CN116606810A - 白细胞介素-10在提高nk细胞杀伤活性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了白细胞介素‑10在提高NK细胞杀伤活性中的应用。本发明首次发现白细胞介素‑10(IL‑10)能够有效提高提高NK细胞杀伤活性，利用含有白细胞介素‑10的培养基培养NK细胞能够获得杀伤活性显著提高的NK细胞，为提高NK细胞杀伤活性提供新思路，利于NK细胞的广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及白细胞介素-10在提高NK细胞杀伤活性中的应用。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)是一种无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，是机体免疫系统的重要组成部分。NK细胞具有较广的抗瘤谱，NK细胞杀伤靶细胞的一个重要机制为：释放穿孔素和颗粒酶B引起靶细胞坏死或凋亡，NK细胞在体内接触到肿瘤细胞之后，通过胞吐将含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性物质释放，穿孔素通过聚合作用在靶细胞表面形成小孔，释放的颗粒酶B进入靶细胞，可通过多种不同途径激起细胞的死亡，如激起caspases的链锁反应，引起靶细胞DNA降解活动，然后裂解致使肿瘤细胞凋亡。
目前，对于NK细胞的进一步应用，NK细胞的杀伤活性依然有待提高。CN110438078A公开了一种党参炔醇体外促进NK细胞增殖、增强其杀伤活性的用途，发现，党参中的两种成分党参炔醇、党参苷Ⅰ对NK细胞的体外培养具有不完全相同的作用，党参炔醇可以显著促进NK细胞的体外增殖，也可以提高NK细胞杀伤活性，党参苷Ⅰ虽然不能明显促进NK细胞的体外增殖，但是可以显著提高NK细胞的杀伤活性，且党参炔醇、党参苷Ⅰ均不会影响NK细胞中CD3－CD56+细胞比例。CN114262685A公开了常山乙素用于提高NK细胞杀伤力的用途，基于细胞增殖实验、Western blot实验、ELISA实验和靶细胞杀伤实验，发现常山乙素在体外可以促进NK细胞增殖并提高其杀伤力。
综上所述，开发提高NK细胞杀伤活性的方法，对于NK细胞的应用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供白细胞介素-10在提高NK细胞杀伤活性中的应用，本发明首次发现白细胞介素-10能够有效提高提高NK细胞杀伤活性，利用含有白细胞介素-10的培养基培养NK细胞能够获得杀伤活性显著提高的NK细胞。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供白细胞介素-10在提高NK细胞杀伤活性中的应用。
本发明首次发现白细胞介素-10(IL-10)能够有效提高提高NK细胞杀伤活性，利用含有白细胞介素-10的培养基培养NK细胞能够获得杀伤活性显著提高的NK细胞。
白细胞介素-10(IL-10)一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是公认的炎症与免疫抑制因子。在肿瘤、感染、器官移植、造血系统及心血管系统中发挥重要作用，与血液、消化、尤其是心血管系统疾病密切相关。
优选地，所述白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL，包括但不限于2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、240ng/mL、280ng/mL、290ng/mL、292ng/mL、295ng/mL、298ng/mL或299ng/mL。
第二方面，本发明提供一种提高NK细胞杀伤活性的方法，所述方法包括：
将NK细胞置于含有白细胞介素-10的培养基中培养。
可以理解，本领域中通用的NK细胞培养基均适用于本发明，在其中添加IL-10即可。
优选地，所述培养基中白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL，包括但不限于2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、240ng/mL、280ng/mL、290ng/mL、292ng/mL、295ng/mL、298ng/mL或299ng/mL。
第三方面，白细胞介素-10在制备提高NK细胞杀伤活性产品中的应用。
