KR101926114B1

KR101926114B1 - 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법

Info

Publication number: KR101926114B1
Application number: KR1020170068792A
Authority: KR
Inventors: 전병희
Original assignee: 주식회사 싸이토젠
Priority date: 2016-11-10
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2018-12-06
Also published as: KR20180052508A

Abstract

본 발명은 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 고밀도 마이크로칩을 이용해서 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 분리 검출하고, 분리된 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 단기배양을 통해 동시 배양 과정을 거친 후 T세포 수용체의 클론형을 분석할 수 있다.

Description

맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법 {A METHOD FOR ANALYZING IMMUNE CELLS FOR CUSTOMIZED CANCER THERAPY}

본 발명은 암환자의 맞춤형 치료를 위한 암환자 면역세포 분석방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 암환자 면역세포의 분리 및 단기배양을 통한 유전자 분석방법에 관한 것이다.

암을 치료하는 방법은 크게 수술치료, 항암화학요법, 방사선치료 세 가지로 구분이 되며, 이외에 국소치료법, 호르몬요법, 광역학치료법, 레이저치료법 등이 있다. 최근에는 면역요법, 유전자요법까지 포함시키기도 한다. 또한 색전술, 면역치료, 동위원소치료 등이 나오고 있다. 수술치료는, 치료 효과를 얻기 위하여 시행하는 근치적 수술, 예방적 효과를 얻기 위해 시행하는 예방적 수술과 증상의 완화를 위해 시행하는 완화적 수술이 있다. 항암화학요법은 암세포를 죽이는 약물, 즉 항암제를 사용하는 것으로 전신에 작용하는 치료방법이며, 방사선 치료는 방사선으로 암 덩어리에 충격을 주어 암세포를 죽이는 치료 방법이다.

특히, 항암화학요법이 가장 많이 쓰이고 있는데, 항암화학요법의 목표는 암세포를 파괴하여 다시 재발하지 못하게 하는 암의 치료(완치)에 있다. 림프종, 급성림프성백혈병, 그리고 고환암 등은 완치를 목적으로 항암 화학요법을 시행하는 대표적인 사례이다. 항암요법에 쓰이는 항암제에는 세포 주기 중 어느 특정 주기에 있는 세포에만 작용하는 세포주기 특이약제(cell-cycle-specific drug, 예를 들면 M이나 S상에 작용)와 증식상에 있는 세포에는 주기에 관계없이 작용하는 세포주기 비특이약제(cell-cycle-nonspecific drug)가 있다. 이들 항암제는 DNA와 RNA의 합성 과정과 유사분열을 방해하거나 DNA 분자 자체에 해로운 영향을 미쳐서 암세포를 죽인다. 그러나 항암화학요법은 암 세포뿐만 아니라 정상세포 중 분열과 증식이 활발한 부분인 위장관의 점막, 머리카락, 골수, 생식계의 세포들에도 영향을 미치기 때문에 건강한 세포의 손상은 항암화학요법 부작용의 원인이 될 수 있다.

근래에 부각되고 있는 암면역치료는 암백신치료(cancer vaccine therapy)부터 단일클론항체치료(monoclonal antibody therapy), 입양면역치료(adoptive cell therapy) 또는 세포치료(cell therapy)까지 매우 광범위한 영역을 포함한다. 암면역치료는 종양 면역감시체계라는 개념에서 비롯되었는데, 종양 면역감시체계란 종양세포가 그 발생 및 성장 단계에서 숙주의 면역세포 중 T-세포에 의해 처음 인식이 되고, 이 T-세포에서 인터페론 감마 등이 분비되어 면역세포들을 동원하여 종양세포를 죽이게 된다는 내용이다. 그리고 종양세포는 적극적으로 T-세포의 관용(T-cell tolerance)을 유도하여 재분포되고 성장을 하는 “암 면역편집(immunoediting)” 과정을 겪게 된다. 이후, 암 면역학분야에서는 이러한 암세포와 면역세포의 상호작용을 응용하여 종양에 대한 면역요법(immune therapy)을 개발하고자 하는 노력이 지속되어 왔다

암면역치료는 단일클론항체, 사이토카인 또는 면역세포와 같은 체외에서 만들어진 면역성분을 투여함으로써 체내 면역기능의 역할을 하거나 또는 면역기능을 자극하거나 유도함으로써 그 효과를 보인다. 암면역치료에는 암 면역치료는 크게 능동(active)과 수동(passive) 면역치료법으로 나눌 수 있다.

