TW202117009A

TW202117009A - 衍生自人類富潛能幹細胞的神經幹細胞株的製備方法

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Publication number: TW202117009A
Application number: TW109122236A
Authority: TW
Inventors: 拉米雷斯胡安卡洛斯比利亞埃斯庫薩; 烏里克德納; 夏洛特溫特爾貝特爾森
Original assignee: 丹麥商諾佛儂迪克股份有限公司
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2021-05-01
Also published as: EP3994250A1; CN114174497A; US20220233602A1; WO2021004864A1; JP2022538503A; CN114174497B

Abstract

本發明一般有關於幹細胞領域，更具體地有關於高純度神經幹細胞群體、一種用於獲得此種高純度幹細胞衍生之神經幹細胞株、例如衍生自富潛能幹細胞(例如人類胚胎幹細胞)的神經幹細胞株的方法。此外，本發明有關於以此種高純度神經幹細胞株作為治療神經退化病症的藥物之用途。

Description

衍生自人類富潛能幹細胞的神經幹細胞株的製備方法

本發明一般相關於幹細胞領域，更具體地，相關於一種高純度神經幹細胞群體、獲得此類神經幹細胞之高度純幹細胞衍生株的方法，例如衍生自富潛能神經幹細胞株，例如人類胚胎幹細胞。此外，本發明相關於此類高度純神經幹細胞株的用途，使用作為治療神經退化疾病的藥物，以及使用從此類神經幹細胞獲得的胞外體治療中風的用途。

神經幹細胞(NSC)是會自我更新的富潛能細胞，具有產生神經元和神經膠質細胞。NSC在中樞神經系統正常胚胎發育過程中暫時出現，且類似的細胞亦可衍生自例如人類富潛能幹細胞(hPSC)。迄今為止，已進行大量研究開發有效率的流程，以成功地將hPSC分化為高度純和可擴增的人類NSCs。將hPSC分化為人類NSC的已建立方法是經由形成細胞堆積體，即所謂的胚狀體。然而，許多當前流程會產生異質細胞群體，其包含例如非神經等同性的側細胞群體。因此，需要人工篩選NSC(例如通過人工挑選神經玫瑰環)，這是一個費力且費時的過程，因而限制了量產性。

在過去的幾年中，已探索使用NSC-衍生的細胞外囊泡(EVs)和胞外體來治療腦損傷和神經退化，包括腦梗塞。細胞外囊泡(EVs)是脂質雙層分隔的顆粒，可從細胞中自然釋放。EV的直徑範圍從接近物理上可能的最小單層脂質體尺寸(大約20-30奈米)到大至10微米或更大，儘管絕大多數EV都小於200 nm。胞外體是大多數細胞類型釋放的奈米級EV(直徑從30至150 nm)(Colombo等人，2014)。胞外體內含各種分子(貨物)，這些分子可包含衍生自其宿主細胞的蛋白質、核酸和脂質，因而促進細胞間溝通並調節接受者細胞的功能(Robbins等人，2016)。利用胞外體進行缺血性中風治療的最新進展，已將其功能改善歸因於其貨物，其中包括微小RNA、DNA、脂質、蛋白質和RNA(Chen和Chopp，2018年)。這些觀察顯示，應用NSC-衍生的胞外體可能是治療腦損傷(包括中風和外傷性腦損傷(TBI))的有潛力新方法。

一些文獻(Ruttachuk等人，2013、Watanabe等人，2007)揭示使用ROCKi及/或雙重SMAD抑制，從2D培養物中的hPSC中獲得NSC的方法(Qiuhong等人，2019、US2017260501、Meixiang等人，2018)。在這些方法的一些中，需要在擴增之前進行解剖，以提高純度，即，人工挑選和分離該細胞。這相當耗時間和資源，且降低了該方法量產的能力。

本發明之一目的是克服上述挑戰，特別是提供一種獲得NSC株的方法，該方法能夠實現量產性，並提供具有非常高純度的NSC的GMP群體。

前述目的係以本發明的各個態樣達成。另外，本發明亦可解決其他問題，這將從示例性實施例的揭示中顯而易見。在本發明的第一態樣中，提供一種從富潛能幹細胞(PSC)獲得體外NSC株的方法，該方法包含下列步驟：將該PSC解離為單一細胞、在懸浮培養液中培養該PSC、使該PSC處於懸浮狀態以自發形成三維細胞堆積體，並將其分化為由神經外胚層細胞(包括NSC)組成的神經外胚層球體(NECS)，任擇地解離NSC、將NSC鋪在基底上、使NSC形成神經玫瑰環，並維持和擴增NSC以建立NSC株。

用於PSC的神經誘導以及隨後生成和建立NSC株的流程可大致分為三個主要階段：神經外胚層誘導和NECS形成；鋪上NECS和玫瑰環的形成，以及最後藉由在擴增培養基中重鋪細胞以建立NSC株。藉由遵循這些主要階段，本發明人已開發一種用於建立基於NECS的快速和可靠的分化流程之方法，該方法產生具有神經玫瑰環形態上高度純和可擴增的人類NSC群體。該方法促進NSC株的分化和建立。十天後，本發明人在二維層次觀察到清晰可見的神經玫瑰環，它們準備解離。當神經玫瑰環被解離並重鋪3-4代後，就建立了NSC株。一主要優點是避免人工分離的繁瑣且耗時的步驟。本發明人相信，在沒有強制堆積的情況下控制均勻NECS的形成，使得該方法能夠提供如此高的純度。因此，本發明人發現，使PSC自發形成NECS的步驟特別重要。自發形成部分地促進具某一尺寸的NECS群體形成，一旦被鋪上，將產生高度純、良好界定與均質的神經玫瑰環群體。在一較佳實施例中，該方法進一步包含攪拌該懸浮培養物的步驟。本發明人驚訝地發現，在最初的非強制形成NECS之後，對培養物進行攪拌可進一步建立直徑小於500 µm的NECS群體。進一步令人驚訝地發現，通過控制NECS的大小，可以改善神經玫瑰環的純度和形成。在一較佳實施例中，在鋪上NSC的步驟之前，NECS的直徑小於500 µm。

在一態樣中，本發明相關於一種從富潛能幹細胞(PSC)獲得神經外胚層細胞的方法，包含以下步驟： ˙ 在懸浮培養液中使該PSC與ROCKi和單一SMAD抑制劑接觸， ˙ 允許該懸浮的PSC自發地形成三維細胞堆積體， ˙ 允許該三維細胞堆積，以 ˙ 在動態細胞培養懸浮液中分化成直徑小於500 µm 的神經外胚層球， ˙ 允許該神經外胚層球形成神經玫瑰環，其中該神經玫瑰環包含神經外胚層細胞。

在一態樣中，本發明相關於一種從富潛能幹細胞(PSC)獲得神經外胚層細胞的方法，包含在包含單一SMAD抑制劑的培養基中培養該PSC的步驟。

另一方面，本發明相關於一種從富潛能幹細胞獲得神經外胚層細胞的方法，該方法包含在包含單一SMAD抑制劑的培養基中培養該PSC的步驟，其中該單一SMAD抑制劑是RepSox或GW788388。

在一態樣中，本發明相關於一種從富潛能幹細胞獲得神經外胚層細胞的方法，該方法包含在含有單一SMAD抑制劑的培養基中培養該富潛能幹細胞的步驟，其中該單一SMAD抑制劑為濃度為約20 µM 至約60 µM的RepSox。

在一態樣中，本發明相關於一種從富潛能幹細胞獲得神經外胚層細胞的方法，該方法包含在包含單一SMAD抑制劑的培養基中培養該富潛能幹細胞的步驟，其中該單一SMAD抑制劑為GW788388，濃度約為0,1ng/ml 至約150 ng/ml。

本發明的另一態樣相關於從PSC獲得神經外胚層細胞的方法，其包含以下步驟：使該PSC與轉化生長因子(TGF)/激活素/節點信號傳導途徑的抑制劑接觸，並允許該PSC分化為神經外胚層細胞，其中該轉化生長因子(TGF)/激活素/節點信號轉導途徑的抑制劑是RepSox，較佳濃度為約 0.1 µM 至約100 µM。本發明人驚訝地發現，此特定濃度的小分子能以非常高的效率促進PSCs分化為神經外胚層譜系，甚至不需要同時抑制骨形態發生蛋白(BMP)信號傳導途徑，即不需要雙重SMAD抑制，例如使PSC與Noggin接觸。這簡化分化為神經外胚層譜系的流程，並有助於將該流程轉化為GMP順應性。

在一態樣中，本發明相關於一種高純度神經幹細胞群體，其中該神經幹細胞至少80%具有OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性。

在一態樣中，本發明相關於一種高純度神經幹細胞群體，其中該神經幹細胞至少80%具有OTX2/PAX6/SOX2三重陽性。

本發明的另一態樣提供本發明的NSC株在生產胞外體中的用途。在又一態樣中，提供一種由本發明方法獲得的NSC株產生胞外體的方法，其包含允許NSC產生胞外體並分離該胞外體之步驟。

本發明的另一態樣相關於一種使用作為藥物的胞外體，特別是用於治療神經退化疾病及/或腦損傷，例如但不限於中風、外傷性腦損傷(TBI)和阿茲海默症。因此，在一實施例中，該神經退化疾病是中風。在另一實施例中，該神經退化疾病是外傷性腦損傷(TBI)。在另一實施例中，該神經退化疾病是阿茲海默症。

本發明的另一態樣係提供一種維持和擴增NSC株的方法，該方法包含以下步驟：在受質上培養NSC、使NSC重新形成神經玫瑰環、將NSC解離成單一懸浮液、使NSC與ROCK抑制劑接觸、及以將NSC重鋪在第二受質上。本發明人驚訝地發現，在每次分代時使NSCs與ROCK抑制劑接觸，可顯著維持玫瑰環結構的複雜度、形態和神經前驅組成物。

在一態樣中，本發明相關於一種用於獲得體外神經幹細胞的方法，包含以下步驟： ˙ 將PSC解離為單一細胞， ˙ 在懸浮培養液中使該PSC與ROCKi和單一SMAD抑制劑接觸， ˙ 使懸浮液中的PSC自發形成三維細胞堆積物， ˙ 允許該三維細胞堆積體在動態細胞培養懸浮液中，分化為直徑小於 500 µm的神經外胚層球體， ˙ 將含NECS的神經外胚層細胞鋪在受質上，或任擇地解離該含NECS的NSC， ˙ 允許該NSC形成神經玫瑰環，並維持和擴增NSC以建立NSC株，無需人工挑選和分離。

在另一態樣中，本發明相關於一種從PSC獲得體外神經幹細胞(NSC)株的方法，包含以下步驟： ˙ 將該PSC解離為單一細胞或包含少於約50個細胞的堆積體， ˙ 在動態懸浮培養液中培養獲得的細胞， ˙ 允許該獲得的懸浮細胞自發形成NECS，並進一步產生NSC。 ˙ 允許維持和擴增NSC，以建立NSC株。

最後一個態樣之方法的優點是可以快速提供NSC，這些NSC可藉由在二維或懸浮狀態中進一步分化為神經外胚層譜系的特定細胞。

在整份申請案中，前述各態樣的較佳實施例中，PSC是hPSC。在之後的較佳實施例中，該產物也是人類-衍生。因此，在較佳實施例中，NSC和NSC株分別是人類NSC和NSC株。

除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。除非另有說明，本發明的實施採用本領域技術人員已知的化學、生物化學、生物物理學、分子生物學、細胞生物學、基因學、免疫學和藥理學的常規方法。

請注意，所有標題和子標題在本文中僅出於方便起見而使用，不應以任何方式解釋為對本發明的限制。

除非另外要求，否則本文提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，“諸如”)的使用僅旨在更好地闡明本發明，並非對本發明的範圍構成限制。說明書中的任何語言都不應解釋為指示任何未申明的要素對於實施本發明為必要的。

