CN114174497A

CN114174497A - 衍生自人类多能干细胞的神经干细胞系的生成

Info

Publication number: CN114174497A
Application number: CN202080049043.2A
Authority: CN
Inventors: J·C·维拉埃斯库萨·拉米雷斯; U·多恩; C·V·贝特尔森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2019-07-05
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2040-07-01
Also published as: EP3994250A1; TW202117009A; US20220233602A1; WO2021004864A1; CN114174497B; JP2022538503A

Abstract

本发明总体上涉及干细胞领域，更具体地涉及高纯度神经干细胞群体、用于获得此类高纯度干细胞衍生的神经干细胞系，如衍生自多能干细胞如人类胚胎干细胞的神经干细胞系的方法。此外，本发明涉及此类高纯度神经干细胞系用作用于治疗神经变性疾病的药物的用途。

Description

衍生自人类多能干细胞的神经干细胞系的生成

技术领域

本发明总体上涉及干细胞领域，更具体地涉及高纯度神经干细胞群体、用于获得此类高纯度干细胞衍生的神经干细胞系，如衍生自多能干细胞如人类胚胎干细胞的神经干细胞系的方法。此外，本发明涉及此类高纯度神经干细胞系用作用于治疗神经变性疾病的药物的用途，以及从此类神经干细胞获得的外泌体用于治疗卒中的用途。

背景

神经干细胞(NSC)是自我更新的专能(multipotent)细胞，具有生成神经元和胶质细胞的能力。NSC在中枢神经系统的正常胚胎发育过程中暂时存在，并且类似的细胞也可以衍生自例如人类多能干细胞(hPSC)。迄今已为开发将hPSC成功分化为高纯度且可扩充的人类NSC群体的有效方案做出了大量的努力。将hPSC分化为人类NSC的成熟方法是通过形成细胞聚集体，即所谓的胚状体。但许多目前的方案会产生不均一的细胞群体，其中包含例如非神经性质的侧细胞群体。因此需要进行NSC的人工选择(例如通过人工挑选神经玫瑰花结)，而这是个费时费力的过程，从而限制了可扩展性。

在过去的数年中探索了使用NSC衍生的细胞外囊泡(EV)和外泌体来治疗脑损伤和神经变性，包括脑梗塞。细胞外囊泡(EV)是由细胞自然释放的脂双层分隔的颗粒。尽管EV的直径范围可从接近物理上可能的最小单层脂质体大小(大约20-30纳米)到10微米或更大，但绝大多数EV小于200nm。外泌体是大多数类型的细胞所释放的纳米级EV(直径为30-150nm)(Colombo等人,2014)。外泌体含有多种分子(货物)，这些分子可包括源自其宿主细胞的蛋白质、核酸和脂质，从而促进细胞间通讯并调节受体细胞功能(Robbins等人,2016)。近期将外泌体用于缺血性卒中治疗的工作将改善的功能结果归因于其货物，这些货物包括微小RNA、DNA、脂质、蛋白质和RNA(Chen和Chopp,2018)。这些观察结果表明，NSC衍生的外泌体的应用可能是一种治疗包括卒中和创伤性脑损伤(TBI)在内的脑损伤的有前景的新途径。

一些文献(Ruttachuk等人,2013，Watanabe等人,2007)据称公开了使用ROCKi和/或双重SMAD抑制从2D培养物中的hPSC获得NSC的方法(Qiuhong等人,2019，US2017260501，Meixiang等人,2018)。在其中一些方法中，需要在扩充前剖开以提高纯度，即人工选择和分离细胞。这会消耗相当多的时间和资源，并且会降低所述方法的可扩展能力。

本发明的目的是克服上述挑战，特别是提供获得NSC系的方法，该方法能实现可扩展性并且提供具有极高纯度的NSC的GMP群体。

发明内容

上述目的通过本发明的方面来实现。另外，本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。本发明的第一方面提供了从多能干细胞(PSC)获得体外NSC系的方法，其包括以下步骤：将所述PSC解离成单细胞，在悬浮培养物中培养所述PSC，使悬浮液中的PSC自发形成三维细胞聚集体，以及将所述PSC分化为由包括NSC的神经外胚层细胞组成的神经外胚层球体(NECS)，任选地解离所述NSC，将所述NSC涂布在基底上，使所述NSC形成神经玫瑰花结，以及维持并扩充所述NSC以建立NSC系。

用于PSC的神经诱导和NSC系的随后生成和建立的方案可被大致分为三个主要阶段：神经外胚层诱导和NECS形成；NECS涂布和玫瑰花结形成；以及最后通过在扩充培养基中重新涂布细胞来建立NSC系。依照这些主要阶段，本发明人开发了用于实现快速且可靠的基于NECS的分化方案的方法，其产生具有神经玫瑰花结形态的高纯度且可扩充的人类NSC群体。该方法有利于NSC系的分化和建立。在十天后，本发明人观察到清晰可见的2D神经玫瑰花结，其准备用于解离。当神经玫瑰花结被解离并额外重新涂布3-4代后，NSC系得以建立。一个重大优势是避免了繁琐耗时的人工分离步骤。本发明人认为是控制形成均一的NECS而不强迫聚集使得该方法能够提供如此高的纯度。因此，本发明人发现使PSC自发形成NECS的步骤至关重要。自发形成部分地有利于具有某大小的NECS群体，而该群体一旦涂布，便产生高纯度、良好界定且均质的神经玫瑰花结群体。在优选实施方案中，该方法进一步包括对悬浮培养物进行搅拌的步骤。本发明人意外地发现，在NECS的初始非强迫形成之后对培养物进行搅拌可促进直径大小小于500μm的NECS群体的建立。还意外地发现，通过控制NECS的大小可以改善神经玫瑰花结的纯度和形成。在优选实施方案中，在NSC涂布步骤之前，NECS的直径小于500μm。

在一方面，本发明涉及从多能干细胞(PSC)获得神经外胚层细胞的方法，其包括以下步骤：

·在悬浮培养物中使所述PSC与ROCKi和单一SMAD抑制剂接触，

·使悬浮液中的所述PSC自发形成三维细胞聚集体，

·在动态细胞培养悬浮液中使所述三维细胞聚集体分化为直径小于500μm的神经外胚层球体，

·使所述神经外胚层球体形成神经玫瑰花结，其中所述神经玫瑰花结包含神经外胚层细胞。

在一方面，本发明涉及从多能干细胞(PSC)获得神经外胚层细胞的方法，其包括在包含单一SMAD抑制剂的培养基中培养所述PSC的步骤。

在另一方面，本发明涉及从多能干细胞获得神经外胚层细胞的方法，其包括在包含单一SMAD抑制剂的培养基中培养所述PSC的步骤，其中所述单一SMAD抑制剂是RepSox或GW788388。

在一方面，本发明涉及从多能干细胞获得神经外胚层细胞的方法，其包括在包含单一SMAD抑制剂的培养基中培养所述多能干细胞的步骤，其中所述单一SMAD抑制剂是浓度为约20μM至约60μM的RepSox。

在一方面，本发明涉及从多能干细胞获得神经外胚层细胞的方法，其包括在包含单一SMAD抑制剂的培养基中培养所述多能干细胞的步骤，其中所述单一SMAD抑制剂是浓度为约0.1ng/ml至约150ng/ml的GW788388。

本发明的另一方面涉及从PSC获得神经外胚层细胞的方法，其包括使所述PSC与转化生长因子(TGF)/激活蛋白/节点信号通路的抑制剂接触以及使所述PSC分化为神经外胚层细胞的步骤，其中所述转化生长因子(TGF)/激活蛋白/节点信号通路的抑制剂是RepSox，优选浓度范围为约0.1μM至约100μM。本发明人意外地发现，在某些浓度下的该小分子能促进PSC以非常高的效率分化为神经外胚层谱系，甚至不需要同时抑制骨形态发生蛋白(BMP)信号通路，即无需双重SMAD抑制，例如使PSC与Noggin接触。这将分化方案简化为神经外胚层谱系，并促进方案转化为GMP合规。

在一方面，本发明涉及高纯度神经干细胞群体，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6或PAX6/SOX2是至少80％双阳性的。

在一方面，本发明涉及高纯度神经干细胞群体，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2是至少80％三阳性的。

本发明的另一方面提供了本发明的NSC系用于产生外泌体的用途。另一方面提供了从根据本发明的方法获得的NSC系产生外泌体的方法，其包括使所述NSC产生外泌体以及分离所述外泌体的步骤。

本发明的另一方面涉及用作药物的外泌体，特别是用于治疗神经变性病症和/或脑损伤，诸如但不限于卒中、创伤性脑损伤(TBI)和阿尔茨海默病。因此，在一个实施方案中，该神经变性病症是卒中。在另一实施方案中，该神经变性病症是创伤性脑损伤(TBI)。在又一实施方案中，该神经变性病症是阿尔茨海默病。

本发明的另一方面提供了维持并扩充NSC系的方法，其包括以下步骤：在基底上培养所述NSC，使所述NSC重新形成神经玫瑰花结，将所述NSC解离成单一悬浮液，使所述NSC与ROCK抑制剂接触，以及将所述NSC重新涂布在第二基底上。本发明人意外地发现，在每次传代时使NSC与ROCK抑制剂接触明显维持了玫瑰花结结构、形态和神经前体组成的复杂性。

在一方面，本发明涉及用于获得体外神经干细胞的方法，其包括以下步骤：

·将PSC解离成单细胞，

·在悬浮培养物中使所述PSC与ROCKi和单一SMAD抑制剂接触，

·使悬浮液中的PSC自发形成三维细胞聚集体，

·将含有NECS的神经外胚层细胞涂布在基底上，或任选地将含有NECS的NSC解离，

·使所述NSC形成神经玫瑰花结，维持并扩充所述NSC以建立NSC系，而不需要人工挑选和分离。

在另一方面，本发明涉及从PSC获得体外神经干细胞(NSC)系的方法，其包括以下步骤：

·将所述PSC解离成单细胞或包含少于约50个细胞的聚集体，

·将所述获得的细胞在动态悬浮培养物中培养，

·使悬浮液中的所述获得的细胞自发形成NECS，并进一步生成NSC，

·使所述NSC得以维持并扩充，以建立NSC系。

根据这一最后方面的方法的优势在于快速提供NSC，该NSC可备用于通过在2D或悬浮液中培养而进一步分化为神经外胚层谱系的特定细胞。

在前述方面的优选实施方案中，所述PSC是hPSC，这在整个申请中都适用。在下文中，优选实施方案中的产物也是人源的。因此，在优选实施方案中，所述NSC和NSC系分别是人类NSC和人类NSC系。

