EP1181354A1 - Procede de multiplication de cellules souches - Google Patents
Procede de multiplication de cellules souchesInfo
- Publication number
- EP1181354A1 EP1181354A1 EP00936985A EP00936985A EP1181354A1 EP 1181354 A1 EP1181354 A1 EP 1181354A1 EP 00936985 A EP00936985 A EP 00936985A EP 00936985 A EP00936985 A EP 00936985A EP 1181354 A1 EP1181354 A1 EP 1181354A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- stem cells
- cell
- inhibitor
- approximately
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 117
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 105
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims abstract description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 230000011712 cell development Effects 0.000 claims description 60
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 50
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 23
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 21
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 13
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 8
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 7
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 5
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 5
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 3
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims 1
- 230000023715 cellular developmental process Effects 0.000 abstract description 3
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 19
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 19
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 5
- 102000015215 Stem Cell Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 4
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 3
- SXXHYAMKYMNIHI-UHFFFAOYSA-N fluoroimino(sulfanylidene)methane Chemical compound FN=C=S SXXHYAMKYMNIHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 229940123587 Cell cycle inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710127797 Macrophage colony-stimulating factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003443 anti-oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000002875 cyclin dependent kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 210000000267 erythroid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000011773 genetically engineered mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
Definitions
- the subject of the present invention is a method of multiplying stem cells.
- the subject of the invention is in particular a method making it possible both to rapidly multiply said stem cells and to maintain them in an undifferentiated state.
- the current cultures which allow stem cells to be maintained in an undifferentiated state, and in particular hematopoietic stem cells, and / or multiplying them, are long-term cultures in which the cells divide very slowly. More particularly, the cultures allowing for example a self-renewal (an identical multiplication) of stem cells, in particular of hematopoietic stem cells, are only cultures on medullary stroma, or cultures with slow multiplication, in the absence of medullary stroma .
- stem cells in particular hematopoietic stem cells
- medullary stroma which makes it possible to use only few cytokines but causes slow division of cells (and therefore slow multiplication of cells) in the presence of a mixture of progenitors with mature hematopoietic and stromal cells.
- stem cells in particular hematopoietic stem cells
- the Piacibello culture system In the case of long-term cultures, in the absence of a medullary stroma, the Piacibello culture system can be mentioned. In this culture system (Piacibello et al. 1997 Blood), the CD34 + cells containing hematopoietic stem cells are seeded at 20,000 cells per ml, and each week half of the culture is removed and replaced with fresh medium. After two weeks, the number of cells doubles at a rate of once a week, over several months. During the first two weeks of Piacibello culture, there is a strong loss of CD34 + cells which stabilize at less than 2%. Thus, current cultures are not very compatible with a production for clinical or biotechnological purposes of stem cells maintaining their undifferentiated and multipotent character.
- One of the main aims of the invention is to propose a method of culturing stem cells making it possible to obtain human stem cells in an undifferentiated state, quickly and in large quantities.
- One of the aims of the invention is to propose a rapid process for culturing stem cells, without medullary stroma, and making it possible to reduce the culture volumes.
- One of the other aims of the invention is to use the stem cells thus obtained to reconstitute tissues and organs to be transplanted.
- the subject of the invention is the use of a cell development inhibitor in a controlled manner to maintain the undifferentiated state of stem cells, in particular human stem cells, while allowing their cell division.
- an inhibitor of cell development can also be an inhibitor of cell differentiation of stem cells.
- TGF- ⁇ (“transforming growth factor”), previously known as an inhibitor of cellular development of stem cells, and in particular hematopoietic stem cells or primitive hematopoietic progenitors, appears to be, according to invention, an inhibitor of cell differentiation.
- cell development inhibitor includes both any substance that inhibits cell proliferation and / or cell growth, and / or cell differentiation.
- cell proliferation inhibitor also means cell division inhibitor, or cell cycle inhibitor.
- use of a cell development inhibitor in a controlled manner means that the cell development inhibitor is used in a modular manner in order to allow:
- the expression "use of a cell development inhibitor in a controlled manner” means, in other words, that the cell development inhibitor can be used in conditions such that stem cells are taken out of their resting state in order to divide, in controlled conditions preventing differentiation.
- stem cells means immature cells, or undifferentiated (or undifferentiated) cells, or primitive cells, or pluripotent cells or multipotent cells.
- the stem cells advantageously used according to the invention are human stem cells chosen from the group consisting of embryonic stem cells at the origin of somatic stem cells, and / or stem cells / somatic progenitors themselves themselves.
- blood and / or various solid tissues such as skin, liver, pancreas, heart, kidney, bone, or nervous tissue.
- embryonic stem cells at the origin of somatic stem cells is defined for example as a cell which can give rise to any one of the somatic stem cells.
- embryonic stem cells is defined for example as a cell which can give rise to a specific tissue.
- the stem cells according to the invention are in particular human hematopoietic somatic stem cells, also called primary hematopoietic progenitors.
- the cell development inhibitor advantageously used according to the invention is chosen from the group consisting of gene products controlling cell development with respect to cell differentiation and / or cell division , cyclin dependent kinase inhibitors, factors controlling apoptosis or aging, and cytokines (such as interferons, TGF- ⁇ ).
- cytokines such as interferons, TGF- ⁇ .
- retinoblastoma gene As inhibitors of dependent cyclin kinases, mention may especially be made of the retinoblastoma gene, the PI 5, PI 6, P21, P27 genes.
- the retinoblastoma gene is a tumor suppressor (anti-oncogenic) gene.
- the PI 5, PI 6, P21, P27 genes inhibit the cell cycle.
- telomerase As a factor controlling apoptosis, there may be mentioned in particular the genes bcl-2, bax, fas. As a factor controlling aging, mention may especially be made of telomerase.
- cytokines which may be inhibitors of cell development, mention may in particular be made of interferons and in particular TGF- ⁇ .
- the subject of the invention is the use of an inhibitor of cell development as defined above, in sequential association with an anti-inhibitor of cell proliferation, to trigger a number of cell divisions ranging from 1 to approximately 100, in particular from 1 to approximately 10, and in particular for triggering a single cell division, while maintaining the undifferentiated state of the stem cells, in particular human stem cells.
- the expression “sequential association” means that the anti-cell proliferation inhibitor is not used simultaneously with the cell development inhibitor.
- the subject of the invention is a method of multiplying stem cells in a culture medium, in particular human stem cells, characterized in that it comprises:
- the stem cells in particular human stem cells, in the resting state are brought out of their resting state by neutralizing the effect of an inhibitor of cell development, and in particular of an inhibitor of cell proliferation, produced by cells and / or present in the culture medium, so that there is triggering of a number of cell divisions ranging from 1 to approximately 100, in particular from 1 to approximately 10, and in particular of a single cell division,
- the subject of the invention is also a method of multiplying stem cells in a culture medium, in particular human stem cells, characterized in that it comprises: - a step according to which the stem cells, in particular the human stem cells, in the state of division are prevented from entering a state of differentiation, using a cell development inhibitor,
- the multiplication process according to the invention is characterized in that, during and at the end of said process, the stem cells thus multiplied are kept in an undifferentiated state.
- the expression “multiplied stem cells” has the same meaning as the expression “amplified stem cells”.
- the expression “multiplication process” has the same meaning as the expression “amplification process”.
- the resting state of the cells means that the cells do not differentiate or divide.
- the stem cells multiplied according to the method of multiplication of the invention are human stem cells chosen from the group consisting of embryonic stem cells at the origin of somatic stem cells, and the somatic cells they -same at the origin of blood and / or various solid tissues such as the skin, the liver, the pancreas, the heart, the kidney, the bone, or nervous tissue.
- the multiplication method according to the invention is characterized in that the stem cells, in particular human cells, are present at a cell concentration of approximately 1 to approximately 10 10 cells per ml, and in particular at a concentration ranging from approximately 10 3 to about 10 10 cells per ml, and more particularly about
- the cell development inhibitor is synthesized by stem cells, in particular stem cells human, and / or is added to the culture medium containing the stem cells, in particular the human stem cells.
- Said cell development inhibitor is synthesized by the stem cells and / or is added to the culture medium: (a) before the first cell division, and
- the cell development inhibitor When the cell development inhibitor is synthesized by stem cells, it may or may not be secreted.
- the quantity of cell development inhibitor synthesized by the stem cells, or added to the culture medium, must be sufficient so that said cells (a) are maintained in their resting state before the first cell division, and ( b) are placed in the state of rest when they were previously in a state of division.
