JP2022538503A - ヒト多能性幹細胞由来の神経幹細胞株の生成 - Google Patents

Abstract

本発明は、概して、幹細胞の分野に関し、より具体的には、高純度の神経幹細胞集団、ヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞に由来する神経幹細胞株などの神経幹細胞の、このような高純度の神経幹細胞由来株を取得するための方法に関する。さらに、本発明は、神経変性疾患の治療に使用するための医薬として使用するための、このような高純度の神経幹細胞株の使用に関する。

Description

本発明は、概して、幹細胞の分野に関し、より具体的には、高純度の神経幹細胞集団、ヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞に由来する神経幹細胞株などの神経幹細胞の、このような高純度の神経幹細胞由来株を取得するための方法に関する。さらに、本発明は、神経変性疾患の治療における使用のための医薬として使用するための、このような高純度の神経幹細胞株の使用、および脳卒中の治療のためのかかる神経幹細胞から取得されたエクソソームの使用に関する。

神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロンおよび神経膠細胞を生成する能力を有する自己再生多能性細胞である。ＮＳＣは、中枢神経系の正常な胚発生中に一時的に存在し、類似の細胞は、例えば、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）にも由来し得る。これまでに、ｈＰＳＣを高純度で増殖可能なヒトＮＳＣの集団に分化させるのに成功した効率的なプロトコルの開発のために、多大な努力がなされてきた。ヒトＮＳＣへのｈＰＳＣの分化のための確立された方法は、胚様体と呼ばれる細胞凝集体の形成を介したものである。しかしながら、多くの現在のプロトコルは、例えば、非神経性同一性のサイドセルラーポピュレーションを含む、不均一な細胞集団をもたらす。したがって、ＮＳＣの手動選択（例えば、神経ロゼットの手動採取による）が必要であり、これは骨の折れる時間のかかるプロセスであり、それによってスケーラビリティが制限される。

この数年間にわたって、脳梗塞を含む、脳損傷および神経変性を治療するために、ＮＳＣ由来細胞外小胞（ＥＶ）およびエクソソームの使用が探索されてきた。細胞外小胞（ＥＶ）は、細胞から自然に放出される脂質二重層で区切られた粒子である。ＥＶの直径は、物理的に可能な最小の単層のリポソームのサイズ（約２０～３０ナノメートル）に近いものから、１０ミクロン以上の大きさまで幅があるが、ＥＶの大部分は２００ｎｍよりも小さい。エクソソームは、ほとんどの細胞型によって放出されるナノスケールのＥＶ（直径３０～１５０ｎｍ）である（Ｃｏｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。エクソソームは、その宿主細胞に由来するタンパク質、核酸、および脂質を含むことができ、細胞間コミュニケーションを促進し、レシピエント細胞機能を調節する様々な分子（カーゴ）を含有する（Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。虚血性脳卒中療法のためのエクソソームの利用に関する最近の研究は、改善された機能的帰結を、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、脂質、タンパク質、ＲＮＡを含むそれらのカーゴに起因すると考えている（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｈｏｐｐ，２０１８）。これらの知見は、ＮＳＣ由来エクソソームの適用が、脳卒中および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を含む脳損傷の治療のための有望な新しい手段であり得ることを示唆している。

いくつかの文書（Ｒｕｔｔａｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．２００７）では、ＲＯＣＫｉおよび／またはデュアルＳＭＡＤ阻害（ｄｕａｌ ＳＭＡＤ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を使用して、２Ｄ培養物中のｈＰＳＣからＮＳＣを取得するための方法を開示するとされている（Ｑｉｕｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１９、ＵＳ２０１７／２６０５０１、Ｍｅｉｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８）。これらの方法の一部では、純度を増加させるために、増殖前に解体する必要があり、すなわち、細胞の手動選択および単離を必要とする。これは時間とリソースを消費し、当該方法のスケーラビリティの能力を低下させる。

本発明の目的は、前述の課題を克服すること、特に、スケーラビリティを可能にし、非常に高純度のＮＳＣのＧＭＰ集団を提供するＮＳＣ株を取得するための方法を提供することである。

前述の目的は、本発明の態様によって達成される。さらに、本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかになるであろうさらなる課題を解決することができる。本発明の第一の態様では、インビトロで多能性幹細胞（ＰＳＣ）からＮＳＣ株を取得するための方法であって、ＰＳＣを単一細胞に解離させる工程と、懸濁培養においてＰＳＣを培養する工程と、懸濁液中のＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自然発生的に形成することを可能にする工程と、それらを、ＮＳＣを含む神経外胚葉細胞からなる神経外胚葉球（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｓｐｈｅｒｅ（ＮＥＣＳ））に分化させる工程と、任意選択的にＮＳＣを解離させる工程と、ＮＳＣを基材上にプレーティングする工程と、ＮＳＣが神経ロゼットを形成することを可能にする工程と、ＮＳＣを維持および増殖させてＮＳＣ株を確立する工程と、を含む、方法が提供される。

ＰＳＣの神経誘導、およびそれに続くＮＳＣ株の生成および確立に使用されるプロトコルは、大まかに３つの主要段階に分けられる：神経外胚葉誘導およびＮＥＣＳ形成、ＮＥＣＳプレーティングおよびロゼット形成、ならびに最終的に細胞を増殖培地中でリプレーティングすることによるＮＳＣ株の確立。これらの主要段階に従うことによって、本発明者らは、高速かつ信頼性の高いＮＥＣＳベースの分化プロトコルを可能にする方法を開発し、これは神経ロゼット形態を有する主に純粋で増殖可能なヒトＮＳＣ集団をもたらす。方法は、ＮＳＣ株の分化および確立を促進する。１０日後、本発明者らは、解離する準備ができている、２Ｄで明確で目に見える神経ロゼットを観察した。ＮＳＣ株は、神経ロゼットが解離され、さらに３～４継代のためにリプレーティングされたときに確立される。大きな利点の１つは、手動による単離の、退屈で時間のかかる工程を回避できることである。本発明者らは、強制凝集することなく均一なＮＥＣＳの形成を制御することにより、方法がこのような高純度を提供することが可能であると考えている。したがって、本発明者らは、ＰＳＣが自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能にする工程が特に重要であることを見出した。自然発生的な形成は、部分的には、一旦プレーティングされると、高純度の、明確に画定された、均質な神経ロゼット集団をもたらすサイズを有するＮＥＣＳ集団を促進する。好ましい実施形態では、方法は、懸濁培養物を攪拌させる工程をさらに含む。本発明の発明者らは驚くべきことに、ＮＥＣＳの初回の非強制的形成後、培養物を攪拌させることで、直径サイズが５００μｍ未満のＮＥＣＳの集団の確立がさらに促進されることを発見した。さらに驚くべきことに、ＮＥＣＳのサイズを制御することによって、神経ロゼットの純度および形成を改善できることが見出された。好ましい実施形態では、ＮＥＣＳの直径は、ＮＳＣをプレーティングする工程の前に５００μｍ未満である。

一態様では、本発明は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、
・懸濁培養において当該ＰＳＣをＲＯＣＫｉおよび単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる工程、
・懸濁液中の当該ＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自然発生的に形成することを可能にする工程、
・動的細胞培養懸濁液中で、当該三次元細胞凝集体が５００μｍ未満の直径の神経外胚葉球（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｓｐｈｅｒｅ）に分化することを可能にする工程、
・当該神経外胚葉球が、神経ロゼットを形成することを可能にする工程であって、当該神経ロゼットが神経外胚葉細胞を含む工程を含む、方法に関する。

一態様では、本発明は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地中で当該ＰＳＣを培養する工程を含む、方法に関する。

別の態様では、本発明は、多能性幹細胞から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地中で当該ＰＳＣを培養する工程を含み、当該単一のＳＭＡＤ阻害剤は、ＲｅｐＳｏｘまたはＧＷ７８８３８８である、方法に関する。

一態様では、本発明は、多能性幹細胞から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地中で当該多能性幹細胞を培養する工程を含み、当該単一のＳＭＡＤ阻害剤は、約２０μＭ～約６０μＭの濃度のＲｅｐＳｏｘである、方法に関する。

一態様では、本発明は、多能性幹細胞から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地中で当該多能性幹細胞を培養する工程を含み、当該単一のＳＭＡＤ阻害剤は、約０，１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＷ７８８３８８である、方法に関する。

本発明の別の態様は、ＰＳＣから神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、ＰＳＣを、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）／アクチビン／ノーダル（ｎｏｄａｌ）シグナル伝達経路の阻害剤と接触させる工程、およびＰＳＣが神経外胚葉細胞に分化することを可能にする工程を含み、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）／アクチビン／ノーダルシグナル伝達経路の阻害剤は、好ましくは、約０．１μＭ～約１００μＭの範囲の濃度のＲｅｐＳｏｘである、方法に関する。本発明者らは驚くべきことに、特定の濃度のこの小分子が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の同時阻害を必要としない場合でも、すなわち、ＰＳＣをＮｏｇｇｉｎと接触させるなどの二重ＳＭＡＤ阻害を伴わずに、非常に高い効率でＰＳＣの神経外胚葉系統への分化を促進することを見出した。これは、神経外胚葉系統への分化プロトコルを簡素化し、プロトコルのＧＭＰコンプライアンスへの転換を容易にする。

一態様では、本発明は、高純度の神経幹細胞集団に関し、当該神経幹細胞は、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％の二重陽性である。

一態様では、本発明は、高純度の神経幹細胞集団に関し、当該神経幹細胞は、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％の三重陽性である。

本発明の別の態様では、エクソソームを産生するための本発明のＮＳＣ株の使用が提供される。さらなる態様では、本発明の方法に従って取得されたＮＳＣ株からエクソソームを産生するための方法であって、ＮＳＣがエクソソームを産生することを可能にする工程およびエクソソームを単離する工程を含む、方法が提供される。

本発明の別の態様は、特に脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）およびアルツハイマー病などであるがこれらに限定されない神経変性障害および／または脳損傷の治療における使用のための、医薬として使用するためのエクソソームに関する。したがって、一実施形態では、神経変性障害は脳卒中である。別の実施形態では、神経変性障害は外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である。さらに別の実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病である。

本発明の別の態様では、ＮＳＣ株を維持および増殖させる方法であって、基材上でＮＳＣを培養する工程と、ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程と、ＮＳＣを単一の懸濁液に解離させる工程と、ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程と、ＮＳＣを第２の基材上にリプレーティングする工程と、を含む、方法が提供される。本発明者らは驚くべきことに、各継代でＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させることにより、ロゼット構造、形態、および神経前駆体組成物の複雑さが著しく維持されることを発見した。

一態様では、本発明は、インビトロで神経幹細胞を取得するための方法であって、
・ＰＳＣを単一細胞に解離させる工程、
・懸濁培養において当該ＰＳＣをＲＯＣＫｉおよび単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる工程、
・懸濁液中のＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自発的に形成することを可能にする工程、
・動的細胞培養懸濁液中で、当該三次元細胞凝集体が、５００μｍ未満の直径の神経外胚葉球に分化することを可能にする工程、
・ＮＥＣＳ含有神経外胚葉細胞を基材上にプレーティングするか、または任意選択的にＮＥＣＳ含有ＮＳＣを解離させる工程、
・ＮＳＣが、神経ロゼットを形成することを可能にし、ＮＳＣを維持および増殖させて手動での採取および分離を必要とせずにＮＳＣ株を確立する工程を含む、方法に関する。

別の態様では、本発明は、ＰＳＣからインビトロで神経幹細胞（ＮＳＣ）株を取得するための方法であって、
・当該ＰＳＣを、単一細胞または約５０個未満の細胞を含む凝集体に解離させる工程、
・当該取得された細胞を、動的懸濁培養で培養する工程、
・当該取得された細胞が、懸濁液中で自然発生的にＮＥＣＳを形成し、さらにＮＳＣを産生することを可能にする工程、
・ＮＳＣが、維持および増殖してＮＳＣ株を確立することを可能にする工程を含む、方法に関する。

この最後の態様による方法の利点は、２Ｄまたは懸濁液中のいずれかで培養することによって、神経外胚葉系統の特定細胞へのさらなる分化のために容易に利用可能なＮＳＣの迅速な提供である。

前述の態様の好ましい実施形態では、ＰＳＣはｈＰＳＣであることが、出願全体に適用される。以下において、好ましい実施形態における生成物もヒト由来である。したがって、好ましい実施形態では、ＮＳＣおよびＮＳＣ株は、それぞれヒトＮＳＣおよびＮＳＣ株である。

