CN112272700A - 人a1星形胶质细胞的制造方法、人a1星形胶质细胞及被测物质的评价方法 - Google Patents

人a1星形胶质细胞的制造方法、人a1星形胶质细胞及被测物质的评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种包括从除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞诱导人A1星形胶质细胞的人A1星形胶质细胞的制造方法；通过上述人A1星形胶质细胞的制造方法获得的人A1星形胶质细胞；及使用了人A1星形胶质细胞的被测物质的评价方法。根据本发明，可提供一种人A1星形胶质细胞的制造方法，其包括在TNFα及IFNγ的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序a。

Description

人A1星形胶质细胞的制造方法、人A1星形胶质细胞及被测物 质的评价方法
技术领域
本发明涉及一种人A1星形胶质细胞的制造方法及人A1星形胶质细胞。而且，本发明涉及一种使用了所制造的人A1星形胶质细胞的被测物质的筛选方法。
背景技术
作为构成脑的神经胶质细胞的一种的星形胶质细胞发挥针对神经元的营养供给、突触形成或消除等、维持中枢神经系统的稳态的各种作用，且从疾病的机理阐明或创药的观点备受瞩目。
已知星形胶质细胞通过神经疾病或衰老而被活化。近年报导有活化星形胶质细胞中存在神经障碍性A1星形胶质细胞和神经保护性A2星形胶质细胞这两种(非专利文献1及专利文献1)。从能够在抑制神经损伤的药剂的筛选中利用等创药研究方面考虑，人的A1星形胶质细胞的价值大。
关于星形胶质细胞的活化，非专利文献1中记载有通过TNFα、IL-1α、C1q这三种成分将小鼠的(未被活化)星形胶质细胞诱导成A1星形胶质细胞。但是，报道有小鼠与人的星形胶质细胞存在种差(非专利文献2)，且尚不明确在人星形胶质细胞中是否也能够同样地诱导。
专利文献2中记载有诸如TNFα或IFNγ之类的炎症细胞因子参与星形胶质细胞的活化的建议、通过TNFα、IFNγ及MPTP这三种成分对小鼠的(未被活化)星形胶质细胞进行了活化。但是，星形胶质细胞的活化结果，尚不明确被诱导成A1星形胶质细胞或A2星形胶质细胞中的哪一个，并且还不明确在人星形胶质细胞中是否也产生相同的活化。
非专利文献3中记载有IFNγ及IL-1β参与人的星形胶质细胞的活化。但是，星形胶质细胞活化的结果，尚不明确被诱导成A1星形胶质细胞或A2星形胶质细胞中的哪一个。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开US2016/0340648
专利文献2：美国专利申请公开US2010/0087504
非专利文献
非专利文献1：Nature,2017年，541卷，481-487页
非专利文献2：Neuron,2016年，89卷，1号,37-53页
非专利文献3：Glia,2014年，62卷,999-1013页
发明内容
发明要解决的技术课题
从创药研究的方面考虑，人的A1星形胶质细胞的价值大，并要求用于轻松地获得人的A1星形胶质细胞的方法。如上所述，关于星形胶质细胞的活化及诱导获得了一定的成果，但尚未发现用于可靠地从人星形胶质细胞诱导成人A1星形胶质细胞的方法。本发明应解决的课题在于提供一种包括从除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞诱导人A1星形胶质细胞的人A1星形胶质细胞的制造方法。本发明应解决的课题在于还提供一种通过上述人A1星形胶质细胞的制造方法获得的人A1星形胶质细胞。本发明应解决的课题在于还提供一种使用了上述人A1星形胶质细胞的被测物质的评价方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究的结果，发现通过在TNFα及IFNγ的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞而能够将上述人星形胶质细胞诱导成人A1星形胶质细胞。本发明根据这些发现而完成。
即，根据本发明，可提供以下发明。
＜1＞一种人A1星形胶质细胞的制造方法，其包括在TNFα及IFNγ的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序a。
＜2＞根据＜1＞所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其还在选自包括IL-1α、IL-1β及C1q的组中的至少一个细胞因子和/或补体的存在下进行上述工序a。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其在下述任一种的存在下进行上述工序a。
(1)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β
(2)TNFα、IFNγ、IL-1α、C1q
(3)TNFα、IFNγ、IL-1β、C1q
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
(5)TNFα、IFNγ
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