- the amount of cell development inhibitor synthesized by the stem cells can vary from 0.01 pg to 1 mg / ml in the culture medium, and in particular from 0.1 pg to 10 ng / ml.
- the amount of cell development inhibitor added to the culture medium can vary from 0.1 pg to 1 mg / ml in the culture medium, and in particular from 1 pg to 10 ng / ml.
- the multiplication method according to the invention is characterized in that the cell development inhibitor is chosen from the group consisting of the gene products controlling cell development with respect to cell differentiation and / or cell division, inhibitors of dependent cyclin kinases, factors controlling apoptosis or aging, and cytokines (such as interferons, TGF ⁇ ).
- the cell development inhibitor is chosen from the group consisting of the gene products controlling cell development with respect to cell differentiation and / or cell division, inhibitors of dependent cyclin kinases, factors controlling apoptosis or aging, and cytokines (such as interferons, TGF ⁇ ).
- the cell development inhibitor is present at a low concentration in the culture medium containing the stem cells, and in particular at a concentration ranging from approximately 10 ⁇ 10 mg / ml to 1 mg / ml.
- the multiplication method according to the invention is characterized in that the neutralization of the effect of the inhibitor of cell development, and in particular of the inhibitor of cell proliferation, present in the culture medium, is carried out by: the addition to the culture medium of an anti-inhibitor of cell proliferation, and / or
- the effect of said inhibitor is neutralized by adding to the culture medium an anti-inhibitor of cell proliferation, which can penetrate into the cell, such as an antisense oligonucleotide.
- an anti-inhibitor of cell proliferation which can penetrate into the cell, such as an antisense oligonucleotide.
- the effect of said inhibitor is neutralized either by adding an anti-proliferation inhibitor to the culture medium. or by removing the culture medium from the cell development inhibitor.
- the removal of a cell development inhibitor from the culture medium can in particular be carried out using blocking antibodies or by washing in order to neutralize said inhibitor.
- the quantity of cell development inhibitor withdrawn from the culture medium containing the stem cells must be sufficient so that there is triggering of a number of cell divisions ranging from 1 to approximately 100, in particular from 1 to approximately 10, including a single cell division.
- the amount of cell development inhibitor removed from the culture medium varies from 0.01 pg to 1 ng / ml, and in particular from 0.1 pg to 10 ng / ml.
- the cell development inhibitor removed from the culture medium belongs in particular to the group of cytokines, antisense oligonucleotides blocking the expression of development genes.
- the amount of anti-cell proliferation inhibitor added to the culture medium containing the stem cells must be sufficient so that there is triggering of a number of cell divisions ranging from 1 to approximately 100, in particular from 1 to approximately 10, and in particular of a single cell division.
- the amount of anti-cell proliferation inhibitor added to the culture medium varies from 0.1 ⁇ g to 10 mg / ml for blocking antibodies or from 0.01 ⁇ M to 1 mM of antisense oligonucleotide in the culture medium , and in particular from 1 ⁇ g to 100 ⁇ g / ml for blocking antibodies or from 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M of antisense oligonucleotides.
- the anti-cell proliferation inhibitor is chosen from the group consisting of antisense oligonucleotides or blocking antibodies and in particular by the anti-
- the multiplication method according to the invention is characterized in that the anti-inhibitor of cell proliferation is present in a concentration ranging from approximately 10 "18 to approximately 10 " 3 g / ml, including 0.1 to
- the method of multiplication according to the invention of stem cells is characterized in that it comprises, in order to obtain a sufficient number of stem cells maintained in the undifferentiated state, a total number of cycles of divisions (or division states) of between 1 to 100 cycles, in particular between 5 to 20 cycles, and in particular 10 cycles.
- the total duration of all the rest states of the multiplication process according to the invention varies from 1 hour to 3 years, in particular from 20 hours to 200 hours, and the total duration of the whole division cycles of the multiplication process according to the invention varies from 10 hours to 3 years and in particular from 20 hours to 200 hours.
- the multiplication method according to the invention is characterized in that the duration of a single rest state ranges from approximately 1 hour to 3 years, and is in particular approximately 6 hours to 72 hours, and in that the duration of a single division cycle ranges from approximately 6 hours to 3 years, and is in particular from approximately 6 hours to 24 hours.
- the total duration of the multiplication process according to the invention comprising all of the rest and division states ranges from 1 day to 3 years, and is in particular from 1 day to 15 days.
- the set of rest and division cycles of a multiplication process lasts from 1 to 15 days, and the applications envisaged are cell therapy.
- the set of rest and division cycles of a multiplication process lasts from 1 day to 3 years, and the applications envisaged are experimental.
- the method of multiplying stem cells according to the invention makes it possible to obtain an amplification of the stem cells by a factor ranging from approximately 2 to approximately 10 12 , and in particular from approximately 2 to approximately 10 4 .
- the multiplication method according to the invention makes it possible to obtain a number of amplified stem cells and maintained in the undifferentiated state, from 2 to 10 12 times greater than the initial number of undifferentiated stem cells.
- the culture medium of the multiplication method according to the invention contains hematopoietic stem cells and comprises one or more cytokines (added to the culture medium) chosen from the group consisting of interleukins and CSFs , said cytokines being present at a concentration ranging from approximately 10 ⁇ 8 ⁇ g / ml to approximately 1 mg / ml, and in particular from approximately 10 ⁇ 5 ⁇ g / ml to 0.1 ⁇ g / ml, and possibly other factors growth.
- CSFs colony-stimulating factor
- GM-CSF factor stimulating granulocytic and monocytic colonies
- GCSF factor stimulating granulocytic colonies
- MCSF factor stimulating monocytic colonies
- SF Stepel factor
- TPO thrombopoietin
- FL Flt-3 ligand
- the method of multiplication according to the invention of stem cells, and in particular human somatic stem cells is more particularly characterized in that it comprises the following steps: a) the initiation of a first cycle of division of embryonic stem cells or undifferentiated somatic in a culture medium, and in particular of cells hematopoietic somatic strains, by seeding said undifferentiated stem cells in the resting state, at a high initial cell concentration, in particular at a concentration ranging from 10 to 10 cells per ml, in the presence of one or more cytokines, and by neutralizing the effect of the inhibitor of cell development, and in particular of the inhibitor of cell proliferation, present in the culture medium, so that the aforesaid cells come out of their state of rest by the triggering of a first cell division, b) the return to rest of the undifferentiated embryonic or somatic stem cells obtained in the previous step, using a cell development inhibitor, said inhibitor being synthesized by said stem cells, or
- the modalities of the different stages of the stem cell multiplication process according to the invention are those already described above.
- the quantity of anti-cell proliferation inhibitor added to the culture medium, or the quantity of cell development inhibitor withdrawn from the culture medium containing the stem cells, must be sufficient so that there is triggering of 'a first cell division.
- the cell development inhibitor is TGF- ⁇ ; TGF- ⁇ is synthesized by hematopoietic somatic stem cells themselves in an amount ranging from 0.01 pg to 1 ng / ml.
- the TGF- ⁇ is then neutralized by the addition to the culture medium of an anti-inhibitor of cell proliferation: the anti-TGF- ⁇ .
- the anti-TGF- ⁇ is added in an amount ranging from 0.1 ⁇ g to 100 ⁇ g / ml of antibody or 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M of oligonucleotides.
- the washing step ⁇ described above makes it possible in particular to neutralize the TGF- ⁇ inhibitor formed during or at the end of a previous division cycle in order to allow the following division.
- the dilution step (d) described above, maintaining an optimal cell concentration allows both: - the rapid return to the resting state of the stem cells, due to a rapid synthesis of said cells of the cell development inhibitor, in particular TGF- ⁇ ,
- TGF- ⁇ slows down the differentiation process of stem cells throughout the multiplication process, namely during and at the end of the different rest and division cycles.
- the stop step f) described above can be carried out by washing said stem cells thus multiplied, by freezing them, or by putting them in a differentiation medium.
- the differentiation medium in which the stem cells thus multiplied are placed and maintained in an undifferentiated state according to the method of the present invention is chosen as a function of the tissue or of the organ which it is sought to reconstitute.
- the multiplication process according to the invention makes it possible to obtain significant productions of stem cells, said stem cells being maintained in an undifferentiated state during the various rest and division cycles of said process. Large productions of immature cells are thus obtained in a reduced volume.
- the present invention relates to the use of undifferentiated and amplified human stem cells as obtained according to the method of the invention described above, for reconstituting human blood and / or solid tissues or human organs.