수동면역치료는 이미 형성된 항체(Ab), 사이토카인(cytokine) 또는 T세포들을 투여하여 이들이 직간접적으로 암세포를 제거하게 하는 방법이다. 최근에는 항체(Ab)나tumor - infiltrating lymphocyte(TIL)와 같이 암을 특이적으로 공격할 수 있는 Ab와 TIL를 in vitro에서 다량 만들어 환자에게 주입하는 방법이 있다. 능동면역치료는 환자로 하여금 암 특이 면역반응을 백신을 투여해 생성하게 하는 것으로 암항원을 이용해 암항원 특이적(specific) 면역 반응을 유도하는 것과 BCG 투여 같은 비특이(nonspecific) 적으로 면역반응을 유도하는 두 종류가 있다. 특이적 면역치료법을 수행함에 있어 선행되어야 할 과제는 종양세포에서 발현하는 단백질 중에서 효과적으로 면역 반응을 유도할 수 있는 '종양 세포 관련 항원(Tumor Associated Antigen, TAA)'을 찾는 것이다. 방법적으로는 우선 종양 세포로부터 얻은 유전자를 항원 제시 분자인 MHC를 발현하는 세포에 주입한 다음 종양 세포 특이적인 림프구와 반응하여 활성화시킬 수 있는 항원을 찾는 방법이 있다. 두 번째는 암환자의 종양세포로부터 추출한 펩타이드 (peptide)를 항원 제시 세포에 적재하여 특정항암 림프구와 반응시켜 활성 정도를 확인하여 알 수 있다. 최근에는 생체내의 주요 항원제시세포로서 innate immunity와 adaptive immunity를 중개할 수 있는 수지상세포를 이용한 암백신 개발이 활발이 진행되고 있다. 이는 환자의 골수나 혈액에서 수지상세포를 분리한 다음 실험관에서 다양한 방법으로 종양 세포 관련 항원을 적재하고 이들을 활성화시켜 다시 환자에게 주입하는 방법이다. 비특이적 면역치료법은 생체 내 면역 반응, 특히 T 세포의 활성과 분화에 중요한 면역 보조 자극제를 이용하여 암환자의 전반적인 면역력을 향상시키는 방법이라 할 수 있다.

이러한 혁신적인 면역치료법에 있어서 가장 큰 한계로 지적되는 것 중 하나가 암 특이적인 면역반응으로 암세포를 완전히 제거하는데 양적/질적 측면에서 한계가 존재한다는 것이다. 이는 면역치료를 위해 환자로부터 면역세포를 수득하기 위해, 암조직 생검을 물리적으로 떼어내서 확보하는 방법을 사용하는데 이러한 과정을 반복하기가 상당히 힘들기 때문이다. 즉, 암환자의 면역세포를 확보하기 위해서 사용하는 조직생검은 환자의 조직 일부를 확보하는 것을 의미하며, 이는 곧 조직검사를 해야한다는 것을 의미한다. 이러한 조직검사는 환자에게 상당한 부담이 되기 때문에 반복적으로 수행하기 매우 어렵고 따라서 암환자의 면역세포를 충분히 확보하는데 어려움이 생길 수 밖에 없다.

또한, 암환자의 조직이 아니라 암환자의 체액에서도 일부 면역세포를 확보할 수 있는데, 이 방법의 한계는 확보된 면역세포가 암환자내에 존재하는 암과 상호작용이 이루어져서 암환자의 암에 특이적인 정보를 가지고 있는지 여부에 대한 불확실성이 존재한다는 점이다.

따라서, 암환자에 부담을 주지 않으면서 동시에 암환자의 암에 특이적인 면역세포를 확보하는 기술이 필요한 실정이다.