上述工序a包括：工序a1，将能够分化成人多能干细胞或人星形胶质细胞的细胞分化成除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞；及工序a2，在TNFα及IFNγ的存在下培养在工序a1中获得的除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在上述工序a中培养的除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞为人A2星形胶质细胞。
＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
上述工序a为无血清培养基中的培养。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在上述工序a中，TNFα在培养基中的浓度为0.01ng/mL～30ng/mL。
＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在上述工序a中，IFNγ在培养基中的浓度为0.1ng/mL～20ng/mL。
＜9＞根据＜1＞至＜8＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在上述工序a中，TNFα在培养基中的浓度与IFNγ在培养基中的浓度之比为100:1～1:100。
＜10＞一种人A1星形胶质细胞，其为通过＜1＞至＜9＞中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法而获得的经分离的人A1星形胶质细胞。
＜11＞一种被测物质的评价方法，其包括使＜10＞所述的人A1星形胶质细胞与被测物质接触。
＜12＞根据＜11＞所述的被测物质的评价方法，其中，
在使＜10＞所述的人A1星形胶质细胞与被测物质接触之后，对上述人A1星形胶质细胞所具有的神经障碍性的变化进行评价。
发明效果
根据本发明，能够从人星形胶质细胞制造人A1星形胶质细胞。本发明的人A1星形胶质细胞及本发明的被测物质的评价方法在创药研究等中有用。
附图说明
图1中示出在特定组合的化合物的存在下培养人星形胶质细胞之后的状态。
图2中示出在特定组合的化合物的存在下培养人星形胶质细胞(从星形胶质细胞前体细胞诱导)之后的状态。
图3中示出在特定组合的化合物的存在下培养人星形胶质细胞之后对GBP2及CXCL10的表达进行了定量的结果。
图4中示出在特定组合的化合物的存在下培养人星形胶质细胞之后对C3的表达进行了定量的结果。
图5中示出在特定组合的化合物的存在下培养人星形胶质细胞(从星形胶质细胞前体细胞诱导)之后对C3的表达进行了定量的结果。
图6中示出在特定组合的化合物的存在下培养人星形胶质细胞(原代培养)之后对C3的表达进行了定量的结果。
图7中示出当将神经细胞(还表记为神经元)连同未处置的人星形胶质细胞进行了培养时或连同在特定组合的化合物的存在下进行培养的人星形胶质细胞进行了培养时的神经细胞的状态。
图8中示出将神经细胞(还表记为神经元)连同未处置的人星形胶质细胞进行了培养时或连同在特定组合的化合物的存在下进行培养的人星形胶质细胞进行了培养时的神经细胞死亡的评价结果。
图9中示出将神经细胞连同未处置的人星形胶质细胞(从星形胶质细胞前体细胞诱导)进行了培养时或连同在特定组合的化合物的存在下进行培养的人星形胶质细胞(从星形胶质细胞前体细胞诱导)进行了培养时的神经细胞的状态及神经突起长度。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
TNFα表示肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα)。
IFNγ表示干扰素γ(Interferonγ)。
IL-1α表示白细胞介素1α(Interleukin-1α)。
IL-1β表示白细胞介素1β(Interleukin-1β)。
C1q表示补体C1q。
MPTP表示1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶。
EMP1表示上皮膜蛋白1(Epithelial membrane protein 1)。
CD109表示分化抗原组109(Cluster of Differentiation 109)。
GBP2表示鸟苷酸结合蛋白2(guanylate binding protein 2)。
C3表示补体分子C3。
CXCL10表示C-X-C基序趋化因子10(C-X-C motif chemokine 10)。
GAPDH表示甘油醛3磷酸脱氢酶。
HBEGF表示肝素结合表皮生长因子样生长因子(heparin binding-epidermalgrowth factor-like growth factor)。
WST表示水溶性四唑盐(Water soluble Tetrazolium salts)。
本发明涉及一种包括在TNFα及IFNγ的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序a的人A1星形胶质细胞的制造方法。
工序a为在TNFα及IFNγ的存在下或除了TNFα及IFNγ以外，还在选自包括IL-1α、IL-1β及C1q的组中的至少一种细胞因子和/或补体的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序。