- undifferentiated and amplified human stem cells as obtained according to the method of the invention can in particular be used to amplify insufficient samples of umbilical cord blood, bone marrow or peripheral blood, or for the transplantation of hematopoietic stem cells.
- the undifferentiated and amplified human stem cells as obtained according to the method of the invention can also be used for studies on the human genome (expression and function of the genes for human development).
- Figures 1A and 1B represent the effect of TGF- ⁇ on the maintenance of the undifferentiated state of CD34 + cells.
- the PKH26 dye that attaches to the cell membrane allows you to determine the number of divisions that the cell has made: after doubling the cell, the intensity of the dye is divided by 2, after 2 doublings by 4 etc ... This gives different populations moving to the right.
- the concentration of TGF- ⁇ being higher (30 pg / ml of TGF- ⁇ ) (FIG. 1B), a higher percentage of cells is observed.
- stem cells used in the example below are more particularly hematopoietic human somatic stem cells originating from umbilical cord blood and characterized by the membrane marker CD34 +. In what follows, said cells will be called “CD34 + cells”.
- CD34 + cells are diluted in PBS (phosphate buffered saline) / BSA (bovine serum albumin) (0.2%) and incubated with anti-CD34 + antibodies conjugated to FITC (fluoroisothiocyanate) (clone 8G12; Becton Dickinson, San Jose, CA) for 30 minutes at 4 ° C. then washed twice with PBS / BSA.
- the control consists of cells incubated with non-specific IgG1 conjugated to the FITC.
- the CD34 + are labeled with the dye PKH26 (Sigma, France) according to the manufacturer's instructions. Cells with an average intensity of PKH26 are sorted in a window representing approximately 10% of the full width. This corresponds to approximately 20% of CD34 + cells. Four 400 cell aliquots are used in the HPP-Q test. The rest of the resting cells and the proliferating cells are sorted and cultured in a semi-solid medium. Calibrated beads (Coulter-Beckman) are used to standardize the analyzes between day 0 and day 3.
- HPP-Q test High Proliferative Potential-Quiescent Cell
- TGF- ⁇ the inhibitor of cell development
- stem cells in particular hematopoietic, at rest.
- HPP-Q test consists in determining the degree of maturity of stem cells, in particular hematopoietic cells, and is characterized in that it comprises the following steps:
- a first set of stem cells, in particular hematopoietic cells, is cultured in a medium suitable for their culture, said medium not containing means for blocking at least one inhibitor of cell development such as TGF- ⁇ , during about 14 to about 28 days, preferably 18 days,
- the culture of a second set of stem cells, in particular hematopoietic cells, of the same nature and of the same degree of maturity as those mentioned above, is carried out in an appropriate medium containing means for blocking at least less an inhibitor of cell development, these blocking means being present, in the culture medium at an effective concentration,
- HPP-CFC progenitor forming a colony with high potential proliferative
- HPP-MEG megakaryocytic progenitor with high proliferative potential
- HPP-GEMM granulocytic erythrocytic progenitor megakaryocyte with high proliferative potential
- the number and nature of the colonies are observed under a microscope: the number of mixed colonies made up of cells of the red line and one or more types of the white line is counted.
- the number of mixed colonies is higher when the cell population cultured is immature, that is to say made up of younger cells, some of which are at rest.
- the more immature the cell that gave birth to the colony, even at rest the greater its proliferation potential, so the colony from this cell once activated will be larger in size.
- CD34 + cells were seeded at a cell concentration of 10 6 cells per ml in 24-well culture plates at a rate of 1 ml per well at day -T0. Said cells were seeded in a serum-free medium containing cytokines and a TGF- ⁇ inhibitor (anti TGF- ⁇ ).
- Step Factor 10 ng / ml
- TPO Thrombopoietin 10 ng / ml
- IL6 Interleukin 6
- CD34 + cells are incubated at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO2 and 97% humidity saturation. Every 2 days, the volume of the culture is measured, the number of CD34 + cells is counted, and the viability of said cells is determined.
- the medium is readjusted in volume, in cytokines or growth factors and in inhibitor of TGF- ⁇ .
- the protocol of the method according to the invention makes it possible to culture the cells in a microbioreactor which maintains the conditions of media constant with regard to catabolites and anabolites (cytokines and inhibitors excluded).
- the seeding of CD34 + cells at a high cell concentration makes it possible to create a bioreactor at high cell concentration, and thus to reduce the culture volumes.
- the microbioreactor consists of a culture chamber, of a size adapted to the number of cells and to their cell density (1 to 100 ml), separated from a dialysis chamber by a membrane, and optionally from a gas chamber by a another membrane, to keep the constituents of the medium constant.
- Micro detectors make it possible to control various parameters in the culture chamber: pH, CO, O 2 , glucose, lactate, etc.
- Inputs and outputs allow to renew or modify the culture media, or to add or remove cells.
- the entire microbioreactor can be automated by pumps and computerized programmers.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de façon contrôlée pour maintenir l'état indifférencié de cellules souches, notamment de cellules souches humaines, tout en permettant leur division cellulaire.
Description
PROCEDE DE MULTIPLICATION DE CELLULES SOUCHES
La présente invention a pour objet un procédé de multiplication de cellules souches. L'invention a notamment pour objet un procédé permettant à la fois de multiplier rapidement lesdites cellules souches et de les maintenir dans un état indifférencié.
Les cultures actuelles qui permettent le maintien des cellules souches dans un état indifférencié, et notamment des cellules souches hematopoïetiques, et/ou les multipliant, sont des cultures à long terme dans lesquelles les cellules se divisent très lentement. Plus particulièrement, les cultures permettant par exemple un autorenouvellement (une multiplication à l'identique) de cellules souches, notamment de cellules souches hematopoïetiques, sont uniquement des cultures sur stroma médullaire, ou des cultures à multiplication lente, en l'absence de stroma médullaire.
S 'agissant plus particulièrement des cultures à long terme sur stroma médullaire, on peut citer les cultures de type Dexter, dans lesquelles les cellules souches, notamment les cellules souches hematopoïetiques, se développent sur un stroma médullaire, ce qui permet de n'utiliser que peu de cytokines mais entraîne une division lente des cellules (et donc une multiplication lente des cellules) en présence d'un mélange de progéniteurs avec des cellules matures hematopoïetiques et stromales. De plus, contrairement à ce qui se passe chez la souris, il n'y a pas de maintien à long terme chez l'homme de cellules souches sur stroma.
S 'agissant des cultures à long terme, en l'absence de stroma médullaire, on peut mentionner le système de culture de Piacibello. Dans ce système de culture (Piacibello et al. 1997 Blood), les cellules CD34+ contenant des cellules souches hématopoiétiques sont ensemencées à 20000 cellules par ml, et chaque semaine la moitié de la culture est prélevée et remplacée par du milieu frais. Après deux semaines, le nombre de cellules double à un rythme de une fois par semaine, sur plusieurs mois. Pendant les deux premières semaines de la culture de Piacibello, il y a une forte perte des cellules CD34+ qui se stabilisent à moins de 2%. Ainsi, les cultures actuelles sont peu compatibles avec une production à des fins cliniques ou biotechnologiques de cellules souches maintenant leur caractère indifférencié et multipotent.
Par ailleurs, à ce jour on ne connaît pas d'inhibiteur de la différenciation de cellules souches permettant un autorenouvellement continu satisfaisant.
L'un des principaux buts de l'invention est de proposer un procédé de culture de cellules souches permettant d'obtenir, rapidement et en quantité importante, des cellules souches humaines dans un état indifférencié.
L'un des buts de l'invention est de proposer un procédé rapide de culture de cellules souches, sans stroma médullaire, et permettant de réduire les volumes de culture.
L'un des autres buts de l'invention est d'utiliser les cellules souches ainsi obtenues pour reconstituer des tissus et des organes à transplanter.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de façon contrôlée pour maintenir l'état indifférencié de cellules souches, notamment de cellules souches humaines, tout en permettant leur division cellulaire.
La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs que, dans certaines conditions, un inhibiteur du développement cellulaire peut être également un inhibiteur de la différenciation cellulaire de cellules souches. A ce titre, le TGF-β (« transforming growth factor » (facteur de croissance transformant)), préalablement connu comme un inhibiteur du développement cellulaire de cellules souches, et notamment de cellules souches hématopoiétiques ou progéniteurs primitifs hématopoiétiques se révèle être, selon l'invention, un inhibiteur de la différenciation cellulaire. L'expression « inhibiteur du développement cellulaire » englobe à la fois toute substance inhibant la prolifération cellulaire et/ou la croissance cellulaire, et/ou la différenciation cellulaire.