본 발명이 이루고자하는 기술적 과제는 종래의 암환자의 조직생검 추출방법에 대한 부담을 완화하고 보다 효율적인 암 면역치료를 위한 면역세포 분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법은,

암환자로부터 액상생검샘플을 획득하는 단계;

상기 액상생검샘플로부터 바이오칩을 이용하여 면역세포 및 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계;

상기 분리된 면역세포와 혈중 순환 암세포를 단기배양하는 단계;

상기 단기배양된 면역세포로부터 핵산분자를 분리하여 증폭시키는 단계;

상기 증폭된 핵산분자의 염기서열을 분석하여 상기 액상생검샘플의 클론형 프로필을 생성하는 단계;

상기 생성된 클론형 프로필을 기반으로 클론형 발생빈도를 분석하는 단계;

상기 분석된 클론형 발생빈도를 빈도수에 따라 순위를 결정하는 단계; 및

상기 결정된 순위를 기반으로 상기 면역세포의 클론형을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 액상생검샘플은 혈액일 수 있다.

상기 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 분리하는 단계는 대기압 1000내지 1020hPa하에서 이루어질 수 있다.

상기 단기배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 인슐린의 농도는 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 트랜스페린의 농도는 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 상피성장인자의 농도는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 ROCK 억제제의 농도는 3 내지 30μM인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 단기배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 바이오칩은 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 고밀도 마이크로칩은 사이즈 특이성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 BSA용액 코팅은 0.05내지0.15% 농도로 코팅되는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 면역세포는 T 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 핵산분자 염기서열은 면역세포 수용체의 핵산분자 염기서열인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 면역세포 분석방법은 암환자를 진단, 스크리닝, 모니터링 또는 예후예측을 위한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 환자로부터 액상생검을 이용하여 T세포 수용체(T cell Receptor, TCR)의 클론형을 분석함으로써 환자에 대한 부담을 덜어주고 또한 환자의 암 상태를 그대로 반영한 T세포 수용체를 획득 및 분석하여 암치료를 위한 면역세포 분석을 보다 효율적으로 할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도1은 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도2는 고밀도 마이크로칩에 의해 분리된 혈중 순환 암세포를 찍은 사진이다.
도3은 본 발명에 따른 배양액에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양액에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도4는 본 발명에 따른 배양액을 이용하여, 본 발명에서 사용된 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 암세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도5는 본 발명에 따라 분리된 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 본 발명의 따른 배양액으로 배양한 결과를 나타낸 그림이다.
도6은 비소세포폐암 환자에서 채취한 암조직샘플의 T세포 수용체의 클론형과, 혈중 순환 암세포와 동시배양된 T세포 수용체의 클론형이 overlap되는 부분을 나타내는 그림이며, (a)는 환자104번(subject 104), (b)는 환자 105번(subject 105)에서의 실험데이터를 의미한다.
도7은 비소세포폐암 환자에서 채취한 암조직샘플의 T세포 수용체의 클론형과, 혈중 순환 암세포와 동시배양된 T세포 수용체의 클론형이 overlap되는 부분을 나타내는 그림이며, (a)는 환자106번(subject 106), (b)는 환자 107번(subject 107)에서의 실험데이터를 의미한다.
도8은 비소세포폐암 환자에서 채취한 암조직샘플의 T세포 수용체의 클론형과, 혈중 순환 암세포와 동시배양된 T세포 수용체의 클론형이 overlap되는 부분을 나타내는 그림이며, (a)는 환자108번(subject 108), (b)는 환자 109번(subject 109)에서의 실험데이터를 의미한다.
도9는 각각의 비소세포폐암 환자에서 채취한 암조직샘플의 T세포 수용체의 클론형과, 혈중 순환 암세포와 동시배양된 T세포 수용체의 클론형이 각각의 다른 비소세포폐암환자 서로에 대해T세포 수용체의 클론형이 일치하는지 여부를 나타내는 주는 그림이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 일측면에 따른 맞춤형 암치료를 위한 면역세포분석 기반 암환자 판별방법은 (a) 암환자로부터 액상생검샘플을 획득하는 단계 (b) 상기 액상생검샘플로부터 바이오칩을 이용하여 면역세포 및 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계 (c) 상기 분리된 면역세포와 혈중 순환 암세포를 단기배양하는 단계 (d) 상기 단기배양된 면역세포로부터 핵산분자를 분리하여 증폭시키는 단계 (e) 상기 증폭된 핵산분자의 염기서열을 분석하여 상기 액상생검샘플의 클론형 프로필을 생성하는 단계 (f) 상기 생성된 클론형 프로필을 기반으로 클론형 발생빈도를 분석하는 단계 및 (g) 상기 분석된 클론형 발생빈도를 빈도수에 따라 순위를 결정하는 단계 (h) 상기 결정된 순위를 기반으로 상기 면역세포의 클론형을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 액상생검이란, 천자나 절개 등의 침습적인 시술 없이 혈액이나 복수 등 체액에 있는 암의 유전자조각을 채취하는 검사를 의미한다. 즉, 상기 액상생검은 혈액 등의 체액 검사만으로 신체 부위별 혈액이나 복수내에 존재하는 암세포 유래 DNA를 분석하여 암 발생 및 전이 등에 대한 상세한 관찰이 가능하게 해줄 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 액상생검을 위한 샘플은 혈액, 활액, 복수, 흉막액, 뇌척수액, 복막액을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 액상 생검 샘플은 혈액일 수 있다.

