CN112725278B - 诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法 - Google Patents

诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法，包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基，以及N2补充剂、B27补充剂、L‑抗坏血酸、L‑谷氨酰胺、GSK‑3β抑制剂、TGF‑β抑制剂、BMP抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子hLIF、肝素Heparin和多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子。本发明的培养液可由诱导多功能干细胞为原料定向分化培养得到多巴胺能祖细胞，并可用于直接移植或终末分化为多巴胺能神经元，以及可用于PD的临床细胞替代移植治疗，体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。本发明具有操作便捷、培养时间短，产量高、分化纯度高，整个环节无动物源性成分等优点。

Description

诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化 方法
技术领域
本发明属于干细胞治疗技术领域的干细胞分化技术，具体涉及一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种进行性神经退行性疾病，尽管它于200年前就已被发现，但我们对其病因以及潜在的细胞和分子致病机制仍不十分清楚，目前一致认为PD的运动症状主要是由中脑黑质多巴胺能神经元的变性坏死引起的。哺乳动物神经系统损伤后一般不能再生，而传统治疗手段对于神经系统损伤的治疗效果又极为有限，所以多巴胺能神经元就成为细胞替代治疗的理想靶点。
现有患者的材料仅限于生物液体和死后的大脑样本。疾病建模和药物筛选虽然能够在动物模型中开展，但这种方法有自身的局限性，因为实验室动物不会遭受多数神经退行性疾病，包括PD。以已知基因突变的诱导多功能干细胞定向分化获得的神经元为载体，将有助于进一步阐述神经退行性疾病的分子作用机制。这种经干细胞体外诱导分化培养获得的神经细胞可以作为神经退行性疾病病变过程研究的独特模型。
诱导多功能干细胞分化得到的神经元亚型细胞已被证明是药物筛选、神经发育以及神经退行性疾病建模的理想来源；其在应用中面临的一个主要挑战是需要为每个特定的神经元亚型细胞研发相应的分化方法；其进一步应用于临床相关神经退行性疾病的细胞替代治疗中，就更需要分化方案必须以精确可控、有效和可复制的方式产生真正接近原代且具生物活性的神经元亚型细胞，并且批次间的差异达到最小。
当前诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法主要分为两种，一种是诱导多功能干细胞先分化为神经干细胞，然后神经干细胞再分化为多巴胺能祖细胞，另一种方法就是诱导多功能干细胞直接分化为多巴胺能祖细胞。前一种方法是用CK1抑制剂和骨形态发生蛋白抑制剂处理诱导多功能干细胞，通过测定经处理诱导多功能干细胞的神经干细胞标志物鉴定神经干细胞，再用至少一种多巴胺能祖细胞诱导化合物处理神经干细胞并且分析最终分化获得的细胞的多巴胺能祖细胞标志物；此方法分化时间长，过程复杂，并且分化效率不高。后一种方法在已报到的文献和专利中均通过在分化过程中以精确的时间顺序添加特定的细胞因子混合物进行定向分化，这些分化方法成本较高，分化时间长，过程复杂。因此针对现有技术的缺点：存在不确定性培养因子(如血清)、诱导周期长、过程复杂且存在不确定性、分化效率差、纯度低等。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效快捷的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液以及分化方法。本发明具有操作便捷、分化培养时间短、分化效率高、产量高、分化纯度高，整个环节无动物源性成分，可用于临床等优点。
本发明的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基(Neurobasal medium)，以及N2补充剂(N2 supplement CTS厂家：Thermo Fisher货号：A1370701)、B27补充剂(B27 supplementminus vitamin A厂家：Thermo Fisher货号：12587010)、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、GSK-3β抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP信号通路抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子hLIF、肝素(Heparin)和多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子。