図１は、実験プロトコルの概略図を示す。「試験された化合物」は、試験された小分子：ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＴＥＷ－７１９７またはＬＹ２１０９７６１のいずれかを指す。「Ｙ」は、１０μＭ ＲＯＣＫｉ（Ｙ－２７６３２）を意味する。 図２は、３日目に撮影された明視野顕微鏡写真を示し、振とうにより、ＮＥＣＳの均一性が向上することを明確に示している。スケールバー：２００μｍ。 図３は、ＧＷ７８８３８８およびＲｅｐＳｏｘを用いた培養からのＮＥＣＳの形態を示す。小分子ＲｅｐＳｏｘは、明るい空洞を有するＮＥＣＳの形成を誘導するのに対し、ＧＷ７８８３８８は、より暗く高密度のコアをもたらす。 図４は、プロセス中の異なる時点での懸濁液中のＮＥＣＳおよび付着性ＮＥＣＳの明視野顕微鏡写真を示す。３日目に、いくつかのＮＥＣＳが懸濁培養物中に形成される。２Ｄで播種後、８日目に多くのロゼットが、および１０日目にいくつかの均一なロゼットが見られる。スケールバー：２００μｍ（Ａ、Ｅ）、１００μｍ（Ｆ）、５０μｍ（Ｂ、Ｃ、Ｄ）。 図５は、各神経ロゼットの中心（ルーメン）に位置するＺＯ１タンパク質の頂端局在化を示す、ＲｅｐＳｏｘ（２５μＭ）を使用した神経ロゼット形成の例を示す。すべての細胞は、神経前駆細胞マーカーのＮｅｓｔｉｎ（ＮＥＳ）に対して陽性であった。 図６は、ＧＷ７８８３８８とＲｅｐＳｏｘの２つの化合物の比較を示す。細胞は、密着結合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）マーカーＺＯ１に沿ってＮＳＣマーカーＮＥＳで染色され、このため神経ロゼットおよび他の構造の可視化を可能にする。ｈＥＳＣをＲｅｐＳｏｘで処理すると複数の神経ロゼットが観察されるが、ＧＷ７８８３８８では少数のロゼットしか観察されない。さらに、ＧＷ７８８３８８では、神経ロゼット非形成細胞が観察される。スケールバー：１００μｍ。 図７および８は、密着結合ＺＯ１に沿ってＮＳＣマーカーＮＥＳで染色され、ＲｅｐＳｏｘ ０．２５μＭ、２．５μＭ、２５μＭ、および５０μＭでそれぞれＤＡＰＩで対比染色された細胞を示す。細胞の組織化は、ＲｅｐＳｏｘの量によって明らかに影響を受け、高用量は神経ロゼット形成を改善する。白色の矢印はＮＥＳ陰性細胞を示す。 上記参照。 図９および１０は、ＲｅｐＳｏｘ ５０μＭを用いた生物学的複製間の神経ロゼットサイズの変化を示す。スケールバー：１００μｍ。 上記参照。 図１１は、各複製のＮＥＣＳのサイズ分布を示す。グラフは、５０単位増分（μｍ）の相対的なＮＥＣＳ直径の間隔内にある、ＮＥＣＳの数（粒子数）を示す。 図１２は、４００μｍを超えるＮＥＣＳの効果を示す。すべての細胞（ＤＡＰＩ）がマーカーＮＥＳに対して陽性であるわけではない。 図１３は、提示された方法によって生成されたＮＳＣ株の増殖可能性および集団の倍加時間（日数）を示す。さらに、線形回帰モデルをｌｏｇ２変換したデータに適用して、ＮＳＣがいくつかの細胞継代を介して経時的にどのように増殖し、倍加するかを可視化した。 図１４および１５は、５継代後に神経ロゼット形成（ＮＥＳ／ＺＯ－１）の保持を示す、確立されたＮＳＣ株の異なる継代培養を示す。さらに、すべての細胞がＳＯＸ２陽性であり、ほぼすべての細胞がＰＡＸ６およびＯＴＸ２陽性である。スケールバー：１００μｍ。 上記参照。 図１６は、神経ロゼット形成（ＮＥＳ／ＺＯ－１）の保持を示す、継代数１２の確立されたＮＳＣ株を示す。さらに、すべての細胞がＳＯＸ２陽性であり、ほぼすべての細胞がＰＡＸ６およびＯＴＸ２陽性である。スケールバー：１００および１０μｍ。 図１７は、１２継代の確立されたＮＳＣ株が、神経ロゼット形成の保持を示し前のマーカーＦＯＸＧ１およびＯＴＸ２に対して陽性であることを示す。スケールバー：１００μｍ。 図１８は、ｈＥＳＣと比較したＮＳＣの相対的な遺伝子発現を示す。左軸は、２－ΔΔＣｔ法によって計算されたｈＥＳＣに対する相対的な倍率変化を示す。右軸は－ΔΔＣｔであり、提示された値は、ｈＥＳＣ（ΔΔＣｔ）±ＳＤに正規化されたΔＣｔの平均である。２５μＭ（ｎ＝５）、５０μＭ（ｎ＝４）。遺伝子は、多能性、ＮＳＣ、ならびにニューロン制限前駆細胞、前部（ａｎｔｅｒｉｏｒ）／前脳、中脳、および後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）／後脳に典型的なマーカーにグループ化される。統計検定は、有意水準がα＝５％（ｐ＜０．０１（＊＊）およびｐ＜０．００１（＊＊＊））のｌｏｇ１０（ｄＣｔ）値で実行される。Ｎ．ｄ．＝検出せず、またはＣｔ＞３５。 図１９は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定される２つの神経幹細胞マーカーＰＡＸ６およびＯＴＸ２について、３継代での二重陽性細胞の定量化を示す。ＰＡＸ６／ＯＴＸ２陽性細胞の割合は９３．４％である。 図２０は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定された神経幹細胞マーカーＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＳＯＸ２、ならびに前脳メーカーＦＯＸＧ１について、８継代での二重陽性細胞の定量化を示す。ＰＡＸ６／ＯＴＸ２、ＰＡＸ６／ＦＯＸＧ１、およびＰＡＸ６／ＳＯＸ２の割合は８０％を超えている。 図２１は、ｈＥＳＣおよびＮＳＣの両方から収集された上清にエクソソームが存在することを示す。サイズ、タンパク質含量および粒子数は、ｈＥＳＣによって産生されるエクソソームとＮＳＣによって産生されるエクソソームの間で異なる。ＮＳＣによって産生されるエクソソームの構造は、電子顕微鏡によって撮像される。

別段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者に公知の化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。

すべての見出しおよび小見出しが、本明細書では便宜上使用されているだけであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。

本明細書で提示する任意およびすべての例または例示的な語句（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより明瞭にするという意図しかなく、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中のいずれの語句も、特許請求されないいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。

本出願全体を通して、細胞を分化するためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用され得る。本発明の方法は、典型的には、一連の工程によって定義される。本明細書で使用される場合、方法に関する「工程」という用語は、何かが取り組まれている、および／または動作が実施される段階として理解されるべきである。実施される工程および／または取り組んでいる工程が、同時および／または順次および／または連続的である場合が、当業者によって理解されるであろう。

本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書に別段の示唆がない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。

本発明の細胞、化合物、または薬剤の量、用量、温度などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された量の５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含するよう意図される。本明細書で使用される場合、プロトコルに関する「日」という用語は、ある特定の工程を実施するための特定の時間を指す。

一般的に、かつ別段の記載がない限り、「０日目」は、プロトコルの開始を指し、これは例えば、幹細胞をプレーティングすること、または幹細胞をインキュベーターに移すこと、または幹細胞の移植前に、現在の細胞培養培地中の幹細胞を化合物と接触させることによるが、これらに限定されない。典型的には、プロトコルの開始は、未分化幹細胞を別の細胞培養培地および／または容器に移すことにより、例えば、限定されないが、プレーティングもしくはインキュベートすることにより、および／または未分化幹細胞を、分化プロセスが開始されるような方法で未分化幹細胞に影響を及ぼす化合物と最初に接触させることによって、行われる。

１日目、２日目などの「Ｘ日目」に言及する場合、これは、０日目のプロトコル開始に関連するものである。当業者は、別段の指定がない限り、ステップを実施するための正確な日時が変動し得ることを認識するであろう。したがって、「Ｘ日目」は、±１０時間、±８時間、±６時間、±４時間、±２時間、または±１時間などの時間範囲を包含するよう意図される。

本明細書で使用される場合、「約Ｘ日目～約Ｙ日目から」というフレーズは、ある事象が開始される日を指す。このフレーズは、その事象が開始し得る日の間隔を提供する。例えば、「細胞が約３日目～約５日目に分化因子と接触する」場合、これは、すべての選択肢：「細胞が約３日目から分化因子と接触する」、「細胞が約４日目から分化因子と接触する」、および「細胞が約５日目から分化因子と接触する」を包含するものとして解釈される。したがって、このフレーズは、３日目～５日目の間にのみ起こる事象として解釈されるべきではない。これは、「約Ｘ日目～約Ｙ日目まで」というフレーズに準用する。

以下、本発明による方法は、非限定的な実施形態および実施例によってより詳細に記載される。ＰＳＣから神経幹細胞株を取得するための方法が提供される。したがって、方法は、幹細胞の使用において相殺される。

「幹細胞」は、分化能および増殖能（特に自己再生能力）を有するが、分化能を維持する未分化細胞として理解されるべきである。幹細胞は、分化能に従って、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、多分化能性幹細胞、単能性幹細胞などの亜集団を含む。

本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）とは、インビトロで培養することができ、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する任意の細胞系統に分化する効力を有する幹細胞を指す。ＰＳＣは、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織中の幹細胞、体細胞などから誘導され得る。ＰＳＣの例としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）などが含まれる。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から取得されたミューズ細胞（多系統分化ストレス耐性細胞）、および生殖細胞（例えば、精巣）から産生される生殖細胞系列幹細胞（ＧＳ細胞）も、ＰＳＣの用語に包含される。したがって、本発明で使用される多能性幹細胞は、例えば、ＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５に記載されているように、胚盤胞から調製される胚性幹細胞、または市販の細胞もしくは細胞株であり得る。ＥＳ細胞株はまた、子宮外胚を破壊することなく、かつ臨床転帰に影響を及ぼすことなく、単一割球から誘導することもできる（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）およびＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２００６））。

本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても知られる）という用語は、一般に再プログラミングとして知られるプロセスによって、成体細胞から直接生成され得るＰＳＣのタイプを意味する。多能性関連遺伝子の特定のセットの産物の導入によって、成体細胞は、ＰＳＣに変換され得る。胚性幹細胞はまた、例えば、ＷＯ２００３／０４６１４１に記載されるような単為生殖性物に由来してもよい。胚性幹細胞は、単一の割球から、または胚を破壊することなく取得された内部細胞塊を培養することによって産生され得る。胚性幹細胞は、所与の組織から入手可能であり、市販されている。本発明の方法および産生物は、好ましくは、ｈＰＳＣ、すなわち、ｉＰＳＣまたは単為生殖性物を含む胚性幹細胞のいずれかに由来する幹細胞に基づく。

本発明は、ＰＳＣからインビトロでＮＳＣ株を取得するための方法であって、
・ＰＳＣを単一細胞に解離させる工程、
・取得された細胞を懸濁培養で培養する工程、
・動的懸濁液中で当該取得された細胞が、ＮＥＣＳを自然発生的に形成することを可能にする工程と、当該ＮＥＣＳをＮＳＣに分化させる工程と、基材上にＮＳＣをプレーティングする工程または任意選択でＮＳＣを解離させる工程、
・ＮＳＣが神経ロゼットを形成することを可能にする工程と、ＮＳＣを維持および増殖させてＮＳＣ株を確立する工程を含む、方法を提供する。

本明細書で使用される場合、「神経」という用語は、神経系を指す。本明細書で使用される場合、「神経細胞」という用語は、細胞型を模倣する細胞を指し、それは、当然ながら外胚葉の胚葉、より具体的には、神経外胚葉の一部であり、この用語は、早期神経前駆細胞から成熟した有糸分裂後ニューロンに至るまで、この胚葉内の発達の任意の段階にある細胞を包含することを意味する。

本明細書で使用される場合、「神経外胚葉細胞」という用語は、神経外胚葉系統に沿った発達中の任意の段階の細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「神経幹細胞」（ＮＳＣ）という用語は、無制限に、自己再生および増殖することができ、ニューロン、星状細胞およびオリゴデンドロサイトなどの神経細胞およびグリア細胞に最終的に分化し得る子孫細胞を生成する多能性細胞を指す。ＮＳＣの非幹細胞子孫は、神経前駆細胞と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「神経前駆体細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」および「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」という用語は、互換的に使用されてもよく、神経幹細胞にさらに由来するが、広範な増殖能力は維持しない細胞を意味する。

本明細書で使用される場合、「神経幹細胞株」という用語は、神経ロゼット構造および、マーカーＺＯ１、ＮＥＳ、ＳＯＸ２、ＯＴＸ２、およびＰＡＸ６を維持しながら少なくとも１０継代、継代培養することができるＮＳＣの集団を意味する。神経ＮＳＣ株を取得するための方法を参照することによって、一つ以上のＮＳＣ株を確立することができることを意味する。本発明者らは、１０日後すでに２Ｄで神経ロゼット形成を観察した。ＮＳＣ株は、神経ロゼットが解離され、さらなる３～４継代にわたりリプレーティングされたときに確立される。以後、ＮＳＣ株が確立したとみなされ、そこから、ＮＳＣを少なくとも１０継代にわたり継代培養することができる。一実施形態では、ＮＳＣ株は不死化されない、すなわち、一実施形態では、ＮＳＣ株は１００継代以下にわたり継代培養することができる。