附图简述

图1示出了实验方案的示意图。“测试化合物”是指所测试的任何小分子：SB431542、LDN、GW788388、RepSox、SB525334、LY2157299、TEW-7197或LY2109761。“Y”表示10μM ROCKi(Y-27632)。

图2示出了在第3天拍摄的亮视野显微照片，清楚地示出摇动提高了NECS的均一性。比例尺：200μm。

图3示出了来自与GW788388和RepSox的培养物的NECS的形态。小分子RepSox诱导形成具有亮腔的NECS，而GW788388导致更暗且更致密的核心。

图4示出了在过程中的不同时间点，在悬浮液中的NECS和粘附的NECS的亮视野显微照片。在第3天，在悬浮培养物中形成了若干NECS。在2D接种后，在第8天可见许多玫瑰花结，且在第10天可见若干均一的玫瑰花结。比例尺：200μm(A，E)；100μm(F)；50μm(B、C、D)。

图5示出了使用RepSox(25uM)的神经玫瑰花结形成的示例，显示出在每个神经玫瑰花结的中心(内腔)定位的ZO1蛋白的顶端定位。所有细胞都是神经祖细胞标志物巢蛋白(NES)阳性的。

图6示出了两种化学化合物GW788388和RepSox的比较。将细胞用NSC标志物NES以及紧密连接标志物ZO1染色，由此使神经玫瑰花结和其他结构可视化。当用RepSox处理hESC时观察到多个神经玫瑰花结，而采用GW788388时仅观察到少量玫瑰花结。此外，采用GW788388时观察到未形成神经玫瑰花结的细胞。比例尺：100μm。

图7和图8示出了在0.25μM、2.5μM、25μM和50μM的RepSox下，用NSC标志物NES以及紧密连接标志物ZO1染色并且用DAPI复染的细胞。细胞的排布明显受到RepSox的量的影响，其中更高的剂量能提高神经玫瑰花结形成。白色箭头指示NES阴性细胞。

图9和图10示出了采用50μM RepSox的生物学重复实验之间神经玫瑰花结大小的变化。比例尺：100μm。

图11示出了每次重复实验的NECS大小分布。该图显示了增量为50个单位(μm)的相对NECS直径区间中的NECS数目(颗粒计数)。

图12示出了大于400μm的NECS的影响。并非所有细胞(DAPI)都是标志物NES阳性的。

图13示出了由所示方法生成的NSC系的可扩充性和群体倍增时间(天)。此外，将线性回归模型应用于经log2转换的数据，以对NSC如何通过数次细胞传代随时间扩充和倍增进行可视化。

图14和图15示出了建立的NSC系的不同传代，显示出在5次传代后保留的神经玫瑰花结形成(NES/ZO-1)。此外，所有细胞都是SOX2阳性的，并且几乎所有细胞都是PAX6和OTX2阳性的。比例尺：100μm。

图16示出了建立的NSC系的第12次传代，显示出保留的神经玫瑰花结形成(NES/ZO-1)。此外，所有细胞都是SOX2阳性的，并且几乎所有细胞都是PAX6和OTX2阳性的。比例尺：100μm和10μm。

图17示出了建立的NSC系的第12次传代，显示出保留的神经玫瑰花结形成和前脑标志物FOXG1和OTX2阳性。比例尺：100μm。

图18示出了NSC相对于hESC的相对基因表达。左轴示出了通过2-ΔΔCt法计算的相对于hESC的相对变化倍数。右轴是-ΔΔCt，显示的值是相对于hESC(ΔΔCt)±SD归一化的ΔCt的平均值。25μM(n＝5)，50μM(n＝4)。基因按多能性、NSC和神经元限制性祖细胞、前脑、中脑和后脑的典型标志物进行分组。对log10(dCt)值进行统计检验，显著性水平为α＝5％(p<0.01(**)和p<0.001(***))。N.d.＝未检测或Ct>35。

图19示出了通过流式细胞术(FACS)确定的，针对两种神经干细胞标志物PAX6和OTX2对第3次传代的双阳性细胞的定量。PAX6/OTX2阳性细胞的百分比为93.4％。

图20示出了通过流式细胞术(FACS)确定的，针对神经干细胞标志物PAX6、OTX2和SOX2以及前脑标志物FOXG1对第8次传代的双阳性细胞的定量。PAX6/OTX2、PAX6/FOXG1和PAX6/SOX2的百分比高于80％。

图21示出了从hESC和NSC两者收集的上清液中存在外泌体。在hESC和NSC产生的外泌体之间，颗粒的大小、蛋白质含量和数目不同。NSC产生的外泌体的结构通过电子显微术成像。

描述

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。

需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。

除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。说明书中的任何用语均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。

在整个本申请中，当涉及分化细胞的过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。本发明的方法通常由一系列步骤来限定。如本文所用的，与方法相关的术语“步骤”应理解为阶段，在该阶段中正进行某事和/或执行动作。本领域普通技术人员将会理解待执行的步骤和/或进行的步骤何时是同时的和/或相继的和/或连续的。

如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个或多于一个。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。

如本文所用的术语“约”在提及可测量的值如本发明的细胞、化合物或药剂的量、剂量、温度等时，意在涵盖指定量的5％、1％、0.5％、甚至0.1％的变化。如本文所用的，关于方案的术语“天”是指用于执行某些步骤的特定时间。

一般而言，除非另有说明，否则“第0天”是指方案的起始，这是通过例如但不限于将干细胞涂布或将干细胞转移到培养箱，或在转移干细胞之前使干细胞在其当前的细胞培养基中与化合物接触来进行。通常，方案的起始是通过将未分化的干细胞转移到不同的细胞培养基和/或容器，例如但不限于通过涂布或孵育，和/或首先以启动分化过程的方式使未分化的干细胞与影响未分化干细胞的化合物接触。

当提及“第X天”，如第1天、第2天等时，它是相对于第0天的方案起始而言的。本领域普通技术人员将会认识到，除非另有指定，否则执行该步骤的天数的确切时间可能会有所不同。因此，“第X天”旨在涵盖诸如+/-10小时、+/-8小时、+/-6小时、+/-4小时、+/-2小时或+/-1小时的时间跨度。

如本文所用的，短语“从大约第X天至大约第Y天起”是指事件开始的那一天。该短语提供了事件可能开始的天数间隔。例如，如果“细胞从大约第3天至大约第5天起与分化因子接触”，那么这将被解释为包含以下所有选项：“细胞从大约第3天起与分化因子接触”，“细胞从大约第4天起与分化因子接触”，以及“细胞从大约第5天起与分化因子接触”。因此，不应将该短语解释为仅在第3天至第5天的时间间隔内发生的事件。这在必要的变通后适用于短语“到大约第X天至大约第Y天”。

在下文中，通过非限制性实施方案和实施例更详细地描述了本发明的方法。提供了从PSC获得神经干细胞系的方法。因此，该方法抵消干细胞的使用。

“干细胞”应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的未分化细胞。根据分化潜能，干细胞包括诸如多能干细胞(PSC)、专能(multipotent)干细胞、单能干细胞等亚群。

如本文所用的，术语“多能干细胞”(PSC)是指能够在体外培养并具有分化成属于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何细胞谱系的能力的干细胞。PSC可以从受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。PSC的实例包括胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎生殖细胞(EG细胞)等。从间充质干细胞(MSC)获得的Muse细胞(多谱系分化持续应激细胞)和从生殖细胞(例如睾丸)产生的种系干细胞(GS细胞)也包含在PSC术语中。因此，本发明中使用的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如在例如WO 03/055992和WO 2007/042225中所述，或者是可商购获得的细胞或细胞系。ES细胞系还可以源自单个分裂球，而不会破坏子宫外胚胎，也不会影响临床结果(Chung等人(2006)和Klimanskaya等人(2006))。

如本文所用的，术语“诱导多能干细胞”(也称为iPS细胞或iPSC)是一种类型的PSC，其可以通过通常被称为重编程的过程直接从成体细胞生成。通过引入特定组的多能性相关基因的产物，可以将成体细胞转化为PSC。胚胎干细胞也可以衍生自孤雌生殖体(parthenotes)，如在例如WO2003/046141中所述。另外，胚胎干细胞可以从单个卵裂球产生或通过培养在不破坏胚胎的情况下获得的内细胞团来产生。胚胎干细胞可从给定的组织获得，也可以商购获得。优选地，本发明的方法和产物基于hPSC，即源自iPSC或胚胎干细胞的干细胞，包括孤雌生殖体。

本发明提供了从PSC获得体外NSC系的方法，其包括以下步骤：

·将PSC解离成单细胞，

·将获得的细胞在悬浮培养物中培养，

·使动态悬浮液中的所述获得的细胞自发形成NECS，使所述NECS分化为NSC，将NSC涂布在基底上，或者任选地解离NSC，

·使NSC形成神经玫瑰花结，维持并扩充NSC以建立NSC系。

如本文所用的，术语“神经”是指神经系统。如本文所用的，术语“神经细胞”是指模拟细胞类型的细胞，其天然是外胚层的胚层的一部分，更具体地是神经外胚层，并且该术语旨在涵盖该胚层内处于任何发育阶段的细胞，如从早期神经祖细胞一直到成熟的有丝分裂后的神经元。

如本文所用的，术语“神经外胚层细胞”是指沿神经外胚层谱系发育过程中任何阶段的细胞。

如本文所用的，术语“神经干细胞”(NSC)是指专能细胞，其能够无限制地自我更新并增殖，以产生可终末分化为神经细胞和神经胶质细胞的子代细胞，例如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSC的非干细胞后代被称为神经祖细胞。

如本文所用的，术语“神经前体细胞”和“神经祖细胞”可互换使用，并且意指进一步源自神经干细胞但不保持广泛增殖能力的细胞。

如本文所用的，术语“神经干细胞系”是指可以传代至少10代、保持神经玫瑰花结结构和标志物ZO1、NES、SOX2、OTX2和PAX6的NSC群体。提及获得神经NSC系的方法是指可以建立一个或多个NSC系。本发明人已经在10天后观察到2D的神经玫瑰花结形成。当神经玫瑰花结解离并重新涂布额外3-4次传代时，就建立了NSC系。此后认为建立了NSC系，从这一刻开始，NSC可以传代至少10代。在一个实施方案中，NSC系不是永生化的，即在一个实施方案中，NSC系可以传代不超过100代。

在一个实施方案中，本发明的建立的NSC系被传代3-4代。在一个实施方案中，本发明的建立的NSC系被传代10代。在一个实施方案中，本发明的建立的NSC系被传代20代。