상기 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cells, CTC)란, 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포를 의미한다. 혈중 순환 암세포들은 매우 드물고 구할 수 있는 표본의 양이 매우 제한된다. 혈중 순환 암세포의 검출 및 특성해석에서의 기술은 다중역전사정량중합효소연쇄반응 방법들, 영상화 기반 접근법들, 그리고 미세여과법 및 마이크로칩 장치들을 포함하며 이제 국한되지 않는다. 혈중 순환 암세포는 액상생검검체로 개별화된 치료와 치료 후 경과관찰을 필연적으로 제공할 수 있는 종양생물학적 표지자로 작용할 수 있다. 또한, 혈중 순환 암세포는 종양의 생물학적 특성 및 종양세포의 파종을 이해하기 위한 표적으로 사용될 수 있지만 이에 국한되지 않는다.

상기 면역세포란, 외부에서 침입한 병원균이나 이물질, 바이러스 등에 저항하여 이겨낼 수 있도록 면역력을 조절하거나 균을 직접 제거하는 세포를 말한다. 면역세포에는 미생물이나 암세포를 포식한 다음, 미생물이나 암세포의 항원을 전달하는 대식세포 표면에 제시된 미생물이나 항원을 인식, 이에 대한 항체를 생산하여 공격하는 B림프구, 외부 항원을 가진 세포를 직접 파괴하는 세포독성 T림프구 그리고 이러한 면역반응들을 조절하는 조력-T림프구와 억제 T림프구, 자연살해세포라고 불리는 NK세포, NKT, DC 등이 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 T세포, B세포, NK세포, 수지상세포 및 대식세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 면역세포는 T 세포일 수 있다.

상기 바이오 칩이란, 반도체와 같은 무기물로 된 고체 기질에 생물에서 유래된 DNA, 단백질, 효소, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포 등의 물질을 고밀도로 집적화하고 조합하여 기존의 반도체칩 형태로 만든 혼성 소자로서 생체분자의 고유한 기능을 이용하며 유전자 발현 양상, 유전자 결합, 단백질 분포 등의 생물학적 정보를 얻거나 생화학적 공정 및 반응 속도 또는 정보 처리 속도를 높이는 도구나 장치를 말한다.

상기 고밀도 마이크로칩이란, 바이오칩의 작용 원리를 기반으로 특정 사이즈의 물질을 분리해낼 수 있는 바이오칩을 말한다.

상기 고밀도 마이크로칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 혈중 순환 암세포를 포착할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5μm이 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5 μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5μm보다 작을 경우 적혈구 및 백혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5 μm보다 클 경우에는 기공의 크기가 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 크기보다 커서 혈중 순환 암세포 및 면역세포가 칩을 통과하여 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩의 기공 모양은 원형, 사각형 또는 타원 모양일 수 있으며, 바람직하게는 사각형일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩의 기공은 규칙적인 패턴으로 배열될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서 상기 고밀도 마이크로칩은 구체적으로 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리를 소재로 제작될 수 있다. 상기 기공들은 멤스(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)기술을 이용한 에칭(etching)에 의해 형성될 수 있다.