一実施形態では、本発明の確立されたＮＳＣ株は、３～４継代にわたり継代培養される。一実施形態では、本発明の確立されたＮＳＣ株は、１０継代にわたり継代培養される。一実施形態では、本発明の確立されたＮＳＣ株は、２０継代にわたり継代培養される。

「インビトロ」という用語は、ＮＳＣがヒトまたは動物体の外部で提供され、維持されることを意味する。一実施形態では、ＮＳＣは非天然である。

「非天然」という用語は、ＮＳＣが、ヒト起源を有し得るＰＳＣに由来するが、自然界には存在しない人工構築物であることを意味する。一般に、幹細胞の分野では、人体の細胞にできるだけ似た細胞を提供することが目的であることが多い。しかしながら、成熟細胞が人体本来の天然細胞と区別できない程度まで、ＰＳＣが胚期および胎児期に受ける発達を模倣することは、可能とならないかもしれない。本質的に、本発明の一実施形態では、ＮＳＣは人工的である。

本明細書で使用される場合、「人工」という用語は、自然界で天然に存在するが、天然に存在しない構築物に改変された材料を含み得る。これは、人体の細胞を模倣する非天然細胞に分化する、ヒト幹細胞を含む。好ましくは、ＮＳＣは幹細胞由来である。より好ましくは、ＮＳＣは、ＰＳＣに由来する幹細胞である。さらなる実施形態では、ＮＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）および／またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する幹細胞である。

ＰＳＣは、最初は単一細胞に解離される。本明細書で使用される場合、「単一細胞に解離する」という用語は、ＰＳＣを単一細胞懸濁液にすることを意味する。「単一細胞懸濁液」とは、細胞の単一細胞および／または典型的には約５個または６個未満の細胞の三次元の小さな凝集体が機能および増殖することを可能にする、細胞懸濁液または懸濁培養物を意味する。細胞を懸濁状態にする場合、細胞の大部分は基材または容器表面に付着しない。ＰＳＣを単一細胞懸濁液にするための任意の適切な手段を使用してもよい。当業者は、酵素的またはキレート化など、ＰＳＣを、単一細胞懸濁液にするためのいくつかの方法が存在することを容易に認識するであろう。一実施形態では、ＰＳＣは、０日目に単一細胞懸濁液に解離される。ＰＳＣを懸濁状態にすることは、細胞を、基材および／または細胞外基質からの細胞の相互の解離を促進する治療に供することを意味する。一実施形態では、ＰＳＣは、ＰＳＣをトリプシンおよび／またはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔなどの細胞解離剤と接触させることによって、単一細胞懸濁液に解離される。

さらなる工程で、ＰＳＣを懸濁培養で培養する。本明細書で使用される場合、「懸濁培養」という用語は、単一細胞または細胞の凝集体が液体培地中に自由に浮遊していることを意味する。懸濁培養はまた、三次元培養と呼んでもよく、二つの用語は、本出願全体を通して互換的に使用され得る。したがって、ＰＳＣは、基材表面に付着されず、またはそうでなければ、細胞外基質などの足場内に固定されていない。しかしながら、懸濁培養中の一部の細胞が容器の表面に付着し得ることは十分に認識されている。懸濁培地を攪拌しないと、細胞は、重力によって最終的に容器の表面に定着する。

「培養」という用語は、幹細胞が、制御された条件下で、一般に、それらの自然環境の外で連続的な手順として増殖するプロセスとして理解されるべきであり、これは、その様々な段階で細胞の生存率を維持するために、方法全体を通して使用され得る。対象となる細胞が、例えば、限定されないが、生体組織または胚から単離された後、それらは続いて、注意深く制御された条件下で維持される。これらの条件は、各細胞型によって異なるが、一般に、必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、増殖因子、ホルモン、およびガス（ＣＯ_２、Ｏ_２）を供給し、物理化学的環境（ｐＨ緩衝液、浸透圧、温度）を調節する培地を備えた適切な容器からなる。

典型的には、幹細胞は、その現在の発生状態での生存能力に適した細胞培養培地で提供される。培養のための幹細胞を提供することは、通常、幹細胞を、新しい基材上に播種すること、またはインキュベーター中で懸濁することなどによって、異なる環境へと移すことを暗示する。当業者は、幹細胞がそのような移動に対して脆弱であり、手順が注意を必要とすること、および幹細胞を元の細胞培養培地中で維持することが、細胞培養培地を分化プロセスにより適した別の細胞培養培地で置き換える前に、細胞のより持続可能な移動を促進し得ることを認識するであろう。したがって、一実施形態では、０日目の細胞培養培地は、第１の細胞培養培地であり、細胞培養培地の少なくとも一部は、約１日目から第２の細胞培養培地で置き換えられる。

本明細書で使用される場合、細胞培養培地、第１の細胞培養培地、および第２の細胞培養培地に関する「置き換える」という用語は、ある量の細胞培養培地が適切な手段によって取り出され、任意選択で、実質的に等量の細胞培養培地が添加されて、細胞培養培地の総量が実質的に同じままである、手順を意味する。「第１の細胞培養培地を除去すること」とは、第１の除去および第２の細胞培養培地の添加の後として理解され、その後の任意の後続の置き換えは、第１および第２の細胞培養培地の混合物の置き換えであり、混合物は、除去および添加される量に対応する比率である。したがって、順次除去では、第１の細胞培養培地は、第２の細胞培養培地によって連続的に希釈され、この手順を繰り返すことによって、細胞培養培地は最終的に、第１の細胞培養培地を実質的に含まないことになる。

さらなる実施形態では、細胞培養培地は、化学的に定義され、かつ異種由来成分を含まない（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）。本明細書で使用される場合、細胞培養培地に関する「化学的に定義される」という用語は、化学構成成分のすべてが既知であるヒトまたは動物細胞のインビトロ細胞培養に適した増殖培地を意味する。化学的に定義された培地は、構成成分のすべてが特定され、それらの正確な濃度が既知でなければならないことを必要とする。

本明細書で使用される場合、「異種由来成分を含まない」および「動物由来成分を含まない」という用語は、互換的に使用でき、かつ本発明によれば、任意の動物由来の構成成分を好ましくは完全に欠いていることを意味する。好ましい実施形態では、細胞培養培地はまた、フィーダーを含まない（ｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅ）。

「フィーダーを含まない」および「フィーダー細胞を含まない」という用語は、互換的に使用されてもよく、そうでなければ培養幹細胞に栄養を与える目的で存在し得るヒトおよび動物細胞を欠いている培養系を指し、すなわち、フィーダー細胞は、それらが支持する幹細胞に代謝物を供給するが、増殖または分裂を意図する細胞ではない。

本発明者らは、化学的に定義された「異種由来成分を含まない」および「フィーダー細胞を含まない」細胞培養環境を好むが、規制機関は、そのような基準に完全に準拠することなく、本発明による方法に基づいた医薬品および治療を承認し得る。本発明者らは、ＧＭＰおよびＧＴＰの最高水準を遵守するよう努める。しかしながら、本発明は、そのような基準に限定されるものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明がそのような高い基準を固執することなく実施され得ることを容易に認識するであろう。

一実施形態では、第１の細胞培養培地は、基材への移動時に幹細胞の生存能力を支持する任意の好適な細胞培養培地であってもよい。そのような細胞培養培地は市販されており、例えば、ｉＰＳおよびＥＳ幹細胞用のＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地などのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）であり得る。したがって、一実施形態では、ｉＰＳおよびＥＳ幹細胞用のＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地などのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）。

一実施形態では、第２の細胞培養培地は、化学的に定義され、かつ異種由来成分を含まない。さらなる実施形態では、第２の細胞培養培地はまた、フィーダーを含まない。一実施形態では、第二の細胞培養培地は、ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。類似の培地は、同等に良好に機能し、容易に購入可能である。さらなる実施形態では、ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、Ｎ２および／またはＢ２７で補充される。一実施形態では、Ｎ２の濃度は、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）～約２．５％（ｖ／ｖ）。一実施形態では、Ｂ２７の濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）～約１％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）。

一実施形態では、ＰＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程で、ＰＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。

ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連コイル状コイル含有キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、ＲｈｏＡ低分子量ＧＴＰａｓｅのエフェクターであり、セリン／トレオニンキナーゼのＡＧＣファミリーに属する。ＲＯＣＫキナーゼは、細胞の収縮、遊走、アポトーシス、生存、および増殖を含む多くの機能を有する。ＩＲｈｏ関連、コイル状コイル含有プロテインキナーゼＲＯＣＫ阻害剤は、ｒｈｏキナーゼを標的とし阻害する一連の化合物である。本明細書で使用される場合、「Ｙ－２７６３２」は、ＣＡＳ番号１２９８３０－３８－２を有するトランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩を指す。

一実施形態では、細胞培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２またはＴｉｇｅｒである。

したがって、好ましい実施形態では、ＰＳＣが単一細胞懸濁液に解離されると同時に、ＰＳＣはＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約１日目から徐々に低下する。次いで、一実施形態では、ＰＳＣは、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭの濃度で、ＰＳＣを０日目に単一細胞懸濁液に解離させる工程から開始して、約１日間、ＲＯＣＫ阻害剤と接触させる。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。

方法は、単一細胞懸濁液中のＰＳＣが、自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能にする工程を含む。

三次元細胞凝集体
本明細書で使用される場合、「三次元細胞凝集体」という用語は、単一細胞から形成される幹細胞のクラスター、または短期間、すなわち１～２日間、互いに付着した少数個の細胞の凝集体を意味する。三次元細胞凝集体は、細胞のごく少数のＰＳＣおよび／またはごく少数の細胞分裂の間の初期細胞付着を介して形成され、分裂が継続するにつれて本質的に成長する。このプロセスでは、初期のＰＳＣ懸濁培養物はＲＯＣＫ阻害剤にさらされる。ＲＯＣＫｉの存在下で、ＰＳＣが自然発生的に三次元細胞凝集体を形成し、その後、ＮＥＣＳを形成するより大きな細胞凝集体を形成することを可能にする工程は、受動的な手順である。本明細書で使用される場合、三次元細胞凝集体の形成を指す場合の「自然発生的」という用語は、三次元細胞凝集体自体の形成が、ＰＳＣを単一細胞懸濁液にすることを除いて、いかなる手段によっても強制または促進されないことを意味する。

一実施形態では、三次元細胞凝集体は、２４時間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、最初の２４時間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、少なくとも２４時間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、約１～３日間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、約２～３日間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、約１日間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、約２日間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、約３日間のＰＳＣのＲＯＣＫｉへの曝露後に形成される。

神経外胚葉球
本明細書で使用される場合、「神経外胚葉球」（ＮＥＣＳ）という用語は、細胞分裂によりサイズが大きくなり、同時に数日間、すなわち５～６日間神経外胚葉の運命に分化した三次元細胞凝集体を意味する。本発明の方法によると、ＮＥＣＳの細胞は、初期の小さな三次元細胞凝集体を形成する際に、発生から神経外胚葉系統に向けられる。ＮＥＣＳは、成熟期に応じて神経外胚葉細胞、ＮＳＣ、および神経ロゼットを形成するＮＳＣが含まれる。ＮＥＣＳは、細胞の細胞分裂を介して形成され、分裂が続くにつれて本質的に増殖する。したがって、一実施形態では、ＰＳＣは有糸分裂を介して実質的にＮＥＣＳを形成する。本明細書で使用される場合、「有糸分裂」という用語は、染色体の数が維持される遺伝的に同一の細胞を生じさせる細胞分裂を指す。本発明による方法において、ＮＥＣＳは、分化しながら分割されるＰＳＣによって形成される。したがって、ＮＥＣＳは、最初にＰＳＣを含み、これらの細胞が分裂し、分化すると、分化幹細胞を含むＮＥＣＳを形成する。ＰＳＣが自然発生的に小さな細胞凝集体を形成し、その後、より大きなＮＥＣＳを形成することを可能にする工程は、受動的な手順である。本明細書で使用される場合、ＮＥＣＳの形成を指す場合の「自然発生的」という用語は、ＮＥＣＳ自体の形成が、ＰＳＣを単一細胞懸濁液にすることを除いて、いかなる手段によっても強制または促進されないことを意味する。自然発生的な形成は、細胞の活発な凝集とは反対であり、これは、円錐形状のウェルまたは液滴において細胞を一緒にクラスター化することによって促進され得る。本明細書で使用される場合、当該「自然発生的」形成は、「非強制的」形成または「受動的」形成とも呼ばれうる。したがって、一実施形態では、ＮＥＣＳは、強制的な凝集なしに形成することを可能にする。好ましい実施形態では、ＮＥＣＳは、細胞懸濁液中で自然発生的に形成され得る。任意の特定の理論に束じられるものではないが、ＮＥＣＳの自然発生的形成は、一部はＰＳＣの増殖によるものであり、おそらくは、１つ以上のＮＥＣＳの自然発生的凝集によるものであると考えられる。

