JP2003501081A - 幹細胞の増殖工程 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、幹細胞（特にヒト幹細胞の１つ）の細胞分裂を可能にしながら、それらの未分化状態を維持するための制御された手法による細胞発育の阻害物質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、幹細胞の増殖工程に関する。本発明は、詳細には前記幹細胞の急速
な増殖及び未分化状態での維持を同時に可能にする工程に関する。

【０００２】 幹細胞（詳細には造血幹細胞）を未分化状態に維持させ、そして／又はそれら
を増殖させる現行の培養は、細胞が非常に緩やかに分裂する長期培養である。よ
り詳細には、例えば幹細胞（詳細には造血幹細胞）の自己再生（同一細胞へ増殖
）を可能にする培養は、単に骨髄間質での培養、又は骨髄間質の非存在下での緩
やかな増殖による培養である。

【０００３】 より詳細な骨髄間質での長期培養に関しては、幹細胞（詳細には造血幹細胞）が
骨髄間質で発育し、それにより微量のサイトカインしか使用させないが、前駆細
胞と成熟造血細胞及び間質細胞との混合物の存在下で細胞の緩やかな分裂（及び
それによる細胞の緩やかな増殖）を引き起こすデクスター型（Dexter type）の
培養が挙げられる。

【０００４】 その上、マウスとは異なりヒトでは、幹細胞が長期間間質に維持されない。

【０００５】 骨髄間質の非存在下での長期培養に関しては、ピアシベロ培養系（Piacibello
culture system）が挙げられる。この培養系（Piacibello et al, 1997 Blood
）では、造血幹細胞を含有するＣＤ３４＋細胞が２０，０００細胞／mlの量で播
種され、毎週培養物の半分が除去されて、新鮮な培地に交換される。２週間後か
ら数ヶ月間、週に１回の割合で細胞数が倍増する。Piacibello培養での最初の２
週間は、ＣＤ３４＋細胞の高い損失があり、２％未満で安定する。

【０００６】 それ故、現行の培養は、臨床上又は生物工学上の目的で未分化性及び多分化性
を維持する幹細胞の産生とはあまり適合性がない。

【０００７】 加えて、十分な連続自己再生を可能にする幹細胞の分化の阻害物質は、今日ま
で知られていない。

【０００８】 本発明の主な目的の１つは、ヒト幹細胞に未分化状態を急速且つ有意な量で得
させる幹細胞の培養工程を提供することである。

【０００９】 本発明の目的の１つは、骨髄間質を用いず、培養容量を減少させる、幹細胞の
急速な培養工程を提供することである。

【００１０】 本発明の別の目的の１つは、組織及び移植臓器を再生させるための、この方法
で得られた幹細胞の使用である。

【００１１】 本発明は、幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）の細胞分裂を可能にしながら、それ
らの未分化状態を維持するための制御された手法による細胞発育の阻害物質の使
用に関する。

【００１２】 本発明は、「ある条件下では細胞発育の阻害物質が幹細胞の細胞分化の阻害物
質ともなり得る」という本発明者によりなされた発見から発している。これに関
して、幹細胞（詳細には造血幹細胞又は原始造血前駆細胞）の細胞発育の阻害物
質としてこれまでに公知のＴＧＦ−β（形質転換成長因子）が細胞分化の阻害物
質であることが、本発明により見出されている。

【００１３】 表現「細胞発育の阻害物質」は、細胞増殖及び／又は細胞成長（cell growth
）及び／又は細胞分化を阻害するいずれの物質も同時に包含する。

【００１４】 表現「細胞増殖の阻害物質」も、細胞分裂の阻害物質又は細胞周期の阻害物質
を意味する。

【００１５】 表現「制御された手法による細胞発育の阻害物質の使用」は、細胞発育の阻害
物質が、 ａ）所望なら、細胞分裂の途中又は終了時に幹細胞の未分化状態を維持しながら
、前記幹細胞の細胞分裂を可能にするため、あるいは ｂ）必要ならば、前記幹細胞の細胞分化を阻害するために幹細胞の細胞発育の阻
害を可能にするため、の改良可能な手法で用いられることを意味する。

【００１６】 表現「制御された手法による細胞発育の阻害物質の使用」は、換言すれば、分
化を防ぐ制御された条件下で分裂するために、その幹細胞がそれらの休止状態か
ら脱出されるような条件で、細胞発育の阻害物質が用いられ得ることを意味する
。

【００１７】 表現「幹細胞」は、未熟細胞又は分化されていない（又は未分化）細胞、又は
原始細胞、又は多能性細胞、又は多分化細胞を意味する。

【００１８】 本発明により有利に用いられる幹細胞は、体性幹細胞を起源とする胚性幹細胞
、並びに／あるいは血液及び／又は（皮膚、肝臓、膵臓、心臓、腎臓、骨、若し
くは神経組織のような）種々の固体組織を起源とする幹細胞／体性前駆細胞自身
からなる群から選択されたヒト幹細胞である。