在整份申請書中，術語“方法”和“流程”在提及分化細胞的過程時可以互換使用。本發明的方法通常由一系列步驟定義。如本文中所使用的，與方法有關的術語“步驟”應被理解為正在進行某件事及/或某動作的階段。本領域普通技術人員將理解，待進行的步驟及/或正在進行的步驟是同時及/或接續及/或連續的。

如本文所用，“一(a)”或“一(an)”或“該”可表示一或多個。。除非說明書中另有說明，否則以單數形式出現的術語也包括複數形式。如本文中所使用的，“及/或”是指並且涵蓋一或多個相關聯的所列項目的任一和所有可能的組合，以及當以替代方式(“或”)解釋時缺乏組合。此外，本發明亦預期在本發明的一些實施例中，可排除或省略本文闡述的任何特徵或特徵的組合。

如本文所用，術語“約”是指一可測量值，例如本發明的細胞量、化合物或試劑量、劑量、溫度及類似術語，意指涵蓋指定數量的5%、1%、0.5%甚至0.1%的變化。如本文所用，術語“天數”指的是該流程中用於執行某些步驟的特定時間。

通常，除非另有說明，否則“第0天”是指流程的起始，例如但不限於將幹細胞鋪上或將幹細胞轉移至培養箱或在轉移該幹細胞之前將當前的細胞培養基中的幹細胞與一化合物接觸。通常，流程的起始將經由將未分化的幹細胞轉移至不同的細胞培養基及/或容器中，例如但不限於藉由鋪上或靜置、及/或將未分化的幹細胞與會以啟動分化之方式影響未分化幹細胞之化合物進行第一次接觸。

當提到“第X天”(例如第1天、第2天等)時，它是相對於流程在第0天的起始而言的。本領域的普通技術人員將認知到，除非另外指定，否則一天中進行該步驟的確切時間可能會有所不同。因此，“第X天”意指涵蓋諸如+/-10小時、+/-8小時、+/-6小時、+/-4小時、+/-2小時或+/-1小時的時間跨度。

如本文所使用的，術語“從大約第X日到大約第Y日”是指事件開始的日期。該術語提供事件可能開始的天數間隔。例如，如果“從大約第3天到大約第5天，將細胞與分化因子接觸”，那麼這應被限制為涵蓋所有選項：“從約第3天起將細胞與分化因子接觸”、“從約第4天起將細胞與分化因子接觸”、和“從約第5天起將細胞與分化因子接觸”。因此，該術語不應被限制為僅在從第3天到第5天的時間間隔內發生的事件。這比照適用於術語“至大約第X日至大約第Y日”。

在下文中，經由非限制性實施例和實例更詳細地描述本發明的方法。提供一種從PSC獲得神經幹細胞株的方法。因此，該方法抵消幹細胞的使用。

“幹細胞”應理解為具有分化潛能和增殖能力(特別是自我更新能力)但保持分化潛能的未分化細胞。根據分化潛能，幹細胞包括亞群如富潛能幹細胞(PSC)、多潛能幹細胞、單能幹細胞及類似物。

如本文所用，術語“富潛能幹細胞”(PSC)是指能夠在體外培養並且具有分化為屬於三個胚層(外胚層、中胚層、內胚層)的任何細胞譜系之能力的幹細胞。PSC可以從受精卵、複製胚胎、生殖幹細胞、組織中的幹細胞、體細胞及類似細胞誘導。PSC的實例包括胚胎幹細胞(ESC)、誘導性富潛能幹細胞 (iPSC)、胚胎生殖細胞(EG細胞)及類似細胞。從間充質幹細胞(MSC)獲得的Muse細胞(多譜系分化壓力忍受細胞)和從生殖細胞(例如睾丸)產生的生殖幹細胞(GS細胞)，也涵蓋於PSC術語中。因此，本發明中使用的富潛能幹細胞可以是由囊胚製備的胚胎幹細胞，如在WO 03/055992和WO 2007/042225中所述者，或者是可商購的細胞或細胞株。ES細胞株也可以衍生自單一卵裂球，而不會破壞子宮內 胚胎，也不會影響臨床結果(Chung等人 (2006)和Klimanskaya等人 (2006))。

如本文所用，術語“誘導性富潛能幹細胞”(也稱為iPS細胞或iPSC)是指可經由通常稱為重新程式化的過程直接從成體細胞產生的PSC種類。藉由引入特定的富潛能性-相關基因集之產物，可以將成體細胞轉化為PSC。胚胎幹細胞也可以衍生自孤雌單倍體(parthenotes)，如WO 2003/046141中所述。另外，可以從單一卵裂球或經由培養獲得的內部細胞團產生胚胎幹細胞，而不會破壞胚胎。胚胎幹細胞可由特定的體制獲得，也可商購獲得。較佳地，本發明的方法和產物基於hPSC，即衍生自iPSC或胚胎幹細胞(包括孤雌單倍體)的幹細胞。

本發明提供一種從PSC中獲得體外 NSC株的方法，包含以下步驟： ˙ 將PSC解離為單一細胞， ˙ 在懸浮培養液中培養獲得的細胞， ˙ 允許動態懸浮液中的細胞自發地形成NECS、將該NECS分化為NSC、將NSC鋪在受質上，或任擇地解離該NSC， ˙ 允許該NSC形成神經玫瑰環，並維持和擴增NSC，以建立NSC株。

如本文所用，術語“神經”是指神經系統。如本文所用，術語“神經細胞”是指模擬細胞類型的細胞，其本來是外胚層的胚層的一部分，更具體地是神經外胚層，該術語旨在涵蓋此胚層內處於任何發育階段的細胞，例如早期的神經前驅細胞一直到成熟、有絲分裂後神經元。

如本文所用，術語“神經外胚層細胞”是指在神經外胚層譜系發育過程的任一階段的細胞。

如本文所用，術語“神經幹細胞”(NSC)是指富潛能細胞，其能夠自我更新並無限制地增殖，以產生可最終分化為神經和神經膠質細胞的後代細胞，例如神經元、星形膠質細胞和寡樹突細胞。NSC的非幹細胞後代稱為神經前驅細胞。

如本文所用，術語“神經先驅細胞(precursor cell)”和“神經前驅細胞(neural progenitor cell)”可以互換使用，是指進一步衍生自神經幹細胞但不保持廣泛的增殖能力的細胞。

如本文所用，術語“神經幹細胞株”是指可以分代至少10代以維持神經玫瑰環結構和標誌物ZO1、NES、SOX2、OTX2和PAX6的NSC群體。當提及用於獲得神經NSC株的方法是指可以建立一或多個NSC株的方法。本發明人在十天後觀察到二維神經玫瑰環的形成。當神經玫瑰環被觧離並重鋪3至4代後，便建立NSC株。此後，NSC株被認為已建立，從該時點開始，NSC可分代至少10代。在一實施例中，NSC株並未被永生化，即在一實施例中，NSC株可分代不超過100代。

在一實施例中，將本發明已建立的NSC株分代3至4代。

在一實施例中，將本發明已建立的NSC株分代10代。

在一實施例中，將本發明已建立的NSC株分代20代。

術語“體外”是指在人體或動物體外提供和維持NSC。在一實施例中，該NSC是非天然的。

術語“非天然的”是指儘管該NSCs衍生自可能具有人類來源的PSC，但它仍是自然界中不存在的人工構建體。一般而言，在幹細胞領域中的一個目的通常是提供盡可能類似於人體細胞的細胞。然而，目前無法將PSC在胚胎和胎兒階段經歷的發育模擬到其成熟細胞與人體天然細胞無法區分的程度。本質上，在本發明的實施例中，該NSC是人工的。

如本文所用，術語“人工的”可以包含自然界天然存在但被修飾為非天然發生的建構體之材料。此包括人類幹細胞，它們分化成模仿人體細胞的非天然細胞。較佳地，NSC為幹細胞衍生。更佳地，NSC是衍生自PSC的幹細胞。在另一實施例中，NSC是衍生自人類胚胎幹細胞(hESC)及/或人類誘導性富潛能幹細胞(hiPSC)的幹細胞。

PSC最初解離為單一細胞。如本文所用，術語“解離為單一細胞”是指將PSC帶入單細胞懸浮液中。“單細胞懸浮液”是指細胞懸浮液或懸浮培養物，其中單細胞及/或通常少於約五或六個細胞的三維小細胞堆積體可發揮作用並複製。當將細胞帶入懸浮液時，大多數細胞不會黏附在受質或容器表面。可以使用任何合適的方法將PSC帶入單細胞懸液中。本領域技術人員將容易認知到，目前有幾種用於將PSC帶入單細胞懸浮液的方法，例如酵素化或螯合化。在一實施例中，在第0天將PSC解離為單細胞懸浮液。將PSC帶入懸浮液是指將細胞進行可促進細胞彼此分開、從受質及/或細胞外基質分開的處理。在一實施例中，PSC係藉由與細胞解離劑如胰蛋白酶及/或TrypLE Select接觸，而將PSC解離為單細胞懸浮液。

在進一步的步驟中，將PSC係培養於懸浮培養液中。如本文所用，術語“懸浮培養”是指單一細胞或細胞堆積體可在液體培養基中自由漂浮。懸浮培養也可以稱為三維培養，且在整份申請書中此二術語可互換使用。因此，PSC不附著於受質表面或固定在骨架如細胞外基質中。然而，眾所周知，懸浮培養中的某些細胞可能附著在血管表面。在不攪動懸浮培養液的情況下，由於重力，細胞最終將沉降在血管表面。

術語“培養”應理解為經由該過程幹細胞在受控條件下生長，通常在其天然環境之外以連續程序進行，該過程可以在整個方法中採用以維持細胞在其各階段的存活性。在有興趣的細胞從例如但不限於活組織或胚胎中分離出之後，隨後將其維持在精心控制的條件下。這些條件因每種細胞類型而異，但通常由合適的容器組成，該容器置有提供必需營養素(胺基酸、碳水化合物、維生素、礦物質)、生長因子、賀爾蒙和氣體(CO₂ 、O₂ )，並調整生理-化學環境(pH緩衝液、滲透壓、溫度)。

通常，幹細胞係於細胞培養基中提供，該培養基適合於其當前發育狀態下的存活性。提供用於培養的幹細胞通常意指將幹細胞轉移到不同的環境中，例如藉由接種到新的受質上或懸浮在培養器中。本領域普通技術人員將容易認知到，幹細胞對於這種轉移是脆弱的，並且該過程需要勤勞且將幹細胞保持在原始細胞培養基中，可促進細胞更可持續的轉移，之後替換另一種更適合分化過程的細胞培養基。在一實施例中，第0天的細胞培養基是第一細胞培養基，並且從第1天起，至少一部分細胞培養基被第二細胞培養基替代。

如本文所用，術語細胞培養基、第一細胞培養基和第二細胞培養基的“替代”是指其中一定量的細胞培養基經合適的方式取出，並且任擇地，加入實質上等量的細胞培養基，使得細胞培養基的總體積實質上保持相同。“移除第一細胞培養基”應理解為在第一次移除並加入加第二細胞培養基之後，隨後的任何替代將是第一和第二細胞培養基的混合物的替代，該混合物之比例對應於移除和加入的量。因此，在依序移除中，第一細胞培養基將被第二細胞培養基連續稀釋，且藉由重複此過程，細胞培養基最終將實質上不含該第一細胞培養基。

在又一實施例中，該細胞培養基是化學成分確定的且無異種物質的。如本文所用，關於細胞培養基的術語“化學成分確定的”是指適用於人類或動物細胞的體外細胞培養的生長培養基，其中所有化學成分都是已知的。化學成分確定的培養基要求所有的成分都必須經識別，並知道其確切濃度。