所述GSK-3β抑制剂为TWS119；所述TGF-β抑制剂为RepSox；所述BMP信号通路抑制剂为DMH-1；所述成纤维细胞生长因子为FGF8b；所述多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)和人血清白蛋白。
在本发明一较佳实施例中，DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的体积比为1:1，N2补充剂，B27补充剂(备注：N2补充剂，B27补充剂购买来的原液分别是100X和50X，使用时是1X，也就是将原液稀释100倍和50倍)，L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L，优选0.2mmol/L；L-谷氨酰胺浓度为1～5mmol/L，优选2mmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.1～0.50μmol/L，优选0.2μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度为1～5μmol/L，优选2μmol/L；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为0.5～5μmol/L，优选3μmol/L；所述成纤维细胞生长因子的浓度为50～150ng/mL，优选100ng/mL；所述人白血病抑制因子的浓度为10～50ng/mL，优选25ng/mL；所述肝素的浓度为1～10mg/mL，优选5mg/mL。所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，优选20ng/mL；神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为5～20ng/mL，优选10ng/mL；人血清白蛋白的浓度为1～10mg/mL优选5mg/mL。
本发明的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液还可以包括：嘌吗啡胺(purmorphamine)，浓度为1～10μmol/L，优选为5μmol/L；激活剂cAMP，浓度为0.5～2mmol/L，优选1mmol/L；抗氧化剂β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)，浓度为5～20μmol/L，优选为10μmol/L。
本发明的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液还可以包括：Rock抑制剂(Thiazovivin)，浓度为0.5～5mmol/L，优选为2mmol/L。
所述培养液中的各组分可协同诱导诱导多功能干细胞定向分化为多巴胺能祖细胞。其中，DMEM/F12和Neurobasal培养基混合作为无血清的基础培养基，DMEM/F12含有体积比为1:1的DMEM培养基和F12培养基，营养成分丰富；Neurobasal培养基可使大脑神经元细胞、神经干细胞具有良好的生存能力和存活率。N2补充剂和B27补充剂都是无血清成分，营养丰富，用于基础培养基的补充成分。L-抗坏血酸作为培养基中的辅助因子。L-谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。所述TGF-β抑制剂选用RepSox(2-(3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine，CAS号为446859-33-2)。所述GSK-3β抑制剂选用TWS119(3-[[6-(3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]oxyphenol ditrifluoroacetate，CAS号为1507095-58-0]。所述BMP抑制剂选用DMH-1(4-[6-[4-(1-Methylethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline，CAS号为1206711-16-1)，可以更有效的促进分化，使诱导效率更高。所述成纤维细胞生长因子家族是一类促有丝分裂和促进细胞生长作用的重要多肽因子，其成员之一FGF8b还具有增强En的表达，上调Pax(与中脑发生密切相关的一类通源域蛋白)水平的作用，直接参与了中脑AP轴的发育分化。所述人白血病抑制因子hLIF是一种糖蛋白类的细胞因子，对神经系统的作用是多方面的，能促进神经元的形成和存活。延长神经干细胞体外增值时间，从而提高神经干细胞的体外增殖速度，阻止其衰老。hLIF已经被证明具有多重神经保护机制，可以提升Neurotrophin-3(NT-3)表达，促进神经元的分化。hLIF可能通过激活钙离子通道，降低细胞内钙离子的浓度，从而减少多巴胺能神经元的凋亡。所述肝素Heparin，是一种抗凝特性粘多糖，具有增强细胞因子的稳定性，并能促进多巴胺祖细胞的分化。所述多种多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子，例如脑源性神经营养因子(BDNF)，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，人血清白蛋白可以为多巴胺能祖细胞的生长提供所需的营养，被公认为在神经细胞的分化和存活、神经突起的生长和功能联系以及成熟神经元的存活中扮演重要角色。