【００１９】 表現「体性幹細胞を起源とする胚性幹細胞」は、例えば体性幹細胞のいずれか
１つを産生し得る細胞と定義される。

【００２０】 表現「体性幹細胞」は、例えば特定の組織を産生し得る細胞と定義される。

【００２１】 本発明による幹細胞は、詳細にはヒト造血体性幹細胞であり、原始造血前駆細
胞（primitive hematopoietic progenitor）とも呼ばれる。

【００２２】 有利な実施態様によると、本発明により有利に用いられる細胞発育の阻害物質
は、細胞分化及び／又は細胞分裂に関して細胞発育を制御する遺伝子の産物、サ
イクリン依存性キナーゼの阻害物質、アポトーシス又は加齢を制御する因子、並
びに（インターフェロン及びＴＧＦ−βのような）サイトカインからなる群から
選択される。用語「サイトカイン」は、成長因子がある条件下で成長阻害物質と
しても作用し得る場合でも、その成長因子全てを意味する。

【００２３】 細胞分化及び／又は細胞分裂に関して細胞発育を制御する遺伝子の産物として
は、詳細には成長因子、サイトカイン、及び分化、加齢、又はアポトーシスを制
御する遺伝子の産物が挙げられる。

【００２４】 サイクリン依存性キナーゼの阻害物質としては、詳細には網膜芽細胞腫遺伝子
、並びにＰ１５、Ｐ１６、Ｐ２１、及びＰ２７遺伝子が挙げられる。

【００２５】 網膜芽細胞腫遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子（抗腫瘍遺伝子）である。

【００２６】 Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ２１、及びＰ２７遺伝子は、細胞周期を阻害する。

【００２７】 アポトーシスを制御する因子としては、詳細にはｂｃｌ−２、ｂａｘ、及びｆ
ａｓ遺伝子が挙げられる。

【００２８】 加齢を制御する因子としては、詳細にはテロメラーゼが挙げられる。

【００２９】 細胞発育の阻害物質となり得るサイトカインとしては、詳細にはインターフェ
ロン（詳細にはＴＧＦ−β）が挙げられる。

【００３０】 有利な実施態様によると、本発明は、幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）の未分化
状態を維持しながら、１〜約１００（詳細には１〜約１０）の範囲の複数の細胞
分裂を開始する、詳細には１回の細胞分裂を開始する細胞増殖の抗阻害物質との
逐次配合における、上記定義のような細胞発育の阻害物質の使用に関する。

【００３１】 表現「逐次配合」は、細胞増殖の抗阻害物質が、細胞発育の阻害物質と同時に用
いられないことを意味する。

【００３２】 有利な実施態様によると、本発明は、培地中の幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）
の増殖工程に関し、それが： −休止状態の幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、その細胞により産生され、そし
て／又は培地中に存在する細胞発育の阻害物質（詳細には細胞増殖の阻害物質）
の影響の中和により、それらの休止状態から脱出され、それにより１〜約１００
（詳細には１〜約１０）の範囲の複数の細胞分裂（詳細には１回の細胞分裂）の
開始がある段階、 −及び先行の段階で得られた幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、細胞発育の阻害
物質の援助によりそれらの分化を阻害される段階、を含むことを特徴とする。

【００３３】 本発明は、培地中の幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）の増殖工程にも関し、それ
が： −分裂の状態の幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、細胞発育の阻害物質の援助に
より分化の状態に入るのを防がれることによる段階、 −及び先行の段階で得られた幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、細胞発育の阻害
物質（詳細には細胞増殖の阻害物質）の影響の中和により分裂の状態に復帰し、
それにより１〜約１００（詳細には１〜約１０）の範囲の複数の細胞分裂（詳細
には１回の細胞分裂）の開始があることによる段階、を含むことを特徴とする。

【００３４】 本発明による増殖工程は、前記工程の途中及び終了時に、この方法で増殖され
た幹細胞が未分化状態に維持されていることを特徴とする。

【００３５】 本発明によると、表現「増殖された幹細胞」は、表現「増幅された幹細胞」と
同じ意味を有する。その上、表現「増殖工程」は、表現「増幅工程」と同じ意味
を有する。

【００３６】 細胞の休止状態は、細胞が分化及び分裂していないことを意味する。

【００３７】 有利な実施態様によると、本発明の増殖工程により増殖された幹細胞は、体性
幹細胞を起源とする胚性幹細胞、並びに血液及び／又は（皮膚、肝臓、膵臓、心
臓、腎臓、骨、若しくは神経組織のような）種々の固体組織を起源とする体性細
胞自身からなる群から選択されたヒト幹細胞である。