如本文所用，術語“無異種物質”和“無動物性”可以互換使用，並且在本發明中較佳地是指完全不含任何動物來源的成分。在一個較佳的實施例中，細胞培養基亦為無餵養層的。

術語“無餵養層”和“無餵養層細胞”可以互換使用，並且是指沒有人類和動物細胞的培養系統，否則，這些人類和動物細胞的存在是為了滋養培養的幹細胞，即餵養細胞可提供代謝物給其所支持的幹細胞，但不是用於生長或分裂的細胞。

即使本發明人偏愛化學成分確定的、“無異種物質”和“無餵養細胞”的細胞培養環境，但監管機構仍可基於本發明的方法核准藥物產品和治療方法，而無需完全遵守此類標準。本發明人致力遵守GMP和GTP的最高標準。但是，本發明不應被解釋為受限於這些標準。本領域技術人員將容易地認知到，可以在不遵循這種高標準的情況下實施本發明。

在一實施例中，第一細胞培養基可為在轉移到受質上時支持幹細胞存活的任何合適的細胞培養基。此類細胞培養基是可商購的，且可為例如Nutristem®、如用於iPS與ES幹細胞的Nutristem® hPSC XF培養基。因此，在一實施例中，為Nutristem®，如用於iPS和ES幹細胞之Nutristem® hPSC XF培養基。

在一實施例中，第二細胞培養基是化學成分確定的且無異種物質的。在另一實施例中，第二細胞培養基也是無餵養層的。在一實施例中，第二細胞培養基包含GMEM、DMEM或DMEM/F12。類似的培養基可能同樣效用良好且很容易購買。在另一實施例中，DMEM/F12補充有N2和/或B27。在一實施例中，N2的濃度為約0.01%(v/v)至約5%(v/v)，較佳為約0.5%(v/v)至約2.5%(v/v)。在一實施例中，B27的濃度為約0.05%(v/v)至約1%(v/v)，較佳約0.1%(v/v)。

在一實施例中，在使PSC解離為單細胞懸浮液的步驟中，將PSC與ROCK抑制劑接觸。ROCK 抑制劑

Rho結合-螺旋-螺旋激酶(ROCK)是RhoA小GTP酶的效應子，屬於絲胺酸/蘇胺酸激酶AGC家族。ROCK激酶具有許多功能，包括細胞收縮、遷移、凋亡、存活和增殖。含IRho結合-螺旋-螺旋激酶ROCK抑制劑是一系列靶向並抑制rho激酶的化合物。如本文所用，“Y-27632”是指反式-4-(1-胺基乙基)-N-(4-吡啶基)環己烷甲醯胺二鹽酸鹽，CAS號 129830-38-2。

在一實施例中，該細胞培養基包含ROCK抑制劑。在一實施例中，ROCK抑制劑是Y-27632或Tiger。

因此，在一較佳實施例中，將PSC與ROCK抑制劑接觸，可同時使PSC解離為單細胞懸浮液。在一實施例中，ROCK抑制劑的濃度為約 0.5 µM 至約50 µM，較佳約5 µM至約25 µM，更佳約10 µM。在一實施例中，ROCK抑制劑的濃度從約第1天開始逐漸降低。之後在一實施例中，將PSC與ROCK抑制劑接觸約一天，從使PSC解離成單細胞懸浮液的步驟開始，第0天的濃度為約0.5 µM 至約50 µM，更佳約5 µM至約25 µM，尤佳約10 µM。在一實施例中，ROCK抑制劑是Y-27632。

該方法包含使單細胞懸浮液中的PSC自發形成NECS的步驟。三維細胞堆積體

如本文所用，術語“三維細胞堆積體”是指在短時間即1至2天中由單個細胞或彼此附著的少量細胞的堆積體形成的幹細胞簇。三維細胞堆積體是經由少量PSC及/或細胞分裂的少量細胞之間的附著形成的，並且隨著分裂繼續內在地增長。對於此過程，將最初的PSC懸浮培養物暴露於ROCK抑制劑下。在ROCKi存在的情況下，允許PSC自發形成三維細胞堆積體並隨後較大細胞堆積形成NECS的步驟是一個被動過程。如本文所用，術語“自發地”當指稱三維細胞堆積體的形成時，是指三維細胞堆積體的形成，除了將PSC帶入單細胞懸浮狀態之外，不以任何方式迫使或促進。

在一實施例中，將PSC暴露於ROCKi 24小時後，形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi最初24小時之後，形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi至少24小時之後形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi約1至3天後，形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi約2至3天後形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi約1天後，形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi約2天後形成三維細胞堆積體。在一實施例中，在PSC暴露於ROCKi約3天後，形成三維細胞堆積體。神經外胚層球體

如本文所用，術語“神經外胚層球體”(NECS)是指三維細胞堆積體，其由於細胞分裂而尺寸增大，並且同時分化成神經外胚層命運數天，即5至6天。根據本發明的方法，當形成初始的小型三維細胞堆積體時，NECS細胞自一開始就被引導至神經外胚層譜系。NECS將包含神經外胚層細胞、NSCs 和NSCs形成神經玫瑰環，取決於成熟階段。NECS是經由細胞的細胞分裂形成的，並隨著分裂的繼續而固有地增長。之後，在一實施例中，PSC實質上會經由有絲分裂形成NECS。如本文所用，術語“有絲分裂”是指細胞分裂成基因等同的細胞，其中維持染色體數目。在本發明的方法中，NECS由PSC分裂同時分化而形成。因此，NECS最初包含PSC，且當這些細胞分裂並進行分化時，它們會形成包含分化幹細胞的NECS。允許PSC自發地形成小細胞堆積體且隨後形成更大的NECS的步驟是一個被動過程。如本文所用，如本文所用，術語“自發地”當指稱三維細胞堆積體的形成時，是指NES的形成，除了將PSC帶入單細胞懸浮狀態之外，不以任何方式迫使或促進。自發形成與細胞的主動聚集相反，可藉由細胞聚集成錐形孔或液滴而促進。如本文所使用的，“自發”構造也可以被稱為“非強迫”構造或“被動”構造。因此，在一實施例中，NECS被允許在沒有強制聚合的情況下形成。在一較佳實施例中，該NECS允許以細胞懸浮方式自發形成。不受任何特定理論的束縛，據信NECS的自發形成部分是由於PSC的增殖，並可能部分是由於一或多種NECS的自發堆積。

在一實施例中，該三維細胞堆積體允許自發形成NECS另外五天。在一實施例中，該三維細胞堆積體允許自發形成NECS至少另外五天。在一實施例中，該三維細胞堆積體允許自發形成NECS另外三至八天。在一實施例中，該三維細胞堆積體允許自發形成NECS另外三至十天。懸浮培養

在一實施例中，該方法更包含攪動懸浮培養物，以產生動態細胞培養懸浮液的步驟。如本文所用，術語“攪動”是指為了維持懸浮培養而使細胞培養基晃動。可以任何合適的方式來提供攪拌。在一實施例中，藉由搖晃攪拌懸浮培養物。在另一實施例中，以約5 rpms至約80 rpms，較佳約20 rpms至約70 rpms，更佳約40 rpms至約60 rpms的速度攪拌懸浮培養物。在一實施例中，以約30 rpm至約100 rpm，較佳約40 rpm至約90 rpm，更佳50 rpm至約80 rpm的速度攪拌懸浮培養物。在一實施例中，以約5 rpms至約80 rpms，較佳約20 rpms至約70 rpms，更較佳約40 rpms至約60 rpms的速度攪拌懸浮培養物。在一實施例中，以約50 rpm至約80 rpm的速度攪拌懸浮培養物。在一實施例中，以約60 rpm至約70 rpm的速度攪拌懸浮培養物。在一較佳的實施例中，當開始逐漸降低ROCK抑制劑的濃度時，對懸浮培養物進行攪拌。在一實施例中，從約第0天、第1天、第2天或第3天開始對懸浮培養物進行攪拌，較佳從約第1天起對懸浮培養物進行攪拌。在一實施例中，對懸浮培養物進行攪拌直至鋪上NECS的步驟。

本發明方法包含將PSC分化為NSC的步驟。允許PSC分化不應被解釋為要進行的單獨最終步驟。本領域普通技術人員將理解，如本文所用，術語“分化(differentiate)”和“分化(differentiation)”是指細胞從未分化狀態進展到分化狀態、從未成熟狀態進展到不太成熟狀態、或從未成熟狀態進展到成熟的過程，其隨著該方法的進行而連續發生，並使細胞暴露於各種促進分化的因子下。這例如但不限於正在分化為NSC的PSC。細胞相互作用和成熟發生變化時，細胞會失去未分化細胞的標誌物或獲得分化細胞的標誌物。單一標誌物丟失或增加代表細胞已“成熟或完全分化”。

在一較佳實施例中，PSC在第0天開始向NSC分化。這表示PSC向NSC的分化在將PSC解離為單細胞懸浮物後立即開始。

在一實施例中，使PSC與TGFβR1/ALK5 受器抑制劑接觸。如本文所用，術語“接觸”當提及培養細胞時，意指將細胞暴露於如特定化合物下，藉由將該特定化合物靠近細胞以產生“接觸”細胞。可以使用任何合適的方式來完成接觸。接觸的非限制性實例是藉由將化合物加到細胞的細胞培養基中。只要細胞和特定化合物夠近，例如化合物以適當濃度存在於細胞培養基中，便假設細胞接觸發生。當提及“使細胞與X接觸”可被視為與“在包含X的細胞培養基中培養細胞”同義。此外，如本文所用，術語“抑制劑”當提及抑制信號傳導靶標或信號傳導靶標途徑時，是指當與未經處理的細胞或以不會抑制經處理細胞或組織之化合物處理的細胞相較時，會干擾(即減少或消除或抑制)所得的靶標分子或靶標化合物或靶標過程(如特定的分化結果，例如，抑制促進默認細胞類型分化的主動信號傳導途徑，因而誘導分化為非默認細胞類型)的化合物。

如本文所用，“OTX2”是指Orthodenticle Homeobox 2基因、轉錄本或蛋白質，其為胚胎發育期間包括神經前驅細胞的前腦結構的標誌物。

如本文所用，“PAX6”是指“Paired Box 6”基因、轉錄本或蛋白質，其為胚胎發育期間包括神經前驅細胞的前腦結構的標誌物。

如本文所用，“SOX2”是指“SRY-Box轉錄因子2”基因、轉錄本或蛋白質，其為神經前驅細胞的標誌物。

如本文所用，“FOXG1”是指“Forkhead Box G1”基因、轉錄本或蛋白質，其為胚胎發育期間前腦細胞的標誌物。

如本文所用，“ZO1”或“TJP1”是指“Tight Junction Protein 1”基因、轉錄本或蛋白質，作用為緊密連接轉接蛋白。它用於定義神經玫瑰環的頂端部分、空腔。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少80%的細胞共表現PAX6和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少85%的細胞共表現PAX6和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少90%的細胞共表現PAX6和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少93%的細胞共表現PAX6和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少80%的細胞共表現PAX6、SOX2和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少85%的細胞共表現PAX6、SOX2和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中至少90%的細胞共表現PAX6、SOX2和OTX2。

在一實施例中，本發明相關於一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中約93%的細胞共表現PAX6、SOX2和OTX2。小母親抗十五褶(SMAD) 蛋白信息傳導途徑之抑制劑

如本文所用，“（小母親抗十五褶）Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD)蛋白信息傳導路徑之抑制劑”是指可特異性抑制小母親抗十五褶(SMAD)蛋白信號傳導途徑的化合物。小母親抗十五褶(SMAD)蛋白信號轉導的抑制劑之實例可選自於包含GW788388、LDN-193189、LY2157299、LY364947、NOGGIN、RepSox、SB431542、和TEW-7197之群組。

如本文所用，“GW788388”表示小分子化學名稱N-(噁烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲醯胺，CAS編號：452342-67-5。

如本文所用，“LDN-193189”表示IUPAC名稱為4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，CAS編號：1062368-24-4。