L'expression « inhibiteur de la prolifération cellulaire » signifie également inhibiteur de la division cellulaire, ou inhibiteur du cycle cellulaire. L'expression « utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de façon contrôlée » signifie que l'inhibiteur du développement cellulaire est utilisé de façon modulable afin de permettre :
(a) la division cellulaire des cellules souches lorsque celle-ci est souhaitée, tout en maintenant l'état indifférencié desdites cellules souches au cours ou à la fin de la division cellulaire, ou,
(b) rinhibition du développement cellulaire des cellules souches lorsque celui-ci est nécessaire pour inhiber la différenciation cellulaire desdites cellules souches.
L'expression « utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de façon contrôlée » signifie, en d'autres termes, que l'inhibiteur du développement cellulaire
peut être utilisé dans des conditions telles que les cellules souches sont sorties de leur état de repos afin de se diviser, dans des conditions contrôlées empêchant la différenciation.
L'expression « cellules souches » signifie cellules immatures, ou bien cellules non différenciées (ou indifférenciées), ou bien cellules primitives, ou bien cellules pluripotentes ou cellules multipotentes.
Les cellules souches avantageusement utilisées selon l'invention sont des cellules souches humaines choisies dans le groupe constitué par les cellules souches embryonnaires à l'origine des cellules souches somatiques, et/ou les cellules souches/progéniteurs somatiques elles/eux mêmes à l'origine du sang et/ou de différents tissus solides tels que la peau, le foie, le pancréas, le cœur, le rein, l'os, ou du tissu nerveux.
L'expression « cellules souches embryonnaires à l'origine des cellules souches somatiques » est définie par exemple comme une cellule pouvant donner naissance à l'une quelconque des cellules souches somatiques.
L'expression « cellules souches somatiques » est définie par exemple comme une cellule pouvant donner naissance à un tissu spécifique.
Les cellules souches selon l'invention sont notamment les cellules souches somatiques humaines hematopoïetiques, encore appelées progéniteurs primitifs hematopoïetiques.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'inhibiteur du développement cellulaire utilisé avantageusement selon l'invention est choisi dans le groupe constitué par les produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement, et les cytokines (tels que les interférons, le TGF-β). Par le terme "cytokines", on désigne tous les facteurs de croissance, même si ces facteurs peuvent agir également comme des inhibiteurs de la croissance dans certaines conditions.
Comme produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, on peut notamment citer les facteurs de croissance, les cytokines, le produit de gènes contrôlant la différenciation, le vieillissement ou l'apoptose.
Comme inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes on peut notamment citer le gène du rétinoblastome, les gènes PI 5, PI 6, P21, P27.
Le gène du rétinoblastome est un gène suppresseur de tumeur (anti-oncogène).
Les gènes PI 5, PI 6, P21, P27 inhibent le cycle cellulaire.
Comme facteur contrôlant l'apoptose, on peut notamment citer les gènes bcl-2, bax, fas. Comme facteur contrôlant le vieillissement, on peut notamment citer la télomerase.
Comme cytokines pouvant être des inhibiteurs du développement cellulaire, on peut notamment citer les interférons et en particulier le TGF-β.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire tel que défini ci-dessus, en association séquentielle avec un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire, pour déclencher un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment pour déclencher une seule division cellulaire, tout en maintenant l'état indifférencié des cellules souches, notamment des cellules souches humaines. L'expression « association séquentielle » signifie que l' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire n'est pas utilisé de façon simultanée avec l'inhibiteur du développement cellulaire.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet un procédé de multiplication de cellules souches dans un milieu de culture, notamment de cellules souches humaines, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape dans laquelle les cellules souches, notamment les cellules souches humaines, à l'état de repos sont sorties de leur état de repos par la neutralisation de l'effet d'un inhibiteur du développement cellulaire, et notamment d'un inhibiteur de la prolifération cellulaire, produit par les cellules et/ou présent dans le milieu de culture, de telle sorte qu'il y ait déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire,
- et, une étape dans laquelle les cellules souches, notamment les cellules souches humaines, obtenues à l'étape précédente sont inhibées dans leur différenciation, à l'aide d'un inhibiteur du développement cellulaire.
L'invention a également pour objet un procédé de multiplication de cellules souches dans un milieu de culture, notamment de cellules souches humaines, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une étape selon laquelle les cellules souches, notamment les cellules souches humaines, à l'état de division sont empêchées d'entrer dans un état de différenciation, à l'aide d'un inhibiteur du développement cellulaire,
- et, une étape selon laquelle les cellules souches, notamment les cellules souches humaines, obtenues à l'étape précédente sont remises dans leur état de division, par la neutralisation de l'effet d'un inhibiteur du développement cellulaire, et notamment d'un inhibiteur de la prolifération cellulaire, de telle sorte qu'il y ait déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire. Le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que, au cours et à l'issue dudit procédé, les cellules souches ainsi multipliées sont maintenues dans un état indifférencié.
Selon l'invention, l'expression « cellules souches multipliées » a la même signification que l'expression « cellules souches amplifiées ». De même l'expression « procédé de multiplication » a la même signification que l'expression « procédé d'amplification ».
L'état de repos des cellules signifie que les cellules ne se différencient pas et ne se divisent pas.
Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules souches multipliées selon le procédé de multiplication de l'invention, sont des cellules souches humaines choisies dans le groupe constitué par les cellules souches embryonnaires à l'origine des cellules souches somatiques, et les cellules somatiques elles-mêmes à l'origine du sang et/ou des différents tissus solides tels que la peau, le foie, le pancréas, le cœur, le rein, l'os, ou du tissu nerveux. Le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que les cellules souches, notamment les cellules humaines, sont présentes à une concentration cellulaire d'environ 1 à environ 1010 cellules par ml, et notamment à une concentration allant d'environ 103 à environ 1010 cellules par ml, et plus particulièrement d'environ
104 à environ 109 cellules par ml. II faut noter que la présente invention s'applique aussi bien aux cellules humaines qu'aux cellules animales.
Dans le procédé de multiplication de l'invention, l'inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé par les cellules souches, notamment les cellules souches
humaines, et/ou est ajouté dans le milieu de culture contenant les cellules souches, notamment les cellules souches humaines.
Ledit inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé par les cellules souches et/ou est ajouté dans le milieu de culture : (a) avant la première division cellulaire, et
(b) au cours ou à la fin d'un cycle de division (lorsque lesdites cellules se trouvent préalablement en état de division).
Lorsque l'inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé par les cellules souches, il peut être sécrété ou non. La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire synthétisée par les cellules souches, ou ajoutée dans le milieu de culture, doit être suffisante de façon à ce que lesdites cellules (a) soient maintenues dans leur état de repos avant la première division cellulaire, et (b) soient placées à l'état de repos lorsqu'elles se trouvaient préalablement en état de division. La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire synthétisée par les cellules souches peut varier de 0,01 pg à 1 mg/ml dans le milieu de culture, et notamment de 0,1 pg à lO ng/ml.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire ajoutée dans le milieu de culture peut varier de 0,1 pg à 1 mg/ml dans le milieu de culture, et notamment de 1 pg à lO ng/ml.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que l'inhibiteur du développement cellulaire est choisi dans le groupe constitué par les produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement, et les cytokines (tels que les interférons, le TGFβ).
Les produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement, ainsi que les cytokines sont notamment ceux décrits ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'inhibiteur du développement cellulaire est présent à une faible concentration dans le milieu de culture contenant les cellules souches, et notamment à une concentration allant d'environ 10"10 mg/ml à 1 mg/ml.
Le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que la neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire, présent dans le milieu de culture, est effectuée par : - l'addition dans le milieu de culture d'un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire, et/ou
- le retrait du milieu de culture de l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire.
La neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire permet aux cellules souches de sortir de leur état de repos et de déclencher au moins une division.
De préférence, lorsque l'inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé sans être sécrété par les cellules souches, l'effet dudit inhibiteur est neutralisé par addition dans le milieu de culture d'un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire, qui peut pénétrer dans la cellule, tel qu'un oligonucléotide antisens. Cependant, lorsque l'inhibiteur du développement cellulaire est sécrété par les cellules souches, ou lorsque ledit inhibiteur est ajouté dans le milieu de culture, l'effet dudit inhibiteur est neutralisé soit par addition dans le milieu de culture d'un antiinhibiteur de la prolifération cellulaire, soit par retrait du milieu de culture de l'inhibiteur du développement cellulaire. Le retrait de inhibiteur du développement cellulaire du milieu de culture peut notamment être effectué à l'aide d'anticorps bloquants ou par lavage afin de neutraliser ledit inhibiteur.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire retirée du milieu de culture contenant les cellules souches doit être suffisante de telle sorte qu'il y ait déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire retirée du milieu de culture varie de 0,01 pg à 1 ng/ml, et notamment de 0,1 pg à 10 ng/ml.