【００３８】 本発明による増殖工程は、その幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、約１〜約１
０¹⁰細胞／mlの細胞濃度、詳細には約１０³〜約１０¹⁰細胞／ml、より詳細には
約１０⁴〜約１０⁹細胞／mlの範囲の濃度で存在することを特徴とする。

【００３９】 本発明がヒト細胞及び動物細胞の両者に適用されることは、指摘されるべきで
ある。

【００４０】 本発明の増殖工程において、細胞発育の阻害物質は、幹細胞（詳細にはヒト幹
細胞）により合成され、そして／又は幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）を含有する
培地に添加される。

【００４１】 細胞発育の前記阻害物質は、幹細胞により合成され、そして／又は： （ａ）最初の細胞分裂の前、及び （ｂ）（前記細胞が事前に分裂状態にある場合には）分裂周期の途中又は終了時
、に培地に添加される。

【００４２】 細胞発育の阻害物質が幹細胞により合成される場合、それは分泌されても、ま
たは分泌されなくてもよい。

【００４３】 幹細胞により合成された、又は培地に添加された細胞発育の阻害物質の量は、
（ａ）最初の細胞分裂前の休止状態に維持されるため、そして（ｂ）それらが事
前に分裂状態にある場合には休止状態に入れられるために十分でなければならな
い。

【００４４】 幹細胞により合成される細胞発育の阻害物質の量は、培地中に０．０１pg〜１
mg/ml、詳細には０．１pg〜１０ng/mlまで様々であってもよい。

【００４５】 その培地に添加される細胞発育の阻害物質の量は、培地中に０．１pg〜１mg/m
l、詳細には１pg〜１０ng/mlまで様々であってもよい。

【００４６】 有利な実施態様によると、本発明による増殖工程は、細胞発育の阻害物質が、
細胞分化及び／又は細胞分裂に関して細胞発育を制御する遺伝子産物、サイクリ
ン依存性キナーゼの阻害物質、アポトーシス又は加齢を制御する因子、並びに（
インターフェロン及びＴＧＦ−βのような）サイトカインからなる群から選択さ
れることを特徴とする。

【００４７】 細胞分化及び／又は細胞分裂に関して細胞発育を制御する遺伝子の産物、サイ
クリン依存性キナーゼの阻害物質、アポトーシス又は加齢を制御する因子、並び
にサイトカインは、詳細には上記のものである。

【００４８】 有利な実施態様によると、細胞発育の阻害物質は、幹細胞を含有する培地に低
濃度（詳細には約１０^-10mg/ml〜１mg/mlの範囲の濃度）で存在する。 本発明による増殖工程は、培地中に存在する細胞発育の阻害物質（詳細には細
胞増殖の阻害物質）の影響の中和が、 −細胞増殖の抗阻害物質の培地への添加、及び／又は −細胞発育の阻害物質（詳細には細胞増殖の阻害物質）の培地からの回収、によ
り実行されることを特徴とする。

【００４９】 細胞発育の阻害物質の影響の中和は、幹細胞を休止状態から離脱させ、少なく
とも１回の分裂を開始させる。

【００５０】 好ましくは、細胞発育の阻害物質が幹細胞により分泌されることなく合成され
る場合には、前記阻害物質の影響は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような
細胞へ浸透し得る細胞増殖の抗阻害物質の培地への添加により中和される。

【００５１】 しかし、細胞発育の阻害物質が幹細胞により分泌される場合、又は前記阻害物
質が培地に添加される場合には、前記阻害物質の影響は、細胞増殖の抗阻害物質
の培地への添加、又は細胞発育の阻害物質の培地からの回収、のいずれかにより
中和される。

【００５２】 培地からの細胞発育の阻害物質の回収は、詳細には遮断抗体の援助により、又
は前記阻害物質を中和するための洗浄により実行され得る。

【００５３】 幹細胞を含有する培地から回収される細胞発育の阻害物質の量は、１〜約１０
０、詳細には１〜約１０の範囲の複数の細胞分裂、より詳細には１回の細胞分裂
の開始があるために十分でなければならない。

【００５４】 培地から回収される細胞発育の阻害物質の量は、０．０１pg〜１ng/ml、詳細
には０．１pg〜１０ng/mlまで様々である。

【００５５】 培地から回収される細胞発育の阻害物質は、詳細には発育遺伝子の発現を遮断
するサイトカイン及びアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群に属する。

【００５６】 幹細胞を含有する培地に添加される細胞増殖の抗阻害物質の量は、１〜約１０
０、詳細には１〜約１０の範囲の複数の細胞分裂、より詳細には１回の細胞分裂
の開始があるために十分でなければならない。

【００５７】 培地に添加される細胞増殖の抗阻害物質の量は、遮断抗体０．１μg〜１０mg/
ml、又は培地中のアンチセンスオリゴヌクレオチド０．０１μM〜１mM、詳細に
は遮断抗体１μg〜１００μg/ml、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド０．１
μM〜１００μMまで様々である。