一実施形態では、三次元細胞凝集体は、さらに５日間、自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能とする。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、少なくともさらに５日間、自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能とする。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、さらに３～８日間、自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能とする。一実施形態では、三次元細胞凝集体は、さらに３～１０日間、自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能とする。

懸濁培養
一実施形態では、方法は、懸濁培養物を攪拌させて、動的細胞培養懸濁液を作製する工程をさらに含む。本明細書で使用される場合、「攪拌」という用語は、懸濁培養を維持する目的で、細胞培養培地の動きを提供することを意味する。攪拌は、適切な任意の手段によって提供されてもよい。一実施形態では、懸濁培養物は、振とうすることによって攪拌させる。さらなる実施形態では、懸濁培養物は、約５ｒｐｍ～約８０ｒｐｍ、好ましくは約２０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍ、より好ましくは約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約３０ｒｐｍ～約１００ｒｐｍ、好ましくは約４０ｒｐｍ～約９０ｒｐｍ、より好ましくは５０ｒｐｍ～約８０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約５ｒｐｍ～約８０ｒｐｍ、好ましくは約２０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍ、より好ましくは約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約５０ｒｐｍ～約８０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約６０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍの速度で攪拌される。好ましい実施形態では、懸濁培養物は、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を徐々に低下させ始めるときに攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約０日目、１日目、２日目、または３日目から攪拌され、好ましくは懸濁培養物は、約１日目から攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、ＮＥＣＳをプレーティングする工程まで攪拌される。

本発明の方法は、ＰＳＣをＮＳＣに分化させる工程を含む。ＰＳＣが分化することを可能にすることは、実施される別個の最終ステップとして解釈されるべきではない。当業者は、本明細書で使用される場合、「分化する」および「分化」という用語が、細胞が未分化状態から分化状態に、未成熟状態からあまり未成熟ではない状態に、または未成熟状態から成熟状態に進行するプロセスを指し、これは方法が実行され、細胞が分化を促進する様々な要因に曝されるときに継続的に発生することを容易に理解するであろう。これは、例えば、ＮＳＣに分化するＰＳＣであるがこれに限定されない。細胞相互作用および成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを損失するまたは分化した細胞のマーカーを獲得するときに生じる。単一マーカーの損失または獲得は、細胞が「成熟または完全に分化」されたことを示し得る。

好ましい実施形態では、ＰＳＣのＮＳＣへの分化は、０日目に開始される。これは、ＰＳＣのＮＳＣへの分化が、ＰＳＣを単一細胞懸濁液に解離させた直後に開始されることを意味する。

一実施形態では、ＰＳＣは、ＴＧＦβＲ１／ＡＬＫ５受容体の阻害剤と接触させる。本明細書で使用される場合、細胞を培養することに関する「接触」という用語は、「接触した」細胞を生成するために、例えば、特定の化合物を細胞に近づけることによって、細胞を特定の化合物に曝露することを意味する。接触は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。接触の非限定的な例は、化合物を細胞の細胞培養培地に添加することによる。細胞の接触は、細胞および特定の化合物が近接している限り、例えば、化合物が細胞培養培地中に好適な濃度で存在する限り、起こるものと想定される。「細胞をＸと接触させる」とは、「Ｘを含む細胞培養培地で細胞を培養する」と同義とみなされ得る。本明細書で使用される場合、シグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路の阻害に関する「阻害剤」という用語は、未処置の細胞または処置された細胞もしくは組織を阻害しない化合物で処置された細胞と比較した場合に、特定の分化結果など（例えば、デフォルトの細胞型分化を促進する活性シグナル伝達経路を抑制し、それによって非デフォルトの細胞型への分化を誘導する）、結果として生じる標的分子または標的化合物または標的プロセスに干渉する（すなわち、低減または排除または抑制する）化合物を指す。

本明細書で使用される場合、「ＯＴＸ２」は、オルソデンティクルホメオボックス２（Ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、神経前駆細胞を含む胚発生中の前脳構造のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＰＡＸ６」は、「ペアードボックス６（Ｐａｉｒｅｄ Ｂｏｘ ６）」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、神経前駆細胞を含む胚発生中の前脳構造のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ２」は、「ＳＲＹボックス転写因子２（ＳＲＹ－Ｂｏｘ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ２）」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、神経前駆細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＦＯＸＧ１」は、「フォークヘッドボックスＧ１（Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ Ｇ１）」遺伝子、転写物またはタンパク質を指し、胚発生中の前脳細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＺＯ１」または「ＴＪＰ１」は、「タイトジャンクションタンパク質１（Ｔｉｇｈｔ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、タイトジャンクションアダプタータンパク質として作用する。これは、神経ロゼットの頂端部分であるルーメンを定義するために使用される。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の少なくとも８０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の少なくとも８５％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の約９３％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の少なくとも８０％が、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の少なくとも８５％が、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の少なくとも９０％が、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、細胞の約９３％が、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２およびＯＴＸ２を共発現する。

Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路の阻害剤
本明細書で使用される場合、「Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路の阻害剤」は、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路を特異的に阻害する化合物を指す。Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤の例は、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＮＯＧＧＩＮ、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ４３１５４２、およびＴＥＷ－７１９７を含む群から選択されてもよい。

本明細書で使用される場合、「ＧＷ７８８３８８」は、小分子化学名Ｎ－（オキサン－４－イル）－４－［４－（５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－２－イル］ベンズアミド、およびＣＡＳ番号：４５２３４２－６７－５を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＬＤＮ－１９３１８９」は、ＩＵＰＡＣ名４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン、およびＣＡＳ番号：１０６２３６８－２４－４の化合物を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＬＹ２１５７２９９」は、強力なＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）阻害剤であり、代替名ガルニセルチブ、および化学名４－［２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル］キノリン－６－カルボキサミド、ならびにＣＡＳ番号：７００８７４－７２－２である、小分子を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＬＹ３６４９４７」は、ＩＵＰＡＣ名４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、およびＣＡＳ番号３９６１２９－５３－６の化合物を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＮＯＧＧＩＮ」は、骨形成タンパク質－４（Ｂ ＭＰ ４）などのシグナル伝達タンパク質の形質転換増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーのメンバーに結合し、それを不活性化する、分泌されたホモ二量体糖タンパク質を示す。ＮＯＧＧＩＮは典型的には、グリコシル化、ジスルフィド結合二量体としてヒト細胞内で発現される６５ｋＤａのタンパク質である。

本明細書で使用される場合、「ＲｅｐＳｏｘ」は、ＴＧＦ－βＲＩの強力で選択的な阻害剤であり、代替名Ｅ－６１６４５２、ＳＪＮ ２５１１、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、および化学名２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、ならびにＣＡＳ番号４４６８５９－３３－２である、小分子を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＳＢ４３１５４２」は、化学名４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド、およびＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９の化合物を意味する。

本明細書で使用される場合、「ＴＥＷ－７１９７」は、代替名バクトセルチブおよび化学名２－フルオロ－Ｎ－［［５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］アニリン、ならびにＣＡＳ番号：１３５２６０８－８２－２の、小分子を意味する。

多能性幹細胞（ＰＳＣ）からインビトロで神経幹細胞（ＮＳＣ）株を取得する方法。

一実施形態では、ＰＳＣは、単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、または単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む培地中で培養される。一実施形態では、ＰＳＣは、ＲｅｐＳｏｘと接触させるか、またはＲｅｐＳｏｘを含む培地中で培養される。一実施形態では、ＰＳＣは、ＧＷ７８８３８８と接触させるか、またはＧＷ７８８３８８を含む培地中で培養される。

一実施形態では、ＲｅｐＳｏｘの濃度は、約１μＭ～約２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１００μＭ、より好ましくは約２０μＭ～約８０μＭ、より好ましくは約３０μＭ～約７０μＭ、より好ましくは約４０μＭ～約６０μＭ、さらにより好ましくは約４５μＭ～約５５μＭである。

特定の実施形態では、ＰＳＣは、約５０μＭの濃度でＲｅｐＳｏｘと接触させる。

一実施形態では、ＰＳＣは、０日目からＲｅｐＳｏｘと接触させる。０日目にＰＳＣをＲｅｐＳｏｘと接触させることにより、細胞が懸濁状態になると細胞の分化が開始される。したがって、ＮＥＣＳを形成することを可能にされた細胞はすでに、ＮＳＣになることに向けた分化の初期段階に入っている。より具体的な実施形態では、ＰＳＣは、０日目からＮＳＣを増殖させる工程までＲｅｐＳｏｘと接触させる。

一実施形態では、ＰＳＣは、０日目からＧＷ７８８３８８と接触させる。０日目にＰＳＣをＧＷ７８８３８８と接触させることにより、細胞を懸濁状態になると細胞の分化が開始される。したがって、ＮＥＣＳを形成することを可能にされた細胞はすでに、ＮＳＣになることに向けた分化の初期段階に入っている。より具体的な実施形態では、ＰＳＣは、０日目からＮＳＣを増殖させる工程までＧＷ７８８３８８と接触させる。

一実施形態では、本発明は、神経幹細胞を取得するための方法に関し、当該方法は、手動による採取および単離を必要とせずに、細胞の８０％超がＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２陽性であるＮＳＣを産生するための単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む。

別の実施形態では、多能性幹細胞を、ＲｅｐＳｏｘまたはＧＷ７８８３８８であるＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させ、手動での採取および単離を必要とせずに、細胞の８０％超がＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２であるＮＳＣを産生する。

発明者らは、これらＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤を、手動での採取および単離を必要とせずに、より均質で、細胞の８０％超がＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２である、ＮＳＣの集団を提供するものとして特定した。

本発明者らは、これらＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤を、より均質または高純度であり、細胞の８０％超がＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２二重陽性である、ＮＳＣの集団を提供するものとして特定した。本発明者らは、これらＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤を、手動での採取および単離を必要とせずに、より均質または高純度であり、細胞の８０％超がＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２二重陽性である、ＮＳＣの集団を提供するものとして特定した。

発明者らは驚くべきことに、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の単一阻害が、アップスケーリングに適したＮＳＣの集団を提供することを発見した。

一実施形態では、本発明は、例えば限定されないが、フラスコ、タンクおよび／またはバイオリアクターにアップスケーリングするための方法を提供する。

別の実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の単一の阻害剤は、約０．２５μＭ～約２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１５０μＭ、より好ましくは約１５μＭ～約１００μＭ、さらにより好ましくは約２０μＭ～約７５μＭの濃度のＲｅｐＳＯＸである。

別の実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の単一の阻害剤は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約４０ｎｇ／ｍｌ～約７５ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＷ７８８３８８である。

方法による任意選択のステップでは、自然発生的に形成されるＮＥＣＳのＮＳＣは、基材上にプレーティングする前に解離され得る。ただし、ＮＥＣＳは直接プレーティングできるため、この工程は必要ない。したがって、以下のプレーティングの記述において、ＮＥＣＳを解離させる任意の工程が準用されて行われる場合、ＮＥＣＳをプレーティングすることへの言及を同様に適用することができる。

方法は、基材上に懸濁液中のＮＳＣをプレーティングする工程を含む。「プレーティング」という用語は、好適な基材上にＮＥＣＳを分布させることを意味する。当業者は、幹細胞を基材上に移すための適切な技術を知っているであろう。ＮＥＣＳを基材上で培養することは、二次元培養とも呼ばれ得る。懸濁培養から二次元培養への移行は、生存可能条件を維持するために細胞の継続的な培養を意味する。

本明細書で使用される場合、「基材」という用語は、幹細胞の増殖を可能にし、その上にコーティングが提供され得る表面として理解されるべきである。これは、ウェルプレートおよびビーズであってもよいが、これらに限定されない。当業者は、細胞を培養するための好適な基材を容易に認識し、これらは市販されている。典型的な基材としては、細胞培養処理済みマルチウェルプレート、例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｎｕｎｃ（商標）細胞培養処理済みマルチウェルプレートが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態によれば、ＮＥＣＳは、細胞外基質でコーティングされた基材上にプレーティングされる。

「細胞外基質」という用語は、細胞表面受容体との相互作用に関与する細胞外分子を意味し、したがって、付着、増殖、遊走、および分化などの細胞挙動を調節するか、または機械的支持の機能を果たす。一実施形態では、コーティングされた基材上のコーティングは、ラミニンおよび／またはフィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンおよび／またはコラーゲンを含む。

一実施形態では、本発明のＮＳＣは、細胞外小胞を調製するために使用される。

本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「ラミニン」という用語は、アルファ鎖、ベータ鎖、およびガンマ鎖と呼ばれる３つのサブユニットからなるヘテロ三量体分子を指す。本明細書では、ヒトラミニンへの言及が行われる。５種類の鎖（アルファ１～アルファ５）、３種類のベータ鎖（ベータ１～ベータ３）、および３種類のガンマ鎖（ガンマ１～ガンマ３）が既知であり、これらの鎖の様々な組み合わせは、少なくとも１２種類のラミニンアイソフォームを生じさせる。例えば、「ラミニンアルファ５ベータ１ガンマ１」は、本明細書において「ラミニン－５１１」と称される。同じことが他のアイソフォームにも適用される。ラミニンを指す場合の「その断片」は、無傷のラミニンの一部を意味する。例えば、ラミニン－５１１のＥ８断片は、ヒト胚性幹細胞に強く付着することがわかっている。ラミニンおよびその断片は、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ ＡＢまたはＮｉｐｐｉ Ｉｎｃ．などの企業から市販されている。