术语“体外”是指在人体或动物体外提供并维持NSC。在一个实施方案中，NSC是非天然的。

术语“非天然”是指NSC尽管衍生自可能具有人类来源的PSC，却是在自然界中并不存在的人工构建体。一般来说，提供尽可能与人体细胞相似的细胞通常是干细胞领域内的一个目标。但是，可能永远无法将PSC在胚胎和胎儿阶段所经历的发育模拟到成熟细胞与人体天然细胞无法区分的程度。本质上，在本发明的一个实施方案中，NSC是人造的。

如本文所用的，术语“人造的”可包括在自然界中天然存在但被修饰为非天然存在的构建体的材料。这包括人类干细胞，其分化为模拟人体细胞的非天然存在的细胞。优选地，NSC是干细胞衍生的。更优选地，NSC是衍生自PSC的干细胞。在另一实施方案中，NSC是衍生自人类胚胎干细胞(hESC)和/或人类诱导多能干细胞(hiPSC)的干细胞。

PSC最初解离成单细胞。如本文所用的，术语“解离成单细胞”是指使PSC成为单细胞悬浮液。“单细胞悬浮液”是指细胞悬浮液或悬浮培养物，其中单细胞和/或通常少于约五个或六个细胞的小型三维细胞聚集体被允许发挥功能和繁殖。当使细胞悬浮时，大多数细胞不粘附于基底或容器表面。用于使PSC成为单细胞悬浮液的任何合适的手段均可以使用。本领域技术人员将容易地认识到存在多种使PSC成为单细胞悬浮液的方法，例如酶促或螯合。在一个实施方案中，PSC在第0天解离成单细胞悬浮液。使PSC成为悬浮液意味着对细胞进行处理，以促进细胞彼此之间、与基底和/或细胞外基质解离。在一个实施方案中，通过使PSC与细胞解离剂如胰蛋白酶和/或TrypLE Select接触，将PSC解离成单细胞悬浮液。

在进一步的步骤中，将PSC在悬浮培养物中培养。如本文所用的，术语“悬浮培养物”是指单细胞或细胞聚集体在液体培养基中自由漂浮。悬浮培养也可称为三维培养，并且这两个术语在整个申请中可以互换使用。因此，PSC不附着于基底表面且不以其他方式固定在支架如细胞外基质中。然而，众所周知，悬浮培养物中的一些细胞可能附着在容器表面。如果不搅拌悬浮介质，由于重力，细胞最终会沉淀在容器表面。

术语“培养”应被理解为干细胞在受控条件下生长的过程，通常在其自然环境之外作为连续的过程进行，在整个方法中可采用该过程以保持细胞在其各个阶段的活力。在从例如但不限于活组织或胚胎中分离出目的细胞后，将它们维持在仔细控制的条件下。这些条件因每种细胞类型而异，但通常由合适的容器组成，该容器具有提供必需营养成分(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(CO₂、O₂)以及调节理化环境(pH缓冲液、渗透压、温度)的培养基。

通常，干细胞将在细胞培养基中提供，该细胞培养基适合在其当前发育状态下的活力。提供干细胞以供培养通常意味着将干细胞转移到不同的环境中，例如通过接种到新的基底上或悬浮在培养箱中。本领域普通技术人员将容易地认识到，干细胞对于这样的转移是脆弱的，因而该过程需要谨慎，并且将干细胞维持在原始细胞培养基中可以促进在将细胞培养基替换为另一种更适合分化过程的细胞培养基之前更可持续的细胞转移。在一个实施方案中，在第0天的细胞培养基是第一细胞培养基，并且至少一部分细胞培养基从第1天起被第二细胞培养基替换。

如本文所用的，关于细胞培养基、第一细胞培养基和第二细胞培养基的术语“替换”是指一种程序，其中通过合适的手段取出一定量的细胞培养基，并且任选地，加入基本上等量的细胞培养基，使得细胞培养基的总体积基本保持不变。“去除第一细胞培养基”应被理解为在第一次去除和添加第二细胞培养基之后，任何随后的替换将是第一和第二细胞培养基的混合物的替换，该混合物的比率对应于去除和添加的量。因此，在连续去除中，第一细胞培养基将被第二细胞培养基连续稀释，并且通过重复该过程，细胞培养基最终将基本上不含第一细胞培养基。

在进一步的实施方案中，第一细胞培养基是化学成分确定的并且无xeno。如本文所用的，关于细胞培养基的术语“化学成分确定的”是指适合人类或动物细胞的体外细胞培养的生长培养基，其中所有化学成分都是已知的。化学成分确定的培养基要求必须确定所有成分并了解其确切的浓度。

如本文所用的，术语“无xeno”和“无动物成分”可以互换使用，并且根据本发明，是指优选地完全不含任何动物来源的成分。在优选的实施方案中，细胞培养基也是无饲养物的。

术语“无饲养物”和“无饲养细胞”可以互换使用，是指不含人和动物细胞的培养系统，为了滋养所培养的干细胞，这些细胞可能以其他方式存在，即饲养细胞为它们所支持的干细胞提供代谢物，但不是打算用于生长或分裂的细胞。尽管本发明人更喜欢化学成分确定的、“无xeno”和“无饲养细胞”的细胞培养环境，但监管机构可能会批准基于本发明方法的医药产品和治疗，而无需完全遵守这样的标准。本发明人努力遵守GMP和GTP的最高标准。然而，本发明不应被解释为局限于这样的标准。本领域技术人员将容易地认识到，本发明可以在不遵守此类高标准的情况下实施。

在一个实施方案中，第一细胞培养基可以是任何合适的细胞培养基，其在干细胞转移至基底时支持干细胞的活力。这样的细胞培养基是可商购获得的，并且可以是例如

例如用于iPS和ES干细胞的

hPSC XF培养基。因此，在一个实施方案中是

例如用于iPS和ES干细胞的

hPSC XF培养基。

在一个实施方案中，第二细胞培养基是化学成分确定的并且无xeno。在进一步的实施方案中，第二细胞培养基也是无饲养物的。在一个实施方案中，第二细胞培养基包含GMEM、DMEM或DMEM/F12。类似的培养基可能同样有效并且易于购买获得。在进一步的实施方案中，DMEM/F12补充有N2和/或B27。在一个实施方案中，N2的浓度为约0.01％(v/v)至约5％(v/v)，优选约0.5％(v/v)至约2.5％(v/v)。在一个实施方案中，B27的浓度为约0.05％(v/v)至约1％(v/v)，优选约0.1％(v/v)。

在一个实施方案中，在将PSC解离成单细胞悬浮液的步骤中使PSC与ROCK抑制剂接触。

ROCK抑制剂

Rho相关的含卷曲螺旋的激酶(ROCK)是RhoA小GTP酶的效应物，并且属于丝氨酸/苏氨酸激酶的AGO家族。ROCK激酶具有许多功能，包括细胞收缩、迁移、凋亡、存活和增殖。IRho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶ROCK抑制剂是一系列靶向并抑制rho激酶的化合物。如本文所用的，“Y-27632”是指CAS编号为129830-38-2的反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐。

在一个实施方案中，细胞培养基包含ROCK抑制剂。在一个实施方案中，该ROCK抑制剂是Y-27632或Tiger。

因此，在优选实施方案中，在将PSC解离成单细胞悬浮液的同时使PSC与ROCK抑制剂接触。在一个实施方案中，ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM。在一个实施方案中，ROCK抑制剂的浓度从约第1天起逐渐降低。因此在一个实施方案中，从在第0天将PSC解离成单细胞悬浮液的步骤起，使PSC与浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM的ROCK抑制剂接触约一天。在一个实施方案中，该ROCK抑制剂是Y-2763。

所述方法包括使单细胞悬浮液中的PSC自发形成NECS的步骤。

三维细胞聚集体

如本文所用的，术语“三维细胞聚集体”是指由单细胞形成的干细胞簇，或几个细胞在短时间(即1-2天)内彼此附着的聚集体。三维细胞聚集体是通过少数PSC之间的初始细胞附着和/或细胞的少数细胞分裂形成的，并且随着分裂的继续而固有地生长。对于这个过程，初始PSC悬浮培养物暴露于ROCK抑制剂。在ROCKi的存在下，使PSC自发形成三维细胞聚集体，随后形成更大的细胞聚集体(其形成NECS)的步骤是被动的过程。如本文所用的，当提及三维细胞聚集体的形成时，术语“自发地”意指除了使PSC成为单细胞悬浮液之外，不通过任何手段强迫或促进三维细胞聚集体的形成。

在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi 24小时后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi的前24小时后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi至少24小时后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi约1-3天后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi约2-3天后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi约1天后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi约2天后形成。在一个实施方案中，三维细胞聚集体在PSC暴露于ROCKi约3天后形成。

神经外胚层球体

如本文所用的，术语“神经外胚层球体”(NECS)是指由于细胞分裂而大小增大并同时分化为神经外胚层命运数天(即5-6天)的三维细胞聚集体。根据本发明的方法，当形成初始的小型三维细胞聚集体时，NECS的细胞从开始就被导向神经外胚层谱系。NECS将包含神经外胚层细胞、NSC和形成神经玫瑰花结的NSC，取决于成熟阶段。NECS通过细胞的细胞分裂形成，并且随着分裂的继续而固有地生长。因此，在一个实施方案中，PSC实质上通过有丝分裂形成NECS。如本文所用的，术语“有丝分裂”是指产生遗传相同的细胞的细胞分裂，其中染色体数目得以维持。在根据本发明的方法中，NECS是由PSC在分化的同时分裂形成的。因此，NECS最初包含PSC，而随着这些细胞分裂和经历分化，它们形成包含分化干细胞的NECS。使PSC自发形成小细胞聚集体并随后形成更大NECS的步骤是被动过程。如本文所用的，当提到NECS的形成时，术语“自发地”是指除了使PSC成为单细胞悬浮液之外，不会以任何方式强迫或促进NECS的形成。自发形成与细胞的主动聚集相反，主动聚集可通过将细胞一起聚集在锥形孔中或小液滴中来促进。如本文所用的，“自发”形成也可称为“非强迫”形成或“被动”形成。因此，在一个实施方案中，允许NECS形成而没有强迫聚集。在优选实施方案中，允许NECS在细胞悬浮液中自发形成。不受任何特定理论的约束，据信NECS的自发形成部分地是由于PSC的增殖，并且可能部分地是由于一个或多个NECS的自发聚集。

在一个实施方案中，允许三维细胞聚集体自发形成NECS额外五天。在一个实施方案中，允许三维细胞聚集体自发形成NECS至少额外五天。在一个实施方案中，允许三维细胞聚集体自发形成NECS额外三到八天。在一个实施方案中，允许三维细胞聚集体自发形成NECS额外三到十天。