L'inhibiteur du développement cellulaire retiré du milieu de culture appartient notamment au groupe des cytokines, des oligonucléotides antisens bloquant l'expression de gènes du développement.
La quantité d' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire ajoutée dans le milieu de culture contenant les cellules souches doit être suffisante de telle sorte qu'il y ait
déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire.
La quantité d' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire ajoutée dans le milieu de culture varie de 0,1 μg à 10 mg/ml pour les anticorps bloquants ou de 0,01 μM à 1 mM d'oligonucléotide antisens dans le milieu de culture, et notamment de 1 μg à 100 μg/ml pour les anticorps bloquants ou de 0,1 μM à 100 μM d'oligonucléotides antisens.
L' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire est choisi dans le groupe constitué par des oligonucléotides antisens ou des anticorps bloquants et notamment par l'anti-
TGF-β. Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que l' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire est présent en une concentration allant d'environ 10"18 à environ 10"3 g/ml, notamment 0,1 à
20 μg/ml, et notamment 4.10"6 g/ml (4 μg/ml).
Le procédé de multiplication selon l'invention des cellules souches, notamment des cellules souches humaines, est caractérisé en ce qu'il comporte, afin d'obtenir un nombre suffisant de cellules souches maintenues à l'état indifférencié, un nombre total de cycles de divisions (ou d'états de division) compris entre 1 à 100 cycles, notamment entre 5 à 20 cycles, et notamment 10 cycles.
Selon un mode de réalisation avantageux, la durée totale de l'ensemble des états de repos du procédé de multiplication selon l'invention varie de 1 heure à 3 ans, notamment de 20 heures à 200 heures, et la durée totale de l'ensemble des cycles de division du procédé de multiplication selon l'invention varie de 10 heures à 3 ans et notamment de 20 heures à 200 heures.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que la durée d'un seul état de repos s'échelonne d'environ 1 heure à 3 ans, et est notamment d'environ 6 heures à 72 heures, et en ce que la durée d'un seul cycle de division s'échelonne d'environ 6 heures à 3 ans, et est notamment d'environ 6 heures à 24 heures.
La durée totale du procédé de multiplication selon l'invention comprenant l'ensemble des états de repos et de division s'échelonne de 1 jour à 3 ans, et est notamment de 1 jour à 15 jours.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'ensemble des cycles de repos et de division d'un procédé de multiplication dure de 1 à 15 jours, et les applications envisagées sont la thérapie cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation, l'ensemble des cycles de repos et de division d'un procédé de multiplication dure de 1 jour à 3 ans, et les applications envisagées sont d'ordre expérimental.
Un procédé qui dure 3 ans permet par exemple des expériences de longue durée pour étudier la sénescence.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication des cellules souches selon l'invention, et notamment des cellules souches somatiques humaines, permet d'obtenir une amplification des cellules souches d'un facteur compris d'environ 2 à environ 1012, et notamment d'environ 2 à environ 104.
Ainsi, le procédé de multiplication selon l'invention permet d'obtenir un nombre de cellules souches amplifiées et maintenues à l'état indifférencié, de 2 à 1012 fois plus important que le nombre initial de cellules souches non différenciées.
Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de culture du procédé de multiplication selon l'invention, contient des cellules souches hématopoiétiques et comprend une ou plusieurs cytokines (ajoutées dans le milieu de culture) choisies dans le groupe constitué par les interleukines et les CSF, lesdites cytokines étant présentes à une concentration allant d'environ 10~8 μg/ml à environ 1 mg/ml, et notamment d'environ 10"5 μg/ml à 0,1 μg/ml, et éventuellement d'autres facteurs de croissance.
Comme cytokines pouvant être ajoutées dans le milieu de culture, on citera notamment les interleukines telles que l'IL 1 à l'IL 16, les CSF (« colony-stimulating factor » (facteurs stimulant les colonies)) tels que le GM-CSF (facteur stimulant les colonies granulocytaires et monocytaires), GCSF (facteur stimulant les colonies granulocytaires), MCSF (facteur stimulant les colonies monocytaires), SF (Steel factor), la TPO (thrombopoïétine) ou le FL (Flt-3 ligand).
Des facteurs de croissance autres que les interleukines et les CSF peuvent être utilisés. Le procédé de multiplication selon l'invention des cellules souches, et notamment des cellules souches somatiques humaines, est plus particulièrement caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'initiation d'un premier cycle de division de cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées dans un milieu de culture, et notamment de cellules
souches somatiques hematopoïetiques, par ensemencement desdites cellules souches non différenciées à l'état de repos, à une forte concentration cellulaire initiale, notamment à une concentration allant de 10 à 10 cellules par ml, en présence d'une ou de plusieurs cytokines, et par la neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire, présent dans le milieu de culture, de telle sorte que les susdites cellules sortent de leur état de repos par le déclenchement d'une première division cellulaire, b) le retour au repos des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées obtenues à l'étape précédente, à l'aide d'un inhibiteur du développement cellulaire, ledit inhibiteur étant synthétisé par lesdites cellules souches, ou étant ajouté dans le milieu de culture, c) le lavage éventuel des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées obtenues à l'étape précédente, afin d'éliminer les catabolites et l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment l'inhibiteur de la prolifération cellulaire éventuellement présents dans le milieu de culture, d) la dilution éventuelle des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées obtenues à l'étape précédente afin de maintenir une concentration cellulaire optimale allant d'environ 100 à 101 cellules par ml, e) la répétition successive des cycles de division et de repos décrits ci-dessus jusqu'à ce que le facteur d'amplification des cellules soit suffisant pour obtenir le
1 nombre de cellules souches souhaitées, et notamment soit de 2 fois à environ 10 fois le nombre de cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées initiales, ce qui correspond à une durée totale du procédé de multiplication d'environ 1 jour à 3 ans, et notamment de 1 jour à 15 jours, f) l'arrêt de la multiplication des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées pour les stocker, les utiliser ou les faire se différencier in vitro.
Les modalités des différentes étapes du procédé de multiplication des cellules souches selon l'invention sont celles déjà décrites ci-dessus.
Ainsi, la quantité d' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire ajoutée dans le milieu de culture, ou la quantité d'inhibiteur du développement cellulaire retirée du milieu de culture contenant les cellules souches, doit être suffisante afin qu'il y ait déclenchement d'une première division cellulaire.
Selon un mode de réalisation préféré, l'inhibiteur du développement cellulaire est le TGF-β ; le TGF-β est synthétisé par les cellules souches somatiques hématopoiétiques elles-mêmes en une quantité allant de 0,01 pg à 1 ng/ml.
Le TGF-β est ensuite neutralisé par l'ajout dans le milieu de culture d'un anti- inhibiteur de la prolifération cellulaire : l'anti-TGF-β. L'anti-TGF-β est ajouté en une quantité allant de 0,1 μg à 100 μg/ml d'anticorps ou 0,1 μM à 10 μM d'oligonucléotides.
Le retour au repos des cellules souches somatiques hématopoiétiques, notamment décrit dans l'étape b) ci-dessus, est obtenu par le TGF-β synthétisé par lesdites cellules souches elles-mêmes (ou d'autres inhibiteurs ajoutés). L'étape de lavage © décrite ci-dessus permet notamment de neutraliser l'inhibiteur TGF-β formé au cours ou à la fin d'un cycle de division précédent afin de permettre la division suivante.
L'étape de dilution (d) décrite ci-dessus, maintenant une concentration cellulaire optimale permet à la fois : - le retour rapide à l'état de repos des cellules souches, dû à une synthèse rapide desdites cellules de rinhibiteur du développement cellulaire, notamment du TGF-β,
- une division non moins rapide des cellules souches après chaque état de repos, en présence d' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire, notamment d'anti-TGF-β.
Le TGF-β ralentit le processus de différenciation des cellules souches tout au long du procédé de multiplication, à savoir au cours et à la fin des différents cycles de repos et de division.