本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「フィブロネクチン」という用語は、インテグリンと呼ばれる膜貫通受容体タンパク質に結合する細胞外基質の高分子量（約４４０ｋＤａ）糖タンパク質を指す。インテグリンと同様に、フィブロネクチンは、コラーゲン、フィブリン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えば、シンデカン）などの細胞外基質構成成分に結合する。

本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「ビトロネクチン」という用語は、血清、細胞外基質、および骨に豊富に見られるヘモペキシンファミリーの糖タンパク質を指す。

本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「コラーゲン」という用語は、動物体の様々な結合組織内の細胞外空間における構造タンパク質を指す。結合組織の主要構成成分として、これは、哺乳動物において最も豊富なタンパク質であり、全身タンパク質含量の２５％～３５％を占める。コラーゲンは、一緒に巻かれて三重らせんを形成して、細長いフィブリルを形成するアミノ酸からなる。

好ましい実施形態では、細胞外基質は、ラミニンまたはその断片を含み、好ましくは、ラミニン－５１１およびラミニン－５２１からなる群から選択される。別の実施形態では、ラミニンまたはその断片は、ラミニン－５１１およびラミニン－５２１の組み合わせである。一実施形態では、細胞外基質は、ラミニン－５１１および／またはラミニン－５２１、ならびに１つ以上のさらなるラミニン（複数可）を含む。一実施形態では、ラミニンは、無傷のラミニンタンパク質である。別の実施形態では、ラミニンは、無傷のラミニンタンパク質の断片である。さらなる実施形態では、ラミニンの濃度は、約０．００１μｇ／ｃｍ^２～約５０μｇ／ｃｍ^２、好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～約２５μｇ／ｃｍ^２、より好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～１０μｇ／ｃｍ^２、より好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～約５、より好ましくは約０．２５μｇ／ｃｍ^２～約１μｇ／ｃｍ^２、さらにより好ましくは約０．５μｇ／ｃｍ^２である。

一実施形態では、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも９０％のＮＥＣＳが、５００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前にＮＥＣＳが、５００μｍ未満の直径を有する。一実施形態では、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のＮＥＣＳが、４００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも８０％のＮＥＣＳが、４００μｍ未満の直径を有し、より好ましくは、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも９０％のＮＥＣＳが、４００μｍ未満の直径を有する。一実施形態では、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のＮＥＣＳが、３００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも８０％のＮＥＣＳが、３００μｍ未満の直径を有する。好ましい実施形態では、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも９０％のＮＥＣＳが、５００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳをプレーティングする工程の前にＮＥＣＳが、５００μｍ未満の直径を有する。

さらなる実施形態では、ＮＳＣを含有するＮＥＣＳの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％がマーカーＳＯＸ２を発現する時に、ＮＥＣＳはプレーティングされる。

神経ロゼット
本明細書で使用される場合、「神経ロゼット」という用語は、神経外胚葉細胞およびＮＳＣの自己形成組織を指し、円様形態を有する神経外胚葉細胞およびＮＳＣのクラスターが中心から放射状に増殖する。いかなる特定の理論にも束じられるものではないが、神経ロゼットの形成は、培養中のＮＳＣの固有の発達特性であり、二次元培養において容易に視覚化される。神経ロゼットは、二次元培養物にプレーティングする前にＮＥＣＳに存在する可能性があるが、視覚化するのはより困難である。本発明によれば、ＮＳＣの放射状配置は、神経外胚葉細胞の生存可能条件を提供するだけでなく、神経系統に沿って細胞を維持し促進するために必要な要因を提供するという条件とともに、細胞自体によって実質的に形成される。当業者は、懸濁培養中のＮＥＣＳにおいて、神経ロゼット形成がすでに行われ得ることを認識するであろう。ただし、神経ロゼット形成は、二次元基材上に形成することを可能にすると、容易に観察可能である。

方法は、神経幹細胞（ＮＳＣ）株を確立するためにＮＳＣを維持および増殖させる工程を含む。本明細書で使用される場合、「維持する」および「維持」という用語は、互換的に使用されてもよく、細胞を生存可能かつ増殖性を維持する培養条件を提供することを指す。本明細書で使用される場合、「増殖する」および「増殖」という用語は、互換的に使用されてもよく、細胞集団の増殖を指し、すなわち、ＮＳＣが、それらが連続的に成長および分裂することを可能にする条件が提供される。一実施形態では、ＮＳＣを増殖させる工程は、ＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程、ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程、第２の基材上に単一細胞懸濁液中のＮＳＣをリプレーティングする工程、およびＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程を、さらに含む。さらなる実施形態では、神経幹細胞（ＮＳＣ）株の維持および増殖させるために工程が繰り返される。一実施形態では、ＮＳＣは、ＮＳＣをトリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔなどの細胞解離剤と接触させることによって、単一細胞懸濁液に解離される。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭである。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。

方法の一実施形態において、ＰＳＣは、約５日間～約１５日間、好ましくは約７日間～約１３日間、より好ましくは約９日間～約１１日間、好ましくは約１０日間でも、分化することが可能である。さらに、一実施形態では、ＮＳＣは、約４日後～約１５日後、好ましくは約５日後～約１０日後、より好ましくは約５日後～約８日後、さらにより好ましくは約６日後にプレーティングされる。さらなる実施形態では、ＮＳＣを維持および増殖させる工程は、ＮＳＣをプレーティングしてから約１日～約８日後、好ましくは、ＮＳＣをプレーティングしてから約３日～約５日後、より好ましくは、ＮＳＣをプレーティングしてから４日後に開始される。

好ましい実施形態では、方法は、神経ロゼットを単離する工程を含まない。本明細書で使用される場合、「神経ロゼットを単離する」という用語は、適切に形成され、さらなる増殖に対して実行可能であると考えられる神経ロゼットを識別することを意味する。こうした識別は、特定のマーカーの分析によって促進されてよく、単離は、顕微鏡下での手動採取によって促進されてもよい。しかしながら、本方法は、神経ロゼットを単離する別個の工程を必要としない。したがって、好ましい実施形態では、方法は、ＮＳＣを維持および増殖させるために神経ロゼットを手動で選択する工程を含まない。したがって、実質的にすべての形成された神経ロゼットが維持可能かつ増殖可能であり、好ましい実施形態では、実質的にすべての形成された神経ロゼットが維持および増殖させられることになる。「実質的にすべて」とは、一部の神経ロゼットが実行可能ではなく、したがって維持可能かつ増殖可能ではないことを意味する。

用語「高純度な」神経幹細胞集団は、細胞の８０％超がＯＴＸ２／ＰＡＸ６二重陽性またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２二重陽性であり、手動の採取および単離を必要としない、均質なＮＳＣ集団を意味する。

一実施形態では、本発明の方法によって取得されるＮＳＣは、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して８０％の二重陽性である。

一実施形態では、本発明の方法によって取得されるＮＳＣは、手動での採取および単離を必要とせずに、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して８０％の二重陽性である。

一実施形態では、本発明の方法によって取得されるＮＳＣは、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％の二重陽性である。

一実施形態では、本発明の方法によって取得されるＮＳＣは、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％の三重陽性である。

一実施形態では、本発明の方法によって取得されるＮＳＣは、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２／ＦＯＸＧ１に対して少なくとも８０％の四重陽性である。

本発明の別の態様は、ＰＳＣをＲｅｐＳｏｘと接触させ、ＰＳＣが神経外胚葉細胞に分化することを可能にする工程を含む、ＰＳＣから神経外胚葉細胞を誘導する方法に関する。一実施形態では、神経外胚葉細胞はＮＳＣである。好ましい実施形態では、ＲｅｐＳｏｘの濃度は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、または４５μＭよりも高く、好ましくは約２０μＭよりも高い。さらに、好ましい実施形態では、ＲｅｐＳｏｘの濃度は、約２００μＭ、１５０μＭ、１００μＭ、８０μＭ、または６０μＭ未満、好ましくは約７０μＭ未満である。一実施形態では、ＲｅｐＳｏｘの濃度は、約１μＭ～約２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１００μＭ、より好ましくは約２０μＭ～約８０μＭ、より好ましくは約３０μＭ～約７０μＭ、より好ましくは約４０μＭ～約６０μＭ、さらにより好ましくは約４５μＭ～約５５μＭである。特定の実施形態では、ＰＳＣは、約５０μＭの濃度でＲｅｐＳｏｘと接触させる。

本発明の別の態様は、ＰＳＣをＧＷ７８８３８８と接触させ、ＰＳＣが神経外胚葉細胞に分化することを可能にする工程を含む、ＰＳＣから神経外胚葉細胞を誘導する方法に関する。一実施形態では、神経外胚葉細胞はＮＳＣである。好ましい実施形態では、ＧＷ７８８３８８の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、または５ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌよりも高い。さらに、好ましい実施形態では、ＧＷ７８８３８８の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、または２０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ未満である。別の実施形態では、ＧＷ７８８３８８の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約４０ｎｇ／ｍｌ～約７５ｎｇ／ｍｌの濃度である。１つの特定の実施形態では、ＰＳＣは、約１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＧＷ７８８３８８と接触させる。

一実施形態では、ＰＳＣは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤とは接触させない。具体的には、一実施形態では、ＰＳＣはＮｏｇｇｉｎとは接触させない。

本発明のさらなる実施形態は、エクソソームを生成するための第１の態様の方法に従って取得されたＮＳＣ株の使用に関する。したがって、本発明の一態様は、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法に従って取得されたＮＳＣ株からエクソソームを産生するための方法であって、ＮＳＣがエクソソームを産生することを可能にする工程と、エクソソームを単離する工程と、を含む、方法に関する。さらに、一態様では、前述の方法に従って取得されたエクソソームが提供される。

エクソソーム
本明細書で使用される場合、「エクソソーム」という用語は、様々な細胞タイプから分泌される膜構造を有する小さな小胞またはナノスケールの小胞（３０～１５０ｎｍの直径）を指す。典型的には、細胞は、エンドサイトーシス起源の小さな膜結合小胞としてエクソソームを産生し、その後、多胞体と形質膜の融合後に細胞外環境に放出される。エクソソームは、体または生物系内の様々な場所との間で分子の運び手として作用し得る。エクソソームは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、タンパク質、および／または他の生体分子などの分子を含んでもよく、その分子は、エクソソームの表面、膜、および／または内部に存在し得る。

一実施形態では、本発明のエクソソームは、少なくとも８０％の細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して二重陽性であるＮＳＣから取得される。

一実施形態では、本発明のエクソソームは、少なくとも８０％の細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して三重陽性であるＮＳＣから取得される。

一実施形態では、本発明のエクソソームは、少なくとも８０％の細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２／ＦＯＸＧ１に対して四重陽性であるＮＳＣから取得される。

さらなる態様は、医薬として使用するための本発明によるエクソソームに関する。一実施形態では、エクソソームは、神経変性障害の治療に使用するためのものである。一実施形態では、神経変性障害は脳卒中である。一実施形態では、神経変性障害は外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である。一実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病である。

一実施形態では、本発明は、静脈内注射、鼻腔内送達、またはくも膜下腔内投与のために、少なくとも８０％の細胞がＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して三重陽性であるＮＳＣに由来するエクソソームに関する。

一実施形態では、本発明は、静脈内注射、鼻腔内送達、またはくも膜下腔内投与のために、本発明の方法によって取得されたＮＳＣに由来するエクソソームに関する。

動的細胞培養懸濁液
懸濁培養バイオリアクターは、制御されかつ再現可能な培養システムでの幹細胞および／またはその子孫の大規模な増殖および分化を可能にする。これらのシステムは、温度、ｐＨ、および酸素濃度などの条件が監視および制御できる均質な培養環境を提供する。さらに、これらのシステムは、一貫した培養条件下で、かつ培養変動性を最小限にして、多数の細胞の産生を可能にする。

さらなる実施形態では、動的細胞培養物は、約５ｒｐｍ～約８０ｒｐｍ、好ましくは約２０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍ、より好ましくは約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約３０ｒｐｍ～約１００ｒｐｍ、好ましくは約４０ｒｐｍ～約９０ｒｐｍ、より好ましくは５０ｒｐｍ～約８０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約５ｒｐｍ～約８０ｒｐｍ、好ましくは約２０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍ、より好ましくは約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約５０ｒｐｍ～約８０ｐｍの速度で攪拌される。一実施形態では、懸濁培養物は、約６０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍの速度で攪拌される。

培養培地／組成物
微生物または細胞の増殖を支持するように設計された固体、液体、または半固体。さまざまな種類の商業用培地が、さまざまな種類の細胞を増殖させるために使用される。