工序a优选为在下述任一种的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序。
(1)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β
(2)TNFα、IFNγ、IL-1α、C1q
(3)TNFα、IFNγ、IL-1β、C1q
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
(5)TNFα、IFNγ
工序a尤其优选为在下述任一种的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序。
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
(5)TNFα、IFNγ
工序a优选为在MPTP的非存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序。
＜人星形胶质细胞＞
“人星形胶质细胞”是指人的星形胶质细胞。
作为本发明中所使用的“除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞”的获得方法，可举出例如通过如下情况等而获得，即从在外科上从患者获取到的大脑皮层或骨髓等分离，从能够分化成人星形胶质细胞的细胞诱导，从人多能干细胞诱导。这些人星形胶质细胞均能够用作本发明的方法中的“除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞”。
作为本发明中所使用的“除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞”，优选能够使用从人多能干细胞诱导的人星形胶质细胞及从能够分化成人星形胶质细胞的细胞诱导的人星形胶质细胞。
除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞即使在经分离的状态下或在与其他细胞混在的状态下也能够使用于本发明的方法。并且，还能够假定连续进行从多能干细胞向人星形胶质细胞的诱导和从人星形胶质细胞向人A1星形胶质细胞的诱导。在该情况下，工序a包括：工序a1，将能够分化成人多能干细胞或人星形胶质细胞的细胞分化成除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞；及工序a2，在TNFα及IFNγ的存在下培养在工序a1中获得的除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞。
作为人多能干细胞，能够举出人iPS细胞(human induced pluripotent stemcells：人诱导多能干细胞)、人ES细胞(human embryonic stem cells：人类胚胎干细胞)、人间充质干细胞等，但并未特别限定。
作为能够分化成人星形胶质细胞的细胞，能够举出神经干细胞、神经胶质系神经前体细胞、神经胶质前体细胞、星形胶质细胞前体细胞、成纤维细胞等，但并无特别限定。
＜活化人星形胶质细胞＞
“活化人星形胶质细胞”是指因神经疾病等的影响而被活化的人星形胶质细胞。活化人星形胶质细胞中已知神经障碍性为特征的人A1星形胶质细胞和神经保护性人A2星形胶质细胞。活化人星形胶质细胞也包含于本发明的人星形胶质细胞。
＜人A1星形胶质细胞＞
“人A1星形胶质细胞”为被活化的人星形胶质细胞的一种。
通过本发明的方法制造的人A1星形胶质细胞例如能够利用细胞的形态变化、人A1星形胶质细胞的特征性质或特异性标志而进行检测、确认及分离。
人A1星形胶质细胞具有肥大型特征性外观。因此，能够通过使用显微镜观察来检测人A1星形胶质细胞。
作为人A1星形胶质细胞的特异性标志，可举出GBP2、CXCL10及C3等，但并不限定于这些。
特异性标志的检测中能够利用免疫方法(使用抗体进行的检测)，但关于蛋白分子可以通过其mRNA量的定量来进行检测。
人A1星形胶质细胞表示神经细胞障碍性。因此，能够将人A1星形胶质细胞与神经细胞共培养，并利用针对神经细胞的障碍作用而进行检测。
＜人A2星形胶质细胞＞
“人A2星形胶质细胞”为被活化的人星形胶质细胞的一种。
A2星形胶质细胞中各种神经营养因子表达上升，且对神经细胞起保护作用。作为A2星形胶质细胞的特异性标志可举出EMP1或CD109等，但并不限定于这些。
人A2星形胶质细胞具有星形外观。
在本发明中，作为在工序a中培养的除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞能够使用人A2星形胶质细胞。
＜TNFα＞
TNFα为细胞因子的一种，且为在炎症时的生物防御或免疫机构的激活中广泛涉及的物质。用于实现“TNFα的存在下”的培养条件的方法并无特别限定，例如可通过将TNFα添加到培养基，与产生TNFα的细胞共培养，添加产生TNFα的细胞的培养上清液来实现。
TNFα的浓度只要适当地进行确定即可而并无特别限定，例如能够在0.01ng/mL～30ng/mL，优选在0.5ng/mL～10ng/mL的范围内使用。
＜IFNγ＞
IFNγ是指，控制细胞介导免疫的诱导的细胞因子。用于实现“IFNγ的存在下”的培养条件的方法并无特别限定，例如能够通过将IFNγ添加到培养基，与产生IFNγ的细胞共培养，添加产生IFNγ的细胞的培养上清液来实现。
IFNγ的浓度只要适当地进行确定即可而并无特别限定，例如能够在0.1ng/mL～20ng/mL，优选在0.5ng/mL～10ng/mL的范围内使用。