悬浮培养物

在一个实施方案中，所述方法进一步包括对悬浮培养物进行搅拌以产生动态细胞培养悬浮液的步骤。如本文所用的，术语“搅拌”是指为了维持悬浮培养物的目的提供细胞培养基的运动。搅拌可以通过任何合适的手段提供。在一个实施方案中，通过摇动对悬浮培养物进行搅拌。在进一步的实施方案中，以约5rpm至约80rpm，优选约20rpm至约70rpm，更优选约40rpm至约60rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约30rpm至约100rpm，优选约40rpm至约90rpm，更优选50rpm至约80rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约5rpm至约80rpm，优选约20rpm至约70rpm，更优选约40rpm至约60rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约50rpm至约80rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约60rpm至约70rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在优选实施方案中，当开始逐渐降低ROCK抑制剂的浓度时对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，从大约第0天、第1天、第2天或第3天起对悬浮培养物进行搅拌，优选地从大约第1天起对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，对悬浮培养物进行搅拌直到NECS涂布步骤。

本发明的方法包括将PSC分化为NSC的步骤。让分化细胞分化不应被解释为要进行的单独的最终步骤。本领域普通技术人员将会理解，如本文所用的，术语“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态、从未成熟状态进展至较成熟状态或从未成熟状态进展至成熟状态的过程，该过程在执行所述方法和细胞暴露于促进分化的多种因子时不断发生。一个示例是PSC分化为NSC，但不限于此。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。

在优选实施方案中，PSC向NSC的分化在第0天开始。这意味着PSC向NSC的分化是在将PSC解离成单细胞悬浮液后立即开始的。

在一个实施方案中，PSC与TGFβR1/ALK5受体的抑制剂接触。如本文所用的，关于培养细胞的术语“接触”是指通过使例如特定化合物接近细胞而使细胞暴露于特定化合物，以便产生“接触的”细胞。接触可以使用任何合适的手段来完成。接触的非限制性实例是通过将化合物添加到细胞的细胞培养基中。只要细胞和特定化合物接近，例如，化合物以合适的浓度存在于细胞培养基中，就假定发生细胞的接触。提及“使细胞与X接触”可被视为与“在包含X的细胞培养基中培养细胞”同义。此外，如本文所用的，关于抑制信号传导靶标或信号传导靶标通路的术语“抑制剂”是指与未处理的细胞或用不抑制被处理的细胞或组织的化合物处理的细胞相比，干扰(即减少或消除或抑制)所得靶分子或靶化合物或靶过程如特定分化结果(例如，抑制促进默认细胞类型分化的活性信号通路，从而诱导分化为非默认细胞类型)的化合物。

如本文所用的“OTX2”是指Orthodenticle同源框2基因、转录物或蛋白质，它是胚胎发育过程中包括神经祖细胞在内的前脑结构的标志物。

如本文所用的“PAX6”是指“成对盒6”基因、转录物或蛋白质，它是胚胎发育过程中包括神经祖细胞在内的前脑结构的标志物。

如本文所用的“SOX2”是指“SRY-Box转录因子2”基因、转录物或蛋白质，它是神经祖细胞的标志物。

如本文所用的“FOXG1”是指“叉头框G1”基因、转录物或蛋白质，它是胚胎发育过程中前脑细胞的标志物。

如本文所用的“ZO1”或“TJP1”是指“紧密连接蛋白1”基因、转录物或蛋白质，其充当紧密连接衔接蛋白。它用于定义神经玫瑰花结的顶端部分、内腔。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中至少80％的细胞共表达PAX6和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中至少85％的细胞共表达PAX6和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中至少90％的细胞共表达PAX6和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中约93％的细胞共表达PAX6和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中至少80％的细胞共表达PAX6、SOX2和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中至少85％的细胞共表达PAX6、SOX2和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中至少90％的细胞共表达PAX6、SOX2和OTX2。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中约93％的细胞共表达PAX6、SOX2和OTX2。

Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号通路的抑制剂

如本文所用的，“Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号通路抑制剂”是指特异性抑制Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号通路的化合物。Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂的实例可选自GW788388、LDN-193189、LY2157299、LY364947、NOGGIN、RepSox、SB431542和TEW-7197。

如本文所用的，“GW788388”表示化学名称为N-(环氧乙烷-4-基)-4-[4-(5-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-基)吡啶-2-基]苯甲酰胺且CAS编号为452342-67-5的小分子。

如本文所用的，“LDN-193189”表示IUPAC名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉且CAS编号为1062368-24-4的化合物。

如本文所用的，“LY2157299”表示一种小分子，它是有效的TGFβ受体I(TGFβRI)抑制剂，别名为Galunisertib，化学名称为4-[2-(6-甲基吡啶-2-基)-5,6-二氢-4H-吡咯并[1,2-b]吡唑-3-基]喹啉-6-甲酰胺，CAS编号：700874-72-2。

如本文所用的，“LY364947”表示IUPAC名称为4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉且CAS编号为396129-53-6的化合物。

如本文所用的，“NOGGIN”表示分泌的同型二聚体糖蛋白，其结合并灭活信号蛋白的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，如骨形态发生蛋白-4(BMP4)。NOGGIN通常是在人类细胞中以糖基化、二硫键连接的二聚体形式表达的65kDa蛋白质。

如本文所用的，“RepSox”表示一种小分子，其为TGF-βRI的有效且选择性抑制剂，别名为E-616452、SJN 2511、ALK5抑制剂II，化学名称为2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶，CAS编号：446859-33-2。

如本文所用的，“SB431542”表示化学名称为4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺且CAS编号为301836-41-9的化合物。

如本文所用的，“TEW-7197”表示别名为Vactosertib、化学名称为2-氟-N-[[5-(6-甲基吡啶-2-基)-4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-1H-咪唑-2-基]甲基]苯胺且CAS编号为1352608-82-2的小分子。

从多能干细胞(PSC)获得体外神经干细胞(NSC)系的方法。

在一个实施方案中，使PSC与单一SMAD抑制剂接触，或在包含单一SMAD抑制剂的培养基中培养。在一个实施方案中，使PSC与RepSox接触，或在包含RepSox的培养基中培养。在一个实施方案中，使PSC与GW788388接触，或在包含GW788388的培养基中培养。

在一个实施方案中，RepSox的浓度为约1μM至约200μM，优选约10μM至约100μM，更优选约20μM至约80μM，更优选约30μM至约70μM，更优选约40μM至约60μM，甚至更优选约45μM至约55μM。

在特定实施方案中，使PSC与浓度约为50μM的RepSox接触。

在一个实施方案中，从第0天起使PSC与RepSox接触。通过在第0天使PSC与RepSox接触，细胞的分化在细胞被悬浮时开始。因此，被允许形成NECS的细胞已经历朝向变成NSC的分化的早期。在更特定的实施方案中，从第0天到扩充NSC的步骤期间使PSC与RepSox接触。

在一个实施方案中，从第0天起使PSC与GW788388接触。通过在第0天使PSC与GW788388接触，细胞的分化在细胞被悬浮时开始。因此，被允许形成NECS的细胞已经历朝向变成NSC的分化的早期。在更特定的实施方案中，从第0天到扩充NSC的步骤期间使PSC与GW788388接触。

在一个实施方案中，本发明涉及用于获得神经干细胞的方法，其中所述方法包括单一SMAD抑制剂以产生其中超过80％的细胞为OTX2/PAX6/SOX2阳性的NSC，而无需人工挑选和分离。

在另一实施方案中，使多能干细胞与SMAD蛋白信号传导抑制剂接触，该抑制剂是RepSox或GW788388，以产生其中超过80％的细胞为OTX2/PAX6/SOX2阳性的NSC，而无需人工挑选和分离。

本发明人将这些SMAD蛋白信号传导抑制剂鉴定为能提供更均质的NSC群体，其中超过80％的细胞为OTX2/PAX6/SOX2阳性，且无需人工挑选和分离。

本发明人将这些SMAD蛋白信号传导抑制剂鉴定为能提供更均质或高纯度的NSC群体，其中超过80％的细胞为OTX2/PAX6或PAX6/SOX2双阳性。本发明人将这些SMAD蛋白信号传导抑制剂鉴定为能提供更均质或高纯度的NSC群体，其中超过80％的细胞为OTX2/PAX6或PAX6/SOX2双阳性，且无需人工挑选和分离。

本发明人意外地发现，SMAD蛋白信号传导的单一抑制提供适合放大的NSC群体。

在一个实施方案中，本发明提供了用于放大，例如但不限于烧瓶、罐和/或生物反应器的方法。

在另一实施方案中，SMAD蛋白信号传导的单一抑制剂是浓度为约0.25μM至约200μM，优选约10μM至约150μM，更优选约15μM至约100μM，甚至更优选约20μM至约75μM的RepSox。

在另一实施方案中，SMAD蛋白信号传导的单一抑制剂是浓度为约0.1ng/ml至约150ng/ml，优选约10ng/ml至约90ng/ml，更优选约20ng/ml至约80ng/ml，甚至更优选约40ng/ml至约75ng/ml的GW788388。

在根据所述方法的可选步骤中，自发形成的NECS的NSC可以在涂布到基底上之前解离。然而，该步骤不是必需的，因为NECS可以直接涂布。因此，在以下对涂布的描述中，经过必要的变通，如果已经进行了解离NECS的可选步骤，则可以等同地适用提及涂布NECS。

所述方法包括将悬浮液中的NSC涂布到基底上的步骤。术语“涂布”是指将NECS分布到合适的基底上。本领域技术人员将知晓将包含干细胞的NECS转移到基底上的合适技术。在基底上培养NECS也可称为二维培养。从悬浮培养物到二维培养物的转变意味着细胞的连续培养以维持生存条件。

如本文所用的，术语“基底”应理解为允许干细胞生长且其上可提供涂层的表面。这可以是但不限于孔板和珠。本领域技术人员将容易地认识用于培养细胞的合适基底，并且这些基底是可商购获得的。典型的基底包括但不限于细胞培养物处理的多孔板，例如TheScientific^TMNunc^TM细胞培养物处理的多孔板。根据本发明的一个实施方案，将NECS涂布在用细胞外基质包被的基底上。

术语“细胞外基质”是指细胞外分子，其负责与细胞表面受体的相互作用，从而调节细胞行为，如粘附、增殖、迁移和分化，或提供机械支持功能。在一个实施方案中，包被的基底上的涂层包含层粘连蛋白和/或纤连蛋白和/或玻连蛋白和/或胶原蛋白。

在一个实施方案中，本发明的NSC用于制备细胞外囊泡。

如本文所用的，关于包被在板上的术语“层粘连蛋白”是指由被称为α、β和γ链的三个亚单位组成的异源三聚体分子。本文提及人层粘连蛋白。已知五种α链(α1至α5)、三种β链(β1至β3)和三种γ链(γ1至γ3)，这些链的各种组合至少产生12种层粘连蛋白同种型。例如，“层粘连蛋白α5β1γ1”在本文中被称为“层粘连蛋白-511”或“LN-511”。这同样适用于其他同种型。当提及层粘连蛋白时，“其片段”是指完整层粘连蛋白的一部分。例如，已经发现层粘连蛋白-511的E8片段强烈粘附在人类胚胎干细胞上。层粘连蛋白及其片段可从诸如Biolamina AB或Nippi Inc.等公司商购获得。