如本文所用，“LY2157299”表示一小分子，其是有效的TGFβ受器I(TGFβRI)抑制劑，其替代名稱為葛魯尼索替(Galunisertib)，化學名稱為4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氫-4H-吡咯並[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-羧醯胺，CAS編號：700874-72-2。

如本文所用，“LY364947”表示具有IUPAC名稱4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉，CAS編號：396129-53-6的化合物。

如本文所用，“NOGGIN”表示分泌型同二聚體糖蛋白，其會與信號傳導蛋白例如骨形態發生蛋白-4(BMP 4)的轉化生長因子-β(TGF-β)超家族結合，並使其失活。NOGGIN通常是在人類細胞中表現的65 kDa蛋白，為醣基化、雙硫鍵-連接的二聚體。

如本文所用，“RepSox”表示小分子，其為TGF-βRI的有效和選擇性抑制劑，其替代名稱為E-616452、SJN 2511、ALK5抑制劑II，化學名稱為2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶，CAS編號：446859-33-2。

如本文所用，“SB431542”表示化學名稱為4-[4-(1,3-苯並二噁唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲醯胺，CAS編號：301836-41-9。

如本文所用，“TEW-7197”表示一小分子，其替代名稱為維多索替(Vactosertib)，化學名稱為2-氟-N-[[5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-([1,2,4]三唑並[1,5-a]吡啶-6-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯胺，CAS編號：1352608-82-2。

從富潛能幹細胞(PSC)獲得體外神經幹細胞(NSC)株的方法。

在一實施例中，使PSC與單一SMAD抑制劑接觸或在包含單一SMAD抑制劑的培養基中培養。在一實施例中，使PSC與RepSox接觸或在包含RepSox的培養基中培養。在一實施例中，使PSC與GW788388接觸或在包含GW788388的培養基中培養。

在一實施例中，RepSox的濃度為約 1 µM 至約200 µM，更佳約10 µM至約100 µM，更佳約20 µM 至約80 µM，更佳約30 µM至約70 µM，更佳約40 µM至約60 µM，尤佳約45 µM至約55 µM。

在一特定實施例中，PSC以約 50 µM的濃度與RepSox接觸。

在一實施例中，從第0天起將PSC與RepSox接觸。藉由在第0天將PSC與RepSox接觸使細胞開始分化，此時將細胞帶入懸浮狀態。因此，允許形成NECS的細胞已經歷了分化為NSC的早期階段。在更具體的實施例中，PSC與RepSox的接觸係由第0天一直到擴增NSC的步驟。

在一實施例中，從第0天起將PSC與GW788388接觸。藉由在第0天將PSC與GW788388接觸使細胞開始分化，此時將細胞帶入懸浮狀態。因此，允許形成NECS的細胞已經歷了分化為NSC的早期階段。在更具體的實施例中，PSC與GW788388的接觸係由第0天一直到擴增NSC的步驟。

在一實施例中，本發明涉及一種用於獲得神經幹細胞的方法，其中該方法包含單一SMAD抑制劑以產生NSC，其中超過80%的細胞為OTX2/PAX6/SOX2陽性，而無需人工挑選和分離。

在另一實施例中，該富潛能幹細胞與SMAD蛋白信號轉導抑制劑RepSox或 GW788388接觸，以產生NSC，其中超過80%的細胞為OTX2/PAX6/SOX2陽性，而無需人工挑選和分離。

本發明人辨識出這些SMAD蛋白信號傳導抑制劑，而提供更均一的NSC群體，其中80%以上的細胞是OTX2/PAX6/SOX2陽性，而無需人工挑選和分離。

本發明人辨識出這些SMAD蛋白信號傳導抑制劑，而提供更均一的NSC群體，其中80%以上的細胞是OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性。本發明人辨識出這些SMAD蛋白信號傳導抑制劑，而提供更均一的NSC群體，其中80%以上的細胞是OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性，而無需人工挑選和分離。

本發明人驚訝地發現，SMAD蛋白信號傳導的單一抑制提供了一種適合於規模放大的NSC群體。

在一實施例中，本發明提供用於例如但不限於燒瓶、槽及/或生物反應器的規模擴大的方法。

在另一實施例中，SMAD蛋白信號傳導的單一抑制劑是RepSox，其濃度為約0.25 µM至約200 µM，較佳約10 µM至約150 µM，更佳約15 µM至約100 µM，尤佳為約20 µM至約75 µM。

在另一實施例中，SMAD蛋白信號傳導的單一抑制劑是GW788388，其濃度為約0.1 ng/ml至約150 ng/ml，較佳為約10 ng/ml至約90 ng/ml，更佳為約20 ng/ml至約80 ng/ml，尤佳為約40 ng/ml至約75 ng/ml。

在該方法之一任擇性步驟中，自發形成NECS的NSC可在鋪到受質上之前解離。但是，由於可以直接鋪上NECS，因此不需要此步驟。因此，在下面的鋪上描述中，如果已進行解離NECS的任擇步驟，則可以等同準用施加鋪上NECS。

該方法包含將懸浮之NSC鋪在受質上的步驟。術語“鋪上”是指將NECS分佈在合適的受質上。本領域技術人員將知道適用於將包含幹細胞的NECS轉移到基板上的技術。在受質上培養NECS也可以稱為二維培養。從懸浮培養轉移為二維培養意味著細胞的連續培養以維持可存活條件。

如本文所用，術語“受質”應理解為允許幹細胞生長且可以在其上提供塗層的表面。這可以是但不限於多孔盤和微珠。本領域技術人員將容易地認知到用於培養細胞的合適受質，且這些是可商購的。典型的受質包括但不限於細胞培養處理的多孔盤，例如The Scientific™Nunc™細胞培養處理多孔盤。根據本發明的一實施例，係將NECS鋪在塗有細胞外基質的受質上。

術語“細胞外基質”是指負責與細胞表面受器相互作用，因而調節細胞行為如黏附、增殖、遷移和分化，或發揮機械性支持功能的細胞外分子。在一實施例中，在經塗覆受質上的塗層包含層連結蛋白及/或纖維接合蛋白及/或玻連蛋白及/或膠原蛋白。

在一實施例中，本發明的NSC用於製備細胞外囊泡。

如本文所用，術語“層連結蛋白”當提及在盤上塗覆時，是指由三個次單元，分別稱為α、β和γ鏈組成的異三聚體分子。於此參考人類層連結蛋白。已知有五種α鏈(α1至α5)、三種β鏈(β1至β3)和三種γ鏈(γ1至γ3)，且這些鏈的各種組合至少會產生12種層連結蛋白同種型。例如，“層連結蛋白α5β1γ1”在本文中稱為“層連結蛋白-511”。其他同同種型亦同。當提及層連結蛋白時，“其片段”是指完整層連結蛋白的一部分。例如，已發現層連結蛋白-511的E8片段會強力黏附於人類胚胎幹細胞。層連結蛋白及其片段可由Biolamina AB或Nippi Inc.等公司購得。

如本文所用，術語“纖維接合蛋白”當提及在盤上塗覆時，是指細胞外基質的高分子量(〜440kDa)醣蛋白，其與跨膜受器蛋白(稱為整合素)結合。與整合素相似，纖維接合蛋白會結合細胞外基質成分，例如膠原蛋白、纖維蛋白和硫酸鹽乙醯肝素蛋白聚醣(例如，syndecans)。

如本文所用，術語“玻連蛋白” 當提及在盤上塗覆時，是指在血清、細胞外基質和骨骼中大量發現的凝血酶家族的醣蛋白。

如本文所用，術語“膠原蛋白” 當提及在盤上塗覆時，是指動物體內各種結締組織中細胞外空間中的結構蛋白。作為結締組織的主要成分，它是哺乳動物中含量最高的蛋白質，佔全身蛋白質含量的25%至35%。膠原蛋白由纏繞在一起的胺基酸組成，形成三螺旋，以形成延長的原纖維。

在一較佳實施例中，該細胞外基質包含層連結蛋白或其片段，較佳選自於層連結蛋白-511和層連結蛋白-521。在另一實施例中，層連結蛋白或其片段維層連結蛋白-511和層連結蛋白-521的組合。在一實施例中，基質包含層連結蛋白-511及/或層連結蛋白-521和一或多種其他層連結蛋白。在一實施例中，層連結蛋白是完整的層連結蛋白。在另一實施例中，層連結蛋白是完整的層連結蛋白的片段。在另一實施例中，層連結蛋白的濃度為約0.001 µg/cm² 至約50 µg/cm² ，較佳約0.1 µg/cm² 至約25 µg/cm² ，更佳約0.1 µg/cm² 至10 µg/cm² ，更佳約 0.1 µg/cm² 至約5，更佳約0.25 µg/cm² 至約1 µg/cm² ，尤佳約0.5 µg/cm² 。

在一實施例中，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少90%的NECS具直徑小於 500 µm ，較佳在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，NECS具直徑小於500 µm。在一實施例中，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的NECS具直徑小於400 µm ，較佳地，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少80%的NECS具直徑小於400 µm，更佳地，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少90%的NECS具直徑小於400 µm。在一實施例中，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少50%、60%、70%、80%、90%的NECS具直徑小於300 µm，較佳地，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少80%的NECS具直徑小於300 µm。在一較佳實施例中，在鋪上含有NSC的NECS步驟之前，至少90%的NECS具直徑小於500 µm ，較佳在鋪上含有NSC的NECS步驟之前， NECS具直徑小於500 µm。

在另一實施例中，當至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%含有NSC的NECS表現標誌物SOX2時，鋪上NECS。神經玫瑰環

如本文所用，術語“神經玫瑰環”是指神經外胚層細胞和NSC的自我形成組織化，其中具有類似圓形形態的神經外胚層細胞和NSC簇，從中心放射狀地擴增。不受任何特定理論的束縛，形成神經玫瑰環是培養中NSC的內生性發育特性，且在二維培養中能輕易觀察到。在鋪到二維培養物之前，NECS中可能存在有神經玫瑰環，儘管很難觀察到。根據本發明，NSC的放射狀排列基本上由細胞自身形成，但書為提供神經外胚層細胞可存活條件，以及提供依神經譜系維持和使細胞進一步生長所需的因子。本領域技術人員將認知到，神經玫瑰環的形成可能已經在懸浮培養的NECs中進行。但是，一旦允許在二維受質上形成神經玫瑰環，就可立即觀察到。

該方法包含維持和擴增NSC，以建立神經幹細胞(NSC)株的步驟。如本文所用，術語“維持(maintaining)”和“維持(maintenance)”可以互換使用，並指提供可保持細胞存活和增殖的培養條件。如本文所用，術語“擴增(expanding)”和“擴增(expansion)”可以互換使用，並指細胞群的增殖，即，為NSC提供允許它們連續生長和分裂的條件。在一實施例中，擴增NSC的步驟包括進一步的步驟：將NSC解離為單細胞懸浮液、使NSC與ROCK抑制劑接觸、將單細胞懸浮液中的NSC重新鋪在第二受質上、以及使NSC重新形成神經玫瑰環。在另一實施例中，重複各步驟以維持和擴增神經幹細胞(NSC)株。在一實施例中，藉由使NSC與細胞解離劑如胰蛋白酶或TrypLE Select接觸，將NSC解離為單細胞懸浮液。在一實施例中，ROCK抑制劑的濃度為約0.5 µM 至約50 µM，較佳約5 µM至約25 µM.。在一實施例中，ROCK抑制劑是Y-27632。

在該方法之一實施例中，允許PSC分化約5天至約15天，較佳約7天至約13天，更佳約9天至約11天，尤佳約10天。此外，在一實施例中，在約4天至約15天後，較佳在約5天至約10天後，更佳在約5天至約8天後，尤佳在約6天後鋪上NSC。在另一實施例中，維持和擴增NSC的步驟從鋪上NSC後約1天至約8天起始，較佳在鋪上NSC後約3天至約5天，更佳在鋪上NSC後約4天。