L'étape d'arrêt f) décrite ci-dessus peut être effectuée en lavant lesdites cellules souches ainsi multipliées, en les congelant, ou en les mettant dans un milieu de différenciation. Le milieu de différenciation dans lequel sont mises les cellules souches ainsi multipliées et maintenues dans un état indifférencié selon le procédé de la présente invention, est choisi en fonction du tissu ou de l'organe que l'on cherche à reconstituer.
Par exemple, si l'on veut obtenir des cellules érythroïdes, on utilisera un milieu de culture contenant de l'érythropoiétine (EPO). Le procédé de multiplication selon l'invention permet d'obtenir des productions importantes de cellules souches, lesdites cellules souches étant maintenues dans un état indifférencié au cours des différents cycles de repos et de division dudit procédé. On obtient ainsi des productions importantes de cellules immatures sous un volume réduit.
La présente invention a pour objet l'utilisation des cellules souches humaines non différenciées et amplifiées telles qu'obtenues selon le procédé de l'invention décrit ci- dessus, pour reconstituer du sang humain et/ou des tissus solides ou organes humains.
Ainsi, les cellules souches humaines non différenciées et amplifiées telles qu'obtenues selon le procédé de l'invention, peuvent notamment être utilisées pour amplifier des prélèvements insuffisants de sang de cordon ombilical, de moelle osseuse ou de sang périphérique, ou pour la transplantation de cellules souches hématopoiétiques .
Les cellules souches humaines non différenciées et amplifiées telles qu'obtenues selon le procédé de l'invention, peuvent également servir pour des études sur le génome humain (expression et fonction des gènes du développement humain).
Légende des figures
Les figures 1A et 1B représentent l'effet du TGF-β sur le maintien de l'état indifférencié des cellules CD34+. Le colorant PKH26 qui se fixe à la membrane des cellules permet de déterminer le nombre de divisions que la cellule a effectué : après un doublement de la cellule, l'intensité du colorant est divisée par 2, après 2 doublements par 4 etc... On obtient ainsi différentes populations se déplaçant vers la droite.
En conditions de culture sans TGF-β (20 000 cellules par ml) (Fig. 1A), les cellules se divisent et après 3 jours, les cellules qui se sont divisées plus d'une fois ne contiennent que 1.1% de cellules CD34+fort.
En conditions de culture selon l'invention, la concentration de TGF-β étant plus élevée (30 pg/ml de TGF-β) (Fig. 1B), on observe un pourcentage plus élevé de cellules
CD34+fort
EXEMPLE : PROCEDE DE MULTIPLICATION DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOÏETIQUES
Matériels et méthodes
Les cellules souches utilisées dans l'exemple ci-dessous sont plus particulièrement des cellules souches somatiques humaines hematopoïetiques provenant de sang de cordon ombilical et caractérisées par le marqueur de membrane CD34+. Dans ce qui suit, lesdites cellules seront dénommées « cellules CD34+ ». 1) Marquage des cellules CD34+
Les cellules CD34+ sont diluées dans PBS (phosphate buffer saline) / BSA (bovine sérum albumine) (0,2%) et incubées avec des anticorps anti-CD34+ conjugués à du FITC (fluoroisothiocyanate)(clone 8G12; Becton Dickinson, San José, CA) pendant 30 minutes à 4°C puis lavées 2 fois en PBS/BSA. Le contrôle est constitué par des cellules incubées avec des IgGl non spécifiques conjuguées au FITC.
Pour détecter le colorant permettant de suivre la prolifération des cellules, les CD34+ sont marquées avec le colorant PKH26 (Sigma, France) selon les instructions du fabricant. Les cellules avec une intensité moyenne de PKH26 sont triées dans une fenêtre représentant environ 10% de la largeur complète. Ceci correspond environ à 20% des cellules CD34+. Quatre aliquots de 400 cellules sont utilisées en test HPP-Q. Le reste des cellules au repos et des cellules qui prolifèrent sont triées et cultivées en milieu semi-solide. Des billes calibrées (Coulter-Beckman) sont utilisées pour standardiser les analyses entre le jour 0 et le jour 3.
Description du test HPP-Q (High Proliferative Potential-Quiescent Cell) Le test HPP-Q permet de vérifier que l'inhibiteur du développement cellulaire, notamment le TGF-β, maintient les cellules souches, notamment hematopoïetiques, au repos. Plus particulièrement, le test HPP-Q consiste à déterminer le degré de maturité de cellules souches, notamment hématopoiétiques, et est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- on effectue la culture d'un premier ensemble de cellules souches, notamment hematopoïetiques, dans un milieu approprié à leur culture, ledit milieu ne contenant pas de moyens de blocage d'au moins un inhibiteur du développement cellulaire tel le TGF- β, pendant environ 14 à environ 28 jours, de préférence 18 jours,
- on effectue la culture d'un deuxième ensemble de cellules souches, notamment hématopoiétiques, de même nature et de même degré de maturité que celles mentionnées ci-dessus, dans un milieu approprié contenant des moyens de blocage d'au
moins un inhibiteur du développement cellulaire, ces moyens de blocage étant présents, dans le milieu de culture à une concentration efficace,
- on compare, 18 jours après la mise en culture de chacun des deux ensembles de cellules souches, le nombre et la nature des colonies, la différence des sommes des colonies à haut potentiel prolifératif (HPP-CFC = progéniteur formant une colonie à haut potentiel prolifératif, HPP-MEG = progéniteur mégacaryocytaire à haut potentiel prolifératif, HPP-GEMM = progéniteur granulocytaire érythrocytaire monocytaire mégacaryocytaire à haut potentiel prolifératif) respectivement dans celle du deuxième ensemble et celle du premier ensemble. L'évaluation de la maturité ou de rimmaturité de cellules souches correspond à l'observation suivante.
Après 18 jours, on observe au microscope le nombre et la nature des colonies : on compte le nombre de colonies mixtes constituées de cellules de la lignée rouge et d'un ou de plusieurs types de la lignée blanche. Le nombre de colonies mixtes est plus élevé lorsque la population cellulaire mise en culture est immature, c'est-à-dire constituée de cellules plus jeunes dont certaines sont au repos. D'autre part, plus la cellule qui a donné naissance à la colonie est immature, voire au repos, plus son potentiel de prolifération est grand, donc la colonie provenant de cette cellule une fois activée sera plus importante en taille. 2) Culture des cellules CD34+
Les cellules CD34+ ont été ensemencées à une concentration cellulaire de 106 cellules par ml dans des plaques de culture de 24 puits à raison de 1 ml par puits au jour -T0. Lesdites cellules ont été ensemencées dans un milieu sans sérum, contenant des cytokines et un inhibiteur du TGF-β (anti TGF-β).
« Milieu » :
SBA (milieu sans sérum avec albumine) +
SF(« Steel Factor ») 10 ng/ml
TPO (Thrombopoiétine) 10 ng/ml
FL (Ligand FLt3) 50 ng/ml
IL6 (Interleukine 6) 10 ng/ml
Anti-TGFβ 4 μg/ml
Les cellules CD34+ sont incubées à 37°C dans une atmosphère avec 5% de CO2 et une saturation d'humidité à 97%. Tous les 2 jours, le volume de la culture est mesuré, le nombre de cellules CD34+ est compté, et la viabilité desdites cellules est déterminée.
Après avoir compté le nombre de cellules CD34+ contenues dans la culture, on enlève le volume nécessaire pour ne laisser que 10 cellules par puits.
On réajuste le milieu en volume, en cytokines ou facteurs de croissance et en inhibiteur du TGF-β.
Tous les 8 jours, un tri est effectué pour évaluer les cellules CD34+ et CD38" et la capacité proliférative des cellules CD34+ est évaluée en test HPP-Q.
Régulièrement, les résultats du test HPP-Q sont confirmés par un test en souris immunodéficientes (SCID-NOD). Le protocole du procédé selon l'invention permet de cultiver les cellules dans un microbioréacteur qui maintient les conditions de milieux constantes pour ce qui est des catabolites et anabolites (cytokines et inhibiteurs exclus).
L'ensemencement des cellules CD34+ à une forte concentration cellulaire permet de créer un bioréacteur à forte concentration cellulaire, et ainsi de réduire les volumes de culture.
Principe du bioréacteur ou microbioréacteur
Le microbioréacteur est constitué d'une chambre de culture, de taille adaptée au nombre de cellules et à leur densité cellulaire (1 à 100 ml), séparée d'une chambre de dialyse par une membrane, et éventuellement d'une chambre gazeuse par une autre membrane, pour maintenir constants les constituants du milieu.
Des micro détecteurs permettent de contrôler différents paramètres dans la chambre de culture : pH, CO , O2, glucose, lactate, etc.