【００５８】 細胞増殖の抗阻害物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は遮断抗体から
なる群から選択され、詳細には抗ＴＧＦ−βである。

【００５９】 有利な実施態様によると、本発明による増殖工程は、細胞増殖の抗阻害物質が
、約１０^-18〜約１０^-3g/ml、詳細には０．１〜２０μg/ml、詳細には４・１０^{- 6} g/ml（４μg/ml）の範囲の濃度で存在することを特徴とする。

【００６０】 幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）の増殖のための本発明による工程は、未分化状
態に維持された十分な数の幹細胞を得るために、１〜１００周期、詳細には５〜
２０周期、詳細には１０周期の分裂周期総数を含むことを特徴とする。

【００６１】 有利な実施態様によると、本発明による増殖工程の休止状態全ての合計期間は
、１時間〜３年、詳細には２０時間〜２００時間まで様々であり、本発明による
増殖工程の分裂周期全ての合計期間は、１０時間〜３年、詳細には２０時間〜２
００時間まで様々である。

【００６２】 有利な実施態様によると、本発明による増殖工程は、１つの休止状態の期間が
、約１時間〜３年の範囲で、詳細には約６時間〜７２時間であること、そして１
つの分裂周期の期間が、約６時間〜３年の範囲で、詳細には６時間〜２４時間で
あることを特徴とする。

【００６３】 休止及び分裂の状態全てを含む本発明による増殖工程の合計期間は、１日〜３
年の範囲で、詳細には１日〜１５日である。

【００６４】 有利な実施態様によると、増殖工程の休止及び分裂の周期全てを合わせると１
〜１５日継続し、提案される適用例は細胞療法である。

【００６５】 別の実施態様によると、増殖工程の休止及び分裂の周期全てを合わせると１〜
３年継続し、提案される適用例は実験的指図のものである。

【００６６】 ３年継続する工程は、例えば老化を研究するための長期間の実験を可能にする
。

【００６７】 有利な実施態様によると、幹細胞（詳細にはヒト体性幹細胞）の増殖のための
本発明による工程は、約２〜約１０¹²、詳細には２〜約１０⁴の因子による幹細
胞の増幅を得させる。

【００６８】 本発明による増殖工程は、こうして初期の未分化幹細胞数よりも２〜１０¹²倍
高い、増幅され未分化状態に維持された多数の幹細胞を得させる。

【００６９】 有利な実施態様によると、本発明による増幅工程の培地は、造血幹細胞を含有
し、インターロイキン及びＣＳＦからなる群から選択された（培地に添加された
）１種以上のサイトカイン（前記サイトカインは、約１０^-8μg/ml〜約１mg/ml
、詳細には約１０^-5μg/ml〜約０．１μg/mlの範囲の濃度で存在する）、及び適
当ならば別の成長因子を含む。

【００７０】 その培地に添加し得るサイトカインとしては、詳細にはＩＬ１〜ＩＬ１６のよ
うなインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球及び単球コロニー刺激因子）、Ｇ
ＣＳＦ（顆粒球コロニー−刺激因子）、ＭＣＳＦ（単球コロニー刺激因子）のよ
うなＣＳＦ（コロニー刺激因子）、ＳＦ（Ｓｔｅｅｌ因子）、ＴＰＯ（トロンボ
ポエチン）、又はＦＬ（Ｆｌｔ−３リガンド）が挙げられる。

【００７１】 インターロイキン及びＣＳＦ以外の成長因子を用いてもよい。

【００７２】 幹細胞（詳細にはヒト体性幹細胞）の増殖のための本発明による工程は、より
詳細には以下の段階： ａ）未分化胚性又は体性幹細胞（詳細には造血体性幹細胞）が最初の細胞分裂の
開始により休止状態を離脱するような、１種以上のサイトカインの存在下での、
高い開始細胞濃度（詳細には約１０³〜約１０¹⁰細胞／mlの範囲の濃度）の休止
状態の前記未分化幹細胞を播種することによる、そして培地中に存在する細胞発
育の阻害物質（詳細には細胞増殖の阻害物質）の影響の中和による、培地中の前
述の細胞の分裂の第１周期の開始、 ｂ）未分化胚性又は体性幹細胞により合成された、又は培地に添加された細胞発
育の阻害物質の援助による、先行の段階で得られた前記幹細胞の休止への復帰、
ｃ）適当ならば、培地中に存在し得る異化産物及び細胞発育の阻害物質（詳細に
は細胞増殖の阻害物質）を除去するための、先行の段階で得られた未分化胚性又
は体性幹細胞の洗浄、 ｄ）適当ならば、約１００〜１０¹⁰細胞／mlの範囲の最適な細胞濃度を維持する
ための、先行の段階で得られた未分化胚性又は体性幹細胞の希釈、 ｅ）細胞の増幅因子が、約１日〜３年、詳細には１日〜１５日の増殖工程の合計
期間に対応する所望の幹細胞の数（詳細には初期未分化胚性又は体性幹細胞の数
の２倍〜約１０¹²倍）を得るために十分となるまでの上記分裂及び休止サイクル
の連続反復、 ｆ）インビトロで未分化胚性又は体性幹細胞を保存する、それらを使用する、又
はそれらを分化させるためのそれらの増殖の停止、を含むことを特徴とする。