如本文所用的，关于包被在板上的术语“纤连蛋白”是指与被称为整联蛋白的跨膜受体蛋白结合的细胞外基质的高分子量(～440kDa)糖蛋白。与整联蛋白类似，纤连蛋白与诸如胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(例如黏结蛋白聚糖(syndecans))等细胞外基质成分结合。

如本文所用的，关于包被在板上的术语“玻连蛋白”是指血红素结合蛋白家族的糖蛋白，其丰富地存在于血清、细胞外基质和骨中。

如本文所用的，关于包被在板上的术语“胶原蛋白”是指动物体内各种结缔组织的细胞外间隙中的结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，它是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占全身蛋白质含量的25％至35％。胶原蛋白由缠绕在一起形成三重螺旋的氨基酸组成，从而形成细长的原纤维。

在优选实施方案中，细胞外基质包含层粘连蛋白或其片段，优选选自层粘连蛋白-511和层粘连蛋白-521。在另一实施方案中，层粘连蛋白或其片段是层粘连蛋白-511和层粘连蛋白-521的组合。在一个实施方案中，基质包含层粘连蛋白-511和/或层粘连蛋白-521以及一种或多种其他的层粘连蛋白。在一个实施方案中，层粘连蛋白是完整的层粘连蛋白。在另一实施方案中，层粘连蛋白是完整层粘连蛋白的片段。在进一步的实施方案中，层粘连蛋白的浓度为约0.001μg/cm²至约50μg/cm²，优选约0.1μg/cm²至约25μg/cm²，更优选约0.1μg/cm²至10μg/cm²，更优选约0.1μg/cm²至约5μg/cm²，更优选约0.25μg/cm²至约1μg/cm²，甚至更优选约0.5μg/cm²。

在一个实施方案中，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少90％的NECS具有小于500μm的直径，优选地，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前NECS具有小于500μm的直径。在一个实施方案中，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的NECS具有小于400μm的直径，优选地在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少80％的NECS具有小于400μm的直径，更优选地在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少90％的NECS具有小于400μm的直径。在一个实施方案中，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少50％、60％、70％、80％、90％的NECS具有小于300μm的直径，优选地，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少80％的NECS具有小于300μm的直径。在优选实施方案中，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前至少90％的NECS具有小于500μm的直径，优选地，在涂布含有NECS的NSC的步骤之前NECS具有小于500μm的直径。

在进一步的实施方案中，当至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的含有NECS的NSC表达标志物SOX2时，涂布NECS。

神经玫瑰花结

如本文所用的，术语“神经玫瑰花环”是指神经外胚层细胞和NSC的自形成排布，其中具有圆形形态的神经外胚层细胞和NSC簇从中心径向扩充。不受任何特定理论的束缚，形成神经玫瑰花结是培养中的NSC的固有发育特性，并且在二维培养中很容易显现。神经玫瑰花结可能在涂布二维培养物之前就存在于NECS中，但更难显现。根据本发明，NSC的径向排列基本上由细胞本身形成，条件是提供神经外胚层细胞的生存条件以及提供维持和促进细胞沿神经谱系发展所必需的因素。本领域技术人员将认识到，神经玫瑰花结形成可能已经在悬浮培养中的NECS中发生。然而，神经玫瑰花结形成一旦被允许在二维基底上形成，才容易观察到。

所述方法包括维持并扩充NSC以建立神经干细胞(NSC)系的步骤。如本文所用的，术语“维持”和“保持”可互换使用，并且是指提供保持细胞存活和增殖的培养条件。如本文所用的，术语“扩充”和“扩增”可互换使用，并且是指细胞群体的增殖，即向NSC提供允许它们不断生长和分裂的条件。在一个实施方案中，扩充NSC的步骤包括以下的额外步骤：将NSC解离成单细胞悬浮液，使NSC与ROCK抑制剂接触，将单细胞悬浮液中的NSC重新涂布在第二基底上，以及使NSC重新形成神经玫瑰花结。在进一步的实施方案中，重复这些步骤以维持并扩充神经干细胞(NSC)系。在一个实施方案中，通过将NSC与细胞解离剂如胰蛋白酶或TrypLE Select接触，将NSC解离成单细胞悬浮液。在一个实施方案中，ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM。在一个实施方案中，该ROCK抑制剂是Y-2763。

在所述方法的一个实施方案中，使PSC分化约5天至约15天，优选约7天至约13天，更优选约9天至约11天，甚至优选约10天。另外，在一个实施方案中，在约4天后至约15天后，优选约5天后至约10天后，更优选约5天后至约8天后，甚至更优选约6天后，涂布NSC。在进一步的实施方案中，维持并扩充NSC的步骤在涂布NSC后约1天起至约8天起，优选在涂布NSC后约3天起至约5天起，更优选在涂布NSC后约4天起开始。

在优选实施方案中，所述方法不包括分离神经玫瑰花结的步骤。如本文所用的，术语“分离神经玫瑰花结”是指鉴定已正确形成并被认为存活以供进一步扩充的神经玫瑰花结。这样的鉴定可通过某些标志物的分析来促进，并且分离可以通过在显微镜下人工挑选来促进。然而，本方法不需要分离神经玫瑰花结的单独步骤。因此，在优选实施方案中，该方法不包括人工选择神经玫瑰花结以用于维持并扩充NSC的步骤。因此基本上所有形成的神经玫瑰花结都是可维持和可扩充的，并且在优选实施方案中，基本上所有形成的神经玫瑰花结都得以维持并扩充。“基本上所有”是指一些神经玫瑰花结可能不存活，因此不可维持并扩充。

术语“高纯度”神经干细胞群体是指80％以上的细胞为OTX2/PAX6双阳性或PAX6/SOX2双阳性的均质NSC群体，无需人工挑选和分离。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的NSC对OTX2/PAX6或PAX6/SOX2是80％双阳性的。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的NSC对OTX2/PAX6或PAX6/SOX2是80％双阳性的，且无需人工挑选和分离。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的NSC对OTX2/PAX6或PAX6/SOX2是至少80％双阳性的。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的NSC对OTX2/PAX6/SOX2是至少80％三阳性的。

在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的NSC对OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1是至少80％四阳性的。

本发明的另一方面涉及从PSC诱导神经外胚层细胞的方法，其包括使PSC与RepSox接触以及使PSC分化为神经外胚层细胞的步骤。在一个实施方案中，该神经外胚层细胞是NSC。在优选实施方案中，RepSox的浓度高于约10μM、20μM、30μM、40μM或45μM，优选地高于约20μM。此外，在优选实施方案中，RepSox的浓度低于约200μM、150μM、100μM、80μM或60μM，优选地低于约70μM。在一个实施方案中，RepSox的浓度为约1μM至约200μM，优选约10μM至约100μM，更优选约20μM至约80μM，更优选约30μM至约70μM，更优选约40μM至约60μM，甚至更优选约45μM至约55μM。在一个特定实施方案中，使PSC与浓度约为50μM的RepSox接触。

本发明的另一方面涉及从PSC诱导神经外胚层细胞的方法，其包括使PSC与GW788388接触以及使PSC分化为神经外胚层细胞的步骤。在一个实施方案中，该神经外胚层细胞是NSC。在优选实施方案中，GW788388的浓度高于约0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、3ng/ml或5ng/ml，优选地高于约10ng/ml。此外，在优选实施方案中，GW788388的浓度低于约100ng/ml、80ng/ml、60ng/ml、40ng/ml或20ng/ml，优选地低于约10ng/ml。在一个实施方案中，GW788388的浓度为约0.1ng/ml至约150ng/ml，优选约10ng/ml至约90ng/ml，更优选约20ng/ml至约80ng/ml，甚至更优选约40ng/ml至约75ng/ml。在一个特定实施方案中，使PSC与浓度约为10ng/ml的GW788388接触。

在一个实施方案中，PSC不与骨形态发生蛋白(BMP)信号通路的抑制剂接触。特别地，在一个实施方案中，PSC不与Noggin接触。

本发明的进一步实施方案涉及根据第一方面的方法获得的NSC系用于产生外泌体的用途。因此，本发明的一方面涉及从根据任一前述实施方案的方法获得的NSC系产生外泌体的方法，其包括使NSC产生外泌体以及分离外泌体的步骤。此外，一方面提供了根据前述方法获得的外泌体。

外泌体

如本文所用的，术语“外泌体”是指从各种细胞类型分泌的具有膜结构的小囊泡或纳米级囊泡(直径为30-150nm)。通常，细胞产生作为内吞起源的小型膜结合囊泡的外泌体，然后在多泡体与质膜融合后释放到细胞外环境中。外泌体可以充当身体或生物系统中不同位置之间的分子载体。外泌体可以包含分子，如核酸(例如DNA、mRNA、miRNA)、蛋白质和/或其他生物分子，这些分子可以存在于外泌体的表面、膜和/或内部。

在一个实施方案中，本发明的外泌体从NSC获得，其中至少80％的细胞对于OTX2/PAX6或PAX6/SOX2是双阳性的。

在一个实施方案中，本发明的外泌体从NSC获得，其中至少80％的细胞对于OTX2/PAX6/SOX2是三阳性的。

在一个实施方案中，本发明的外泌体从NSC获得，其中至少80％的细胞对于OTX2/PAX6/SOX2/FOXG是四阳性的。

进一步的方面涉及用作药物的根据本发明的外泌体。在一个实施方案中，外泌体用于治疗神经变性病症。在一个实施方案中，该神经变性病症是卒中。在一个实施方案中，该神经变性病症是创伤性脑损伤(TBI)。在一个实施方案中，该神经变性病症是阿尔茨海默病。

在一个实施方案中，本发明涉及从其中至少80％的细胞对于OTX2/PAX6/SOX2是三阳性的NSC衍生的外泌体，其用于静脉内注射、鼻内递送或鞘内施用。

在一个实施方案中，本发明涉及从通过本发明的方法获得的NSC衍生的外泌体，其用于静脉内注射、鼻内递送或鞘内施用。

动态细胞培养悬浮液

悬浮培养生物反应器允许在受控和可重复的培养系统中大规模扩充并分化干细胞和/或其后代。这些系统提供了均质的培养环境，可以监测并控制其中的条件，如温度、pH和氧浓度。此外，这些系统允许在一致的培养条件下产生大量细胞，并且具有最小的培养变异性。