培养基中的TNFα的浓度与IFNγ的浓度之比并无特别限定，优选为100:1～1:100，更优选为10:1～1:10，进一步优选为5:1～1:5，尤其优选为3:1～1:1。
＜IL-1α＞
IL-1α为从为从白细胞分泌的细胞因子即白细胞介素的一种。用于实现“IL-1α的存在下”的培养条件的方法并无特别限定，例如可通过将IL-1α添加到培养基，与产生IL-1α的细胞共培养，添加产生IL-1α的细胞的培养上清液来实现。
IL-1α的浓度只要适当地确定即可而并无特别限定，例如能够在1pg/mL～5ng/mL，优选在0.05ng/mL～3ng/mL的范围内使用。
＜IL-1β＞
IL-1β为从白细胞分泌的细胞因子即白细胞介素的一种。用于实现“IL-1β的存在下”的培养条件的方法并无特别限定，例如可通过将IL-1β添加到培养基，与产生IL-1β的细胞共培养，添加产生IL-1β的细胞的培养上清液来实现。
IL-1β的浓度只要适当地确定即可而并无特别限定，例如能够在1pg/mL～10ng/mL，优选在0.5ng/mL～5ng/mL的范围内使用。
＜C1q＞
C1q为补体之一。作为补体活化的途径之一有经典途径，但C1q为成为该途径的起点的因子。用于实现“C1q的存在下”的培养条件的方法并无特别限定，例如可通过将C1q添加到培养基，与产生C1q的细胞共培养，添加产生C1q的细胞的培养上清液来实现。
C1q的浓度只要适当地确定即可而并无特别限定，例如能够在10ng/mL～10μg/mL，优选在50ng/mL～300ng/mL的范围内使用。
＜人星形胶质细胞的培养＞
本发明中的人星形胶质细胞的培养只要选择基于所使用的人星形胶质细胞的来源及状态的培养基、温度、其他条件，并在上述各种细胞因子和/或补体的存在下实施即可。只要不妨碍本发明中的人星形胶质细胞的培养，培养基中可以含有除了上述各种细胞因子和/或补体以外的成分。培养基能够从公知的培养基或市售的培养基选择。例如，能够对作为通常的培养基的MEM(最少必须培养基)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)、DMEM/F12或对这些进行改良而得的培养基添加适当的成分(血清、蛋白、氨基酸、糖类、维生素类、脂肪酸类、抗生素等)而使用。作为培养基，优选使用不含有血清的培养基(无血清培养基)。
作为培养条件，只要选择通常的细胞培养的条件即可。可例示37℃、5％C O2的条件等。培养中优选以适当的间隔(优选1天至7天1次，更优选2天至3天1次)替换培养基。当将人星形胶质细胞作为材料而实施本发明的方法时，人A1星形胶质细胞在37℃、5％CO2的条件下出现1天至1周。
体细胞的培养中能够使用板、皿、细胞培养插入物、细胞培养用烧瓶、细胞培养用袋等细胞培养容器。另外，作为细胞培养用袋，优选具有透气性。当需要大量的细胞时，可以使用大型培养槽。培养在开放系统或封闭系统中均能够实施。
在本发明的方法中，能够通过在包含上述各种细胞因子和/或补体的培养基中培养人星形胶质细胞来制造人A1星形胶质细胞。
＜人A1星形胶质细胞及使用了人A1星形胶质细胞的被测物质的评价方法＞
根据本发明，可提供一种通过基于本发明的人A1星形胶质细胞的制造方法获得的经分离的人A1星形胶质细胞。
通过本发明的方法制造的人A1星形胶质细胞还能够为了对人A1星形胶质细胞起作用的医药候选化合物的筛选或医药候选化合物的安全性评价而使用。
根据本发明，可提供一种包括使本发明的人A1星形胶质细胞与被测物质接触的被测物质的评价方法。例如，可以在使人A1星形胶质细胞与被测物质接触之后，通过对人A1星形胶质细胞所具有的神经细胞障碍性的变化进行评价来对被测物质进行评价。人A1星形胶质细胞所具有的神经细胞障碍性的变化例如能够按照后述实施例中所记载的方法，将人A1星形胶质细胞与神经细胞共培养，并利用针对神经细胞的障碍作用而进行评价。
通过以下实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于实施例的范围。
实施例
试验例1：从人星形胶质细胞向人A1星形胶质细胞的诱导
(1)人星形胶质细胞
(1-1)源自人iPS细胞的星形胶质细胞
人星形胶质细胞购买并使用了Cellular Dynamics International Japan Co.,Ltd.的源自人iPS细胞的星形胶质细胞即iCell(注册商标)Astrocytes(星形胶质细胞)(CDI,ASC-100-020-001-PT)。关于iCell(注册商标)Astrocytes，从其外观考虑，确认了是除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞。
(1-2)从星形胶质细胞前体细胞诱导的星形胶质细胞
并且，作为人星形胶质细胞，还使用了添附在试剂盒的方法等的条件下对市售的人星形胶质细胞前体细胞(Axol Bioscience、AX0083)进行了诱导而得的人星形胶质细胞。关于经诱导的人星形胶质细胞，从其外观考虑，确认了是除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞。
(1-3)源自人的原代培养星形胶质细胞
而且，还使用了市售的原代培养人星形胶质细胞(LONZA、CC-2565)。
(2)向人A1星形胶质细胞的诱导
关于向人A1星形胶质细胞的诱导，在实施例1～实施例4及比较例1～比较例4中通过诱导方法1进行，在实施例5中通过诱导方法2进行。在实施例6及实施例7中通过诱导方法3进行。