本発明の別の態様では、ＮＳＣ株を維持および増殖させる方法であって、基材上でＮＳＣを培養する工程と、ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程と、ＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程と、ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程と、ＮＳＣを第２の基材上にリプレーティングする工程と、を含む、方法が提供されている。「第２の基材」という用語は、基材が、第１の基材と同一であってもよいことを意味する。第２の基材は、細胞外基質などの同じまたは異なるコーティングを有してもよい。好ましい実施形態では、ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程において、ＮＳＣはまた、ＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程の前に、コンフルエンシーに到達することも可能にされる。「コンフルエンシー」という用語は、培養培地中の細胞の増殖の尺度として解釈され、基本的には培養容器の被覆度を指す。本明細書で使用される場合、１００％コンフルエンシーは、例えば、皿が細胞によって実質的に覆われることを意味する。一実施形態では、ＮＳＣは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％のコンフルエンシーに到達することが可能である。好ましくは、ＮＳＣは、１００％のコンフルエンシーに到達することが可能である。本明細書で使用される場合、ＮＳＣ株の維持および増殖させる方法に従って工程を実施することは、継代と呼ばれる。実施形態では、少なくとも３継代、好ましくは少なくとも５継代、より好ましくは少なくとも１０継代、さらにより好ましい少なくとも１５継代について、ＮＳＣ株を維持し、増殖させるために工程が繰り返される。通常、最初の３継代が最も重要である。一部は、初期の３～４継代後のみに確立された株を指す場合がある。

さらなる実施形態では、ＮＳＣ株を維持および増殖させるために工程が繰り返される。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである。

最終的な態様では、ＰＳＣからインビトロで神経幹細胞を取得するための方法であって、ＰＳＣを、単一細胞または約５０個未満の細胞を含む凝集体に解離させる工程と、懸濁培養でＰＳＣを培養する工程と、懸濁液中のＰＳＣが自然発生的にＮＥＣＳを形成することを可能にする工程と、ＰＳＣを神経幹細胞に分化させる工程と、を含む、方法が開示される。

一実施形態では、凝集体は、４０個未満の細胞、好ましくは３０個未満の細胞、より好ましくは２０個未満の細胞、さらにより好ましくは１０個未満の細胞を含む。一実施形態では、ＮＳＣは、懸濁培養中でプレーティングまたは維持されてもよく、および／またはさらに分化されてもよい。当業者は、所望の最終生成物に応じて、さらなる分化のための確立されたプロトコルを容易に認識するであろう。

特定の実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される。
１．多能性幹細胞（ＰＳＣ）から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、
・懸濁培養において当該ＰＳＣを、ＲＯＣＫｉおよび単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる工程、
・懸濁液中の当該ＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自然発生的に形成することを可能にする工程、
・動的細胞培養懸濁液中で、当該三次元細胞凝集体が、５００μｍ未満の直径の神経外胚葉球に分化することを可能にする工程、
・当該神経外胚葉球が、神経ロゼットを形成することを可能にする工程であって、前記神経ロゼットが神経外胚葉細胞を含む、工程を含む、方法。
２．当該神経ロゼットが、維持されて神経幹細胞（ＮＳＣ）株へ増殖することを可能にされる、実施形態１に記載の方法。
３．単一のＳＭＡＤ阻害剤が、ＲｅｐＳｏｘまたはＧＷ７８８３８８である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４．ＲｅｐＳｏｘが、約２０μＭ～約６０μＭの濃度にあるか、またはＧＷ７８８３８８が、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌの濃度にある、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
５．当該神経外胚葉細胞が神経幹細胞である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
６．当該神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６に対して少なくとも８０％二重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
７．当該神経幹細胞が、ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％二重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
８．当該神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％三重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
９．当該神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２／ＦＯＸＧ１に対して少なくとも８０％四重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１０．インビトロ神経幹細胞を取得するための方法であって、
・ＰＳＣを単一細胞に解離させる工程、
・懸濁培養において当該ＰＳＣを、ＲＯＣＫｉおよび単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる工程、
・懸濁液中のＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自然発生的に形成することを可能にする工程、
・動的細胞培養懸濁液中で、当該三次元細胞凝集体が、５００μｍ未満の直径の神経外胚葉球に分化することを可能にする工程、
・ＮＥＣＳ含有神経外胚葉細胞を基材上にプレーティングするか、または任意選択的にＮＥＣＳ含有ＮＳＣを解離させる工程、
・ＮＳＣが、神経ロゼットを形成することを可能にし、ＮＳＣを維持および増殖させて手動での採取および分離を必要とせずにＮＳＣ株を確立する工程を含む、方法。
１１．ＰＳＣが、０日目に単一細胞に解離される、先行する実施形態に記載の方法。
１２．ＰＳＣが、ＰＳＣをトリプシンおよび／またはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔなどの細胞解離剤と接触させることによって単一細胞に解離される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１３．ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１４．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、実施形態７または１３に記載の方法。
１５．ＰＳＣが、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭの濃度で、０日目にＰＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程の後、約１日間、ＲＯＣＫ阻害剤と接触させる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１６．ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、約１日目から徐々に低下する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１７．懸濁培養物を攪拌させる工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
１８．懸濁培養物が、約０日目、１日目、２日目、または３日目から攪拌され、好ましくは、懸濁培養物が約１日目から攪拌される、実施形態１７に記載の方法。
１９．懸濁培養物が、ＮＳＣをプレーティングする工程まで攪拌される、実施形態１７または１８に記載の方法。
２０．懸濁培養物が、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度を徐々に低下させ始めるときに攪拌される、実施形態１６および１７に記載の方法。
２１．懸濁培養物が、振とうによって攪拌される、実施形態１７～２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．懸濁培養物が、約５ｒｐｍ～約８０ｒｐｍ、好ましくは約２０ｒｐｍ～約７０ｒｐｍ、より好ましくは約４０ｒｐｍ～約６０ｒｐｍの速度で攪拌される、実施形態１７または２１に記載の方法。
２３．ＰＳＣが、増殖および自然凝集を介して、ＮＥＣＳを実質的に形成する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２４．ＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に少なくとも９０％のＮＥＣＳが、５００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣをプレーティングする工程の前にＮＥＣＳが、５００μｍ未満の直径を有する。先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２５．ＮＳＣをプレーティングする工程の前に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のＮＥＣＳが、４００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣをプレーティングする工程の前に少なくとも８０％のＮＥＣＳが、４００μｍ未満の直径を有し、より好ましくは、ＮＳＣをプレーティングする工程の前に少なくとも９０％のＮＳＣが、４００μｍ未満の直径を有する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２６．ＮＳＣをプレーティングする工程の前に少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％のＮＥＣＳが、３００μｍ未満の直径を有し、好ましくは、ＮＳＣをプレーティングする工程の前に少なくとも８０％のＮＥＣＳが、３００μｍ未満の直径を有する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２７．ＰＳＣのＮＳＣへの分化が、０日目に開始される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２８．ＰＳＣのＮＳＣへの分化が、ＰＳＣを単一細胞懸濁液に解離させた直後に開始される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
２９．ＰＳＣが、ＲｅｐＳｏｘなどのＴＧＦβＲ１／ＡＬＫ５受容体の阻害剤と接触する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３０．ＰＳＣが、ＧＷ７８８３８８などのＴＧＦβ２型受容体／ＡＬＫ５受容体の阻害剤と接触する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３１．ＲｅｐＳｏｘの濃度が、約１μＭ～約２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１００μＭ、より好ましくは約２０μＭ～約８０μＭ、より好ましくは約３０μＭ～約７０μＭ、より好ましくは約４０μＭ～約６０μＭ、より好ましくは約４５μＭ～約５５μＭ、さらにより好ましくは約５０μＭである、実施形態２９に記載の方法。
３２．ＰＳＣが、０日目からＮＳＣを増殖させる工程までＲｅｐＳｏｘと接触する、実施形態２９～３１のいずれか一つに記載の方法。
３３．ＮＳＣが、細胞外基質を含む基材上にプレーティングされる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３４．細胞外基質が、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、およびラミニン、またはこれらの組み合わせ、および／またはこれらの断片からなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法。
３５．細胞外基質が、ラミニンである、実施形態３４に記載の方法。
３６．ラミニンが、ラミニン－５２１およびラミニン－５１１、またはこれらの組み合わせ、またはこれらの断片からなる群から選択される、実施形態３５に記載の方法。
３７．ＰＳＣが、約５～約１５日間、好ましくは約１０日間、分化することが可能である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３８．ＮＳＣが、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のＮＳＣがマーカーＳＯＸ２を発現する時に、プレーティングされる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
３９．当該神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６に対して少なくとも８０％二重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４０．当該神経幹細胞が、ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％二重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４１．当該神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％三重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４２．当該神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２／ＦＯＸＧ１に対して少なくとも８０％四重陽性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４３．ＮＳＣが、約４日後～約１５日後、好ましくは約５日後～約１０日後、より好ましくは約５日後～約８日後、さらにより好ましくは約６日後にプレーティングされる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４４．ＮＳＣを維持および増殖させる工程が、ＮＳＣをプレーティングしてから約３日～約８日後、好ましくは、ＮＳＣをプレーティングしてから約３日～約５日後、より好ましくは、ＮＳＣをプレーティングしてから４日後に開始される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。。
４５．方法が、神経ロゼットを単離する工程を含まない、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４６．方法が、ＮＳＣを維持および増殖させるために神経ロゼットを手動で選択する工程を含まない、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４７．実質的にすべての形成された神経ロゼットが、維持可能であり、増殖可能である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４８．実質的にすべての形成された神経ロゼットが、維持および増殖させられる、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
４９．ＰＳＣが、０日目から１日目まで、第１の細胞培養培地で培養される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
５０．第１の細胞培養培地が、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍである、実施形態４９に記載の方法。
５１．ＰＳＣが、１日目から第２の細胞培養培地で培養される、実施形態４９または５０に記載の方法。
５２．第２の細胞培養培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２である、実施形態５１に記載の方法。
５３．１日目からの細胞培養培地が、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）～約２．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約１％（ｖ／ｖ）の濃度のＮ２サプリメントを含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
５４．ＮＳＣが、約０．０１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）～約２．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）の濃度でＢ２７を含む細胞培養培地で維持および増殖される、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
５５．ＮＳＣを増殖させる工程が、
－プレーティングされたＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程、
－ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程、
－第２の基材上に単一細胞懸濁液中のＮＳＣをリプレーティングする工程、および
－ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程をさらに含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法。
５６．神経幹細胞（ＮＳＣ）株の維持および増殖させるために、さらなる工程が繰り返される、実施形態５５に記載の方法。
５７．ＮＳＣが、ＮＳＣをトリプシンおよび／またはＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔなどの細胞解離剤と接触させることによって、単一細胞懸濁液に解離される、実施形態５５または５６に記載の方法。
５８．ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである、実施形態５５～５７のいずれか一つに記載の方法。
５９．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、実施形態５５～５８のいずれか一つに記載の方法。
６０．多能性幹細胞（ＰＳＣ）から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、
－ＰＳＣをＲｅｐＳｏｘと接触させる工程、および
－ＰＳＣが神経外胚葉細胞に分化することを可能にする工程を含む、方法。
６１．神経外胚葉細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、実施形態６０に記載の方法。
６２．ＲｅｐＳｏｘの濃度が、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、好ましくは約４０μＭよりも高い、実施形態６０または６１に記載の方法。
６３．ＲｅｐＳｏｘの濃度が、約２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１００μＭ未満、９０μＭ未満、８０μＭ未満、７０μＭ未満、６０μＭ未満、好ましくは６０μＭ未満である、実施形態６０～６２のいずれか一つに記載の方法。
６４．ＲｅｐＳｏｘの濃度が、約１μＭ～約２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１００μＭ、より好ましくは約２０μＭ～約８０μＭ、より好ましくは約３０μＭ～約７０μＭ、より好ましくは約４０μＭ～約６０μＭ、より好ましくは約４５μＭ～約５５μＭ、さらにより好ましくは約５０μＭである、実施形態６０～６３のいずれか一つに記載の方法。
６５．ＰＳＣが、ＢＭＰ阻害剤と接触しない、実施形態６０～６４のいずれか一つに記載の方法。
６６．ＰＳＣが、Ｎｏｇｇｉｎと接触しない、実施形態６０～６４のいずれか一つに記載の方法。
６７．ＰＳＣが、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の阻害剤と接触しない、実施形態６０～６５のいずれか一つに記載の方法。
６８．細胞外小胞を産生するための、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株の、使用。
６９．実施形態１～５９のいずれか一つに記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株からエクソソームを作製する方法であって、
－ＮＳＣが細胞外小胞を産生することを可能にする工程、および
－細胞外小胞を単離する工程を含む、方法。
エクソソームを産生するための、先行する実施形態のいずれか一つに記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株の、使用。
７０．実施形態１～５９のいずれか一つに記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株からエクソソームを作製する方法であって、
－ＮＳＣがエクソソームを産生することを可能にする工程、および
－エクソソームを単離する工程を含む、方法。
７１．実施形態０に記載の方法に従って取得された、エクソソーム。
７２．医薬として使用するための実施形態７１に記載のエクソソーム。
７３．神経変性障害の治療に使用するための、実施形態７２に記載のエクソソーム。
７４．神経変性障害が、脳卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、およびアルツハイマー病から選択される、実施形態７３に記載のエクソソーム。
７５．神経幹細胞（ＮＳＣ）株を維持および増殖させるための方法であって、
－基材上でＮＳＣを培養する工程、
－ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程、
－ＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程、
－ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程、および
－第２の基材上にＮＳＣをリプレーティングする工程を含む、方法。
７６．神経幹細胞（ＮＳＣ）株を少なくとも５継代、好ましくは少なくとも１０継代維持および増殖させるために、工程が繰り返される、実施形態７５に記載の方法。
７７．、ＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離する工程の前に、ＮＳＣがコンフルエンシーに到達することが可能である、実施形態７５または７６に記載の方法。
７８．ＮＳＣが、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％のコンフルエンシーに、好ましくは少なくとも９０％のコンフルエンシーに到達することが可能である、実施形態７７に記載の方法。
７９．ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、約０．５μＭ～約５０μＭ、好ましくは約５μＭ～約２５μＭ、さらにより好ましくは約１０μＭである、実施形態７５～７８のいずれか一つに記載の方法。
８０．ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、実施形態７５～７９のいずれか一つに記載の方法。
８１．多能性幹細胞（ＰＳＣ）からインビトロで神経幹細胞を取得するための方法であって、
-ＰＳＣを、単一細胞または約５０個未満の細胞を含む凝集体に解離させる工程、
－懸濁培養で前記ＰＳＣを培養する工程、
－懸濁液中のＰＳＣが（ＮＥＣＳ）を自然発生的に形成することを可能にする工程、および
－ＰＳＣを神経幹細胞に分化させる工程を含む、方法。
８２．凝集体が、４０個未満の細胞、好ましくは３０個未満の細胞、より好ましくは２０個未満の細胞、さらにより好ましくは１０個未満の細胞を含む、実施形態８１に記載の方法。
８３．ＮＳＣが、懸濁培養物中でプレーティングまたは維持されてもよく、および／またはさらに分化されてもよい、実施形態８１または８２に記載の方法。
８４．実施形態１～６７のいずれか一つに記載の方法によって取得された、高純度の神経外胚葉細胞集団。
８５．医薬として使用するための神経細胞または神経膠細胞へのさらなる分化のための、実施形態８４に記載の高純度の神経外胚葉細胞集団。
８６．当該神経細胞もしくは神経膠細胞、または幹細胞に由来する組織もしくは器官を、それを必要とする対象に移植することによって神経変性障害の治療に使用するための、実施形態８５に記載の神経幹細胞または神経膠細胞。
８７．組織または臓器を再生および／または修復および／または構築するためのキットであって、当該キットが、
ｉ．デバイスと
ｉｉ．神経細胞もしくは神経膠細胞へのさらなる分化のための、実施形態１０～１２による神経外胚葉細胞集団、または実施形態７～９のエクソソームもしくはエクソソーム集団と、
ｉｉｉ．生体適合性の足場またはマトリックスと、
ｉｖ．少なくとも１つの増殖因子またはその機能的断片と、
ｖ．ＲＯＣＫ阻害剤および／またはＲｅｐＳｏｘまたはＧＷ７８８３８８などの単一のＳＭＡＤ阻害剤からなる群から選択される薬剤と、
任意選択的に、任意の細胞培養またはそれに由来する組織もしくは臓器を含む細胞を、調製、維持、および／または使用するための指示書と、を含む、キット。