在进一步的实施方案中，以约5rpm至约80rpm，优选约20rpm至约70rpm，更优选约40rpm至约60rpm的速度对动态细胞培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约30rpm至约100rpm，优选约40rpm至约90rpm，更优选50rpm至约80rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约5rpm至约80rpm，优选约20rpm至约70rpm，更优选约40rpm至约60rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约50rpm至约80rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。在一个实施方案中，以约60rpm至约70rpm的速度对悬浮培养物进行搅拌。

培养基/组合物

设计用于支持微生物或细胞生长的固体、液体或半固体。不同类型的商业培养基用于培养不同类型的细胞。

本发明的另一方面提供了维持并扩增NSC系的方法，其包括以下步骤：在基底上培养NSC，使NSC重新形成神经玫瑰花结，将NSC解离成单细胞悬浮液，使NSC与ROCK抑制剂接触，以及将NSC重新涂布在第二基底上。术语“第二基底”是指可以与初始第一基底相同的基底。第二基底可以具有相同或不同的涂层，如细胞外基质。在优选实施方案中，在使NSC重新形成神经玫瑰花结的步骤中，在将NSC解离成单细胞悬浮液的步骤之前，还使NSC达到汇合。术语“汇合”被解释为培养基中细胞增殖的量度，并且基本上是指对培养容器的覆盖度。如本文所用的，100％汇合意味着例如培养皿基本上被细胞覆盖。在一个实施方案中，使NSC达到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％汇合。优选地，使NSC达到100％汇合。如本文所用的，根据维持并扩充NSC系的方法执行步骤被称为“传代”。在一个实施方案中，重复这些步骤以维持并扩充NSC系至少3次传代，优选至少5次传代，更优选至少10次传代，甚至更优选至少15次传代。通常，前三次传代是最关键的。有些人可能仅在三次至四次初始传代之后才将细胞系称为建立的细胞系。

在进一步的实施方案中，重复这些步骤以维持并扩充NSC系。在一个实施方案中，所述ROCK抑制剂是Y-2763。在一个实施方案中，ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM。

最后的方面公开了从PSC获得体外神经干细胞的方法，其包括以下步骤：将PSC解离成单细胞或包含少于约50个细胞的聚集体，在悬浮培养物中培养PSC，使悬浮液中的PSC自发形成NECS，以及将PSC分化为神经干细胞。

在其一个实施方案中，聚集体包含少于40个细胞，优选少于30个细胞，更优选少于20个细胞，甚至更优选少于10个细胞。在一个实施方案中，可将NSC涂布或维持在悬浮培养中，并且/或者进一步分化。本领域技术人员将容易地认识到根据所需的最终产品进行进一步分化的既定方案。

特定的实施方案

通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明：

1.从多能干细胞(PSC)获得神经外胚层细胞的方法，其包括以下步骤：

·在悬浮培养物中使所述PSC与ROCKi和单一SMAD抑制剂接触，

·使悬浮液中的所述PSC自发形成三维细胞聚集体，

2.根据实施方案1的方法，其中使所述神经玫瑰花结维持并扩充成神经干细胞(NSC)系。

3.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述单一SMAD抑制剂是RepSox或GW788388。

4.根据前述实施方案中任一项的方法，其中RepSox的浓度为约20μM至约60μM，或者其中GW788388的浓度为约0.1ng/ml至约20ng/ml。

5.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经外胚层细胞是神经干细胞。

6.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6是至少80％双阳性的。

7.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于PAX6/SOX是至少80％双阳性的。

8.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2是至少80％三阳性的。

9.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1是至少80％四阳性的。

10.用于获得体外神经干细胞的方法，其包括以下步骤：

·将PSC解离成单细胞，

·在悬浮培养物中使所述PSC与ROCKi和单一SMAD抑制剂接触，

·使悬浮液中的PSC自发形成三维细胞聚集体，

·使NSC形成神经玫瑰花结，维持并扩充NSC以建立NSC系，而不需要人工挑选和分离。

11.根据前述实施方案的方法，其中在第0天将所述PSC解离成单细胞。

12.根据前述实施方案中任一项的方法，其中通过使所述PSC与细胞解离剂如胰蛋白酶和/或TrypLE Select接触，将所述PSC解离成单细胞。

13.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM。

14.根据实施方案7和13中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。

15.根据前述实施方案中任一项的方法，其中在第0天将所述PSC解离成单细胞悬浮液的步骤后，使所述PSC与浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM的所述ROCK抑制剂接触约一天。

16.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度从约第1天起逐渐降低。

17.根据前述实施方案中任一项的方法，其进一步包括对所述悬浮培养物进行搅拌的步骤。

18.根据实施方案17的方法，其中从大约第0天、第1天、第2天或第3天起对所述悬浮培养物进行搅拌，优选地从大约第1天起对所述悬浮培养物进行搅拌。

19.根据实施方案17和18中任一项的方法，其中对所述悬浮培养物进行搅拌直到涂布NSC的步骤。

20.根据实施方案16和17的方法，其中当开始逐渐降低所述ROCK抑制剂的浓度时对所述悬浮培养物进行搅拌。

21.根据实施方案17至20中任一项的方法，其中通过摇动对所述悬浮培养物进行搅拌。

22.根据实施方案17和21中任一项的方法，其中以约5rpm至约80rpm，优选约20rpm至约70rpm，更优选约40rpm至约60rpm的速度对所述悬浮培养物进行搅拌。

23.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述PSC经由增殖和自发聚集而基本上形成NECS。

24.根据前述实施方案中任一项的方法，其中在涂布NSC的步骤之前至少90％的NECS具有小于500μm的直径，优选地，在涂布NSC的步骤之前所述NECS具有小于500μm的直径。

25.根据前述实施方案中任一项的方法，其中在涂布NSC的步骤之前至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的NECS具有小于400μm的直径，优选地在涂布NSC的步骤之前至少80％的NECS具有小于400μm的直径，更优选地在涂布NSC的步骤之前至少90％的NECS具有小于400μm的直径。

26.根据前述实施方案中任一项的方法，其中在涂布NSC的步骤之前至少50％、60％、70％、80％、90％的NECS具有小于300μm的直径，优选地，在涂布NSC的步骤之前至少80％的NECS具有小于300μm的直径。

27.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述PSC向NSC的分化在第0天开始。

28.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述PSC向NSC的分化是将PSC解离成单细胞悬浮液后立即开始。

29.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述PSC与TGFβR1/ALK5受体的抑制剂如RepSox接触。

30.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述PSC与TGFβ2型受体/ALK5受体的抑制剂如GW788388接触。

31.根据实施方案29的方法，其中RepSox的浓度为约1μM至约200μM，优选约10μM至约100μM，更优选约20μM至约80μM，更优选约30μM至约70μM，更优选约40μM至约60μM，更优选约45μM至约55μM，甚至更优选约50μM。

32.根据实施方案29至31中任一项的方法，其中从第0天到扩充NSC的步骤期间使所述PSC与RepSox接触。

33.根据前述实施方案中任一项的方法，其中将所述NSC涂布在包含细胞外基质的基底上。

34.根据实施方案33的方法，其中所述细胞外基质选自纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白和层粘连蛋白，或其组合，和/或其片段。

35.根据实施方案34的方法，其中所述细胞外基质是层粘连蛋白。

36.根据实施方案35的方法，其中所述层粘连蛋白选自层粘连蛋白-521、层粘连蛋白-511，或其组合，或其片段。

37.根据前述实施方案中任一项的方法，其中使所述PSC分化约5天至约15天，优选约10天。

38.根据前述实施方案中任一项的方法，其中当至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的NSC表达标志物SOX2时，涂布所述NSC。

39.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6是至少80％双阳性的。

40.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于PAX6/SOX是至少80％双阳性的。

41.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2是至少80％三阳性的。

42.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1是至少80％四阳性的。

43.根据前述实施方案中任一项的方法，其中在约4天后至约15天后，优选约5天后至约10天后，更优选约5天后至约8天后，甚至更优选约6天后，涂布所述NSC。

44.根据前述实施方案中任一项的方法，其中维持并扩充NSC的步骤在涂布NSC后约3天起至约8天起，优选地在涂布NSC后约3天起至约5天起，更优选地在涂布NSC后约4天起开始。

45.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述方法不包括分离神经玫瑰花结的步骤。

46.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述方法不包括人工选择神经玫瑰花结以用于维持并扩充NSC的步骤。

47.根据前述实施方案中任一项的方法，其中基本上所有形成的神经玫瑰花结是可维持的和可扩充的。

48.根据前述实施方案中任一项的方法，其中基本上所有形成的神经玫瑰花结得到维持并扩充。

49.根据前述实施方案中任一项的方法，其中从第0天到第1天起，将所述PSC在第一细胞培养基中培养。

50.根据实施方案49的方法，其中所述第一细胞培养基是Nutristem。

51.根据实施方案49和50中任一项的方法，其中从第1天起，将所述PSC在第二细胞培养基中培养。

52.根据实施方案51的方法，其中所述第二细胞培养基是DMEM/F12。

53.根据前述实施方案中任一项的方法，其中从第1天起的细胞培养基包含浓度为约0.1％(v/v)至约5％(v/v)、优选约0.5％(v/v)至约2.5％(v/v)、更优选约1％(v/v)的N2补充剂。

54.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述NSC在包含浓度为约0.01％(v/v)至约5％(v/v)、优选约0.5％(v/v)至约2.5％(v/v)、更优选约0.1％(v/v)的B27的细胞培养基中维持并扩充。

55.根据前述实施方案中任一项的方法，其中扩充NSC的步骤包括以下的另外步骤：

-将涂布的NSC解离成单细胞悬浮液，

-使所述NSC与ROCK抑制剂接触，

-将单细胞悬浮液中的NSC重新涂布在第二基底上，以及

-使所述NSC重新形成神经玫瑰花结。

56.根据实施方案55的方法，其中重复所述另外步骤以维持并扩充神经干细胞(NSC)系。

57.根据实施方案55和56中任一项的方法，其中通过使NSC与细胞解离剂如胰蛋白酶和/或TrypLE Select接触，将所述NSC解离成单细胞悬浮液。

58.根据实施方案55至57中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM。

59.根据实施方案55至58中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。

60.从多能干细胞(PSC)获得神经外胚层细胞的方法，其包括以下步骤：

-使所述PSC与RepSox接触，以及

-使所述PSC分化为神经外胚层细胞。

61.根据实施方案60的方法，其中所述神经外胚层细胞是神经干细胞(NSC)。

62.根据实施方案60和61中任一项的方法，其中RepSox的浓度高于约10μM、20μM、30μM、40μM，优选地高于约40μM。

63.根据实施方案60至62中任一项的方法，其中RepSox的浓度小于约200μM、150μM、100μM、90、μM、80μM、70μM、60μM，优选地小于60μM。