【００７３】 幹細胞の増殖のための本発明による工程の種々の段階の方法は、既に上に記載
されたものである。

【００７４】 培地に添加された細胞増殖の抗阻害物質の量、又は幹細胞を含有する培地から
回収された細胞発育の阻害物質の量は、こうして最初の細胞分裂の開始があるた
めに十分でなければならない。

【００７５】 好ましい実施態様によると、細胞発育の阻害物質は、ＴＧＦ−βであり、ＴＧ
Ｆ−βは、造血体性幹細胞自身により０．０１pg〜１ng/mlの範囲の量で合成さ
れる。

【００７６】 ＴＧＦ−βは、その後細胞増殖の抗阻害物質（抗ＴＧＦ−β）の培地への添加
により中和される。抗ＴＧＦ−βは、０．１〜１００μg/mlの範囲の量の抗体、
又は０．１μM〜１０μMの範囲の量のオリゴヌクレオチドを添加される。

【００７７】 （詳細には上記段階（ｂ）に記載された）造血体性幹細胞の休止への復帰は、
前記幹細胞自身により合成されたＴＧＦ−β（又はそれ以外の添加された阻害物
質）により得られる。

【００７８】 上記洗浄段階（ｃ）は、詳細には次の分裂を可能にするために先行の分裂周期
の途中又は終了時に形成された阻害物質ＴＧＦ−βの中和を可能にする。

【００７９】 最適な細胞濃度を維持する上記希釈段階（ｄ）は、同時に： −細胞発育の阻害物質（詳細にはＴＧＦ−β）の前記細胞での急速な合成による
、幹細胞の休止状態への急速な復帰、 −細胞増殖の抗阻害物質（詳細には抗ＴＧＦ−β）の存在下での、各休止状態の
後の幹細胞の実に急速な分裂、を可能にする。

【００８０】 ＴＧＦ−βは、増殖工程全体を通して（即ち種々の急速及び分裂周期の途中及
び終了時に）幹細胞の分化の工程を減速させる

【００８１】 上記停止段階（ｆ）は、この方法で増殖された前記幹細胞を洗浄すること、そ
れらを凍結すること、又はそれらを分化の培地に入れることにより実行され得る
。

【００８２】 本発明の工程によるこのように増殖され未分化状態に維持された幹細胞が入れ
られる分化の培地は、再生を意図する組織又は器官により選択される。

【００８３】 例えば、その意図が赤血球細胞を得ることであるなら、エリトロポエチン（Ｅ
ＰＯ）を含む培地を用いる。

【００８４】 本発明による増殖の工程は、幹細胞の有意な産生を得させ、前記幹細胞は、前
記工程の種々の休止及び分裂周期の途中で、未分化状態に維持される。未熟細胞
の有意な産生は、この方法で少ない容量で得られる。

【００８５】 本発明は、ヒト血液及び／又はヒト固体組織若しくは臓器を再生するために上
記発明の工程により得られるような未分化及び増幅されたヒト幹細胞の使用に関
する。

【００８６】 本発明の工程により得られるような未分化及び増幅されたヒト幹細胞は、こう
してさい帯、骨髄、又は末梢血からの不十分な血液試料を増幅させるため、又は
造血幹細胞の移植のために用いることができる。

【００８７】 本発明の工程により得られるような未分化及び増幅されたヒト幹細胞は、ヒト
ゲノム（ヒト発育の遺伝子の発現及び機能）に関する研究に用いることができる
。

【００８８】 図の凡例 細胞膜に自身を付着させるＰＫＨ２６株は、細胞が実行した分裂回数を測定さ
せる（細胞が倍増した後、その株の強度を２で割り、４倍に増加した後は４で割
るなど）。こうして、正しく置き換えられた種々の集団が得られた。

【００８９】 ＴＧＦ−βのない培養条件下（２０，０００細胞／ml）では（図１Ａ）、細胞
は分裂し、３日後には２回以上分裂した細胞は、ＣＤ３４^+high細胞を１．１％
しか含有しなかった。

【００９０】 本発明による培養条件下では、ＴＧＦ−βの濃度がより高い（ＴＧＦ−β ３
０pg／ml）ため（図１Ｂ）、より高い割合のＣＤ３４^+high細胞が観察された。