诱导方法1
将用DMEM(Life technologies,11960-044)稀释了120倍的Matrigel(注册商标)基底膜基质(Corning,356234)以1.5mL/孔添加到6孔板，并在4℃下静置。24小时之后，取代为以下无血清培养基(Serum-free medium)而使用。
无血清培养基的组成
Neurobasal(注册商标)medium(培养基)(50％,Life technologies,21103049)
DMEM(50％)
Penicillin(青霉素)/Streptomycin(链霉素)(×100)(1×,Life technologies,15140-122)
Sodium pyruvate(丙酮酸钠)(1mM,Life technologies,11360-070)
L-glutamine(谷氨酸钠)(292μg/mL,Life technologies,25030-081)
N2 Supplement with Transferrin(Apo)(含转铁蛋白(Apo)的N2补充剂)(1×,Wako,141-09041)N-acetyl cysteine(N-乙酰半胱氨酸)(5μg/mL,Sigma-Aldrich,A8199)
HBEGF(5ng/mL,Peprotech,100-47)
将iCell(注册商标)astrocytes悬浮于无血清培养基，以30x104cells/孔的密度对6孔板进行播种，并在37℃,5％CO2条件下培养了24小时。
将上述星形胶质细胞替换成将表1中所记载的化合物(TNFα(Cell SignalingTechnology,8902SC)、IFNγ(R&D Systems,285-IF)、IL-1α(Sigma-Aldrich,SRP3310)、IL-1β(R&D Systems,201-LB)、C1q(MyBioSource,MBS143105))中的2～5个添加到无血清培养基而成的培养基，并在37℃、5％CO2条件下培养了1天。
诱导方法2
将用DMEM(Life technologies,11960-044)稀释了120倍的Matrigel(注册商标)基底膜基质(Corning,356234)以65μL/孔添加到96孔板，并在4℃下静置。24小时之后，取代为与诱导方法1相同的无血清培养基而使用。
将iCell(注册商标)astrocytes悬浮于无血清培养基，以3x104cells/孔的密度对96孔板进行播种，并在37℃、5％CO2条件下下培养了24小时。
将上述星形胶质细胞替换成将表1中所述的化合物中的2个添加到无血清培养基而成的培养基，并在37℃、5％CO2条件下培养了1天。
诱导方法3
将用DMEM(Life technologies,11960-044)稀释了120倍的Matrigel(注册商标)基底膜基质(Corning,356234)以65μL/孔添加到96孔板，并在4℃下静置，且在24小时之后使用。
在实施例6中，将从市售的人星形胶质细胞前体细胞诱导的星形胶质细胞以3x104cells/孔的密度对96孔板进行播种，并在37℃、5％CO2条件下下培养了24小时，在实施例7中，将原代培养人星形胶质细胞以3x104cells/孔的密度对96孔板进行播种，并在37℃、5％CO2条件下下培养了24小时
将上述星形胶质细胞替换成添加表1所述的化合物中的2个而成的培养基，并在37℃、5％CO2条件下培养了1天。
免疫染色
在实施例6中，通过免疫染色进行了作为星形胶质细胞的标志的GFAP染色。对从通过诱导方法3诱导的人星形胶质细胞前体细胞诱导的星形胶质细胞以100μL/孔添加80％乙醇，并在-30℃下固定了24小时。用PBS清洗3次之后，添加对PBS添加1％的BSA而成的化合物(1％BSA)而封闭，在4℃下对将一次抗体(Millipore、MAB3402)在1％BSA中稀释了3000倍而成的细胞进行了24小时的处理。用PBS清洗3次之后，在室温下对将二次抗体(ThermoFisher Scientific、A11005)在1％BSA中稀释了1000倍而成的细胞进行了1小时的处理。用PBS清洗3次之后，使用IncuCyte S3(Essen BioScience、4647)进行拍摄而获得了图像。
[表1]
表1：(表中数值的单位为ng/mL)
TNFα IFNγ IL-1α IL-1β C1q
实施例1 7.5 5 0.75 2.5 100
实施例2 7.5 5 0.75 2.5
实施例3 7.5 5 0.75 100
实施例4 7.5 5 2.5 100
实施例5 7.5 5
实施例6 7.5 5
实施例7 7.5 5
比较例1 7.5 0.75 2.5 100
比较例2 5 0.75 2.5 100
比较例3 5 2.5
比较例4 7.5 0.75 100
(3)细胞的形态的评价
通过显微镜或拍摄图像对培养后的细胞的形态进行了观察。将结果示于图1、图2。并且，将从图1、图2对形态进行评价而得的结果示于下述表。形态的判定通过将典型的细胞选择10细胞/视角，并对长轴与短轴进行比较而进行。将长轴/短轴为10以下的细胞设为肥大型，将大于10且为纤维状形状的细胞设为纤维型，大将于10且具有多个突起的形状的细胞设为星形。长轴/短轴的评价结果的数值示于图1、图2。在图2的框中放大而示出的细胞为典型的星形(图左侧)、肥大型(图右侧)细胞。
[表2]
细胞的形态
实施例1 均为肥大型