本发明的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法，包括如下步骤：
步骤S1，将层粘连蛋白-521的磷酸盐缓冲液和层粘连蛋白-111的磷酸盐缓冲液铺设并包被到细胞培养板上；
步骤S2，将含有诱导多功能干细胞的上述的培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能祖细胞。
具体地，
步骤S1，将层粘连蛋白-521的磷酸盐缓冲液和层粘连蛋白-111的磷酸盐缓冲液按体积比1:1～3优选1:2比例混合后，按照1～3μg/cm2优选2μg/cm2的浓度铺设在细胞培养板上，置于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO2条件下，包被1～3h优选2h，得到包被的细胞培养板；
步骤S2，将含有已吹打成单细胞的诱导多功能干细胞的上述的培养液铺在包被的细胞培养板上，在35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO2条件下定向分化培养5～8天优选6天得到多巴胺能祖细胞，其中培养液每1～3天优选每2天更换一次。
本发明分化后的多巴胺能祖细胞可进一步分化为多巴胺能神经元；多巴胺能祖细胞和多巴胺能神经元均可应用于帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的临床细胞替代移植治疗，以及体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。对培养得到的多巴胺能祖细胞进行细胞类型鉴定后，包括多巴胺能祖细胞特征性蛋白表达(免疫荧光和流式细胞术)，即可低温贮藏或者用于医学研究。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的培养液采用DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基组成的基础培养液，以及N2补充剂、B27补充剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、GSK-3β抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子、肝素Heparin和多种多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子。其中成纤维细胞生长因子家族是一类促有丝分裂和促进细胞生长作用的重要多肽因子，其成员之一FGF8b还具有增强En的表达，上调Pax(与中脑发生密切相关的一类通源域蛋白)水平的作用，直接参与了中脑AP轴的发育分化。人白血病抑制因子hLIF是一种糖蛋白类的细胞因子，对神经系统的作用是多方面的，能促进神经元的形成和存活。延长神经干细胞体外增值时间，从而提高神经干细胞的体外增殖速度，阻止其衰老。hLIF已经被证明具有多重神经保护机制，可以提升Neurotrophin-3(NT-3)表达，促进神经元的分化。LIF可能通过激活钙离子通道，降低细胞内钙离子的浓度，从而减少多巴胺能神经元的凋亡。所述肝素Heparin，是一种抗凝特性粘多糖，具有增强细胞因子的稳定性，并能促进多巴胺祖细胞的分化。三者联合起来可以有效的诱使诱导多功能干细胞朝多巴胺能祖细胞方向分化。经所述方法，可在较短时间内将诱导多功能干细胞分化成多巴胺能祖细胞。并且所述方法采用层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111按1:2的比例混合铺板，可以使分化效率更高。总的来说，所述方法操作便捷、产量大、分化纯度高，并且分化周期只需要6天，整个环节无动物源成分，为进一步利用患者自体细胞诱导多功能干细胞规模化生产临床应用级别的多巴胺能祖细胞提供了一种全新的方法。
附图说明
图1为诱导多功能干细胞的显微镜照片；
图2A和2B分别为实施例1的培养液和对比例1的培养液培养分化后多巴胺能祖细胞的显微镜照片；
图3为多巴胺能祖细胞的增殖倍数对比图；
图4为本发明培养得到的多巴胺能祖细胞特征性蛋白表达的鉴定(免疫荧光染色)；
图5为本发明培养得到的多巴胺能祖细胞特征性蛋白表达及纯度的鉴定(流式细胞术)；
图6为诱导分化所得的多巴胺能祖细胞终末分化为多巴胺能神经元细胞的显微镜照片；
图7为诱导分化所得的多巴胺能祖细胞终末分化为多巴胺能神经元细胞特征性蛋白表达的鉴定(免疫荧光染色)。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1和对比例1多巴胺能祖细胞培养液的配制
培养液由DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基混合而成的基础培养基，以及添加在基础培养基中的添加组分。添加组分及其含量如表1所示：
表1多巴胺能祖细胞培养液组分及含量
