は、主に吻側腹側中脳の正体を有する培養物を生じたからである。対照的に、新たなＧＭＰプロトコルの実行は、より均質であり、高レベルのＨＯＸＡ２夾雑を含まない細胞のバッチを生じた。

ＧＭＰプロトコル（９～１６日目）へのＦＧＦ８ｂの添加は、尾側腹側中脳マーカー（ＥＮ１、ＰＡＸ８、ＥＴＶ５、およびＳＰＲＹ１）の強く誘導される高レベル発現を引き起こした。これは、ＤＡ高収量と負に相関するマーカー（ＣＯＲＩＮおよびＦＯＸＰ２）の発現の減少と同時にＤＡ収量を推定することを示した。この尾側化は、ＨＯＸＡ２夾雑の非存在下で起こった。実施例１０のＧＭＰプロトコルに従って分化させた２種の臨床的に関連した細胞株（Ｈ９およびＲＣ１７）に由来する移植片を評価する場合、両株は、多数のＴＨ発現細胞を有するニューロンが豊富な移植片を生成することが見出された。図９Ｄ（Ｈ９）および図９Ｅ（ＲＣ１７）は、高レベルの尾側腹側中脳マーカーを含むバッチに由来する移植片の代表的画像である。これらの細胞は、宿主線条体（Ｄ”およびＥ”と表示されたものを参照のこと）に密に神経分布し、成熟ｍｅｓＤＡマーカーを発現した。このプロトコルは、後脳夾雑を低下させ、尾側腹側中脳マーカーの発現を増大させた。これらは、良好な移植転帰の推定となった。

実施例１１
上記ＧＭＰプロトコルがインビボで機能的ドパミン作用性活性を有する細胞を生じるか否か、および前方 対 尾側ＶＭ表現型が、インビボ効力の真の推定となるか否かを決定するために、細胞を、パーキンソン病の動物モデルへの移植によって評価した。一側性の６－ＯＨＤＡ病変に供した２群のラットを、ＬＮ－１１１ ＧＭＰプロトコル（図２中のプロトコル）に従って分化させたＶＭ－パターン形成ＲＣ１７細胞での線条体内移植の前後に、アンフェタミン誘導性回転に関して評価した。一方の動物群（ｍｅｓＤＡ ＲＣ１７）は、９～１６日目までＦＧＦ８ｂの存在下で分化させた細胞を受容して、図９Ｃで示されるように、高レベルの推定マーカー、ＥＮ１、ＣＮＰＹ１、ＳＰＲＹ１、ＥＴＶ５およびＰＡＸ８を発現する尾側ＶＭ ｍｅｓＤＡ前駆細胞を生じた。図１０で示されるように、この動物群は、アンフェタミン誘導性回転の改善および過剰補償（２２週目まで）によって証明されるとおりの機能回復を示した。回転の減少は、行動回復に等価である。なぜならその病変はラットにおいて回転を引き起こすからである。移植片が機能的である場合、回転行動は終わる。対照的に、ＦＧＦ８ｂの非存在下で分化させて、ＳＴＮドメインの吻側ＶＭ細胞を生じた細胞を受容した動物（ＳＴＮ ＲＣ１７群）は、アンフェタミン誘導性回転の機能回復を示さなかった。これらのＳＴＮ－パターン形成細胞は、高レベルの一般的なＶＭマーカーを発現したが、低レベルの推定となる尾側ＶＭマーカーを発現し、それによって、パーキンソン病の動物モデルにおいてインビボ転帰を推定するために、尾側ＶＭマーカーの能力が検証された。

考察
細胞およびそれらのインビボ性能の前臨床評価は当を得ている。なぜなら中枢神経系の障害に関しては、移植は、インビボでの移植後に最終分化および成熟を受ける未成熟前駆細胞で行われるからである。移植した前駆細胞は、インビボで数ヶ月後に機能的になるに過ぎない。これは、移植前に細胞の治療的潜在能力の評価を複雑にする。従って、移植前に前駆細胞のインビトロ特徴に基づいて、移植される細胞のインビボ成熟を推定できることは、望ましい。

ＴＨ＋ニューロンへのインビトロ分化は、インビボでのＴＨ＋ニューロンの形成と相関しないことが見出された。ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１ＡおよびＣＯＲＩＮ（これらは、発生中および幹細胞培養においてｍｅｓＤＡ前駆細胞を同定するために一般に使用される）は、移植後のドパミン分化に必要であるが、それらは、その細胞の収量または機能性をインビボで推定するには十分でないこともまた見出された。これは、特定の細胞系統の分化しつつある前駆細胞において発現されるマーカーにのみ依存するのではなく、細胞の機能的成熟をインビボで推定し得るマーカーを検証する必要性を強調する。

成功裡の移植転帰の推定マーカーを同定するために偏りのないアプローチを適用する場合、ＭＨＢに近い中脳細胞によって発現されるマーカー（すなわち、ＥＮ１、ＥＴＶ５、ＣＮＰＹ１、ＰＡＸ８およびＳＰＲＹ１）が、成功裡の移植転帰と相関する一方で、間脳ドメインにおいて発現されるマーカー（例えば、ＥＰＨＡ３）が、移植転帰と負の相関を示すことが見出された。これらの知見は、ｍｅｓＤＡとＳＴＮ神経系統との間の顕著に近い関係を示すマウスモデルでの近年の研究と一致する。多くの鍵となる転写因子（ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＣＯＲＩＮ、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ２、ＭＳＸ１、ＮＵＲＲ１、およびＰＢＸ１が挙げられる）は、両方の系統によって共有されるのに対して、ｍｅｓＤＡ系統のみが、ＥＮ１およびＣＮＰＹ１（これらは、腹側中脳の尾側部分に制限される）の発現によって同定される。