优选地，所述白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL，包括但不限于2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、240ng/mL、280ng/mL、290ng/mL、292ng/mL、295ng/mL、298ng/mL或299ng/mL。
第四方面，本发明提供一种提高NK细胞杀伤活性的培养基，所述提高NK细胞杀伤活性的培养基中含有白细胞介素-10。
优选地，所述提高NK细胞杀伤活性的培养基中白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL，包括但不限于2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、180ng/mL、240ng/mL、280ng/mL、290ng/mL、292ng/mL、295ng/mL、298ng/mL或299ng/mL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现白细胞介素-10(IL-10)能够有效提高提高NK细胞杀伤活性，利用含有白细胞介素-10的培养基培养NK细胞能够获得杀伤活性显著提高的NK细胞，为提高NK细胞杀伤活性提供新思路，利于NK细胞的广泛应用。
附图说明
图1为不同IL10浓度条件下，PB-NK杀伤HepG2细胞的结果图；
图2为不同IL10浓度条件下，iNK杀伤HepG2细胞的结果图；
图3为不同IL10浓度条件下，PB-NK杀伤K562细胞的结果图；
图4为不同IL10浓度条件下，iNK杀伤K562细胞的结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明具体实施例中以HepG2细胞/K562细胞为例验证NK细胞(iNK/PB-NK)杀伤活性的变化。
实施例1
本实施例提供一种提高NK细胞杀伤活性的方法并分析杀伤活性。
从人外周血分离出外周血单个核细胞(PBMC)，使用IL-2、K562-APC细胞(K562细胞转导进4-1BBL、IL-15、IL-21基因)共培养刺激PB-NK细胞扩增，将3万个外周血来源的PB-NK细胞与3万个带有荧光素酶报告基因的HepG2细胞混合，等量取8组，分别用添加20ng/mLIL-2和20ng/mL IL-15的基础培养基(MEMa(Gibco,32571036)含胎牛血清FBS(Gibco，10099148)，)及添加20ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15和不同浓度的IL-10(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL)的基础培养基(MEMa含胎牛血清FBS)重悬细胞，接种到酶标板上3个孔中，培养48小时后加入底物，用酶标板进行化学发光检测，计算杀伤效率，具体计算方法为：以不加PB-NK细胞的，仅含靶细胞的孔作为参照孔，其荧光值为原始肿瘤细胞数的总荧光值，根据各组不同效靶比的PB-NK细胞杀伤后所剩肿瘤荧光值为剩余荧光值，其杀伤效率计算公式如下：杀伤效率(％)＝(总荧光值-剩余荧光值)/总荧光值×100％，结果如图1所示，使用添加IL-10的培养基培养后，能够显著提高PB-NK细胞的杀伤活性。
实施例2
本实施例提供一种提高NK细胞杀伤活性的方法并分析杀伤活性。
使用因子hVEGF、SB431542、BMP4、Flt-3L、SCF和IL-3诱导人多能干细胞产生HPC，把HPC转移到OP9-DLL4饲养层细胞上并添加因子Flt-3L、SCF、IL-7、IL-3和IL-15诱导HPC产生iNK细胞。将3万个体外分化得到的iNK细胞与3万个带有荧光素酶报告基因的HepG2细胞混合，等量取8组，分别用添加20ng/mL IL-2和20ng/mL IL-15的基础培养基(MEMa(Gibco,32571036)含胎牛血清FBS(Gibco，10099148)，)及添加20ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15和不同浓度的IL-10(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL)的基础培养基(MEMa含胎牛血清FBS)重悬细胞，接种到酶标板上3个孔中，培养48小时后加入底物，用酶标板进行化学发光检测，计算杀伤效率，具体计算方法为：以不加iNK细胞的，仅含靶细胞的孔作为参照孔，其荧光值为原始肿瘤细胞数的总荧光值，根据各组不同效靶比的iNK细胞杀伤后所剩肿瘤荧光值为剩余荧光值，其杀伤效率计算公式如下：杀伤效率(％)＝(总荧光值-剩余荧光值)/总荧光值×100％，结果如图2所示，使用添加IL-10的培养基培养后，能够显著提高iNK细胞的杀伤活性。