Figure GDA0003736560600000051
Figure GDA0003736560600000061
备注：表1所述各物质均为市场上购得
表1中，50×、100×是指将购得的原液稀释50倍、100倍，1×是指稀释100倍后的液体。
实施例2诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞
1、细胞培养板的包被
使用含钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)稀释层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111至浓度分别为14μg/mL，将其按体积比1:2比例混合后，按照2μg/cm2的浓度铺设在细胞培养板上，于37℃，5％CO2条件包被2小时得到包被的细胞培养板。
2、分化培养诱导多功能干细胞
将细胞融合到80％密度的诱导多功能干细胞，按照2mL/孔的体积使用DPBS洗涤，弃掉DPBS后加入1mL/孔的Accutase消化液，于37℃条件下放置5分钟。待细胞回缩成球或部分去贴壁，加入2倍体积的实施例1的培养液(对比例1的培养液也同时设置对照组)，并将其吹打成单细胞，收集于15mL离心管。使用400g转速离心3～5min，收集细胞沉淀。
细胞沉淀中加入3～5mL的实施例1的培养液(对照组加入对比例1的培养液)，轻轻吹打混匀后吸取10μL进行单细胞计数。按10000/cm2的密度将细胞铺在包被后的细胞培养板上，并加入培养液和ROCK抑制剂(10μM)的混合物(1mL/孔)。铺板后的细胞在37℃、5％CO2条件下定向分化培养6天，培养液每2天更换一次。只有在培养的前24小时添加ROCK抑制剂至2mmol/L。
3、细胞形态观察
在多巴胺能祖细胞分化培养铺板前、和诱导分化后，将培养板置于显微镜下观察并拍照。
结果如图1和图2A和2B所示：图1为诱导多功能干细胞，其具有典型的细胞形态；图2A和2B分别为对比例1的培养液和实施例1的培养液分化后的多巴胺能祖细胞，由图可以得出培养液使用实施例1的培养液分化后培养的多巴胺能祖细胞比对比例1的细胞更均质。
实施例3小分子化合物增加多巴胺能祖细胞的产量
通过实施例2的分化培养方法进行多巴胺能祖细胞的定向分化，分别使用对比例1和实施例1的培养液，收取12孔板1个孔的细胞，通过细胞计数仪计数，比较所获多巴胺能祖细胞的细胞数。结果如图3所示。
实施例1的培养液经实施例2的分化培养方法分化后的多巴胺能祖细胞可达到6.2×106，而对比例1的培养液经实施例2的分化培养方法培养分化出来的细胞达到2.8×106，所以实施例1的培养液分化后的多巴胺能祖细胞产量更高。
实施例4多巴胺能祖细胞特征性蛋白表达的鉴定
实施例1的培养液按照实施例2的方法进行的多巴胺能祖细胞的定向分化所得多巴胺能祖细胞进行免疫荧光染色和流式细胞术检测
方法一：免疫荧光染色
1)固定细胞
取培养完成的12孔板，弃去培养液后，沿12孔板板壁缓缓加入1×PBS(pH7.4，下同，1mL/孔)，洗2次；然后沿板壁缓慢加入4％的PFA(多聚甲醛)(1mL/孔)，室温放置18分钟固定细胞，轻柔地吸去PFA，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。
2)一抗孵育
加入1％TritonX-100(0.5mL/孔)，于37℃孵育30分钟；吸去1％TritonX-100，然后加入5％的BSA(0.5mL/孔)封闭，于37℃孵育30分钟；吸去5％的BSA封闭液，然后直接向封闭液中加入一抗，于37℃孵育1小时，吸去一抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。一抗的种类及体积见表2。
表2抗体的种类及体积
Figure GDA0003736560600000081
备注：表2所述各物质均为市场上购得
3)二抗孵育
加入用1％BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗，37℃避光孵育30分钟后，吸去二抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)，每次5分钟；然后加入用1×PBS配好的终浓度为1μg/mL的DAPI(0.5mL/孔)，染色3分钟，吸去DAPI，加入1×PBS洗2次(1mL/孔/次)；最后加入1×PBS(0.5mL/孔)，显微镜下观察并拍照处理。
方法二：流式细胞术
1)固定细胞
将培养于12孔板的多巴胺能祖细胞使用1×DPBS(0.5mL/孔)润洗一次后加0.5～1mL Accutase消化液，置于37℃消化3～5分钟至细胞分离；然后加2～4倍量DPBS稀释消化液，200～300g转速离心并弃掉消化液和DPBS。细胞沉淀使用1mL 90％的冷甲醇固定。
2)一抗孵育
将细胞样本室温下300rcf离心2分钟，弃上清液。向细胞样本中加入5mL PBS，振荡混匀。300rcf离心3分钟，弃上清，加入FACS buffer，吹打混匀，使细胞浓度为2*107个/mL。向流式细胞仪专用管中分别加入50μL相应样本细胞。向样本细胞中加入50μL对应的一抗，吹打5次混匀，室温避光孵育30分钟(每10分钟震荡混匀一次)。向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。一抗的种类及体积见表3。