これらのマーカーの分析に基づいて、腹側中脳－パターン形成培養物がＳＴＮ前駆細胞およびｍｅｓＤＡ前駆細胞の両方を含むこと、ならびに各バッチにおけるそれらの相対的割合が、ＬＭＸ１Ａ、ＦＯＸＡ２およびＯＴＸ２の高い共発現によってのみ規定される前
駆細胞が移植された場合に、観察されはしたが以前には説明されなかったインビボ転帰におけるバリエーションにおそらく寄与することが確認された。

パターン形成を微細に調整して、ドパミン作用性前駆細胞を富化することは、分化の前駆細胞ステージにおいてＦＧＦ８ｂの時宜を得た外因的送達によって達成された。これは、多くの調節と同様に、ｍｅｓＤＡ前駆細胞の生成のために完全なＧＭＰ分化プロトコルの生成を可能にした。このＧＭＰプロトコルへの鍵は、ＬＮ－１１１（発生中の脳において正常に発現されておりかつ分化しつつある神経前駆細胞（しかし多能性幹細胞ではない）の付着を支援することが見出された生理学的に関連する細胞外マトリクス成分）の使用である。

ヒト胎児腹側中脳組織を移植したパーキンソン病患者の死後脳分析から、およそ１００，０００個の移植されるＴＨ＋ニューロンを含む移植片は、患者における顕著な臨床上の利益と関連することが決定された。ラミニンベースのＧＭＰプロトコルを使用すると、分化の開始時に１個のｈＥＳＣあたりに得られるｍｅｓＤＡ前駆細胞の数は、研究グレードプロトコルと比較して大いに増大し、研究グレードプロトコルからの最良の分化に匹敵する移植転帰を生じた。推定マーカーが高い細胞バッチに由来する１００，０００個の移植される前駆細胞あたり、約５０００～６０００個の成熟ＤＡニューロンという平均収量を考慮すると、数百名の患者のための細胞の手動による生成が、自動化培養システムの必要性なしに、小さなＧＭＰ実験室ですら達成可能であり得る。ここで示されるプロトコルは、クリニックに入る他の幹細胞治療と関連する大規模生成問題のうちの多くを省く。

さらに、ＧＭＰプロトコルのインビボ効力ならびに上記に列挙され新たに同定されたマーカーの推定能力は、実施例１１および図１０で検証された。回転の減少は、行動回復に等しいと見做された。なぜならドパミン作用性６－ＯＨＤＡ病変は、動物を回転させたからである。移植片は、回転行動を０のベースラインまで下げたかまたは下回って終わった場合に、機能的と見做された。

ラットモデルへと移植された多数の細胞バッチの全般的な遺伝子プロファイリングは、前駆細胞ステージでの成功裡の移植転帰をインビトロで遙かにより正確に推定するマーカーのパネルの樹立を可能にした。移植転帰をよりよく推定できることで、臨床用途へ向かって幹細胞の発展が加速し、バッチ間で比較できるために、ならびに種々の臨床試験において移植された細胞を比較するために使用され得る。長期的には、既に前駆細胞レベルでの細胞のインビボ成熟および機能特性のよりよい推定は、移植のための自己由来のまたは個々にマッチした細胞の使用を促進する。

上記で開示されたおよび他の特徴および機能の変形、またはこれらの代替物は、多くの他の異なるシステムまたは適用へと組み合わせられ得ることは、理解される。種々の現在予見できなかったまたは予期しないそこでの代替物、改変、バリエーションまたは改善は、当業者によってその後行われ得、それらはまた、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (8)

1. 尾側化した腹側中脳前駆細胞の生成を誘導するための方法であって、該方法は、
   胚性幹細胞を、ラミニン－１１１、ラミニン－４２１、ラミニン－５１１、またはラミニン－５２１を含む基材上にプレートして、該尾側化した腹側中脳前駆細胞を生成する工程を包含し、
   前記幹細胞は、Ｎ２培地、ＴＧＦ－βインヒビター、ノギン、ソニックヘッジホッグタンパク質、およびＧＳＫ３インヒビターを含みかつＢ２７サプリメントを含まない一次培地中で培養され、
   前記一次培地は除去され、二次培地が添加され、該二次培地は、Ｎ２培地および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含み、かつＢ２７サプリメントを含まず、
   前記二次培地は、前記プレートする工程の１５６時間～２２８時間後に添加される、方法。
2. 前記ＦＧＦは、ＦＧＦ８ｂである、請求項１に記載の方法。
3. 前記二次培地は除去され、前記幹細胞は再度プレートされる、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記再度プレートする工程は、前記プレートする工程の２５２時間～２７６時間後に起こる、請求項３に記載の方法。
5. 前記再度プレートする工程は、Ｂ２７培地、ＲＯＣＫインヒビター、前記ＦＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびアスコルビン酸を含む三次培地を使用して起こる、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記幹細胞は、次いで、四次培地中で培養され、該四次培地は、Ｂ２７培地、前記ＦＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびアスコルビン酸を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記幹細胞は、前記プレートする工程後の３２４時間～３９６時間まで、前記四次培地中で培養される、請求項６に記載の方法。
8. 前記幹細胞は、１０８時間～１３２時間の期間にわたって前記四次培地中で培養される、請求項７に記載の方法。

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