本発明は、以下の非限定的実施形態によってなおさらに説明される。
８９．多能性幹細胞（ＰＳＣ）からインビトロで神経幹細胞（ＮＳＣ）株を取得するための方法であって、
－ＰＳＣを単一細胞に解離させる工程、
－懸濁培養物中で前記ＰＳＣを培養する工程、
－懸濁液中のＰＳＣが（ＮＥＣＳ）を自然発生的に形成することを可能にする工程、
－ＰＳＣをＮＳＣに分化させる工程、
－任意選択でＮＳＣを解離させる工程、
－基材上にＮＳＣをプレーティングする工程、
－ＮＳＣが神経ロゼットを形成することを可能にする工程、および
－ＮＳＣを維持および増殖させてＮＳＣ株を確立する工程を含む、方法。
９０．ＰＳＣが、ＰＳＣを単一細胞懸濁液にする工程でＲＯＣＫ阻害剤と接触する、実施形態８９に記載の方法。
９１．懸濁培養物を攪拌させる工程をさらに含む、実施形態８９～９０に記載の方法。
９２．懸濁培養物が、約１日目から攪拌される、実施形態９１に記載の方法。
９３．ＰＳＣが、増殖および／または非強制的凝集によってＮＥＣＳを形成する、実施形態８９～９２に記載の方法。
９４．ＮＥＣＳをプレーティングする工程の前に、ＮＥＣＳが５００μｍ未満の直径を有する、実施形態８９～９２に記載の方法。
９５．ＰＳＣが、約１μｍ～約１００μｍの濃度のＲｅｐＳｏｘと接触する、実施形態８９～９４に記載の方法。
９６．ＮＳＣを増殖させる工程が、
－プレーティングされたＮＳＣを単一細胞懸濁液に解離させる工程、
－ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程、
－第２の基材上に単一細胞懸濁液中のＮＳＣをリプレーティングする工程、および
－ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程をさらに含む、実施形態８９～９５に記載の方法。
９７．神経幹細胞（ＮＳＣ）株を少なくとも１０継代維持および増殖させるために、ＮＳＣを増殖させるさらなる工程が繰り返される、実施形態９６に記載の方法。
９８．細胞外小胞を産生するための、実施形態８９～９７のいずれか一つに記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株の、使用。
９９．エクソソームを産生するための、実施形態８９～９７のいずれか一つに記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株の、使用。
１００．多能性幹細胞（ＰＳＣ）から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、
－ＰＳＣをＲｅｐＳｏｘと接触させる工程、および
－ＰＳＣが神経外胚葉細胞に分化することを可能にする工程を含み、
ＲｅｐＳｏｘの濃度が、約４０μＭ～約６０μＭである、方法。
１０１．神経外胚葉細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、実施形態１００に記載の方法。
１０２．ＰＳＣが、Ｎｏｇｇｉｎと接触しない、実施形態１００または１０１に記載の方法。
１０３．神経幹細胞（ＮＳＣ）株を維持および増殖させる方法であって、
－基材上でＮＳＣを培養する工程、
－ＮＳＣが神経ロゼットを再形成することを可能にする工程、
－ＮＳＣを単一の懸濁液にする工程、
－ＮＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と接触させる工程、および
－第２の基材上にＮＳＣをリプレーティングする工程を含み、
これらの工程が少なくとも１０継代にわたって繰り返される、方法。
１０４．ＲＯＣＫ阻害剤の濃度が、約０．５μＭ～約５０μＭである、実施形態９０～９５および１０３のいずれか一つに記載の方法。

以下は、本発明を実施するためのプロトコルの非限定的な例である。

略語リスト
サイクル閾値（ＣＴ）値、
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ変法イーグル培地／ハムＦ－１２培地）
医薬品製造品質管理基準（Ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＭＰ）、
細胞・組織医薬品品質管理基準（Ｇｏｏｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ＧＴＰ）、
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、
ヒト組換えラミニン（ｈｒＬＮ）
ラミニン（ＬＮ）、
神経幹細胞（ＮＳＣ）
神経外胚葉球（ＮＥＣＳ）
オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、
ペアボックス６（ＰＡＸ６）、
多能性幹細胞（ＰＳＣ）
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
Ｒｈｏ関連多重コイル含有キナーゼ（ＲＯＣＫ）、
Ｒｈｏ関連多重コイル含有キナーゼの阻害剤（ＲＯＣＫｉ）、
Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）、

一般的な調製方法
ｈＥＳＣの培養
内部で生成されたｈＥＳＣ株を、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中のヒト組換えラミニン（ｈｒＬＮ）コーティングプレート（Ｂｉｏｌａｍｉｎｉｎ ５２１ ＬＮ、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）上に維持し、３～５日毎に１：１０～１：２０の比率で酵素的に継代した。継代のために、コンフルエント培養物を、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、酵素を慎重に除去し、細胞を、穏やかにピペットで移すことによって新鮮なＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地中に収集して、単一細胞懸濁液を得て、必要な体積を新鮮なｈｒＬＮ－５２１コーティングされた皿上にプレーティングした。継代後、培地を、新鮮な予熱したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地で置き換え、毎日交換した。

実施例１：ＮＥＣＳおよびロゼット形成のための分化プロトコル
ＰＳＣの神経誘導、およびそれに続く生成とＮＳＣ株の確立に使用される実験プロトコルは、大まかに３つの主要段階に分けられる：神経外胚葉誘導およびＮＥＣＳ形成、ＮＥＣＳプレーティングおよびロゼット形成、ならびに最終的に細胞を増殖培地中でリプレーティングすることによるＮＳＣ株の確立。プロトコルを図１に概略的に示す。
５０～９０％のコンフルエントなｈＥＳＣをＰＢＳ^－／－で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて３７℃でおよそ５分間、単層培養物から解離させて、単一細胞懸濁液を得た。ｈＥＳＣの単一細胞懸濁液を、１０μＭ ＲＯＣＫｉ（Ｙ－２７６３２）で補充されたＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）中に再懸濁し、標準として１ｍＬ当たり１×１０^５－２×１０^５細胞の細胞密度の１ｍＬを、１２ウェルプレートの１つの単一ウェル（約３．５ｃｍ^２）に播種した（０日目）。

１日目に、培地の約５０％を、２０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、１％のＮ－２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））、および異なる濃度のＧＷ７８８３８８またはＲｅｐＳｏｘをＲＯＣＫｉなしで補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））からなるＮＥＣＳ培地と交換した。環状のＮＥＣＳ形成を開始するため、プレートを１～６日目から、様々な速度、タイムスロット、レベルおよび角度で、Ｍｕｌｔｉ Ｂｉｏ ３Ｄ Ｍｉｎｉ－ｓｈａｋｅｒ（ＢｉｏＳａｎ）に配置した。一例として、一つの最適な状態は以下のとおりである、
－速度：４０～６０ｒｐｍ
－角度（回転角度）：２４０～３６０度、１０～１５秒
－振動（揺動角度）：５度、３～５秒。

ＮＥＣＳ培地は、培地の半分を除去し、新鮮な培地を追加することによって毎日交換された。静的培養と動的培養との比較を図２に示し、動的条件によって形成される小さく均一な構造を示す。ＲｅｐＳｏｘ条件とＧＷ７８８３８８条件を比較すると、ＲｅｐＳｏｘを用いた処理はより透明なＮＥＣＳを生成し、密度の低い三次元構造を示している（図３）。動的条件で６日後、すべてのＮＥＣＳを収集し、ラミニンをコーティングした４８ウェルプレート上に２Ｄでプレーティングした。コーティングについては、１：５０天然マウスラミニン（Ｌ２０２０－１ＭＧ、シグマアルドリッチ、１ｍｇ／ｍｌ）は良好であったが、ラミニンのタイプはＬＮ－５２１またはＬＮ－５１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ）にも拡張することができる。７日目から１０日目まで、２Ｄで付着した状態で、すべての培地を除去し、細胞を新鮮なＮＥＣＳ培地で再供給した。異なる工程の例を図４に示し、３日後（動的懸濁液）、８日後（２Ｄの神経ロゼット）、および１０日後（単一細胞解離前）の画像を示すことができる。神経ロゼットは、ＲｅｐＳｏｘ条件で１０日目まではっきりと見え（図５を参照）、細胞はＮＥＳ陽性であり、各神経ロゼットは陽性のＺＯ１ルーメンを示した。

ここで使用した特定の細胞ｈＥＳＣ株では、ＲｅｐＳｏｘの効果は、ＧＷと比較して神経ロゼット構造の形成に優れているようである（図６）。図７および８に示されるように、２５μＭおよび５０μＭのＲｅｐＳｏｘの濃度が、ＮＥＳ陽性細胞および各ロゼットの中心に位置するＺＯ１を有する神経ロゼットの均質集団を取得するのに最適であった。濃度が低いほど、明確な効果はなかった。図９および１０は、５０μＭのＲｅｐＳｏｘを用いて神経ロゼットを生成するための４つの独立した実験（ｒ１～４）を示し、記載方法の再現性を示している。

結論として、ＮＳＣは、単一のＳＭＡＤ阻害剤ＲｅｐＳｏｘを用いて、非常に効果的かつ再現性の高い方法で効率的に産生することができる。ＳＭＡＤ阻害剤ＧＷ７８８３８８を使用できる可能性がある。