3)二抗孵育
室温下300rcf离心2分钟。弃上清，向样本细胞中加入50μL对应的二抗，吹打5次混匀，室温避光孵育15分钟(根据一抗来源选择对应的二抗)。各加入300μL FACS buffer，使用漩涡混合器振荡混匀。选择对应的流式细胞仪通道检测每个标志物的阳性率。
表3抗体的种类及体积
Figure GDA0003736560600000091
图4为实施例4中FOXA2/LMX1A/EN1/OTX2免疫荧光鉴定图片，由图4可知多巴胺能祖细胞特征性蛋白表达量在90％以上。
图5为实施例4中FOXA2/LMX1A/EN1/OTX2流式细胞鉴定结果，由图5可知多巴胺能祖细胞特征性蛋白表达量在95％以上。
上述结果表明：使用本发明的培养液，通过本发明的培养方法，由诱导多功能干细胞分化得到的细胞具有多巴胺能祖细胞的特征性蛋白FOXA2/LMX1A/EN1/OTX2的表达同时分化效率很高。
实施例5诱导分化所得的多巴胺能祖细胞终末分化为多巴胺能神经元细胞
将实施例1培养所得的多巴胺能祖细胞继续培养进行终末分化，可得成熟的多巴胺能神经元细胞。细胞形态如图6所示。将其进行免疫荧光染色，染色方法如下：
1)固定细胞
取培养完成的12孔板，弃去培养液后，沿12孔板板壁缓缓加入1×PBS(pH7.4，下同，1mL/孔)，洗2次；然后沿板壁缓慢加入4％的PFA(多聚甲醛)(1mL/孔)，室温放置18分钟固定细胞，轻柔地吸去PFA，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。
2)一抗孵育
加入1％TritonX-100(0.5mL/孔)，于37℃孵育30分钟；吸去1％TritonX-100，然后加入5％的BSA(0.5mL/孔)封闭，于37℃孵育30分钟；吸去5％的BSA封闭液，然后直接向封闭液中加入一抗，于37℃孵育1小时，吸去一抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。一抗的种类及体积见表2。
3)二抗孵育
加入用1％BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗，37℃避光孵育30分钟后，吸去二抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)，每次5分钟；然后加入用1×PBS配好的终浓度为1μg/mL的DAPI(0.5mL/孔)，染色3分钟，吸去DAPI，加入1×PBS洗2次(1mL/孔/次)；最后加入1×PBS(0.5mL/孔)，显微镜下观察并拍照处理。
表4抗体的种类及体积
Figure GDA0003736560600000101
备注：表4所述各物质均为市场上购得
图6为多巴胺能神经元的明场照片，细胞具有明显的多巴胺能神经元细胞的形态特征；图7为实施例5中FOXA2/LMX1A/TH/MAP2的免疫荧光鉴定图片，由图7可知多巴胺能神经元细胞的特征性蛋白表达量在90％以上。说明诱导分化所得的多巴胺能祖细胞可以成功地终末分化为多巴胺能神经元细胞。可用于PD的临床细胞替代移植治疗，以及体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。
本发明的培养液中各组分协同作用可以有效的诱使诱导多功能干细胞朝多巴胺能祖细胞方向分化。其中成纤维细胞生长因子家族是一类促有丝分裂和促进细胞生长作用的重要多肽因子，其成员之一FGF8b还具有增强En的表达，上调Pax(与中脑发生密切相关的一类通源域蛋白)水平的作用，直接参与了中脑AP轴的发育分化。人白血病抑制因子hLIF是一种糖蛋白类的细胞因子，对神经系统的作用是多方面的，能促进神经元的形成和存活。延长神经干细胞体外增殖时间，从而提高神经干细胞的体外增殖速度，阻止其衰老。hLIF已经被证明具有多重神经保护机制，可以提升Neurotrophin-3(NT-3)表达，促进神经元的分化。LIF可能通过激活钙离子通道，降低细胞内钙离子的浓度，从而减少多巴胺能神经元的凋亡。所述肝素Heparin，是一种抗凝特性粘多糖，具有增强细胞因子的稳定性，并能促进多巴胺祖细胞的分化。三者联合起来可以有效的诱使诱导多功能干细胞朝多巴胺能祖细胞方向分化，增强分化效率。本发明的分化方法采用层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-111按1:2的比例混合铺板，可以使分化效率更高。并且使用一步分化法，操作便捷、分化周期只需要6天并且产量大、分化纯度高，整个环节无动物源成分，为进一步利用患者自体细胞诱导多功能干细胞规模化生产临床应用级别的多巴胺能祖细胞提供了一种全新的方法。

Claims (10)