Des entrées et des sorties permettent de renouveler ou de modifier les milieux de cultures, ou d'ajouter ou de retirer des cellules.
L'ensemble du microbioréacteur peut être automatisé par des pompes et des programmateurs informatisés.
Claims
1. Utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de façon contrôlée pour maintenir l'état indifférencié de cellules souches, notamment de cellules souches humaines, tout en permettant leur division cellulaire.
2. Utilisation d'un inhibiteur selon la revendication 1, dans laquelle les cellules souches sont des cellules humaines choisies dans le groupe constitué par les cellules souches embryonnaires à l'origine des cellules souches somatiques, et/ou les cellules souches/progéniteurs somatiques elles/eux mêmes à l'origine du sang et/ou de différents tissus solides tels que la peau, le foie, le pancréas, le cœur, le rein, l'os, ou du tissu nerveux.
3. Utilisation d'un inhibiteur selon la revendication 1 ou la revendication 2, dans laquelle l'inhibiteur du développement cellulaire est choisi dans le groupe constitué par les produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement, et les cytokines (tels que les interférons, le TGFβ).
4. Utilisation d'un inhibiteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, en association séquentielle avec un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire, pour déclencher un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment pour déclencher une seule division cellulaire, tout en maintenant l'état indifférencié des cellules souches, notamment des cellules souches humaines.
5. Procédé de multiplication de cellules souches dans un milieu de culture, notamment de cellules souches humaines, caractérisé en ce qu'il comprend : une étape dans laquelle les cellules souches, notamment les cellules souches humaines, à l'état de repos sont sorties de leur état de repos par la neutralisation de l'effet d'un inhibiteur du développement cellulaire, et notamment d'un inhibiteur de la prolifération cellulaire produit par les cellules et/ou présent dans le milieu de culture, de telle sorte qu'il y ait déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire,
- et, une étape dans laquelle les cellules souches, notamment les cellules humaines, obtenues à l'étape précédente sont inhibées dans leur différenciation à l'aide d'un inhibiteur du développement cellulaire.
6. Procédé de multiplication selon la revendication 5, caractérisé en ce que à l'issue du procédé de multiplication, les cellules souches ainsi multipliées sont maintenues dans un état indifférencié.
7. Procédé de multiplication selon la revendication 5, caractérisé en ce que les cellules souches sont des cellules humaines choisies dans le groupe constitué par les cellules souches embryonnaires à l'origine des cellules souches somatiques, et les cellules somatiques elles mêmes à l'origine du sang et/ou des différents tissus solides tels que la peau, le foie, le pancréas, le cœur, le rein, l'os, ou du tissu nerveux.
8. Procédé de multiplication selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que les cellules souches, notamment les cellules humaines, sont présentes à une concentration cellulaire d'environ 1 à environ 1010 cellules par ml, et notamment à une concentration allant d'environ 103 à environ 1010 cellules par ml, et plus particulièrement d'environ 104 à environ 109 cellules par ml.
9. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que l'inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé par les cellules souches, notamment les cellules souches humaines, et/ou est ajouté dans le milieu de culture contenant les cellules souches, notamment les cellules souches humaines.
10. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
9, caractérisé en ce que l'inhibiteur du développement cellulaire est choisi dans le groupe constitué par les produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à- vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement, et les cytokines (tels que les interférons, le TGFβ)
11. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
10, caractérisé en ce que l'inhibiteur du développement cellulaire est présent à une faible concentration dans le milieu de culture contenant les cellules souches, et notamment à une concentration allant d'environ 10"10 mg/ml à 1 mg/ml.
12. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
11, caractérisé en ce que la neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire, présent dans le milieu de culture, est effectuée par - l'addition dans le milieu de culture, en quantité appropriée, d'un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire tel qu'un anti-TGF-β, et/ou
- le retrait du milieu de culture de rinhibiteur du développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire, appartenant notamment au groupe des cytokines.
13. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
12, caractérisé en ce que l' anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire est présent en une concentration allant d'environ 10"18 à environ 10"3 g/ml.
14. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
13, dans lequel le milieu de culture contient des cellules souches hématopoiétiques et comprend une ou plusieurs cytokines (ajoutées dans le milieu de culture) choisies dans le groupe constitué par les interleukines et les CSF, lesdites cytokines étant présentes à une concentration allant d'environ 10"8 μg/ml à environ 1 mg/ml, et notamment d'environ 10"5 μg/ml à 0,1 μg/ml.
15. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'initiation d'un premier cycle de division de cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées dans un milieu de culture, et notamment de cellules souches somatiques hematopoïetiques, par ensemencement de cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées à l'état de repos, à une forte concentration cellulaire initiale, notamment à une concentration allant de 103 à 1010 cellules par ml, en présence d'une ou de plusieurs cytokines, et par la neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire, présent dans le milieu de culture, de telle sorte que les susdites cellules sortent de leur état de repos par le déclenchement d'une première division cellulaire, b) le retour au repos des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées obtenues à l'étape précédente, à l'aide d'un inhibiteur du développement cellulaire, ledit inhibiteur étant synthétisé par lesdites cellules souches, ou étant ajouté dans le milieu de culture, c) le lavage éventuel des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées obtenues à l'étape précédente, afin d'éliminer les catabolites et l'inhibiteur du développement cellulaire, et notamment l'inhibiteur de la prolifération cellulaire éventuellement présents dans le milieu de culture, d) la dilution éventuelle des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées obtenues à l'étape précédente afin de maintenir une concentration cellulaire optimale allant d'environ 100 à 1010 cellules par ml, e) la répétition successive des cycles de division et de repos décrits ci-dessus jusqu'à ce que le facteur d'amplification des cellules soit suffisant pour obtenir le nombre de cellules souches souhaitées, et notamment soit de 2 fois à environ 1012 fois le nombre de cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées initiales, ce qui correspond à une durée totale du procédé de multiplication d'environ 1 jour à 3 ans, et notamment de 1 jour à 15 jours, f) l'arrêt de la multiplication des cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées pour les stocker, les utiliser ou les faire se différencier in vitro.
16. Procédé de multiplication selon l'une quelconque des revendications 5 à
15, caractérisé en ce que la durée d'un seul état de repos s'échelonne d'environ 1 heure à 3 ans, et est notamment d'environ 6 heures à 72 heures, et en ce que la durée d'un seul cycle de division s'échelonne d'environ 6 heures à 3 ans, et est notamment d'environ 6 heures à 24 heures.