实施例3
本实施例提供一种提高NK细胞杀伤活性的方法并分析杀伤活性。
从人外周血分离出外周血单个核细胞(PBMC)，使用IL-2、K562-APC细胞(K562细胞转导进4-1BBL、IL-15、IL-21基因)共培养刺激PB-NK细胞扩增。将3万个外周血来源的PB-NK细胞与3万个带有荧光素酶报告基因的K562细胞混合，等量取8组，分别用添加20ng/mL IL-2和20ng/mL IL-15的基础培养基(MEMa(Gibco,32571036)含胎牛血清FBS(Gibco，10099148)，)及添加20ng/mLIL-2、20ng/mLIL-15和不同浓度的IL-10(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL)的基础培养基(MEMa含胎牛血清FBS)重悬细胞，接种到酶标板上3个孔中，培养48小时后加入底物，用酶标板进行化学发光检测，计算杀伤效率，具体计算方法为：以不加PB-NK细胞的，仅含靶细胞的孔作为参照孔，其荧光值为原始肿瘤细胞数的总荧光值，根据各组不同效靶比的PB-NK细胞杀伤后所剩肿瘤荧光值为剩余荧光值，其杀伤效率计算公式如下：杀伤效率(％)＝(总荧光值-剩余荧光值)/总荧光值×100％，结果如图3所示，使用添加IL-10的培养基培养后，能够显著提高PB-NK细胞的杀伤活性。
实施例4
本实施例提供一种提高NK细胞杀伤活性的方法并分析杀伤活性。
使用因子hVEGF、SB431542、BMP4、Flt-3L、SCF和IL-3诱导人多能干细胞产生HPC，把HPC转移到OP9-DLL4饲养层细胞上并添加因子Flt-3L、SCF、IL-7、IL-3和IL-15诱导HPC产生iNK细胞。将3万个体外分化得到的iNK细胞与3万个带有荧光素酶报告基因的K562细胞混合，等量取8组，分别用添加20ng/mL IL-2和20ng/mL IL-15的基础培养基(MEMa(Gibco,32571036)含胎牛血清FBS(Gibco，10099148)，)及添加20ng/mL IL-2、20ng/mL IL-15和不同浓度的IL-10(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL)的基础培养基(MEMa含胎牛血清FBS)重悬细胞，接种到酶标板上3个孔中，培养48小时后加入底物，用酶标板进行化学发光检测，计算杀伤效率，具体计算方法为：以不加iNK细胞的，仅含靶细胞的孔作为参照孔，其荧光值为原始肿瘤细胞数的总荧光值，根据各组不同效靶比的iNK细胞杀伤后所剩肿瘤荧光值为剩余荧光值，其杀伤效率计算公式如下：杀伤效率(％)＝(总荧光值-剩余荧光值)/总荧光值×100％，结果如图4所示，使用添加IL-10的培养基培养后，能够显著提高iNK细胞的杀伤活性。
综上所述，本发明首次发现白细胞介素-10(IL-10)能够有效提高提高NK细胞杀伤活性，利用含有白细胞介素-10的培养基培养NK细胞能够获得杀伤活性显著提高的NK细胞，为提高NK细胞杀伤活性提供新思路，利于NK细胞的广泛应用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (8)
1.白细胞介素-10在提高NK细胞杀伤活性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL。
3.一种提高NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
将NK细胞置于含有白细胞介素-10的培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的提高NK细胞杀伤活性的方法，其特征在于，所述培养基中白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL。
5.白细胞介素-10在制备提高NK细胞杀伤活性产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL。
7.一种提高NK细胞杀伤活性的培养基，其特征在于，所述提高NK细胞杀伤活性的培养基中含有白细胞介素-10。
8.根据权利要求7所述的提高NK细胞杀伤活性的培养基，其特征在于，所述提高NK细胞杀伤活性的培养基中白细胞介素-10的浓度为1～300ng/mL。
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