기공들 중 인접하는 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 직경보다 좁게 형성되어 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 직경에 대하여 45~65%로 형성될 수 있다. 상기 고밀도 마이크로칩은 통로를 흐르는 혈액 또는 솔루션의 압력에 의하여 변형되지 않는다.

혈액은 기공들을 통과한 후, 밖으로 배출되며 혈액 속의 혈중 순환 암세포 및 면역세포들은 기공들을 통과하지 못하고 표면에 잔류된다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 면역세포는 T 세포일 수 있다.

비표적세포들, 즉 혈중 순환 암세포 및 면역세포보다 변형률이 높은 적혈구는 기공들을 쉽게 통과한다.

혈중 순환 암세포 및 면역세포들의 여과 후, 혈중 순환 암세포 및 면역세포들은 솔루션을 역방향 또는 정방향으로 공급하여 밖으로 배출시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 솔루션은 혈중 순환 암세포 및 면역세포들의 손상을 최소화할 수 있도록 역방향으로 공급할 수 있다. 상기 솔루션은 주사기, 시린지펌프, 플런저펌프 등에 의하여 공급될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 솔루션은 혈액을 희석하는 희석제, 물(Water) 및 희석용 산으로 구성될 수 있다. 상기 솔루션의 공급에 의하여 밖으로 배출되는 혈중 순환 암세포 및 면역세포들을 컨테이너(Container), 예를 들어 시험관, 배양접시 등에 수거하여 간편하게 채집할 수 있다.

한편, 직경 7.5~15μm의 혈중 순환 암세포는 약 100mmHg의 압력이 가해질 때 직경 8μm의 관을 통과한다. 직경 8μm의 관을 통과하는 직경 15μm의 혈중 순환 암세포는 약 53%의 변형률을 갖는다. 역세척(Back washing), 즉 혈액의 흐름과 반대방향으로 솔루션을 흐르게 하여 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포를 밖으로 배출시킬 때, 혈중 순환 암세포의 변형률을 고려하면 두 기공들 사이의 간격은 4μm 이하가 바람직하다. 예를 들어, 비소세포폐암과 유방암은 그 암세포의 직경이 40μm 정도에 이르는 것으로 알려져 있다. 역세척 시 직경 40μm의 혈중 순환 암세포의 변형률을 고려하면, 두 기공들 사이의 간격은 21μm 이하로 설정하는 것이 바람직하다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포가 간격 4μm를 초과하는 두 기공들 사이에 존재할 때, 혈중 순환 암세포가 솔루션의 흐름에 의하여 변형되면서 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 또한, 직경 40μm의 암세포도 간격 21μm를 초과하는 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩에 있어서 솔루션의 압력을 고려하여 두 기공들 사이의 간격은 혈중 순환 암세포의 직경에 대하여 45~65%로 이루어진다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포는 간격이 65%를 초과, 즉 약 4.9μm를 초과하는 경우, 역세척에 의하여 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 직경 40μm의 혈중 순환 암세포는 간격이 65%를 초과, 즉 26μm를 초과하는 경우, 역세척에 의하여 두 기공들 사이의 표면으로부터 탈락되지 않을 수 있다. 두 기공들 사이의 표면에 달라붙은 혈중 순환 암세포를 강제로 탈락시키고자 솔루션의 압력을 높이는 경우, 혈중 순환 암세포의 손상이 발생되어 살아 있는 혈중 순환 암세포의 채집율이 저하된다. 직경 7.5μm의 혈중 순환 암세포에 대한 간격이 45% 미만, 즉 약 3.375μm 미만인 경우, 혈액과 솔루션의 흐름에 의하여 상기 고밀도 마이크로칩이 파손될 우려가 높다.