在一較佳的實施例中，該方法不包含分離神經玫瑰環的步驟。如本文所用，術語“分離出神經玫瑰環” 意指辨識出已正確形成並且被認為可存活進行進一步擴展的神經玫瑰環。此種辨識可藉由分析某些標誌物來幫助，並且可以經由在顯微鏡下人工挑選來幫助分離出。然而，本方法不需要分離神經玫瑰環的單獨步驟。因此，在較佳實施例中，該方法不包含人工挑選神經玫瑰環以維持和擴增NSC的步驟。隨之而來的是，實質上所有形成的神經玫瑰環都是可維持和可擴增的，且在一較佳實施例中，實質上所有形成的神經玫瑰環都經維持和經擴增。“實質上全部”是指某些神經玫瑰環可能無法存活，因此無法維持和擴增。

術語“高度純”的神經幹細胞群體是指一NSC群體，其中80%以上的細胞為OTX2/PAX6雙陽性或PAX6/SOX2雙重陽性，而無需人工挑選和分離。

在一實施例中，以本發明的方法獲得的NSC有80%為OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性。

在一實施例中，以本發明的方法獲得的NSC有80%為OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性，而無需人工挑選和分離。

在一實施例中，以本發明的方法獲得的NSC至少有80%為OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性。

在一實施例中，以本發明的方法獲得的NSC至少有80%為OTX2/PAX6/SOX2三重陽性。

在一實施例中，以本發明的方法獲得的NSC至少有80%為OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1四重陽性。

本發明的另一態樣相關於一種從PSC誘導神經外胚層細胞的方法，其包含使PSC與RepSox接觸，並允許PSC分化成神經外胚層細胞的步驟。在一實施例中，該神經外胚層細胞是NSC。在一較佳的實施例中，RepSox的濃度高於約10 µM、20 µM、30 µM、40 µM或45 µM，較佳高於約20 µM。在一實施例中，RepSox的濃度小於約200 µM、150 µM、100 µM、80 µM或60 µM，較佳小於約70 µM。在一實施例中，RepSox的濃度為約1 µM至約200 µM，較佳約10 µM至約100 µM，更佳約20 µM至約80 µM，更佳約30 µM至約70 µM，更佳約40 µM至約60 µM，尤佳約45 µM至約55 µM。在一特定實施例中，PSC與濃度約50 µM的RepSox接觸。

本發明的另一態樣相關於從PSC誘導神經外胚層細胞的方法，其包含將PSC與GW788388接觸，並允許PSC分化成神經外胚層細胞的步驟。在一實施例中，該神經外胚層細胞是NSC。在一較佳的實施例中，GW788388的濃度高於約0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml或5 ng/ml，較佳高於約10 ng/ml。此外，在一較佳實施例中，GW788388的濃度小於約100 ng/ml、80 ng/ml、60 ng/ml、40 ng/ml或20 ng/ml，較佳小於約10 ng/ml。在一實施例中，GW788388的濃度為約0.1 ng/ml至約150 ng/ml，較佳約10 ng/ml至約90 ng/ml，更佳約20 ng/ml至約80 ng/ml，尤佳約40 ng/ml至約75 ng/ml。在一特定實施例中，PSC與濃度約10 ng/ml之GW788388接觸。

在一實施例中，PSC不與骨形態發生蛋白(BMP)信號傳導途徑的抑制劑接觸。具體地，在一實施例中，PSC不與Noggin接觸。

本發明的另一實施例相關於使用以第一態樣的方法獲得的NSC株於製造胞外體之用途。因此，本發明之一態樣相關於一種由前述實施例中任一項的方法獲得的NSC株製造胞外體的方法，包含以下步驟：允許該NSC製造胞外體，並分離該胞外體。此外，在一態樣中，提供以前述方法獲得的胞外體。胞外體

如本文所用，術語“胞外體”是指具有從各種細胞類型分泌的膜結構的小囊泡或奈米囊泡(直徑為30-150 nm)。通常，細胞會產生胞外體，作為胞吞來源的小型膜結合囊泡，之後在多囊泡體與細胞膜融合後，釋放到細胞外環境中。胞外體可作為人體或生物系統中各個位置之間的分子的載體。胞外體可以包含分子如核酸(例如DNA、mRNA、miRNA)、蛋白質及/或其他生物分子，這些分子可以存在於胞外體的表面、膜及/或內部。

在一實施例中，本發明的胞外體獲自NSC，其中至少80%的細胞呈OTX2/PAX6或PAX6/SOX2雙重陽性。

在一實施例中，本發明的胞外體獲自NSC，其中至少80%的細胞呈OTX2/PAX6/SOX2三重陽性。

在一實施例中，本發明的胞外體獲自NSC，其中至少80%的細胞呈OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1四重陽性。

另一態樣相關於使用本發明之胞外體作為藥物。在一實施例中，該胞外體用於治療神經退化疾病。在一實施例中，該神經退化疾病是中風。在一實施例中，該神經退化疾病是外傷性腦損傷(TBI)。在一實施例中，該神經退化性疾病是阿茲海默症。

在一實施例中，本發明相關於一種來自NSC的胞外體，其中至少80%的細胞呈OTX2/PAX6/SOX2三重陽性，用於靜脈內注射、鼻內傳送或鞘內腔投與。

在一實施例中，本發明相關於以本發明方法獲得之衍生自NSC的胞外體，用於靜脈內注射、鼻內傳送或鞘內腔投與。動態細胞培養懸浮液

懸浮培養生物反應器允許在可控和可複製的培養系統中大規模擴增和分化幹細胞和/或其後代。這些系統提供一個均質的培養環境，其條件如溫度、pH和氧氣濃度可經監控和控制。此外，這些系統允許在一致的培養條件下，以最小的培養可變度生產大量細胞。

在另一實施例中，以約5 rpms至約80 rpms，較佳約20 rpms至約70 rpms，更佳約40 rpms至約60 rpms的速度攪拌該動態細胞培養物。在一實施例中，以約30 rpm至約100 rpm，較佳約40 rpm至約90，更佳50 rpm至約80 rpm的速度攪拌該懸浮培養物。在一實施例中，以約5 rpm至約80 rpm，較佳約20 rpm至約70 rpm，更佳約40 rpm至約60 rpm的速度攪拌該懸浮培養物。在一實施例中，以約50 rpm至約80 rpm的速度攪拌該懸浮培養物。在一實施例中，以約60 rpm至約70 rpm的速度攪拌該懸浮培養物。培養基 / 組成物

設計用於支持微生物或細胞的生長之固體、液體或半固體。不同類型的市售培養基用於培養不同類型的細胞。

本發明的另一態樣提供一種維持和擴增NSC株的方法，該方法包括以下步驟：在受質上培養NSC、允許NSC重新形成神經玫瑰環、將NSC解離成單細胞懸浮液、使NSC與ROCK抑制劑接觸、然後將NSC重新鋪在第二受質上。術語“第二受質”是指該受質可以與初始的第一受質相同。第二受質可以具有相同或不同的塗層，例如細胞外基質。在一較佳的實施例中，在允許NSCs重新形成神經玫瑰環的步驟中，將NSCs解離成單細胞懸浮液的步驟之前，亦允許NSCs達到匯集。術語“匯集 ”應理解為一種培養基中細胞增殖的量度，且基本上是指培養容器的覆蓋度。如本文所用，100%匯集表示如一個培養皿實質上全部被細胞覆蓋。在一實施例中，使NSC達到至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的匯集。較佳地，允許NSC達到100%匯集。如本文所使用的，根據維持和擴增NSC株的方法進行各步驟被稱為“分代”。在一實施例中，重複各步驟以維持和擴增NSC株至少3代，較佳至少5代，更佳至少10代，尤佳至少15代。通常，前三代是最關鍵的。有些人可能僅在三到四次初始分代之後才將此細胞株稱為已建立的細胞株。

在另一實施例中，重複各步驟以維持和擴增NSC株。在一實施例中，該ROCK抑制劑是Y-27632。在一實施例中，ROCK抑制劑的濃度為約0.5 µM至約50 µM，較佳約5 µM至約25 µM，尤佳約10 µM。

在最後一態樣中，係揭示一種從PSC獲得體外神經幹細胞的方法，該方法包含以下步驟：將PSC解離為單一細胞或包含少於約50個細胞的堆積體、在懸浮培養液中培養PSC、允許PSC處於懸浮狀態以自發形成NECS，並使PSC分化為神經幹細胞。

在一實施例中，該堆積體包含少於40個細胞，較佳少於30個細胞，更佳少於20個細胞，尤佳少於10個細胞。在一實施例中，可以將NSCs鋪上或維持在懸浮培養液中，及/或進一步分化。本領域技術人員將可輕易地根據期望的最終產物，選出用於進一步分化的已建立流程。特定實施例

本發明經由以下非限制性實施例進一步描述：

1. 一種自富潛能幹細胞 (PSCs)獲得神經外胚層細胞之方法，包含下列步驟： ˙ 將該 PSCs與ROCKi和單一SMAD抑制劑，於懸浮培養液中接觸， ˙ 允許該懸浮液中的PSCs自發地形成三維細胞堆積物， ˙ 允許該三維細胞堆積物可 ˙ 於動態細胞培養懸浮液中分化為具直徑小於 500 µm之神經外胚層球體， ˙ 允許NSCs形成神經玫瑰環，其中該神經玫瑰環包含神經外胚層細胞。

2. 根據實施例1的方法，其中該神經玫瑰環被允許維持並擴增成神經幹細胞（NSC）株。

3. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該單一SMAD抑制劑是RepSox或GW788388。

4. 根據前述實施例中任一項的方法，其中RepSox的濃度為約20 µM至約60 µM，並且其中GW788388的濃度為約0.1 ng/ml至約20 ng/ml。

5. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經外胚層細胞是神經幹細胞。

6. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6雙重陽性。

7. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為PAX6/SOX2雙重陽性。

8. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6/SOX2三重陽性。

9. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1四重陽性。

10. 一種體外獲得神經幹細胞之方法，包含下列步驟： ˙ 將PSC解離為單一細胞， ˙ 將該 PSCs與ROCKi和單一SMAD抑制劑，於懸浮培養液中接觸， ˙ 允許該懸浮液中的PSCs自發地形成三維細胞堆積物 ˙ 允許該三維細胞堆積物可於動態細胞培養懸浮液中分化為具直徑小於500 µm之神經外胚層球體， ˙ 將含NECS的神經外胚層細胞鋪於受質上，或任擇地解離該含NECs的NSCS， ˙ 允許NSCs形成神經玫瑰環，並維持和擴增該NSCs以建立NSCs細胞株，無需人工挑選和分離。

11. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該PSCs於第0天解離成單一細胞。

12. 根據前述實施例中任一項的方法，其中PSC藉由與細胞解離劑如胰蛋白酶及/或TrypLE Select接觸而解離為單一細胞。

13. 根據前述實施例中任一項的方法，其中ROCK抑制劑的濃度為約 0.5 µM至約50 µM，較佳約5 µM至約25µM，尤佳約10 µM。

14. 根據前述實施例7和13所述的方法，其中該ROCK抑制劑為Y-27632。

15. 根據前述實施例中任一項的方法，其中在第0天將PSC解離為單細胞懸浮液的步驟後，將PSC與ROCK抑制劑接觸約1天，濃度為約0.5 µ至約50 µM，較佳約5 µM至約25 µM，尤佳約10 µM。

16. 根據前述實施例中任一項的方法，其中ROCK抑制劑的濃度從大約第1天開始逐漸降低。

17. 根據前述實施例中任一項的方法，更包含攪拌懸浮培養物的步驟。

18. 根據實施例17所述的方法，其中該懸浮培養物從約第0天、第1天、2天或第3天開始進行攪拌，較佳該懸浮培養物從約第1天起進行攪拌。

19. 根據實施例17和18任一者所述的方法，其中將懸浮培養物進行攪拌直到鋪上NSC的步驟。

20. 根據實施例16和17任一者所述的方法，其中當開始逐漸降低ROCK抑制劑的濃度時，對懸浮培養物進行攪拌。

21. 根據實施例17至20任一者所述的方法，其中該懸浮培養物係以搖動方式進行攪拌。

22. 根據實施例17和21任一者所述的方法，其中將懸浮培養物以約5 rpm至約80 rpm，較佳約20 rpm至約70 rpm，更佳約40 rpm至約60 rpm的速度進行攪拌。