【００９１】

【実施例】

実施例：造血幹細胞の増殖工程

【００９２】 材料及び工程 以下の実施例に用いた幹細胞は、より詳細にはさい帯血を起源とするヒト造血
体性幹細胞であり、膜マーカーＣＤ３４＋を特徴とする。以下では、前記細胞を
「ＣＤ３４＋細胞」と呼ぶ。

【００９３】 １）ＣＤ３４＋細胞の標識 ＣＤ３４＋細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／ＢＳＡ（ウシ血清アルブ
ミン）（０．２％）で希釈して、ＦＩＴＣ（フルオロイソチオシアネート）でコ
ンジュゲートした抗ＣＤ３４＋抗体（８Ｇ１２クローン；Becton Dickinson, Sa
n José, CA）と共に４℃で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ／
ＢＳＡで２回洗浄した。対照は、ＦＩＴＣでコンジュゲートした非特異性ＩｇＧ
１と共にインキュベートした細胞からなった。 細胞の増殖をモニタリングさせる株を検出するために、ＣＤ３４＋をメーカー
の使用説明書に従ってＰＫＨ２６株（Sigma, France）で標識した。 ＰＫＨ２６の平均強度を備えた細胞を、完全な幅の約１０％を示す窓（window
）でスクリーニングした。これは、ＣＤ３４＋細胞の約２０％に対応した。４０
０細胞の４等分したものを、ＨＰＰ−Ｑ試験に用いた。休止細胞及び増殖する細
胞の残りをスクリーニングして、半固型培地で培養した。校正ビーズ（calibrat
ed beads）（Coulter-Beckman）を用いて、０日目〜３日目の分析値を標準化し
た。 ＨＰＰ−Ｑ試験の説明（高度増殖性潜在的静止細胞（high proliferative pot
ential-quiescent cell）） ＨＰＰ−Ｑ試験は、細胞発育の阻害物質（詳細にはＴＧＦ−β）が幹細胞（詳
細には造血幹細胞）を維持していることを検証させた。 詳細には、ＨＰＰ−Ｑ試験は、幹細胞（詳細には造血幹細胞）の成熟度の測定
からなり、以下の： −幹細胞（詳細には造血幹細胞）の初回回収物を、それらの培養に適した、約１
４〜約２８日間（好ましくは１８日間）ＴＧＦ−βのような少なくとも１種の細
胞発育の阻害物質を遮断する手段を全く含有しない培地で培養する段階、 −上述のものと同じ性質及び同じ成熟度の幹細胞（詳細には造血幹細胞）の２回
目回収物を、少なくとも１種の細胞発育の阻害物質のための、効果的濃度の培地
に存在する遮断の手段を含む適切な培地で培養する段階、 −幹細胞の２つの回収物それぞれの培養開始後１８日目に、２回目回収物及び初
回回収物それぞれのコロニー数及び性質、並びに高度増殖能のコロニー（ＨＨＰ
−ＣＦＣ＝高度増殖能のコロニーを形成する前駆細胞、ＨＰＰ−ＭＥＧ＝高度増
殖能の巨核球前駆細胞、ＨＰＰ−ＧＥＭＭ＝高度増殖能の顆粒球赤血球単球巨核
球前駆細胞）の総数の差を比較する段階、を含むことを特徴とした。 幹細胞の成熟又は未熟の評価は、以下の観察に対応した。 １８日後に、コロニーの数及び性質を顕微鏡下で観察した：赤線及び１種以上
の白線の細胞で作られた混合コロニーの数を計数した。培養した細胞集団が未熟
で（即ち幼若な細胞で作られ）、その一部が休止している場合、混合コロニーの
数はより高かった。一方で、コロニーを生成した細胞が未熟なほど（又は休止し
ていれば）増殖能がより高く、それ故この細胞を起源とするコロニーが一旦活性
化すると、より大きなサイズになる。