본 발명의 실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩에서 상기 시료가 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중 순환 암세포가 상기 고밀도 마이크로칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중 순환 암세포를 다시 한번 상기 고밀도 마이크로칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포가 포함된 용액을 고밀도 마이크로칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중 순환 암세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 고밀도 마이크로칩은, 혈중 순환 암세포가 분리될 때 상기 고밀도 마이크로칩에 의한 혈중 순환 암세포 데미지를 최소화시키거나 상기 고밀도 마이크로칩이 반복사용이 더 효율적으로 되도록 하기 위해, 또는 혈중 순환 암세포 회수율을 보다 더 효율적으로 하기 위해 특정 물질로 코팅될 수 있다. 상기 특정 물질은, 구체적으로 혈중 순환 암세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 세포에 물리적 또는 화학적으로 데미지를 주지 않는 생체재료이면 가능하다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 특정 물질은 BSA(Bovine Serum Albumin) 또는 항체일 수 있다. 상기 항체는 예를 들어 항상피세포접합분자 항체(Anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule antibody, Anti-EpCAM antibody), 항시토케라틴 항체(Anti-Cytokeratin antibody, Anti-CK antibody) 등으로 구성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 특정 물질은 BSA(Bovine Serum Albumin)일 수 있다.

상기 BSA(Bovine Serum Albumin)용액이란, 소혈청 알부민을 말한다. 분자량은 약 66.4 kDa 정도 되는 단백질로써 대부분의 동물에 많이 존재하는 단백질이다. BSA는 생화학/생물학에서 세포 배양시에 세포의 영양분으로써 첨가해줄 수 있고, 또한 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물로도 많이 쓰이며 제한효소를 사용할때 적은양의 효소(단백질)를 사용해야 하므로 용액내의 단백질 농도를 보완해주기 위하여 첨가해줄 수도 있다. 그리고 여러 생화학적 실험(Western blot, Immunocytochemistry , ELISA 등) 에서 특정 항체를 검출하고자 하는 단백질을 붙여주기 전에, 비특이적 결합(nonspecific binding), 즉 원하지 않는 단백질 혹은 원치않는 위치에 항체가 달라붙는 비특이적 결합을 막아 주기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 원심분리법을 이용하여 말초 혈액을 상기 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩에 반응시켜서 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cells;CTC)와 면역세포를 제외한 기타 생체고분자를 제거할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩을 이용한 분리는 중력으로 이루어질 수 있고, 구체적으로는 대기압 1000 내지 1020hPa에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 대기압1000 내지 1015hPa에서 이루어질 수 있다. 더 바람직하게는 대기압 1000 내지 1013hPa에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액은 상기 고밀도 마이크로칩의 상면, 하면 또는 상기 기공의 내측면에 코팅될 수 있다. 바람직하게는 상기 고밀도 마이크로칩의 상면, 하면 및 상기 기공의 내측면 모두에 코팅될 수 있다

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.05내지 0.15% 농도로 이루어 질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.08 내지 0.012% 농도로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 5내지 15분동안 처리될 수 있다. 볼 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 8내지 12분동안 처리될 수 있다.

도1을 참조해보면, 환자의 혈액에서 먼저 혈구세포를 제거하기 위해서, Ficoll용액을 반응용액에 올리고 난 뒤 원심분리를 통해 1차적으로 혈구세포를 제거한다. 이렇게 본 발명에서 불필요한 혈구세포를 1차적으로 제거한 뒤, BSA용액으로 특별 코팅된 고밀도 마이크로 칩을 이용해서 적혈구를 여과해서 순도가 높은 혈중 암세포와 면역 세포를 분리해낸다. 분리된 혈중 암세포나 면역세포는 염색을 통해 동정을 한다. 상기 BSA로 코팅된 고밀도 마이크로 칩을 이용하게 되면 본 발명에서 분리하고자 하는 혈중 암세포와 면역세포를 손상을 최소화시킨 상태로 분리시킬 수가 있고 이렇게 높은 순도의 혈중 순환 암세포와 면역세포는 본 발명의 암환자 판별 방법이 효과적으로 작용하도록 그 효율을 상당히 증대시켜 줄 수 있다.

상기 분리된 면역세포와 혈중 순환 암세포를 단기배양하는 단계는 면역세포와 혈중 순환 암세포와의 동시 배양을 통해 면역세포가 가지는 암환자 특이적인 정보를 보다 더 효율적이고 효과적으로 확보하기 위함이다. 본 발명의 일시예에 따르면, 상기 면역세포는 T세포 또는 B세포를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 T 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스퍼린, EGF(Epidermal Growth Factor) 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나로 이루어질 수 있다.