23. 根據前述實施例中任一項的方法，其中PSC經由增殖和自發性堆積實質上形成NECS。

24. 根據前述實施例中任一項的方法，其中在鋪上NSCs的步驟前，至少90%的NECS具直徑小於500 µm ，較佳在鋪上NSCs的步驟前，NECS具直徑小於500 µm。

25. 根據前述實施例中任一項的方法，其中在鋪上NSC的步驟前，至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的NECS具直徑小於400 µm，較佳在鋪上NSC的步驟前，至少80%的NECS具直徑小於400 µm，更佳在鋪上NSC的步驟前，至少90%的NECS具直徑小於400 µm 。

26. 根據前述實施例中任一項的方法，在鋪上NSC的步驟前，至少 50%、60%、70%、80%、90%的NECS具直徑小於300 µm，較佳在鋪上NSC的步驟前至少80%的NECS具直徑小於300 µm。

27. 根據前述實施例中任一項的方法，其中PSC在第0天開始分化為NSC。

28. 根據前述實施例中任一項的方法，其中在PSC解離為單細胞懸浮液後，PSC便會立即開始分化為NSC。

29. 根據前述實施例中任一項的方法，其中將PSC與 TGFβR1/ALK5受器抑制劑，例如RepSox接觸。

30. 根據前述實施例中任一項的方法，其中PSC係與TGFβ 第2型受器/ALK5受器抑制劑如GW788388接觸。

31. 根據實施例29所述的方法，其中RepSox的濃度為約1 µM 至約200 µM，較佳約10 µM至約 100 µM，更佳約20 µM 至約80 µM，更佳約30 µM 至約70 µM，更佳約40 µM至約60 µM，更佳約45 µM 至約55 µM，尤佳約50 µM。

32. 根據實施例29至31任一項所述的方法，其中PSC從第0天開始與RepSox接觸，直到擴增NSC的步驟。

33. 根據前述實施例中任一項的方法，其中將NSC係鋪在包含細胞外基質的受質上。

34. 根據實施例33所述的方法，其中細胞外基質選自於由纖維接合蛋白、玻連蛋白、膠原蛋白和層連結蛋白或其組合、及/或其片段組成之群組。

35. 根據實施例34所述的方法，其中該細胞外基質是層連結蛋白。

36. 根據實施例35所述的方法，其中層連結蛋白選自於由層連結蛋白-521、層連結蛋白-511或其組合或其片段組成之群組。

37. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該PSC允許分化約5至約15天，較佳約10天。

38. 根據前述實施例中任一項的方法，其中當至少50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, or 99%的NSC表現標誌物SOX2時，將NSC鋪上。

39. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6雙重陽性。

40. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為PAX6/SOX2雙重陽性。

41. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6/SOX2三重陽性。

42. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1四重陽性。

43. 根據前述實施例中任一項的方法，其中在約4天至約15天後，較佳在約5天至約10天後，更佳在約5天至約8天後，尤佳在約6天後鋪上NSC。

44. 根據前述實施例中任一項的方法，其中維持和擴增NSC的步驟在鋪上NSC後約3天至約8天開始，較佳在鋪上NSC後約3天至約5天開始，更佳在鋪上NSCs後約4天開始。

45. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該方法不包含分離神經玫瑰環的步驟。

46. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該方法不包含人工挑選神經玫瑰環以維持和擴增NSC的步驟。

47. 根據前述實施例中任一項的方法，其中實質上所有形成的神經玫瑰環都是可維持和可擴增的。

48. 根據前述實施例中任一項的方法，其中實質上所有形成的神經玫瑰環都經維持和擴增。

49. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該PSC在第0天至第1天，係於第一細胞培養基中培養。

50. 根據實施例49所述的方法，其中該第一細胞培養基為Nutristem。

51. 根據實施例49和50中任一項所述的方法，其中該PSC從第1天開始在第二細胞培養基中培養。

52. 根據實施例51所述的方法，其中第二細胞培養基是DMEM/F12。

53. 根據前述實施例中任一項的方法，其中從第1天起的細胞培養基包含濃度為約0.1% (v/v)至約5% (v/v)，較佳約0.5% (v/v)至約2.5% (v/v)，更佳約1% (v/v)的N2補充劑。

54. 根據前述實施例中任一項的方法，其中該NSC在包含濃度約0.01% (v/v)至約5% (v/v)，較佳約0.5% (v/v)至約2.5% (v/v)，更佳約 0.1% (v/v)的B27的細胞培養基中維持和擴增。

55. 根據前述實施例中任一項的方法，其中擴增NSC的步驟包括以下進一步的步驟： - 將鋪上的NSC解離為單細胞懸浮液， - 將NSC與ROCK抑制劑接觸， - 將單細胞懸浮液中的NSCs重新鋪在第二受質上，以及 - 允許NSCs重新形成神經玫瑰環。

56. 根據實施例55所述的方法，其中重複該進一步的步驟以維持和擴增神經幹細胞（NSC）株。

57. 根據實施例55和56中任一項的方法，其中藉由將NSC與細胞解離劑如胰蛋白酶和/或TrypLE Select接觸，將NSC解離為單細胞懸浮液。

58. 根據實施例55至57中任一項的方法，其中ROCK抑制劑的濃度為約 0.5 µM至約50 µM，較佳約5 µM至約25 µM，尤佳約10 µM。

59. 根據實施例55至58中任一項的方法，其中ROCK抑制劑為Y-27632。

60. A一種從富潛能幹細胞（PSC）獲得神經外胚層細胞的方法，包含以下步驟： - 將PSCs與RepSox接觸，以及 - 允許PSC分化為神經外胚層細胞。

61. 根據實施例60的方法，其中該神經外胚層細胞是神經幹細胞（NSC）。

62. 根據實施例60和61,中任一項的方法，其中RepSox的濃度高於約 10 µM、20 µM、30 µM、40 µM，較佳高於約40 µM。

63. 根據實施例60至62中任一項所述的方法，其中RepSox的濃度小於約 200 µM、150 µM、100 µM、90 µM、80 µM、70 µM、60 µM，較佳小於約 60 µM。

64. 根據實施例60至63中任一項所述的方法，其中RepSox的濃度為約1 µM至約200 µM，較佳約10 µM至約100 µM，更佳約20 µM 至約 80 µM，更佳約30 µM 至約70 µM，更佳約40 µM至約60 µM，更佳約45 µM 至約 55 µM，尤佳約50 µM。

65. 根據實施例60至64任一項的方法，其中該PSC不與BMP抑制劑接觸。

66. 據實施例60至64中任一項所述的方法，其中該PSC不與Noggin接觸。

67. 根據實施例60至65中任一項所述的方法，其中該PSC不與骨形態發生蛋白（BMP）信號傳導途徑的抑制劑接觸。

68. 使用根據前述實施方案中任一項的方法獲得的神經幹細胞（NSC）株，於產生細胞外囊泡之用途。

69. 一種用於從實施例1至59中任一項方法獲得的神經幹細胞（NSC）株製造胞外體的方法，其包含以下步驟： - 允許NSC產生細胞外囊泡，以及 - 分離該細胞外囊泡。

使用根據前述實施例中任一項方法獲得的神經幹細胞（NSC）株，用於製造胞外體的用途。

70. 一種用於從實施例1至59中任一項方法獲得的神經幹細胞（NSC）株製造胞外體的方法，其包含以下步驟： - 允許NSC產生胞外體，以及 - 分離該胞外體。

71. 一種由實施例69之方法獲得之胞外體。

72. 由實施例70獲得之胞外體，係使用作為藥物。

73. 根據實施例71中所述的胞外體，係用於治療神經退化病症。

74. 根據實施例72中所述的胞外體，其中該神經退化病症為中風、外傷性腦損傷(TBI)和阿茲海默症(Alzheimer’s disease)。

75. 一種用於維持和擴增神經幹細胞（NSC）株的方法，包含以下步驟： - 在受質上培養NSC， - 允許NSC重新形成神經玫瑰環， - 將NSC解離為單細胞懸浮物， - 將NSC與ROCK抑制劑接觸，以及 - 將NSC重鋪於第二受質上。

76. 根據實施例74中所述的方法，其中重複各步驟以維持和擴增神經幹細胞（NSC）株至少5代，較佳至少10代。

77. 根據實施例74和75中任一項的方法，其中在將NSCs解離為單細胞懸浮液的步驟之前，NSC允許達到匯集。

78. 根據實施例76所述的方法，使NSC達到至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的匯集度，較佳至少90%的匯集度。

79. 根據實施例74至77中任一項的方法，其中ROCK抑制劑的濃度為約 0.5 µM 至約 50 µM，較佳約 5 µM 至約 25 µM，尤佳約10 µM。

80. 根據實施例74至78中任一項的方法，其中該ROCK抑制劑為Y-27632。

81. 一種從富潛能幹細胞（PSC）獲得體外神經幹細胞的方法，包含以下步驟： - 將PSC解離為單一細胞或包含少於約50個細胞的堆積體， - 在懸浮培養液中培養PSC， - 允許懸浮的PSC自發形成（NECS），以及 - 使PSC分化為神經幹細胞。

82. 根據實施例80所述的方法，其中該堆積體包含少於40個細胞，較佳少於30個細胞，更佳少於20個細胞，尤佳少於10個細胞。。

83. 根據實施例80和81中任一項所述的方法，其中該NSC可在懸浮培養液中進行鋪上或維持，及/或進一步分化。

84. 一種高純度神經外胚層細胞群，經由實施例1至67中任一項所述的方法獲得。

85. 根據實施例83的高純度神經外胚層細胞群，用於進一步分化為神經細胞或神經膠質細胞，使用作為藥物。

86. 如實施例84所述的神經幹細胞或神經膠質細胞，用於治療神經退化病症，藉由將由該幹細胞衍生之神經或神經膠質細胞或組織或器官，移植到有需要的個體中。

87. 一種用於再生及/或修復和/或構建組織或器官的套組，其中該套組包含： i 一裝置 ii 如實施例10至12的神經外胚層細胞群體，用於進一步分化為神經細胞或神經膠質細胞，或實施例7至9的胞外體或胞外體群體、 iii 生物相容性支架或基質、 iv 至少一種生長因子或其功能片段； v 選自於由ROCK抑制劑及/或單一SMAD抑制劑如RepSox或GW788388組成之群組之一試劑；以及任擇地，用於製備、維持及/或使用該細胞(包括從其衍生的任何細胞培養物或組織或器官)的說明。

88. 本發明經由以下非限制性實施例更進一步描述：

89. 一種從富潛能幹細胞（PSC）獲得體外神經幹細胞（NSC）株的方法，包含以下步驟： - 將PSC解離為單一細胞， - 在懸浮培養液中培養PSC， - 允許懸浮的PSC自發地形成（NECS）， - 將PSC分化為NSC， - 任擇地解離NSC， - 將NSC鋪在受質上， - 允許NSC形成神經玫瑰環，以及 - 維護和擴增NSC以建立NSC株。