实施例2 均为肥大型
实施例3 均为肥大型
实施例4 均为肥大型
实施例5 均为肥大型
实施例6 均为肥大型
比较例1 纤维型、星型
比较例2 纤维型、星型
比较例3 纤维型、星型
比较例4 纤维型、星型
从图1、图2及表2得知在实施例1～实施例6中，几乎所有的细胞表现出特征性肥大型形态的人A1星形胶质细胞。另一方面，得知当为比较例1～比较例4时，不存在表现出肥大型形态的细胞，或者极少。
(4)mRNA表达量的评价
通过定量PCR(Polymerase chain reaction：聚合酶链反应)测定了培养之后的细胞所表达的基因量。关于定量PCR，在实施例1～实施例4及比较例1～比较例4中通过定量PCR方法1进行，在实施例5～实施例7中通过定量PCR方法2进行。
定量PCR方法1
从诱导1天之后的细胞提取了Total RNA。按照包装说明书在Total RNA的提取中使用了RNeasy(注册商标)mini kit(Qiagen,74104)。按照包装说明书在Total RNA的反转印中使用了PrimeScript(注册商标)RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RealTime)(Takara Bio Inc.，RR047A)。定量PCR中按照添附的协议使用了TB Green Premix ExTaqII(Tli RNaseH Plus)(Takara Bio Inc.,RR820B)。循环程序中使用Mx3005P(Stratagene)以95℃30秒实施了1次循环，以95℃5秒、60℃30秒实施了45次循环。引物的序列如下。
GBP2正向引物：tttcaccctggaactggaag(序列号1)
反向引物：gacgaagcacttcctcttgg(序列号2)
CXCL10正向引物：ccacgtgttgagatcattgc(序列号3)
反向引物：cctctgtgtggtccatcctt(序列号4)
GAPDH
正向引物：gtcagtggtggacctgacct(序列号5)
反向引物：tgctgtagccaaattcgttg(序列号6)
定量PCR方法2
按照包装说明书使用FastLane cell Multiplex NR Kit(Qiagen,216513)而从诱导1天之后的细胞实施了mRNA的定量。引物及荧光探针通过Dual Label ed Probe(双重标记探针)设计套件(Takara Bio Inc.)进行了合成。循环程序中使用CFX384 Touch实时PCR分析系统(Bio-Rad)以50℃20分钟、95℃15分钟实施了1次循环，以94℃45秒、60℃75秒实施了45次循环。以下示出引物及荧光探针的序列。
C3探针：5’-(FAM)CACAGCGGCACAGTTCATCACGGCA(BHQ1)-3’
(序列号7)
正向引物：GCCTATTACAACCTGGAGGAAAG(序列号8)
反向引物：GTGACCTTGTCATCCGACTTTTG(序列号9)
CXCL10探针：5’-(Cyanine5)TCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCT(BHQ1)-3’(序列号10)
正向引物：GCCATTCTGATTTGCTGCCTTA(序列号11)
反向引物：ACAGGTTGATTACTAATGCTGATGC(序列号12)
GAPDH探针：5’-(HEX)CATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAA(BHQ1)-3’(序列号13)
正向引物：GAACCATGAGAAGTATGACAACAGC(序列号14)
反向引物：TGGGTGGCAGTGATGGCA(序列号15)
以GAPDH为内标，并通过ΔΔCt法(比较Ct法)对mRNA的表达量进行了定量。将结果示于图3、图4、图5及图6。
从图3得知在实施例1～实施例4中，GBP2及CXCL10均充分表达。另一方面，得知在比较例1～比较例4中，GBP2、CXCL10均几乎未表达，或者即使表达也比实施例少。从图4得知在实施例1及实施例5中C3的表达通过刺激而增加。从图5、图6得知在实施例6及实施例7中C3的表达通过刺激而增加。
试验例2：人A1星形胶质细胞与神经细胞的共培养
(1)针对细胞培养插入物的人星形胶质细胞的播种
人星形胶质细胞与试验例1相同而使用了iCell(注册商标)astrocytes。
将用DMEM稀释了120倍的matrigel(注册商标)以100μL/孔添加到细胞培养插入物(Corning,353104)，并在4℃下静置。24小时之后，替换为与诱导方法1相同的无血清培养基。将iCell(注册商标)astrocytes悬浮于无血清培养基，以5x104cells/孔的密度对细胞培养插入物进行播种，并在37℃、5％CO2条件下进行了培养。
24小时之后，替换成无血清培养基或对无血清培养基添加IL-1α(0.75ng/mL)、TNFα(7.5ng/mL)、C1q(100ng/mL)、IL-1β(2.5ng/mL)、IFNγ(5ng/mL)而成的培养基。
(2)针对培养板的神经细胞的播种
将用磷酸缓冲液(PBS)稀释了10倍的Poly-L-Lysine solution(聚-L-赖氨酸溶液)(Sigma aldrich,P4707)以500μL/孔添加到24孔板，并在室温下静置。24小时之后，将用PBS稀释了166倍的iMatrix-511(Nippi,892012)以500μL/孔添加到24孔板，并在37℃下孵化1小时之后，取代为无血清培养基。