【００９４】 ２）ＣＤ３４＋細胞の培養 Ｄ０日に、ＣＤ３４＋細胞を１０⁶細胞／mlの細胞濃度で１ml／穴の量の２４
穴培養プレートに播種した。サイトカイン及びＴＧＦ−βの阻害物質（抗−ＴＧ
Ｆ−β）を含む無血清培地に、前記細胞を播種した。 「培地」； ＳＢＡ（アルブミンを含む無血清培地）＋ ＳＦ（Ｓｔｅｅｌ因子） １０ng/ml ＴＰＯ（トロンボポエチン） １０ng/ml ＦＬ（リガンドＦＬｔ３） ５０ng/ml ＩＬ６（インターロイキン６） １０ng/ml 抗ＴＧＦ−β ４μg/ml ＣＤ３４＋細胞を５％ＣＯ₂雰囲気、９７％湿度飽和で、３７℃でインキュベ
ートした。 ２日毎に培養物の容量を測定し、ＣＤ３４＋細胞の数を計数して、前記細胞の
生存率を測定した。 培養物中に含有するＣＤ３４＋細胞の数を計数した後、１０⁶細胞／穴だけを
残すのに必要な容量を取り出した。 容量、培地中のサイトカイン又は成長因子、及びＴＧＦ−βの阻害物質を再調
整した。 ８日毎にスクリーニングを実施し、ＣＤ３４＋及びＣＤ３８−細胞を評価して
、ＣＤ３４＋細胞の増殖能をＨＰＰ−Ｑ試験で評価した。 ＨＰＰ−Ｑ試験の結果は、免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ−ＮＯＤ）による試験で
一様に確認した。 本発明による工程のプロトコールは、（サイトカイン及び阻害物質以外では）
培地の条件を異化産物及び同化産物に関して一定に保つミクロバイオリアクター
で細胞を培養させた。 高い細胞濃度のＣＤ３４＋細胞の播種は、バイオリアクターを高い細胞濃度で
作成させ、こうして培養容量を減少させた。 バイオリアクター又はミクロバイオリアクターの原理 ミクロバイオリアクターは、細胞数及び細胞密度に適したサイズ（１〜１００
ml）の培養チャンバーを含み、透析チャンバーとは膜で、そして適当ならばガス
チャンバーとは別の膜で分離されて、培養の構成物を一定に保つ。 微量測定装置（microdetector）は、培養チャンバーの種々のパラメータ：ｐ
Ｈ、ＣＯ₂、Ｏ₂、グルコース、乳酸塩などの制御を可能にする。 入口及び出口は、培地の再生又は変更、あるいは細胞の添加又は回収を可能に
する。 ミクロバイオリアクター全体は、ポンプ及びコンピュータプログラムにより自
動化することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 ＣＤ３４＋細胞の未分化状態の維持に対するＴＧＦ−βの影響を示している。

【図１Ｂ】 ＣＤ３４＋細胞の未分化状態の維持に対するＴＧＦ−βの影響を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 19/00 19/00 25/00 25/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 アトフェルド，アントワネット フランス国、エフ−92160 アントニ、リ ュ・フロリアン 44 Ｆターム(参考） 4B065 AA93X AC20 BB19 CA44 CA46 4C087 AA01 AA03 BB64 ZA01 ZA31 ZA36 ZA75 ZA89 ZA96