90. 根據實施例88的方法，其中在使PSC帶入單細胞懸浮液的步驟中，將PSC與ROCK抑制劑接觸。

91. 根據實施例88至89的方法，更包含攪拌懸浮培養物的步驟。

92. 根據實施例90的方法，其中懸浮培養物從大約第1天開始進行攪拌。

93. 根據實施例88至91的方法，其中該PSC經由增殖及/或非強迫堆積形成NECS。

94. 根據實施例88至92所述的方法，其中，在鋪上該NSC的步驟之前，該NECS的直徑小於 500 µm 。

95. 根據實施例88至93的方法，其中該PSC與濃度約1 µM至約100 µM的RepSox接觸。

96. 根據實施例88至94所述的方法，其中擴增NSC的步驟包含以下進一步的步驟： - 將鋪上的NSC解離為單細胞懸浮液， - 使NSC與ROCK抑制劑接觸， - 將單細胞懸浮液中的NSC重新鋪在第二受質上，以及 - 允許NSCs重新形成神經玫瑰環。

97. 根據實施例95的方法，其中重複擴增NSC的進一步步驟，以維持和擴增神經幹細胞（NSC）細胞至少10代。

98. 使用根據實施例88至96中任一項的方法獲得的神經幹細胞（NSC）株，以製造細胞外囊泡的用途。

99. 使用根據實施例88至96中任一項的方法獲得的神經幹細胞（NSC）株，以產生胞外體的用途。

100. A一種從富潛能幹細胞（PSC）獲得神經外胚層細胞的方法，包含以下步驟： - 將PSCs與RepSox接觸，以及 - 允許PSC分化為神經外胚層細胞，其中RepSox的濃度為約 40 µM至約60 µM。

101. 根據實施例99的方法，其中該神經外胚層細胞是神經幹細胞（NSC）。

102. 根據實施例99至100中任一項的方法，其中該PSC不與Noggin接觸。

103. 一種維持和擴增神經幹細胞（NSC）株的方法，包含以下步驟： - 在受質上培養NSC， - 允許NSC重新形成神經玫瑰環， - 將NSC帶入於單一懸浮狀態， - 將NSCs與ROCK抑制劑接觸，以及 - 將NSCs更換至第二受質上，其中各步驟重複至少10次。

104. 根據實施例89至94和102項中任一項的方法，其中ROCK抑制劑的濃度為約 0.5 µM至約50 µM。實例

以下是用於實施本發明流程的非限制性實例。縮寫列表循環閾值（CT）值； DMEM / F12（Dulbecco經修飾Eagle培養基/ Ham的F-12培養基）；良好生產規範（GMP）；良好組織規範（GTP）；人類胚胎幹細胞（hESC）；人類誘導富潛能幹細胞（hiPSC）；人類富潛能幹細胞（hPSC）；人類重組層連結蛋白（hrLN）；層連結蛋白（LN）; 神經幹細胞（NSC）；神經外胚層球體（NECS）； Orthodenticle Homeobox 2（OTX2）; 配對框6（PAX6）; 富潛能幹細胞（PSC）；即時聚合酶鏈反應（PCR）； Rho結合含螺旋-螺旋激酶（ROCK）; Rho結合含螺旋-螺旋激酶抑制劑（ROCKi）；小母親抗十五褶（SMAD）；一般製備方法 hESCs 之培養

內部產生的hESC株係維持於人類重組層連結蛋白（hrLN）塗覆盤(Biolaminin 521 LN, Biolamina)中的NutriStem hPSC XF培養基(Biological Industries)上，在5% CO₂ 培養箱中於37°C培養，且每3-5天以1:10 – 1:20之酵素進行分代。為了進行分代，將匯集的培養物以不含鈣和鎂離子的磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS）洗滌一次，並在37°C下與TrypLE Select(GIBCO, Thermo Fisher Scientific)一起靜置5分鐘。然後小心地除去酵素，並藉由輕輕移液將細胞收集在新鮮的NutriStem hPSC XF培養基中，以獲得單細胞懸浮液，並將所需體積鋪在新鮮的hrLN-521塗覆培養盤上。分代後，培養基更換為新鮮的預熱NutriStem hPSC XF培養基，並每天更換。實例1: NECS和玫瑰環形成的分化流程

用於hESC的神經誘導以及隨後的產生和NSC株建立的實驗流程可以大致分為三個主要階段：神經外胚層誘導和NECS形成；NECS鋪上和玫瑰環形成，以及最後建立NSC系株，藉由將細胞重鋪於擴增培養基中。該流程如圖1所示。

以PBS^-/- 洗滌50-90%匯集的hESC，並在37°C下以TrypLE™Select（Gibco）從單層培養物中解離約5分鐘，以獲得單細胞懸浮液。將hESC的單細胞懸浮液重新懸浮於補充有10 µM ROCKi（Y-27632）的NutriStem®中，並以1 mL1x10⁵ -2x10⁵ 細胞/ mL的細胞密度之1 mL作為標準，接種至12孔盤之單孔(約3.5 cm² ) 中（第0天）。

在第1天，大約50%的培養基與NECS培養基交換，該培養基由DMEM / F12 GlutaMAX™補充劑（Gibco™）組成，其中補充有20 U/mL青黴素-鏈黴素、1% N-2補充劑（Gibco™）和GW788388，或不同濃度的RepSox，不含ROCKi。為了啟動旋轉NECS形成，從第1-6天開始將盤以不同的速度、時隙、水平和角度放置在Multi Bio 3D Mini-shaker (BioSan)。作為一實例，一最佳條件為： -速度：40-60 rpm -角度（轉彎角度）：240-360度，10-15秒。 -振動（搖擺角度）：5度，3-5秒。

每天藉由移除一半培養基並添加新鮮的培養基更換NECS培養基。靜態與動態培養之間的比較如圖2所示，顯示動態條件形成的小而均勻的結構。比較RepSox和GW788388條件，以RepSox處理產生的NECS更透明，表示其三維結構的密度較小（圖3）。在動態條件下6天後，收集所有NECS並將其以二維方式鋪上在經層連結蛋白塗覆的48孔盤上。用於塗覆，1：50天然小鼠層連結蛋白（L2020-1MG，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）表現良好，但層連結蛋白的類型也可擴展至LN-521或LN-511（BioLamina）。從第7天到第10天，現在以二維方式附著，移除所有培養基，並以新鮮的NECS培養基重新培養細胞。不同步驟的實例示於圖4中，其中有第3天（動態懸浮）、第8天（二維的神經玫瑰環）和第10天（單細胞解離前）後之圖像。在RepSox條件下，到第10天，神經玫瑰環清晰可見（請見圖5），並且細胞呈NES陽性，每個神經玫瑰環均顯示ZO1陽性空腔。

此處使用的特定細胞hESC株，與GW相較，RepSox對神經玫瑰環結構形成的作用似乎更好（圖6）。如圖7和8所示，濃度分別為25和50 µM之RepSox是獲得神經玫瑰環均質群體(其具有NES陽性細胞和ZO1位於每一玫瑰環中心)的最佳濃度。較低的濃度效果不太明顯。圖9和10顯示四個獨立的實驗（r1-4），以50 µM之RepSox生成神經玫瑰環，顯示上述方法的可重複性。

結論為，單一SMAD抑制劑RepSox可以高效和可重複的方式有效率地生產NSC。也可使用SMAD抑制劑GW788388。實例2：預估產生神經玫瑰環的NECS尺寸

對於圖9和圖10中所示的四個獨立實驗，在第6天收集NECS，輕輕重新懸浮，然後將200 µL NECS懸浮培養物的樣本稀釋於200 µL PBS中。測定直徑、尺寸分佈、NECS計數和圓度。例如，我們使用Biorep®Islet Counter及其相關軟體（Biorep Technologies）。BioRep®藉由高解析度圖像量化出島形物，然後進行數位圖像分析，因而計算出各島形物的面積。之後將計算出的面積用於估算島形物的數個特徵，包括單獨直徑(d=2(A/π)^1/2 )和藉由50 µm增量組分類的樣本尺寸分佈 (Buchwald et al., 2016)。

在測量之前，樣本移入八張圖中，以分佈堆積體，而允許最佳偵測。另外，如果所有NECS皆未被軟體自動偵測到，則使用選擇工具將明顯遺漏的NECS加到數據中。

藉由將NECS直徑分類到50 µm柱中，並評估圖形分佈來檢查NECS的均質性（圖11）。如圖所示，直徑小於400 µm的NECS對神經玫瑰環的形成具有類似的影響，其中所有細胞均呈NES陽性。例如藉由靜態培養獲得的較大直徑會產生負面影響，並產生NES陰性細胞部分（圖12）。

結論為，NECS的直徑大小對細胞純度具有強力而直接的影響，小於400 µm的理想大小即可獲得高度均質的NSC群體。實例3：NSC細胞株的擴增和建立

在第10天，神經玫瑰環被完美定義。細胞以PBS^-/- 洗滌，以預熱的TrypLE™Select（37°C）處理，並在37°C下靜置5-10分鐘。將細胞輕輕重新懸浮於預先加熱的經定義胰蛋白酶抑制劑（來自Gibco的DTI）中，並轉移至“洗滌培養基”，該培養基由DMEM / F12 GlutaMAX™補充劑（Gibco™）組成，並補充有20 U/mL青黴素-鏈黴素（Gibco）、1% N-2補充劑（Gibco™）和10 µM ROCKi（Y-27632），將其以1200 rpm離心3分鐘。離心後，去除上清液，並將沉澱物重新懸浮於神經擴增培養基中，該培養基由DMEM / F12 GlutaMAX™補充劑（Gibco™）組成，其中補充有20 U/mL青黴素-鏈黴素（Gibco）、1% N-2補充劑（Gibco™ ）、10 µg/L bFGF、10 µg/L EGF、1‰B-27補充劑（Gibco™），並補充有10 µM ROCKi（Y-27632）。然後將細胞懸浮液接種到塗有1:50天然小鼠層連結蛋白（L2020-1MG，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）的培養盤中。

此後兩到四天，每天重複一次此過程。此後，使用溫和的解離方法，將細胞僅以TrypLE™Select洗滌，並在室溫下靜置2至4分鐘，然後重新懸浮於DTI中。其餘步驟遵循與上述相同的方法。對於每次分裂，將NSC分佈在孔中，其大致對應於雙重培養區域，即1：2分裂。NSC在形成玫瑰環前未分裂。通常，NSC大約需要兩到三天才能形成玫瑰環。在不分裂NSC的期間，移除培養基並添加不含ROCKi（Y-27632）的新鮮製備培養基。

當培養擴增到6孔形式時，即在這種情況下在9天內進行5次分裂後，便開始進行分代編號。

在第10天成功形成玫瑰環後，將細胞解離並重新鋪上以建立NSC株。NSCs擴增36天，並從1×10⁶ 個細胞按比例擴展到1×10⁹ 個以上的細胞，倍增時間約為3-4天，表明其具有持續的擴增能力（圖13）。解離後，NSC保留了其玫瑰環形成的趨勢並維持NSC標誌物NES、PAX6、OTX2和SOX2的表現（圖14-15）。所有細胞均為SOX2陽性。經過數次分代後，保留具有明顯ZO-1中央/空腔定位的典型玫瑰環結構，其中看到多個微小而均勻的玫瑰環（圖14和15，與分代數5相較）。這些NSC在解離後保持其玫瑰環形成趨勢的能力亦可見於圖16，對應於分代數12。NSC形成多個對NES呈陽性且在空腔具有ZO1定位的神經玫瑰環（圖16）。另外，NSC亦連續表現神經元標誌物，包括NSC標誌物PAX6和SOX2。

用於冷凍保存，如上所述將細胞解離並分離出。然後將細胞重新懸浮於STEM-CELLBANKER®（Zenoaq）中，並在-80°C下保存24小時，然後再將小瓶轉移到N₂ 槽中。

NSC在第12代時仍呈標誌物FOXG1和OTX2陽性（圖17），說明前葉（前腦）同一性。亦於mRNA位準上分析該同一性，比較分別以RepSox 25和50 µM產生的二細胞株（圖18）。