按照WO2014/148646A1中所记载的方法，强制表达Neurogenin2，由此将iPS细胞分化成神经细胞。将所获得的神经细胞悬浮于无血清培养基，以10x104cells/孔的密度对24孔板进行播种，并在37℃、5％CO2条件下进行了培养。
(3)与神经细胞的共培养
将播种有人星形胶质细胞的细胞培养插入物和播种有神经细胞的培养板的培养基替换成无血清培养基或添加5个化合物而成的无血清培养基，并开始了合并共培养。作为对照，还同时开始了神经细胞的单独培养。在37℃、5％CO2条件下下培养5天之后，对神经细胞的状态进行了观察。将结果示于图7。
得知用无血清培养基替换的人星形胶质细胞对神经细胞起保护作用，与单独的神经细胞相比，经共培养的神经细胞的活细胞数多，且神经突起也牢固。另一方面，得知替换为添加有5个化合物的无血清培养基的人星形胶质细胞显示神经毒性，与替换为无血清培养基的星形胶质细胞共培养的神经细胞相比，经共培养的神经细胞的死细胞更多，且活细胞及神经突起减少。
(4)神经细胞死亡的定量评价
在共培养5天之后通过WST试验及活细胞数的计算而对活细胞进行了定量评价。使用Cell Counting Kit(细胞计算试剂盒)-8(DOJINDO LABORAT ORIES，CK04)对WST试验进行了评价。去除细胞培养插入物之后，对培养板添加各50μL的Cell Counting Kit溶液，并在37℃、5％CO2条件下进行了1～4小时的显色反应。之后，用酶标仪测定100μL的反应液在450nm及650nm的吸光度，并以从450nm的值减去650nm的值而得的值进行了定量。使用实施WST试验之后的样品并用Cellstain(注册商标)CytoRed solution(DOJI NDOLABORATORIES,C410)及IncuCyte(注册商标)S3(Essen BioScience，4647)对活细胞数进行了评价。对培养板添加各0.5μL的1mmol/L的CytoRed溶液，并在37℃、5％CO2条件下下进行30分～2小时的显色反应而对活细胞进行了染色。之后，使用IncuCyte(注册商标)S3计算出活细胞数。
将结果示于图8。
WST试验及活细胞数的定量结果，确认到与单独的神经细胞相比，与用无血清培养基替换的人星形胶质细胞共培养的神经细胞的活细胞更多。另一方面，确认到和与替换为无血清培养基的星形胶质细胞共培养的神经细胞相比，与替换成添加5个化合物而成的无血清培养基的人星形胶质细胞共培养的神经细胞的活细胞减少。
试验例3：各种人星形胶质细胞的神经障碍性
(1)从人星形胶质细胞前体细胞诱导的星形胶质细胞的播种
将用DMEM(Life technologies,11960-044)稀释了120倍的Matrigel(注册商标)基底膜基质(Corning,356234)以65μL/孔添加到96孔板，并在4℃下静置。24小时之后，以5x104cells/孔的密度对从市售的人星形胶质细胞前体细胞的诱导的星形胶质细胞进行了播种。
(A)无刺激、通过(B)TNFα(7.5ng/mL)、IFNγ(5ng/mL)刺激或通过(C)TNFα(7.5ng/mL)、IL-1α(0.75ng/mL)、C1q(100ng/mL)刺激，并在48小时之后将神经细胞进行了播种。
(2)针对培养板的神经细胞的播种
按照WO2014/148646A1中所记载的方法，强制表达Neurogenin2，由此将iPS细胞分化成神经细胞。将所获得的神经细胞以3x104cells/孔的密度在A1诱导之后的星形胶质细胞上进行播种，并在37℃、5％CO2条件下下培养了3天。
(3)免疫染色
对培养3天而成的细胞以100μL/孔添加80％乙醇，并在-30℃下固定了24小时。用PBS清洗3次之后，添加1％BSA而封闭，在4℃下对将一次抗体(covance、MRB-435P)在1％BSA中稀释了2000倍而成的细胞进行了24小时的处理。用PBS清洗3次之后，在室温下对将二次抗体(Thermo Fisher Scientific、A11008)在1％BSA中稀释了1000倍而成的细胞进行了1小时的处理。用PBS清洗3次之后，使用IncuCyte S3(Essen BioScience、4647)进行拍摄而获得了图像。将结果示于图9。
和分别与(A)无刺激的人星形胶质细胞、通过(B)刺激的人星形胶质细胞、通过(C)刺激的人星形胶质细胞共培养的神经细胞相比，确认到与(B)共培养的神经细胞的神经突起减少。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 人A1星形胶质细胞的制造方法、人A1星形胶质细胞及被测物质的评价方法
<130> 18F01625W1
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 1
tttcaccctg gaactggaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 2
gacgaagcac ttcctcttgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 3
ccacgtgttg agatcattgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 4