64.根据实施方案60至63中任一项的方法，其中RepSox的浓度为约1μM至约200μM，优选约10μM至约100μM，更优选约20μM至约80μM，更优选约30μM至约70μM，更优选约40μM至约60μM，更优选约45μM至约55μM，甚至更优选约50μM。

65.根据实施方案60至64中任一项的方法，其中所述PSC不与BMP抑制剂接触。

66.根据实施方案60至64中任一项的方法，其中所述PSC不与Noggin接触。

67.根据实施方案60至65中任一项的方法，其中所述PSC不与骨形态发生蛋白(BMP)信号通路的抑制剂接触。

68.根据前述实施方案中任一项的方法获得的神经干细胞(NSC)系用于产生细胞外囊泡的用途。

69.从根据实施方案1至59中任一项的方法获得的神经干细胞(NSC)系产生外泌体的方法，其包括以下步骤：

-使所述NSC产生细胞外囊泡，以及

-分离所述细胞外囊泡。

根据前述实施方案中任一项的方法获得的神经干细胞(NSC)系用于产生外泌体的用途。

70.从根据实施方案1至59中任一项的方法获得的神经干细胞(NSC)系产生外泌体的方法，其包括以下步骤：

-使所述NSC产生外泌体，以及

-分离所述外泌体。

71.根据实施方案0的方法获得的外泌体。

72.根据实施方案71的外泌体，其用作药物。

73.根据实施方案72的外泌体，其用于治疗神经变性病症。

74.根据实施方案73的外泌体，其中所述神经变性病症选自卒中、创伤性脑损伤(TBI)和阿尔茨海默病。

75.维持并扩充神经干细胞(NSC)系的方法，其包括以下步骤：

-在基底上培养NSC，

-使所述NSC重新形成神经玫瑰花结，

-将所述NSC解离成单细胞悬浮液，

-使所述NSC与ROCK抑制剂接触，以及

-在第二基底上重新涂布所述NSC。

76.根据实施方案75的方法，其中重复所述步骤以维持并扩充所述神经干细胞(NSC)系至少5次传代，优选至少10次传代。

77.根据实施方案75和76中任一项的方法，其中在将NSC解离成单细胞悬浮液的步骤之前，使NSC达到汇合。

78.根据实施方案77的方法，其中使所述NSC达到至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％汇合，优选至少90％汇合。

79.根据实施方案75至78中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM，优选约5μM至约25μM，更优选约10μM。

80.根据实施方案75至79中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632。

81.从多能干细胞(PSC)获得体外神经干细胞的方法，其包括以下步骤：

-将所述PSC解离成单细胞或包含少于约50个细胞的聚集体，

-将所述PSC在悬浮培养物中培养，

-使悬浮液中的PSC自发形成(NECS)，以及

-使所述PSC分化为神经干细胞。

82.根据实施方案81的方法，其中所述聚集体包含少于40个细胞，优选少于30个细胞，更优选少于20个细胞，甚至更优选少于10个细胞。

83.根据实施方案81和82中任一项的方法，其中可将所述NSC涂布或维持在悬浮培养物中，并且/或者进一步分化。

84.通过根据实施方案1-67中任一项的方法获得的神经外胚层细胞的高纯度群体。

85.实施方案84的神经外胚层细胞的高纯度群体，其用于进一步分化为神经细胞或神经胶质细胞，以用作药物。

86.实施方案85的神经干细胞或神经胶质细胞，其通过将所述神经细胞或神经胶质细胞或衍生自干细胞的组织或器官移植到有需要的受试者中，用于治疗神经变性病症。

87.用于再生和/或修复和/或构建组织或器官的试剂盒，其中所述试剂盒包含：

i.装置

ii.根据实施方案10-12的神经外胚层细胞群体，其用于进一步分化为神经细胞或神经胶质细胞，或实施方案7-9的外泌体或外泌体群体，

iii.生物相容性支架或基质，

iv.至少一种生长因子或其功能片段；

v.选自ROCK抑制剂和/或单一SMAD抑制剂如RepSox或GW788388的药剂；以及

任选地，关于制备、维持和/或使用所述细胞的说明，所述细胞包括任何细胞培养物或由其衍生的组织或器官。

通过以下非限制性实施方案更进一步描述本发明。

89.从多能干细胞(PSC)获得体外神经干细胞(NSC)系的方法，其包括以下步骤：

-将所述PSC解离成单细胞，

-将所述PSC在悬浮培养物中培养，

-使悬浮液中的PSC自发形成(NECS)，

-将所述PSC分化为NSC，

-任选地解离所述NSC，

-在基底上涂布所述NSC，

-使所述NSC形成神经玫瑰花结，以及

-维持并扩充所述NSC以建立NSC系。

90.根据实施方案89的方法，其中在使PSC成为单细胞悬浮液的步骤中使所述PSC与ROCK抑制剂接触。

91.根据实施方案89-90的方法，其进一步包括对所述悬浮培养物进行搅拌的步骤。

92.根据实施方案91的方法，其中从约第1天起对所述悬浮培养物进行搅拌。

93.根据实施方案89-92的方法，其中所述PSC通过增殖和/或非强迫聚集而形成NECS。

94.根据实施方案89-92的方法，其中在涂布NSC的步骤之前所述NECS具有小于500μm的直径。

95.根据实施方案89-94的方法，其中所述PSC与浓度为约1μM至约100μM的RepSox接触。

96.根据实施方案89-95的方法，其中扩充NSC的步骤包括以下的另外步骤：

-将涂布的NSC解离成单细胞悬浮液，

-使所述NSC与ROCK抑制剂接触，

-将单细胞悬浮液中的NSC重新涂布在第二基底上，以及

-使所述NSC重新形成神经玫瑰花结。

97.根据实施方案96的方法，其中重复扩充NSC的另外步骤以维持并扩充神经干细胞(NSC)系至少10次传代。

98.根据实施方案89-97中任一项的方法获得的神经干细胞(NSC)系用于产生细胞外囊泡的用途。

99.根据实施方案89-97中任一项的方法获得的神经干细胞(NSC)系用于产生外泌体的用途。

100.从多能干细胞(PSC)获得神经外胚层细胞的方法，其包括以下步骤：

-使所述PSC与RepSox接触，以及

-使所述PSC分化为神经外胚层细胞，

其中RepSox的浓度为约40μM至约60μM。

101.根据实施方案100的方法，其中所述神经外胚层细胞是神经干细胞(NSC)。

102.根据实施方案100-101中任一项的方法，其中所述PSC不与Noggin接触。

103.维持并扩充神经干细胞(NSC)系的方法，其包括以下步骤：

-在基底上培养所述NSC，

-使所述NSC重新形成神经玫瑰花结，

-使所述NSC成为单一悬浮液，

-使所述NSC与ROCK抑制剂接触，以及

-在第二基底上重新涂布所述NSC，

其中所述步骤重复至少10次传代。

104.根据实施方案90至95和103中任一项的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度为约0.5μM至约50μM。

实施例

以下是用于实施本发明的方案的非限制性示例。

缩写列表

循环阈值(CT)值；

DMEM/F12(Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12培养基)；

良好生产规范(GMP)；

良好组织规范(GTP)；

人类胚胎干细胞(hESC)；

人类诱导多能干细胞(hiPSC)；

人类多能干细胞(hPSC)；

人重组层粘连蛋白(hrLN)

层粘连蛋白(LN)；

神经干细胞(NSC)

神经外胚层球体(NECS)

Orthodenticle同源框2(Orthodenticle Homeobox 2)(OTX2)；

成对盒6(Paried Box 6)(PAX6)；

多能干细胞(PSC)

实时聚合酶链反应(PCR)；

Rho相关的含卷曲螺旋的激酶(ROCK)；

Rho相关的含卷曲螺旋的激酶的抑制剂(ROCKi)；

Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)；

通用制备方法

hESC的培养

内部生成的hESC系在37℃的5％CO₂培养箱中，在人重组层粘连蛋白(hrLN)包被的板(Biolaminin 521LN，Biolamina)上在NutriStem hPSC XF培养基(BiologicalIndustries)中维持，并且每3-5天以1:10–1:20的比例酶促传代。对于传代，将汇合的培养物用不含钙和镁离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，并在37℃下与TrypLE Select(GIBCO，Thermo Fisher Scientific)一起孵育5分钟。然后小心地去除酶，并通过轻轻移液将细胞收集在新鲜的NutriStem hPSC XF培养基中以获得单细胞悬液，并将所需体积涂布在新鲜的hrLN-521包被的培养皿上。传代后，将培养基替换为新鲜预温的NutriStem hPSCXF培养基，并每天更换。

实施例1：NECS和玫瑰花结形成的分化方案

用于hESC神经诱导及随后的生成和NSC系建立的实验方案大致可分为三个主要阶段——神经外胚层诱导和NECS形成；NECS涂布和玫瑰花结形成，以及最后通过在扩充培养基中重新涂布细胞来建立NSC系。该方案在图1中图示。

将50-90％汇合的hESC用PBS^-/-洗涤，并用TrypLE^TMSelect(Gibco)在37℃下从单层培养物中解离大约5分钟以获得单细胞悬浮液。将hESC的单细胞悬浮液重悬在补充有10μMROCKi(Y-27632)的

中，并且作为标准，将细胞密度为1x10⁵-2x10⁵个细胞/mL的1mL接种到12孔板的一个单孔(约3.5cm²)中(第0天)。

在第1天，将大约50％的培养基更换为NECS培养基，该培养基由补充有20U/mL青霉素-链霉素的DMEM/F12 GlutaMAX^TM补充剂(Gibco^TM)、1％N-2补充剂(Gibco^TM)和不同浓度的GW788388或RepSox组成，没有ROCKi。为了启动旋转式NECS形成，将板从第1-6天以不同的速度、时隙、水平和角度放置在Multi Bio 3D迷你摇床(BioSan)上。例如，一种最佳条件是：

-速度：40-60rpm，

-角度(转向角)：240-360度，10-15秒，

-振动(摇摆角)：5度，3-5秒。

每天通过去除一半培养基并添加新鲜培养基来更换NECS培养基。静态培养与动态培养的比较如图2所示，显示出由动态条件形成的小而均一的结构。对于RepSox和GW788388条件之间的比较，用RepSox处理产生更透明的NECS，表明三维结构密度较低(图3)。在动态条件下6天后，收集所有NECS，并在层粘连蛋白包被的48孔板上以2D方式涂布。对于包被，1:50天然小鼠层粘连蛋白(L2020-1MG，Sigma-Aldrich，1mg/ml)表现良好，但层粘连蛋白的类型也可以扩展到LN-521或LN-511(BioLamina)。从第7天到第10天，现在处于2D附着状态，移除所有培养基，并用新鲜的NECS培养基重新饲养细胞。不同步骤的示例可如图4所示，其中有第3天(动态悬浮)、第8天(2D的神经玫瑰花结)和第10天(单细胞解离前)的图像。神经玫瑰花结在RepSox条件下的第10天清晰可见(见图5)，细胞对NES呈阳性，每个神经玫瑰花结都显示出阳性的ZO1内腔。