1.一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液包括：体积比为1:0.9～1.3的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基，以及N2补充剂、B27补充剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、GSK-3β抑制剂、TGF-β抑制剂、BMP信号通路抑制剂、成纤维细胞生长因子、人白血病抑制因子hLIF、肝素和多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子，其中，N2补充剂，B27补充剂，L-抗坏血酸浓度为0.10～1mmol/L；L-谷氨酰胺浓度为1～5mmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.1～0.50μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度为1～5μmol/L；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为0.5～5μmol/L；所述成纤维细胞生长因子的浓度为50～150ng/mL；所述人白血病抑制因子的浓度为10～50ng/mL；所述肝素的浓度为1～10mg/mL；所述多巴胺能祖细胞生长所需的营养因子包括脑源性神经营养因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子和人血清白蛋白；所述脑源性神经营养因子的浓度为10～50ng/mL，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为5～20ng/mL，人血清白蛋白的浓度为1～10mg/mL；
以及，嘌吗啡胺，浓度为1～10μmol/L；激活剂cAMP，浓度为0.5～2mmol/L；抗氧化剂β-巯基乙醇，浓度为5～20μmol/L。
2.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述GSK-3β抑制剂为TWS119；所述TGF-β抑制剂为RepSox；所述BMP信号通路抑制剂为DMH-1；所述成纤维细胞生长因子为FGF8b。
3.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基的体积比为1:1，L-抗坏血酸浓度为0.2mmol/L；L-谷氨酰胺浓度为2mmol/L；所述GSK-3β抑制剂浓度为0.2μmol/L；所述TGF-β抑制剂浓度为2μmol/L；所述BMP信号通路抑制剂的浓度为3μmol/L；所述成纤维细胞生长因子的浓度为100ng/mL；所述人白血病抑制因子的浓度为25ng/mL；所述肝素的浓度为5mg/mL。
4.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述脑源性神经营养因子的浓度为20ng/mL；神经胶质细胞系衍生的神经营养因子的浓度为10ng/mL；人血清白蛋白的浓度为5mg/mL。
5.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液还包括：嘌吗啡胺，浓度为5μmol/L；激活剂cAMP，浓度为1mmol/L；抗氧化剂β-巯基乙醇，浓度为10μmol/L。
6.如权利要求1所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液还包括：Rock抑制剂，浓度为0.5～5mmol/L。
7.如权利要求6所述的诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液还包括：Rock抑制剂，浓度为2mmol/L。
8.一种诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤S1，将层粘连蛋白-521的磷酸盐缓冲液和层粘连蛋白-111的磷酸盐缓冲液铺设并包被到细胞培养板上；
步骤S2，将含有诱导多功能干细胞的权利要求1～5任一项所述的培养液铺在细胞培养板上，定向分化培养得到多巴胺能祖细胞。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：具体地，
步骤S1，将层粘连蛋白-521的磷酸盐缓冲液和层粘连蛋白-111的磷酸盐缓冲液按体积比1:1～3比例混合后，按照1～3μg/cm2的浓度铺设在细胞培养板上，置于35～39℃、3～7％CO2条件下，包被1～3h，得到包被的细胞培养板；
步骤S2，将含有已吹打成单细胞的诱导多功能干细胞的权利要求1～5任一项所述的培养液铺在包被的细胞培养板上，在35～39℃、3～7％CO2条件下定向分化培养5～8天得到多巴胺能祖细胞，其中培养液每1～3天更换一次。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：具体地，
步骤S1，将层粘连蛋白-521的磷酸盐缓冲液和层粘连蛋白-111的磷酸盐缓冲液按体积比1:2比例混合后，按照2μg/cm2的浓度铺设在细胞培养板上，置于37℃、5％CO2条件下，包被2h，得到包被的细胞培养板；
步骤S2，将含有已吹打成单细胞的诱导多功能干细胞的权利要求1～5任一项所述的培养液铺在包被的细胞培养板上，在37℃、5％CO2条件下定向分化培养6天得到多巴胺能祖细胞，其中培养液每2天更换一次。
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