cctctgtgtg gtccatcctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 5
gtcagtggtg gacctgacct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 6
tgctgtagcc aaattcgttg 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 7
cacagcggca cagttcatca cggca 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 8
gcctattaca acctggagga aag 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 9
gtgaccttgt catccgactt ttg 23
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 10
tctgactcta agtggcattc aaggagtacc t 31
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 11
gccattctga tttgctgcct ta 22
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 12
acaggttgat tactaatgct gatgc 25
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 13
catcagcaat gcctcctgca ccaccaa 27
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 14
gaaccatgag aagtatgaca acagc 25
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 寡核苷酸
<400> 15
tgggtggcag tgatggca 18

Claims (12)

1.一种人A1星形胶质细胞的制造方法，其包括在TNFα及IFNγ的存在下培养除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞的工序a。
2.根据权利要求1所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其还在选自由IL-1α、IL-1β及C1q组成的组中的至少一个细胞因子和/或补体的存在下进行所述工序a。
3.根据权利要求1或2所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其在下述任一种的存在下进行所述工序a，
(1)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β；
(2)TNFα、IFNγ、IL-1α、C1q；
(3)TNFα、IFNγ、IL-1β、C1q；
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q；
(5)TNFα、IFNγ。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
所述工序a包括：
工序a1，使能够分化成人多能干细胞或人星形胶质细胞的细胞分化成除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞；及
工序a2，在TNFα及IFNγ的存在下培养在工序a1中获得的除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在所述工序a中培养的除了人A1星形胶质细胞以外的人星形胶质细胞为人A2星形胶质细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
所述工序a为无血清培养基中的培养。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在所述工序a中，TNFα在培养基中的浓度为0.01ng/mL～30ng/mL。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在所述工序a中，IFNγ在培养基中的浓度为0.1ng/mL～20ng/mL。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法，其中，
在所述工序a中，TNFα在培养基中的浓度与IFNγ在培养基中的浓度之比为100:1～1:100。
10.一种人A1星形胶质细胞，其为通过权利要求1至9中任一项所述的人A1星形胶质细胞的制造方法而获得的经分离的人A1星形胶质细胞。
11.一种被测物质的评价方法，其包括使权利要求10所述的人A1星形胶质细胞与被测物质接触。
12.根据权利要求11所述的被测物质的评价方法，其中，
在使权利要求10所述的人A1星形胶质细胞与被测物质接触之后，对所述人A1星形胶质细胞所具有的神经障碍性的变化进行评价。
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