상기 인슐린은 인간의 물질대사 체계의 호르몬 중 하나이며 이자 (기관)의 랑게르한스 섬 베타 세포에서 분비되어, 혈액 속의 포도당 수치인 혈당량을 일정하게 유지시키는 역할을 한다. 혈당량이 일정 이상으로 높아지면 인슐린이 분비되며, 혈액내의 포도당을 세포 내로 유입해 다시 다당류(글리코겐)의 형태로 저장하는 작용을 촉진시킨다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 인슐린을 포함함으로써 혈중 순환 암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순환 암세포 배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인슐린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40ng/ml, 3~30ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 트랜스페린은 β글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2분자의 3가철이온과 결합하여 세포증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린수용체를 매개로 하여 세포 내로 공급하는 철 운반단백질이다. 혈청 속의 철 99% 이상은 트랜스페린과 결합하며 정상적으로는 트랜스페린의 약 1/3이 철과 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단기배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 트랜스페린을 포함함으로써 혈중 순환 암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순환 암세포 배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 트랜스페린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40 ng/ml, 3~30 ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 상피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 상피성장인자 수용체에 결합하여 세포의 성장 및 분열을 촉진시키는 폴리펩티드성 성장인자이다. 또한, 상기 상피성장인자는 단백질합성이나 RNA합성을 촉진하는 것 외에 오르니틴 탈카르복실효소를 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 단기배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 상피성장인자를 포함함으로써 혈중 순환 암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순환 암세포 배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 상피성장인자는 0.5~10ng/ml, 0.5~9ng/ml, 0.5~8ng/ml, 0.5~7ng/ml, 0.5~6ng/ml, 0.5~5ng/ml, 0.7~10ng/ml, 0.7~9ng/ml, 0.7~8ng/ml, 0.7~7ng/ml, 0.7~6ng/ml, 0.7~5ng/ml, 1~10ng/ml, 1~9ng/ml, 1~8ng/ml, 1~7ng/ml, 1~6ng/ml 또는 1~5ng/ml 일 수 있다.