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）の細胞分裂を可能にしながら
   、それらの細胞の未分化状態を維持するための制御された手法による細胞発育の
   阻害物質の使用。
2. 【請求項２】 その幹細胞が、体性幹細胞を起源とする胚性幹細胞、並びに
   ／あるいは血液及び／又は（皮膚、肝臓、膵臓、心臓、腎臓、骨、若しくは神経
   組織のような）種々の固体組織を起源とする幹細胞／体性前駆細胞自身からなる
   群から選択されたヒト細胞である、請求項１記載の阻害物質の使用。
3. 【請求項３】 その細胞発育の阻害物質が、細胞分化及び／又は細胞分裂に
   関して細胞発育を制御する遺伝子の産物、サイクリン依存性キナーゼの阻害物質
   、アポトーシス又は加齢を制御する因子、並びに（インターフェロン及びＴＧＦ
   −βのような）サイトカインからなる群から選択される、請求項１又は２記載の
   阻害物質の使用。
4. 【請求項４】 細胞増殖の抗阻害物質の逐次配合において、幹細胞（詳細に
   はヒト幹細胞）の未分化状態を維持しながら、１〜約１００（詳細には１〜約１
   ０）の範囲の複数の細胞分裂を開始する、詳細には１回の細胞分裂を開始する、
   請求項１〜３のいずれか１項記載の阻害物質の使用。
5. 【請求項５】 培地中の幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）の増殖工程であって
   、それが： −休止状態の幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、その細胞により産生され、そし
   て／又は培地中に存在する細胞発育の阻害物質（詳細には細胞増殖の阻害物質）
   の影響の中和により、それらの休止状態から脱出され、それにより１〜約１００
   （詳細には１〜約１０）の範囲の複数の細胞分裂（詳細には１回の細胞分裂）の
   開始がある段階、 −及び先行の段階で得られた幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）が、細胞発育の阻害
   物質の援助によりそれらの分化を阻害される段階、 を含むことを特徴とする増殖方法。
6. 【請求項６】 増殖工程の終了時に、この方法で増殖した幹細胞が、未分化
   状態に維持されていることを特徴とする、請求項５記載の増殖方法。
7. 【請求項７】 その幹細胞が、体性幹細胞を起源とする胚性幹細胞、並びに
   血液及び／又は（皮膚、肝臓、膵臓、心臓、腎臓、骨、若しくは神経組織のよう
   な）種々の固体組織を起源とする体性細胞自身からなる群より選択されるヒト細
   胞であることを特徴とする、請求項５記載の増殖方法。
8. 【請求項８】 その幹細胞（詳細にはヒト細胞）が、約１〜約１０¹⁰細胞／
   mlの細胞濃度、詳細には約１０³〜約１０¹⁰細胞／ml、より詳細には約１０⁴〜約
   １０⁹細胞／mlの範囲の濃度で存在することを特徴とする、請求項５〜７のいず
   れか１項記載の増殖方法。
9. 【請求項９】 細胞発育の阻害物質が、幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）によ
   り合成され、そして／又は幹細胞（詳細にはヒト幹細胞）を含有する培地に添加
   されることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか１項記載の増殖方法。
10. 【請求項１０】 細胞発育の阻害物質が、細胞分化及び／又は細胞分裂に関
    して細胞発育を制御する遺伝子の産物、サイクリン依存性キナーゼの阻害物質、
    アポトーシス又は加齢を制御する因子、並びに（インターフェロン及びＴＧＦ−
    βのような）サイトカインからなる群より選択されることを特徴とする、請求項
    ５〜９のいずれか１項記載の増殖方法。
11. 【請求項１１】 細胞発育の阻害物質が、幹細胞を含有する培地に低濃度（
    詳細には約１０^-10mg/ml〜１mg/mlの範囲の濃度）で存在することを特徴とする
    、請求項５〜１０のいずれか１項記載の増殖方法。
12. 【請求項１２】 培地中に存在する細胞発育の阻害物質（詳細には細胞増殖
    の阻害物質）の影響の中和が、 −適切な量の抗ＴＧＦ−βのような細胞増殖の抗阻害物質の、培地への添加、及
    び／又は −（詳細にはサイトカイン類に属する）細胞発育の阻害物質（詳細には細胞増殖
    の阻害物質）の培地からの回収、 により達成されることを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか１項記載の増殖
    方法。
13. 【請求項１３】 細胞増殖の抗阻害物質が、約１０^-18〜約１０^-3g/mlの範
    囲の濃度で存在することを特徴とする、請求項５〜１２のいずれか１項記載の増
    殖方法。
14. 【請求項１４】 その培地が、造血幹細胞を含有し、インターロイキン及び
    ＣＳＦからなる群より選択された（培地に添加された）１種以上のサイトカイン
    を含み、前記サイトカインが、約１０^-8μg/ml〜約１mg/ml、詳細には約１０^-5
    μg/ml〜０．１μg/mlの範囲の濃度で存在する、請求項５〜８のいずれか１項記
    載の増殖方法。
15. 【請求項１５】 請求項５〜１４のいずれか１項記載の増殖工程であって、
    それが以下の段階： ａ）未分化胚性又は体性幹細胞（詳細には造血体性幹細胞）が最初の細胞分裂の
    開始により休止状態を離脱するような、１種以上のサイトカインの存在下での、
    高い開始細胞濃度（詳細には１０³〜１０¹⁰細胞／mlの範囲の濃度）の休止状態
    の未分化胚性又は体性幹細胞を播種することによる、そして培地中に存在する細
    胞発育の阻害物質（詳細には細胞増殖の阻害物質）の影響の中和による、培地中
    の上述の細胞の分裂の第１周期の開始、 ｂ）未分化胚性又は体性幹細胞により合成された、又は培地に添加された細胞発
    育の阻害物質の援助による、先行の段階で得られた前記幹細胞の休止への復帰、
    ｃ）適当ならば、培地中に存在し得る異化産物及び細胞発育の阻害物質（詳細に
    は細胞増殖の阻害物質）を除去するための、先行の段階で得られた未分化胚性又
    は体性幹細胞の洗浄、 ｄ）適当ならば、約１００〜１０¹⁰細胞／mlの範囲の最適な細胞濃度を維持する
    ための、先行の段階で得られた未分化胚性又は体性幹細胞の希釈、 ｅ）細胞の増幅因子が、約１日〜３年、詳細には１日〜１５日の増殖工程の合計
    期間に対応する所望の幹細胞の数（詳細には初期未分化胚性又は体性幹細胞の数
    の２倍〜１０¹²倍）を得るために十分となるまでの上記分裂及び休止サイクルの
    連続反復、 ｆ）インビトロで未分化胚性又は体性幹細胞を保存する、それらを使用する、又
    はそれらを分化させるためのそれらの増殖の停止、 を含むことを特徴とする、請求項５〜１４のいずれか１項記載の増殖方法。
16. 【請求項１６】 １回の休止状態の期間が約１時間〜３年の範囲であり、詳
    細には約６時間〜７２時間であること、及び１回の分化周期の期間が、約６時間
    〜３年の範囲であり、詳細には約６時間〜２４時間であることを特徴とする、請
    求項５〜１５のいずれか１項記載の増殖方法。
17. 【請求項１７】 ヒト血液及び／又はヒト固体組織若しくは器官を再生する
    ために、請求項５〜１６のいずれか１項記載の工程により得られるような未分化
    及び増幅されたヒト幹細胞の使用。