実施例２：神経ロゼットを産生するためのＮＥＣＳサイズの推定
図９および１０に示す４つの独立した実験について、６日目にＮＥＣＳ収集し、穏やかに再懸濁し、２００μＬのＮＥＣＳ懸濁培養物の試料を２００μＬのＰＢＳ中で希釈した。直径、サイズ分布、ＮＥＣＳ数、および真円度を決定した。例えば、Ｂｉｏｒｅｐ（登録商標）Ｉｓｌｅｔ Ｃｏｕｎｔｅｒおよびその関連ソフトウェア（Ｂｉｏｒｅｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ＢｉｏＲｅｐ（登録商標）は、個々の島（ｉｓｌｅｔ）の面積を計算するデジタル画像分析にかけられる高解像度画像によって島を定量化する。次いで、計算された面積を、個々の直径（ｄ＝２（Ａ／π）^１／２）および５０μｍの増分群分類による試料のサイズ分布を含む、島のいくつかの特性を推定するために使用する（Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

測定前に、試料を８の字に移動させて、凝集体を分散させ、最適な検出ができるようにした。さらに、すべてのＮＥＣＳがソフトウェアによって自動的に検出されない場合、選択ツールを用いてデータに明確に除外されたＮＥＣＳが追加された。

ＮＥＣＳの直径を５０μｍのビンに分類し、図形的分布（ｆｉｇｕｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を評価することによって、ＮＥＣＳの均質性を調べた（図１１）。グラフに示すように、４００μｍ未満のＮＥＣＳ直径は、すべての細胞がＮＥＳ陽性であった神経ロゼットの形成において同様の影響を及ぼした。例えば、静的培養によって取得されたより大きな直径は、悪影響を及ぼし、ＮＥＳ陰性細胞の一部を産生した（図１２）。

結論として、ＮＥＣＳの直径サイズは、細胞純度に強力かつ直接的な影響を及ぼし、４００μｍ未満がＮＳＣの高い均質集団を取得するための理想的なサイズである。

実施例３：ＮＳＣ株の増殖と確立
１０日目に、神経ロゼットは完全に規定された。細胞をＰＢＳ^－／－で洗浄し、予熱したＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（３７℃）で処理し、３７℃で５～１０分間インキュベートした。細胞を、予熱された規定されたトリプシン阻害剤（ＧｉｂｃｏからのＤＴＩ）中に穏やかに再懸濁し、２０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｎ－２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））、および１０μｍのＲＯＣＫｉ（Ｙ－２７６３２）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））からなる「洗浄培地」に移し、これを３分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上清を除去し、ペレットを、１０μＭ ＲＯＣＫｉ（Ｙ－２７６３２）で補充された、２０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｎ－２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１０μｇ／Ｌ ｂＦＧＦ、１０μｇ／Ｌ ＥＧＦ、１％ Ｂ－２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント（Ｇｉｂｃｏ（商標））からなる神経増殖培地に再懸濁した。次に、細胞懸濁液を、１：５０の天然マウスラミニン（Ｌ２０２０－１ＭＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１ｍｇ／ｍｌ）でコーティングされた培養プレートに播種した。

このプロセスを、１日１回、次の２～４日間繰り返した。その後、細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔで洗浄し、室温で２～４分間インキュベートする、より穏やかな解離法が実施され、次いでＤＴＩ中に再懸濁した。残りの工程は、上述の方法と同じ方法に従った。分割ごとに、ＮＳＣはウェルで分配され、これは２倍の培養領域、すなわち１：２の分割にほぼ対応していた。ＮＳＣは、ロゼットを形成する前に分割されなかった。通常、ＮＳＣがロゼットを形成するには２～３日かかる。ＮＳＣが分割されなかった日には、培地を除去し、新たに調製された培地をＲＯＣＫｉ（Ｙ－２７６３２）なしで添加した。

継代数ナンバリングは、培養を６ウェル形式に増殖させた時、すなわち、この場合、９日間にわたって５分割した後に開始された。

１０日目に成功したロゼット形成後、細胞を解離させ、ＮＳＣ株を確立するためにリプレーティングした。ＮＳＣを３６日間にわたって増殖させ、約３～４日の倍加時間で、１×１０^６個の細胞から１×１０^９個の細胞を超えて比例的に増殖させ、継続的な拡張性を示した（図１３）。解離後、ＮＳＣはロゼット形成傾向を維持し、ＮＳＣマーカーＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＳＯＸ２の発現を維持した（図１４～１５）。すべての細胞はＳＯＸ２陽性であった。ＺＯ－１の顕著な中心／ルーメン局在を有する典型的なロゼット様構造は、いくつかの継代培養後に保持され、複数の小さな均一なロゼットが観察された（図１４および１５、継代数５との比較）。解離後のロゼット形成傾向を維持するこれらのＮＳＣの能力は、図１６にも見られ、継代数１２に対応する。ＮＳＣは、ＮＥＳに対して陽性であり、ルーメン内のＺＯ１位置を有する複数の神経ロゼットを形成する（図１６）。さらに、ＮＳＣは、ＮＳＣマーカーＰＡＸ６およびＳＯＸ２を含む神経マーカーも継続的に発現していた。

凍結保存の場合、細胞は解離され、上述のように単離される。次いで、細胞をＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）（Ｚｅｎｏａｑ）中に再懸濁し、－８０℃で２４時間保存してから、バイアルをＮ_２タンクに移す。

ＮＳＣは、前部マーカーＦＯＸＧ１およびＯＴＸ２について継代１２で依然として陽性であり（図１７）、前部（前脳）の同一性を示す。この同一性はまたｍＲＮＡレベルで分析し、２５および５０μＭのＲｅｐＳｏｘで生成された２つの株を比較した（図１８）。

フローサイトメトリー解析は、この方法で生成された細胞の８０％超が、継代３でＰＡＸ６マーカーおよびＯＴＸ２マーカーに対して二重陽性であったことを示した（図１９）。

フローサイトメトリー解析は、この方法で生成された細胞の８０％超が、継代８でＰＡＸ６／ＯＴＸ２、ＰＡＸ６／ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６／ＳＯＸ２マーカーに対して二重陽性であったことを示した（図２０）。

収集されたデータは、主要なＮＳＣ特性を保持する純粋で増殖可能な細胞株が、二重陽性ＰＡＸ６／ＯＴＸ２およびＰＡＸ６／ＳＯＸ２または三重陽性ＰＡＸ６／ＯＴＸ２／ＳＯＸ２に対して８０％超の高い割合を保持しながら、我々のプロトコルに従って生成され得ることを示す。

実施例４：様々なＳＭＡＤ阻害剤の比較
表１は、試験された様々な化合物および濃度のスコアを示す。測定されたパラメータは、細胞死、ロゼット形成、２Ｄでの単層形成、ロゼット構造で形成された上皮の厚さ、およびサイドポピュレーションの非存在（すべての細胞がＮＥＳおよびＯＴＸ２陽性である）、すなわち細胞集団の純度であった。

以下のパラメータを評価し、以下でさらに詳細に説明した。
細胞死：ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色によりモニターされる。核濃縮（Ｐｙｋｎｏｓｉｓ）、または核凝縮（ｋａｒｙｏｐｙｋｎｏｓｉｓ）は、壊死またはアポトーシスを受けている細胞の核内のクロマチンの不可逆的な縮合である。蛍光顕微鏡下での目視検査後、０のスコアは、核濃縮核の数が多く、３のスコアは、核濃縮核の数が少ないことを表す。

ロゼット数：ＤＡＰＩ、ＺＯ１、およびＮＥＳ染色によってモニターされる。蛍光顕微鏡下での目視検査後、０のスコアは、神経ロゼット核の数が少なく、３のスコアは、ロゼットの数が多いことを示す。

単層形成：明視野およびＤＡＰＩ染色によってモニターされる。顕微鏡下での目視検査後、３のスコアは、ＮＥＣＳ付着後の細胞の平坦な単層を表す。

ロゼット円柱上皮の厚さ：ＤＡＰＩ染色によりモニターされる。蛍光顕微鏡下での目視検査後、３のスコアは、神経ロゼットのより広くより厚い円柱上皮を表す。

サイドポピュレーション：ＮＥＳおよびＯＴＸ２の特異的染色によってモニターされる。蛍光顕微鏡下での目視検査後、６のスコアはＮＥＳ陰性細胞の検出がないことを表す。ＮＥＳ陰性細胞のない条件においてのみ、ＯＴＸ２集団を評価した。これらの場合、３のスコアは、ＯＴＸ２陰性細胞の検出がないことを表す。

以下の化合物および濃度を試験し、前述のパラメータに従って評価した：
－ＳＢ４３１５４２ １０μＭ
－ＳＢ４３１５４２＋ＬＤＮ １０μＭ＋１０μＭ
－ＧＷ ７８８３８８、濃度１０ｎｇ／ｍｌおよび０．１ｎｇ／ｍｌ
－ＲｅｐＳｏｘ、用量２５μＭおよび０．２５μＭ
－ＳＢ５２５３３４、用量１０μＭおよび０．１μＭ
－ＬＹ２１５７２９９、用量１０μＭ
－ＴＥＷ－７１９７、用量１０μＭ
－ＬＹ２１０９７６１、用量２μＭ
－対照 任意のＳＭＡＤ阻害剤で未処理

実施例５：エクソソーム収集
ＰＡＸ６／ＯＴＸ２／ＳＯＸ２およびｈＥＳＣに対する三重陽性ＮＳＣの少なくとも８０％の集団由来の上清を収集し、４℃で１５００ｇで１０分間遠心分離して細胞を除去した。ペレットを廃棄し、上清を新しい収集管に移し、エクソソームの精製のために超遠心分離するまで－８０Ｃで保存した。図２１は、ｈＥＳＣおよびＮＳＣの両方から収集された上清に存在するエクソソームの分析を示す。サイズ、タンパク質含量および粒子数は、ｈＥＳＣによって産生されるエクソソームとＮＳＣによって産生されるエクソソームの間で異なる。ＮＳＣによって産生されるエクソソームの構造は、電子顕微鏡によって画像化される。このデータは、ＰＡＸ６／ＯＴＸ２／ＳＯＸ２に対する三重陽性ＮＳＣの少なくとも８０％の集団が、エクソソームを生成できることを示している。

本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の精神の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。

Claims (15)

1. 多能性幹細胞（ＰＳＣ）から神経外胚葉細胞を取得するための方法であって、
   ・懸濁培養において前記ＰＳＣを、ＲＯＣＫｉおよび単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる工程、
   ・懸濁液中の前記ＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自然発生的に形成することを可能にする工程、
   ・動的細胞培養懸濁液中で、前記三次元細胞凝集体が、約５００μｍ未満の直径の神経外胚葉球（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｓｐｈｅｒｅ）に分化することを可能にする工程、
   ・前記神経外胚葉球が、神経ロゼットを形成することを可能にする工程であって、前記神経ロゼットが神経外胚葉細胞を含む、工程を含む、方法。
2. 前記神経ロゼットが、維持されて神経幹細胞（ＮＳＣ）株へ増殖することが可能となる、請求項１に記載の方法。
3. 前記神経外胚葉細胞が、神経幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
4. インビトロで神経幹細胞を取得するための方法であって、
   ・ＰＳＣを単一細胞に解離させる工程、
   ・懸濁培養において前記ＰＳＣを、ＲＯＣＫｉおよび単一のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる工程、
   ・懸濁液中の前記ＰＳＣが、三次元細胞凝集体を自然発生的に形成することを可能にする工程、
   ・動的細胞培養懸濁液中で、前記三次元細胞凝集体が、５００μｍ未満の直径の神経外胚葉球に分化することを可能にする工程、
   ・ＮＥＣＳ含有神経外胚葉細胞を基材上にプレーティングするか、または任意選択的にＮＥＣＳ含有ＮＳＣを解離させる工程、
   ・前記ＮＳＣが、神経ロゼットを形成することを可能にし、前記ＮＳＣを維持および増殖させて、手動での採取および分離を必要とせずにＮＳＣ株を確立する工程を含む、方法。
5. 前記単一のＳＭＡＤ阻害剤が、ＲｅｐＳｏｘまたはＧＷ７８８３８８である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. ＲｅｐＳｏｘが、約２０μＭ～約６０μＭの濃度であるか、またはＧＷ７８８３８８が、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６またはＳＯＸ２／ＰＡＸ６に対して少なくとも８０％二重陽性である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２に対して少なくとも８０％三重陽性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記神経幹細胞が、ＯＴＸ２／ＰＡＸ６／ＳＯＸ２／ＦＯＸＧ１に対して少なくとも８０％四重陽性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. エクソソームなどの細胞外小胞を産生するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法に従って取得された神経幹細胞（ＮＳＣ）株の、使用。
11. 医薬用の、請求項９に定義のエクソソーム。
12. 脳卒中、外傷性脳損傷、またはアルツハイマー病などの神経変性障害の治療に使用するための、請求項１０に定義のエクソソーム。
13. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって取得された、高純度の神経外胚葉細胞集団。
14. 医薬用の、神経細胞または神経膠細胞へのさらなる分化のための、請求項１３に記載の高純度の神経外胚葉細胞集団。
15. 前記神経細胞もしくは神経膠細胞、または幹細胞に由来する組織もしくは器官を、それを必要とする対象に移植することによって前記神経変性障害の治療に使用するための、請求項１４に定義の神経幹細胞または神経膠細胞。

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