17. Utilisation des cellules souches humaines non différenciées et amplifiées telles qu'obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 5 à 16, pour reconstituer du sang humain et/ou des tissus solides ou organes humains.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9907011 | 1999-06-03 | ||
| FR9907011A FR2794473B1 (fr) | 1999-06-03 | 1999-06-03 | Procede de multiplication de cellules souches |
| PCT/FR2000/001486 WO2000075290A1 (fr) | 1999-06-03 | 2000-05-30 | Procede de multiplication de cellules souches |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EP1181354A1 true EP1181354A1 (fr) | 2002-02-27 |
Family
ID=9546326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP00936985A Withdrawn EP1181354A1 (fr) | 1999-06-03 | 2000-05-30 | Procede de multiplication de cellules souches |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7601534B1 (fr) |
| EP (1) | EP1181354A1 (fr) |
| JP (1) | JP2003501081A (fr) |
| CA (1) | CA2375485A1 (fr) |
| FR (1) | FR2794473B1 (fr) |
| WO (1) | WO2000075290A1 (fr) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2556266A1 (fr) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Stem Cell Therapeutics Corp. | Utilisation de l'hormone de luteinisation (lh) et de la gonadotropine chorionique (hcg) pour la proliferation de cellules souches neuronales et la neurogenese |
| EP2319531A3 (fr) * | 2004-10-07 | 2011-09-07 | Stem Cell Therapeutics Corp. | Stimulation de la proliferation de cellules souches pluripotentes par administration de composés associés à la gestation |
| KR20080106976A (ko) * | 2006-03-17 | 2008-12-09 | 스템 셀 테라퓨틱스 코포레이션 | 신경 줄기 세포 증식제 및 신경 줄기 세포 분화제의 연속 투여 방법 |
| EP2412800A1 (fr) | 2010-07-29 | 2012-02-01 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | Organoïde du foie, ses utilisations et son procédé de culture pour l'obtenir |
| GB201111244D0 (en) * | 2011-06-30 | 2011-08-17 | Konink Nl Akademie Van Wetenschappen Knaw | Culture media for stem cells |
| EP2393917B1 (fr) | 2009-02-03 | 2016-04-06 | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen | Milieu de culture de cellules souches épithéliales et organoïdes comprenant lesdites cellules souches |
| WO2011069091A1 (fr) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Boston Biomedical Research Institute, Inc. | Procédé de clonage de cellules souches pluripotentes |
| US9164079B2 (en) * | 2011-03-17 | 2015-10-20 | Greyledge Technologies Llc | Systems for autologous biological therapeutics |
| JP6095272B2 (ja) | 2011-03-25 | 2017-03-15 | 国立大学法人京都大学 | 上皮系体性幹細胞の製造方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08205860A (ja) * | 1994-01-21 | 1996-08-13 | Usa Government | 造血細胞の膨大化および移植方法 |
| DE4422667A1 (de) * | 1994-06-30 | 1996-01-04 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Züchtung hämatopoetischer Vorläuferzellen |
| WO1997033978A1 (fr) * | 1996-03-12 | 1997-09-18 | Life Technologies, Inc. | Additif pour milieu de culture nutritif pour cellules hematopoietiques |
| EP0834556A1 (fr) * | 1996-09-25 | 1998-04-08 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Procédés de culture de cellules |
| JPH10136978A (ja) * | 1996-11-08 | 1998-05-26 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 造血幹細胞の培養方法 |
| US6084060A (en) * | 1996-12-09 | 2000-07-04 | Imclone Systems Incorporated | Composition and method for preserving progenitor cells |
| JPH10295369A (ja) * | 1997-02-26 | 1998-11-10 | Japan Tobacco Inc | 造血幹細胞の製造方法 |
-
1999
- 1999-06-03 FR FR9907011A patent/FR2794473B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-05-30 EP EP00936985A patent/EP1181354A1/fr not_active Withdrawn
- 2000-05-30 CA CA002375485A patent/CA2375485A1/fr not_active Abandoned
- 2000-05-30 JP JP2001502556A patent/JP2003501081A/ja active Pending
- 2000-05-30 WO PCT/FR2000/001486 patent/WO2000075290A1/fr active Application Filing
- 2000-05-30 US US09/980,484 patent/US7601534B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-09-08 US US12/555,062 patent/US20090325289A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| AMIT M ET AL: "Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells.", BIOLOGY OF REPRODUCTION MAR 2004 LNKD- PUBMED:14627547, vol. 70, no. 3, March 2004 (2004-03-01), pages 837 - 845, ISSN: 0006-3363 * |
| AVERY STUART ET AL: "The regulation of self-renewal in human embryonic stem cells.", STEM CELLS AND DEVELOPMENT OCT 2006 LNKD- PUBMED:17105408, vol. 15, no. 5, October 2006 (2006-10-01), pages 729 - 740, ISSN: 1547-3287 * |
| BEATTIE GILLIAN M ET AL: "Activin A maintains pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers.", STEM CELLS (DAYTON, OHIO) APR 2005 LNKD- PUBMED:15790770, vol. 23, no. 4, April 2005 (2005-04-01), pages 489 - 495, ISSN: 1066-5099 * |
| FORTUNEL N ET AL: "Specific dose-response effects of TGF-beta1 on developmentally distinct hematopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood.", THE HEMATOLOGY JOURNAL : THE OFFICIAL JOURNAL OF THE EUROPEAN HAEMATOLOGY ASSOCIATION / EHA 2000 LNKD- PUBMED:11920180, vol. 1, no. 2, 2000, pages 126 - 135, ISSN: 1466-4860 * |
| HATZFELD MECHTHILD ET AL: "Targeting of p0071 to desmosomes and adherens junctions is mediated by different protein domains.", JOURNAL OF CELL SCIENCE 1 APR 2003 LNKD- PUBMED:12615965, vol. 116, no. Pt 7, 1 April 2003 (2003-04-01), pages 1219 - 1233, ISSN: 0021-9533 * |
| PEIFFER I ET AL: "A sub-population of high proliferative potential-quiescent human mesenchymal stem cells is under the reversible control of interferon alpha/beta.", LEUKEMIA : OFFICIAL JOURNAL OF THE LEUKEMIA SOCIETY OF AMERICA, LEUKEMIA RESEARCH FUND, U.K APR 2007 LNKD- PUBMED:17375123, vol. 21, no. 4, April 2007 (2007-04-01), pages 714 - 724, ISSN: 0887-6924 * |
| See also references of WO0075290A1 * |
| VALLIER LUDOVIC ET AL: "Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.", JOURNAL OF CELL SCIENCE 1 OCT 2005 LNKD- PUBMED:16179608, vol. 118, no. Pt 19, 1 October 2005 (2005-10-01), pages 4495 - 4509, ISSN: 0021-9533 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000075290A1 (fr) | 2000-12-14 |
| FR2794473A1 (fr) | 2000-12-08 |
| FR2794473B1 (fr) | 2003-09-26 |
| JP2003501081A (ja) | 2003-01-14 |
| CA2375485A1 (fr) | 2000-12-14 |
| US20090325289A1 (en) | 2009-12-31 |
| US7601534B1 (en) | 2009-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4336821B2 (ja) | 哺乳動物の骨髄細胞または臍帯血由来細胞と脂肪組織を利用した心筋細胞の誘導 | |
| Ratajczak et al. | Adult murine bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells differentiate into the hematopoietic lineage after coculture over OP9 stromal cells | |
| Petzer et al. | Differential cytokine effects on primitive (CD34+ CD38-) human hematopoietic cells: novel responses to Flt3-ligand and thrombopoietin. | |
| US20090325289A1 (en) | Process for the multiplication of stem cells | |
| EP0789074B1 (fr) | Equivalent de peau comprenant des cellules de Langerhans | |
| FR2836924A1 (fr) | Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet | |
| JP2008119002A (ja) | 単球を起源に持つ、脱分化したプログラム可能な幹細胞およびそれらの製造と使用 | |
| KR20040029311A (ko) | 다능성 줄기 세포의 동종이식편의 내성화 | |
| WO2021049617A1 (fr) | Milieu exempt de sérum ne contenant pas d'albumine et approprié pour la culture de cellules souches hématopoïétiques humaines, et procédé de culture sans albumine | |
| CN103442724A (zh) | 含有可从机体组织中分离的ssea-3阳性的多能干细胞的同种异体移植用细胞治疗用组合物 | |
| EP0800575B1 (fr) | Procede de transfert de gene dans des cellules activees a partir d'un etat de repos | |
| Can et al. | A completely human-derived biomaterial mimicking limbal niche: Platelet-rich fibrin gel | |
| JP2001321434A (ja) | 人工骨髄、血球細胞の増殖方法 | |
| Wu et al. | Contribution of mesenchymal progenitor cells to tissue repair in rat cardiac allografts undergoing chronic rejection | |
| FR2665175A1 (fr) | Equivalent d'epiderme, son procede d'obtention et son utilisation. | |
| EP2454363B1 (fr) | Procédé d'utilisation de cellules directrices pour l'activation et la différentiation de cellules souches/progénitrices spécifiques | |
| JP6446222B2 (ja) | 軟骨分化培養液、及び軟骨組織の製造方法 | |
| US6737051B1 (en) | Cell compositions containing macrophages, presenting anti-infectious and hematopoietic properties | |
| US20230081733A1 (en) | Methods for preparing keratinocytes | |
| CN116635091A (zh) | 胸腺构建体及其用途 | |
| WO2019180394A1 (fr) | Nouvelle méthode d'obtention de cellules t à partir de cellules souches pluripotentes, et leurs utilisations | |
| FR2843123A1 (fr) | Cellules souches issues de tissu adipeux humain | |
| WO2021227573A1 (fr) | Milieu de culture exempt de xeno et procédé de multiplication de cellules souches mésenchymateuses au moyen de celui-ci | |
| EP2201103B1 (fr) | Traitement de tumeurs par des preparations de lymphocytes t | |
| WO2021039882A1 (fr) | Procédé de culture d'une population cellulaire contenant des cellules souches/progénitrices positives tie2 à l'aide d'un substrat de culture et utilisation correspondante |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
| 17P | Request for examination filed |
Effective date: 20011123 |
|
| AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE |
|
| AX | Request for extension of the european patent |
Free format text: AL;LT;LV;MK;RO;SI |
|
| 17Q | First examination report despatched |
Effective date: 20051122 |
|
| RIC1 | Information provided on ipc code assigned before grant |
Ipc: C12N 5/0789 20100101AFI20110916BHEP |
|
| STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
| 18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 20111201 |