通过此处使用的特定细胞hESC系，与GW相比，RepSox对神经玫瑰花结结构形成的效果似乎更好(图6)。如图7和图8所示，25μM和50μM浓度的RepSox是获得具有NES阳性细胞和位于每个玫瑰花结中心的ZO1的均质神经玫瑰花结群体的最佳选择。更低浓度的效果不太明显。图9和图10显示了使用50μM RepSox生成神经玫瑰花结的四个独立实验(r1-4)，表明所述方法的可再现性。

总之，NSC可以用单一SMAD抑制剂RepSox以高效和可再现的方式有效地产生。也可以使用SMAD抑制剂GW788388。

实施例2：估计产生神经玫瑰花结的NECS大小

对于图9和图10所示的四个独立实验，在第6天收集NECS，轻柔地重悬，并将200μLNECS悬浮培养物样品在200μL PBS中稀释。确定直径、大小分布、NECS计数和圆度。例如，我们使用了

Islet Counter及其相关软件(Biorep Technologies)。

通过高分辨率图像来量化岛形物，对该图像进行数字图像分析，由此计算出单个岛形物的面积。然后通过50μm增量组分类(Buchwald等人,2016)，使用计算出的面积来估计岛形物的几个特征，包括单个直径(d＝2(A/π)^1/2)和样品的大小分布。

在测量之前，将样品以8字形移动以分布聚集体，从而实现最佳检测。此外，如果软件未自动检测到所有NECS，则使用选择工具将明显遗漏的NECS添加到数据中。

通过将NECS直径分选到50μm箱元(bin)并评估图形分布(图11)来检查NECS的均质性。如图所示，小于400μm的NECS直径对神经玫瑰花结的形成有类似的影响，其中所有细胞均为NES阳性。例如通过静态培养获得的较大的直径具有负面影响，并产生一定比例的NES阴性细胞(图12)。

总之，NECS的直径大小对细胞纯度有强烈而直接的影响，小于400μm是获得高均质性NSC群体的理想大小。

实施例3：NSC系扩充与建立

在第10天，完美限定了神经玫瑰花结。将细胞用PBS^-/-洗涤，用预热的TrypLE^TMSelect(37℃)处理，并在37℃下孵育5-10分钟。将细胞轻轻重悬在预热的选定胰蛋白酶抑制剂(来自Gibco的DTI)中，并转移到由补充有20U/mL青霉素-链霉素(Gibco)的DMEM/F12GlutaMAX^TM补充剂(Gibco^TM)、1％N-2补充剂(Gibco^TM)和10μM ROCKi(Y-27632)组成的“洗涤介质”中，以1200rpm离心3分钟。离心后，去除上清液，将沉淀物重悬在由补充有20U/mL青霉素-链霉素(Gibco)的DMEM/F12 GlutaMAX^TM补充剂(Gibco^TM)、1％N-2补充剂(Gibco^TM)、10μg/L bFGF、10μg/L EGF、补充有10μM ROCKi(Y-27632)的1‰B-27补充剂(Gibco^TM)组成的神经扩充培养基中。然后将细胞悬浮液接种到用1:50天然小鼠层粘连蛋白(L2020-1MG，Sigma-Aldrich，1mg/ml)包被的培养板中。

在接下来的两到四天中，每天重复此过程一次。之后进行更温和的解离方法，其中细胞仅用TrypLE^TMSelect洗涤并在室温下孵育2-4分钟，然后重悬在DTI中。其余步骤按照上述相同的方法进行。对于每次分割(split)，将NSC分布在孔中，大致对应于双倍培养面积，即1:2分割。NSC在形成玫瑰花结之前没有分割。通常，NSC需要大约两到三天的时间才能形成玫瑰花结。在NSC未分割的时间里，去除培养基，并添加不含ROCKi(Y-27632)的新鲜制备的培养基。

当培养扩大到6孔格式时，即在这种情况下在9天内进行5次分割后，开始进行传代编号。

在第10天成功形成玫瑰花结后，将细胞解离并重新涂布以建立NSC系。将NSC扩充超过36天，并按比例从1×10⁶个细胞扩充到超过1×10⁹个细胞，倍增时间约为3-4天，显示出可连续扩充性(图13)。解离后，NSC保留其玫瑰花结形成趋势，并持续表达NSC标志物NES、PAX6、OTX2和SOX2(图14-15)。所有细胞均为SOX2阳性。在几次传代后保留了具有ZO-1的明显中央/内腔定位的典型玫瑰花结状结构，其中可见多个微小且均一的玫瑰花结(图14和图15，与第5次传代相比)。这些NSC在解离后保留其玫瑰花结形成趋势的能力也可见于图16中，对应于第12次传代。NSC形成多个神经玫瑰花结，其对NES呈阳性且在内腔中具有ZO1定位(图16)。此外，NSC还持续表达神经元标志物，包括NSC标志物PAX6和SOX2。

对于冷冻保存，如上所述将细胞解离并分离。然后将细胞重悬在

(Zenoaq)中并在-80℃下储存24小时，然后再将其小瓶转移到N₂罐中。

NSC在第12次传代时仍对前脑标志物FOXG1和OTX2呈阳性(图17)，表明前脑身份。还在mRNA水平上分析了该身份，比较了用25μM和50μM的RepSox生成的两个系(图18)。

流式细胞术分析表明，使用该方法生成的细胞中有超过80％在第3次传代时对PAX6和OTX2标志物呈双阳性(图19)。

流式细胞术分析表明，使用该方法生成的细胞中有超过80％在第8次传代时对PAX6/OTX2、PAX6/FOXG1、PAX6/SOX2标志物呈双阳性(图20)。

收集到的数据表明，按照我们的方案可以生成保留关键NSC特征的纯净且可扩充的细胞系，保留了高百分比(超过80％)的PAX6/OTX2和PAX6/SOX2双阳性或PAX6/OTX2/SOX2三阳性。

实施例4：不同SMAD抑制剂的比较

表1显示了测试的不同化合物和浓度的评分。测量的参数是细胞死亡、玫瑰花结形成、2D单层形成、玫瑰花结结构中形成的上皮厚度以及无侧群(side population)(所有细胞都是NES和OTX2阳性的)，即细胞群体的纯度。

对以下参数进行了评估，并在下文中进行了更详细的解释：

细胞死亡：通过DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色进行监测。固缩或核固缩是经历坏死或凋亡的细胞的核中染色质的不可逆凝聚。在荧光显微镜下目视检查后，0分代表固缩核数目多，3分代表固缩核数目少。

玫瑰花结数：通过DAPI、ZO1和NES染色进行监测。在荧光显微镜下目视检查后，0分代表神经玫瑰花结核数目少，3分代表玫瑰花结数目多。

单层形成：通过亮视野和DAPI染色进行监测。在显微镜下目视检查后，3分代表NECS附着后细胞的平坦单层。

玫瑰花结柱状上皮的厚度：通过DAPI染色进行监测。在荧光显微镜下目视检查后，3分代表神经玫瑰花结的柱状上皮更宽、更厚。

侧群：通过NES和OTX2的特异性染色进行监测。在荧光显微镜下目视检查后，6分代表未检测到NES阴性细胞。仅在没有NES阴性细胞的条件下评估OTX2群体。在这些情况下，3分代表未检测到OTX2阴性细胞。

根据上述参数测试并评估以下化合物和浓度：

-SB431542 10μM

-SB431542+LDN 10μM+10μM

-GW 788388，浓度10ng/ml和0.1ng/ml

-RepSox，剂量25μM和0.25μM

-SB525334，剂量10μM和0.1μM

-LY2157299，剂量10μM

-TEW-7197，剂量10μM

-LY2109761，剂量2μM

-对照：未用任何SMAD抑制剂处理

实施例5：外泌体收集

收集来自至少80％的PAX6/OTX2/SOX2三阳性NSC和hESC的群体的上清液，并在4℃下以1500g离心10分钟以去除细胞。弃去沉淀物，将上清液转移到新的收集管，并储存在-80℃直至超速离心以纯化外泌体。图21显示了从hESC和NSC两者收集的上清液中存在的外泌体的分析。在hESC和NSC产生的外泌体之间，颗粒的大小、蛋白质含量和数目不同。NSC产生的外泌体的结构通过电子显微术成像。该数据表明，至少80％的PAX6/OTX2/SOX2三阳性NSC的群体可以产生外泌体。

表1：比较

虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落在本发明的真正精神内的所有这些修改和变化。

Claims

·在悬浮培养物中使所述PSC与ROCKi和单一SMAD抑制剂接触，

·使悬浮液中的所述PSC自发形成三维细胞聚集体，

·在动态细胞培养悬浮液中使所述三维细胞聚集体分化为直径小于约500μm的神经外胚层球体，

2.根据权利要求1所述的方法，其中使所述神经玫瑰花结维持并扩充成神经干细胞(NSC)系。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经外胚层细胞是神经干细胞。

4.用于获得体外神经干细胞的方法，其包括以下步骤：

·将PSC解离成单细胞，

·在悬浮培养物中使所述PSC与ROCKi和单一SMAD抑制剂接触，

·使悬浮液中的所述PSC自发形成三维细胞聚集体，

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单一SMAD抑制剂是RepSox或GW788388。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中RepSox的浓度为约20μM至约60μM，或者其中GW788388的浓度为约0.1ng/ml至约150ng/ml。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6或SOX2/PAX6是至少80％双阳性的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2是至少80％三阳性的。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经干细胞对于OTX2/PAX6/SOX2/FOXG1是至少80％四阳性的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的神经干细胞(NSC)系用于产生细胞外囊泡如外泌体的用途。

11.根据权利要求9所述的外泌体，其用作药物。

12.根据权利要求10所述的外泌体，其用于治疗神经变性病症，如卒中、创伤性脑损伤或阿尔茨海默病。

13.通过根据权利要求1-10中任一项所述的方法获得的神经外胚层细胞的高纯度群体。

14.根据权利要求13所述的神经外胚层细胞的高纯度群体，其用于进一步分化为神经细胞或神经胶质细胞，以用作药物。

15.根据权利要求14所述的神经干细胞或神经胶质细胞，其通过将所述神经细胞或神经胶质细胞或衍生自干细胞的组织或器官移植到有需要的受试者中，用于治疗神经变性病症。