流式細胞儀分析顯示，以這種方法產生的細胞中有80%以上在第3代對PAX6和OTX2標誌物呈雙重陽性（圖19）。

流式細胞儀分析顯示，以這種方法產生的細胞中有80%以上在第8代對PAX6/OTX2、PAX6/FOXG1、PAX6/SOX2標誌物呈雙重陽性（圖20）。

由收集到的數據顯示，依照我們的流程可以生成保留關鍵NSC特性的純且可擴增的細胞株，其中保留高比例，超過80%對於PAX6/OTX2與PAX6/SOX2呈雙重陽性，或對於PAX6/OTX2/SOX2呈三重陽性。實例4：不同SMAD抑制劑的比較

表1 顯示測試的不同化合物和濃度的評分。測量的參數是細胞死亡、玫瑰環形成、二維單層形成、玫瑰環結構中形成的上皮厚度、以及無側群（所有細胞均為NES和OTX2陽性），即細胞群的純度。

對以下參數進行評估，並在以下進行更詳細的說明：

細胞死亡 : 藉由DAPI（4'，6-二醯胺基-2-苯基吲哚）染色監測。角質化或核型角質化是染色質在經歷壞死或凋亡的細胞核中不可逆的濃縮。在螢光顯微鏡下目視檢查後，得分0表示高數目的凝結核，得分3代表低數目的凝結核。

玫瑰環編號 : 由DAPI、ZO1和NES染色監測。在螢光顯微鏡下目視檢查後，得分0代表神經玫瑰環核的數量少，得分為3代表神經玫瑰環的數量高。

單層形成 : 以亮場和DAPI染色進行監測。在顯微鏡下目視檢查後，得分3代表NECS附著後的平坦單層細胞。

玫瑰環柱狀上皮的厚度 : 以DAPI染色監測。在螢光顯微鏡下目視檢查後，得分3代表神經玫瑰環的柱狀上皮較寬、較厚。

側群體 : 藉由NES和OTX2的特異性染色進行監測。在螢光顯微鏡下目視檢查後，得分6表示未檢測到NES陰性細胞。僅在沒有NES陰性細胞的條件下評估OTX2群體。在那些情況下，得分3表示未檢測到OTX2陰性細胞。

以下化合物和濃度係根據上述參數測試和評估： - SB431542 10 µM - SB431542 + LDN 10 µM + 10 µM - GW 788388，濃度為10 ng/ml和0.1 ng/ml - RepSox，劑量為25 µM和 0.25 µM - SB525334，劑量為10 µM和 0.1 µM - LY2157299，劑量為10 µM - TEW-7197, 劑量為10 µM - LY2109761，劑量為 2 µM - 對照組：未經任何SMAD抑制劑治療實例5：胞外體收集

收集來自至少80%呈PAX6/OTX2/SOX2三重陽性的NSC和hESC的上清液，並在4°C下以1500 g離心10分鐘以移除細胞。棄去沉澱物，將上清液轉移至新的收集管中，並在-80℃下保存，直至超高速離心以純化外泌體。圖21顯示從hESC和NSC收集的上清液中存在的胞外體的分析。由hESC產生的胞外體和由NSC產生的胞外體之間的尺寸、蛋白質含量和顆粒數量不同。由NSC產生的胞外體的結構係經由電子顯微鏡成像。該數據顯示，至少80%呈PAX6/OTX2/SOX2三重陽性的NSC群體可以產生胞外體。

表 1 : 比較

化合物	細胞死亡	玫瑰環	單層形成	上皮厚度	無側群體(NES Neg)	無側群體(OTX2 Neg)	最終評分
RepSox	3	3	3	2	6	3	20
LY2157299	3	3	2	3	6	0	17
TEW-7197	0	2	2	2	6	3	15
RepSox Low	3	3	3	3	0	N/A	12
GW788388	3	3	3	3	0	N/A	12
SB525334	0	3	2	2	4	N/A	11
SB431542	3	3	2	2	0	N/A	10
SB525334低	2	3	2	3	0	N/A	10
GW788388低	2	2	3	2	0	N/A	9
SB431542/LDN	0	0	0	0	6	3	9
LY2109761	0	0	0	0	6	3	9
對照組	0	0	0	0	0	N/A	0

儘管已在本文中說明及描述本發明之某些特徵，但本領域中具有通常知識者現將想到多種修改、取代、變化及等效物。因此，應瞭解所附申請專利範圍係意欲涵蓋落入本發明之真正精神的所有如此修飾及改變。

無

[圖1]顯示實驗流程的示意圖。“測試的化合物”是指測試的任何小分子：SB431542、LDN、GW788388、RepSox、SB525334、LY2157299、TEW-7197或LY2109761。“Y”代表10 µM ROCKi(Y-27632)。

[圖2]顯示在第3天拍攝的明視野顯微照片，清楚地顯示搖動可以提高NECS的均勻性。比例尺：200 µm。

[圖3]顯示以GW788388和RepSox培養得到的NECS形態。小分子RepSox誘導形成具有明亮空腔的NECS，而GW788388導致更黑和更密的核心。

[圖4]顯示在此過程中的不同時間點，懸浮液中的NECS和黏附型NECS的亮場顯微照片。在第3天，在懸浮培養物中形成數種NECS。二維接種後，在第8天可以看到許多玫瑰環，在第10天可以看到數個均勻的玫瑰環。比例尺：200 µm(A、E); 100 µm(F); 50µm(B、C、D)。

[圖5]顯示使用RepSox(25 uM)形成神經玫瑰環的實例，該圖顯示位於每個神經玫瑰環中心(內腔)的ZO1蛋白的頂端定位。所有細胞均對神經前驅細胞標誌物Nestin(NES)呈陽性。

[圖6]顯示兩種化合物GW788388和RepSox的比較。沿著緊密連接標誌物ZO1，以NSC標記物NES染色細胞，因而使神經玫瑰環和其他結構可視化。當以RepSox處理hESC時觀察到多個神經玫瑰環，而GW788388僅觀察到很少的玫瑰環。。另外，未形成神經玫瑰環的細胞亦於使用GW788388時觀察到。比例尺：100 µm。

[圖7和8]顯示沿著緊接標記物ZO1，以NSC標記物NES染色細胞，並分別於RepSox 0.25 µM、2.5 µM、25 µM和50 µM下，以DAPI複染。RepSox的量明顯影響細胞的組織化，其中較高的劑量可增進神經玫瑰環的形成。白色箭頭表示NES陰性細胞。

[圖9和圖10]顯示使用RepSox 50 µM進行的生物複製之間神經玫瑰環尺寸的變化。比例尺：100 µm。

[圖11]顯示每一次複製的NECS尺寸分佈。該圖顯示相對NECS直徑間隔中的NECS數量(粒子計數)，以50個單位遞增(以µm為單位)。

[圖12]顯示大於400 µm的NECS的影響。並非所有細胞(DAPI)皆為標誌物NES陽性。

[圖13]顯示以所提出的方法產生的NSC株的可擴增性和族群倍增時間(以天為單位)。此外，線性回歸模型已應用於經log2-轉換的數據，以可視化NSC如何經由數次細胞分代隨時間擴增和加倍。

[圖14和15]顯示已建立的NSC株的不同分代，顯示在分代5次之後保留的神經玫瑰環形成(NES/ZO-1)。此外，所有細胞皆呈SOX2陽性，幾乎所有細胞皆呈PAX6和OTX2陽性。比例尺：100 µm。

[圖16]顯示已建立的NSC株的第12代，顯示保留的神經玫瑰環形成(NES/ZO-1)。此外，所有細胞皆呈SOX2陽性，幾乎所有細胞皆呈PAX6和OTX2陽性。比例尺：100和10 µm。

[圖17]顯示已建立的NSC株的第12代，顯示保留的神經玫瑰環形成以及對前驅標誌物FOXG1和OTX2呈陽性。比例尺：100 µm。

[圖18]顯示相對於hESC的NSC相對基因表現。左軸顯示hESC的相對倍數變化，以2-ΔΔCt法計算。右軸是-ΔΔCt，且呈現數值是以hESC標準化的ΔCts平均值(ΔΔCt)±SD。25 µM(n=5)、50 µM(n=4)。基因依照富潛能性、NSC和神經元限制性前驅細胞、前葉/前腦、中腦和後葉/後腦的典型標誌物進行分組。對log10(dCt)值進行統計學檢驗，顯著性位準為α=5% (p＜0.01 (**) 和 p＜0.001 (***))。N.d.=未偵測到或Ct＞35。

[圖19]顯示以流式細胞儀(FACS)測定的第3次分代之PAX6和OTX2(二種神經幹細胞標誌物)雙重陽性細胞之量。PAX6/OTX2陽性細胞的百分比為93.4%。

[圖20]顯示第8次分代之雙重陽性細胞的定量，其中神經幹細胞標誌物PAX6、OTX2和SOX2、以及前腦標誌物FOXG1，係以流式細胞儀(FACS)測定。PAX6/OTX2、PAX6/FOXG1和PAX6/SOX2的百分比超過80%。

[圖21]顯示胞外體存在於從hESC和NSC收集的上清液中。由hESC產生的胞外體和由NSC產生的胞外體之間的尺寸、蛋白質含量和顆粒數量不同。由NSC產生的胞外體結構係以電子顯微鏡成像。

Claims

一種自富潛能幹細胞 (PSCs)獲得神經外胚層細胞之方法，包含下列步驟： ˙ 將該PSCs與ROCKi和單一SMAD抑制劑，於懸浮培養液中接觸， ˙ 允許該懸浮液中的PSCs自發地形成三維細胞堆積物， ˙ 允許該三維細胞堆積物可於動態細胞培養懸浮液中分化為具直徑小於500 µm之神經外胚層球體， ˙ 允許該神經外胚層球體形成神經玫瑰環(neural rosettes)，其中該神經玫瑰環包含神經外胚層細胞。
如請求項1所述之方法，其中該神經玫瑰環被允許維持並擴增成神經幹細胞（NSC）株。
如前述請求項任一項所述之方法，其中該神經外胚層細胞為神經幹細胞。
一種於體外獲得神經幹細胞之方法，包含下列步驟： ˙ 將PSCs解離為單一細胞； ˙ 將該PSCs與ROCKi和單一SMAD抑制劑，於懸浮培養液中接觸； ˙ 允許該懸浮液中之PSCs自發地形成立體細胞堆積物； ˙ 允許該三維細胞堆積物可於動態細胞培養懸浮液中分化為具直徑小於500 µm之神經外胚層球體； ˙ 將含NECS的神經外胚層細胞鋪於受質上，或任擇地解離該含NECs的NSCS； ˙ 允許NSCs形成神經玫瑰環，並維持和擴增該NSCs以建立NSCs細胞株，無需人工挑選和分離。
如前述請求項任一項所述之方法，其中該單一SMAD抑制劑為RepSox 或GW788388。
如前述請求項任一項所述之方法，其中RepSox的濃度為約20 µM至約60 µM，以及其中GW788388的濃度為約0.1 ng/ml至約150 ng/ml。
如前述請求項任一項所述之方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6或 SOX2/PAX6雙重陽性。
如前述請求項任一項所述之方法，其中該神經幹細胞至少80%為OTX2/PAX6/SOX2三重陽性。
如前述請求項任一項所述之方法，其中該神經幹細胞至少80%為 OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1四重陽性。
一種如前述請求項任一項方法獲得的神經幹細胞（NSC）株之用途，其係用於製造細胞外囊泡、例如胞外體。
一種如請求項9所述之胞外體，其係使用作為藥物。
如請求項10之胞外體，係用於治療神經退化病症，如中風、外傷性腦損傷或阿茲海默症(Alzheimer’s disease)。
一種神經外胚層細胞之同質群體，係經由請求項1至10任一項所述之方法而獲得。
如請求項13所述之神經外胚層細胞之同質群體，其係進一步分化為神經或神經膠質細胞而使用作為藥物。
如請求項14之神經幹細胞或神經膠質細胞，係用於治療神經退化病症，藉由將該衍生自幹細胞之神經或神經膠質細胞或組織或器官移植到有需要的個體中。