상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho 키나제(ROCK)를 타겟으로 하여, 그 기능을 억제시키거나 저하시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 여기서, Rho키나제는 세린-트레오닌 키나제의 AGC패밀리(PKA/PKG/PKC)에 속하는 키나제이다. 상기 Rho 키나제는 사이토스켈레톤에 작용함으로써 세포의 운동 및 형태를 제어하는 과정에 관련되어 있다. 구체적으로는 상기 Rho 키나제는 세포의 이동 및 액틴 조직화의 조절인자로 작용할 수 있다. 상기 Rho 키나제는 당뇨병, 출혈성 뇌혈관질환, 파킨스씨 병 같은 신경변성 질환에 관련되어 있고, 상기 Rho 키나제 억제제 가 상기 Rho 키나제관련 질병들에 대한 치료 및 억제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 파수딜은 ROCK 억제제의 하나로서, 뇌혈관경련 치료를 위해 사용될 수 있으며 폐고혈압 치료에도 효과를 나타낼 수 있다. 상기 리파수딜은 상기 파수딜의 유도체로서 ROCK 억제제로 작용할 수 있으며 녹내장 또는 고안압증 치료에도 사용될 수 있다. 상기 RKI-1447은 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 상기 Y27632은 세포를 통과하여 효소의 촉매부위 결합을 위해 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 3~30μM, 3~27μM, 3~24μM, 3~21μM, 4~20μM, 4~30μM, 4~27μM, 4~24μM, 4~21μM, 4~20μM, 5~30μM, 5~27μM, 5~24μM, 5~21μM 또는 5~20μM일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 세포 배양에 사용되는 성장인자를 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 세포 배양에 사용될 수 있는 것이면 그 제한이 없으며, 구체적으로 아드레노메둘린(Adrenomedullin), 앙기오포이에틴(Angiopoietin), 자가분비 운동성 인자(Autocrine motility factor), 뼈형성단백질(Bone morphogenetic proteins), 콜로니 자극인자(Colony-stimulating factors), 표피성장인자(Epidermal growth factor), 에리트로포이에틴(Erythropoietin), 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor), 포이탈 보빈 소마토트로핀(Foetal Bovine Somatotrophin), 성장분화인자-9(Growth differentiation factor-9), 간세포성장인(Hepatocyte growth factor), 간암유래 성장인자(Hepatoma-derived growth factor), 인슐린 유사성장인자(Insulin-like growth factor),인터루킨(Interleukins), 각질세포 성장인자(Keratinocyte growth factor), 마이그레이션 자극인자(Migration-stimulating factor), 미오스타틴(Myostatin), 뉴레굴린(Neuregulins), 뉴로트로핀(Neurotrophins), 태반성장인자(Placental growth factor), 혈소판 유래 성장인자(Platelet-derived growth factor), T세포성장인자(T-cell growth factor), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin), 변형 성장인자(Transforming growth factor), 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha), 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 단기배양은 세포가 배양 플레이트 표면에 부착되게 하여 배양할 수 있거나 표면에 부착되지 못하게 하여 배양할 수도 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 세포가 배양 플레이트 표면에 부착되게 하여 배양할 경우, 상기 배양플레이트는 세포가 잘 부착하게 하기 위해 약한 음전하를 띄는 재질로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 상기 재질은 폴리스티렌(polystyrene)일 수 있다. 또한, 세포의 부착은 extracellular matrix(ECM) 단백질에 대해 특이적인 세포 표면 수용체에 의해 이루어지기 때문에, 상기 배양 플레이트는 표면이 ECM 단백질로 처리된 기질로 이루어질 수 있으며, 세포가 표면에 부착되어 자라게 할 수 있는 배양 플레이트이면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단기배양은 배양 플레이트 표면에 세포가 부착되지 못하게 하여 이루어질 수 있다. 즉, 혈중 순환 암세포는 일반적인 세포 배양 플레이트에서 배양하면 본래의 성질이 바뀌어 버릴 가능성이 있기 때문에 혈액상에서 존재하는 것과 유사한 환경을 조성해주기 위해 부유 상태로 배양될 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따른 단기배양에서 사용되는 상기 배양 플레이트는 세포가 배양 플레이트 표면에 부착되어 자라지 못하도록 하기 위해 세포 접착을 막아주는 표면을 가질 수 있다. 전술하였듯이, 혈중 순환 암세포는 부유상태에서 배양을 시킬 수 있으므로 상기 배양플레이트의 표면이 세포 접착을 막아주도록 코팅이 될 수 있다. 구체적으로, 세포 접착을 막아주기 위한 코팅 재료로서 아가로스(agarose) 또는 히드로겔이 포함될 수 있으며 이에 국한되지 않는다. 즉, 세포가 배양플레이트 표면에 부착되어 자라는 것을 막을 수 있는 재료라면 어느 재료라도 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 배양 플레이트의 표면 코팅은 히드로겔로 이루어질 수 있다.

상기 히드로겔은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하며, 히드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성된다. 구체적으로 보면, 상기 히드로겔은 공유 결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 이렇게 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 비슷한 거동을 보인다. 상기 히드로겔은 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할수 있으며 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양에 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 상기 배양 플레이트에 공유결합으로 코팅되어 혈중 순환 암세포가 상기 배양 플레이트 표면에 접착되는 것을 막아줄 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 중성전하를 가지면서 친수성을 가질 수 있다. 상기 중성전하를 가진다는 것은 전하가 플러스도 아니고 마이너스도 아닌 상태를 가진다는 것을 의미하며, 상기 친수성이란, 물에 대한 강한 친화력을 말하는 것으로서 물에 잘 용해될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 단기배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1내지15일동안 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는 5내지 15일일수 있으며 바람직하게는 10 내지 15일일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 12내지 15일일 수 있다.

상기 염기서열은 DNA또는 RNA의 기본단위 뉴클레오티드의 구성성분 중 하나인 염기들을 순서대로 나열해 놓은 것을 말한다. 유전자는 생물의 유전형질을 결정하는 단백질을 지정하는 기본적인 단위로, 지구상의 모든 생명체들은 염기서열을 통해 단백질을 지정하는 원리를 따른다. 염기가 일렬로 3개씩 모이면 하나의 트리플렛 코드를 형성하여 하나의 아미노산을 지정하게 되는데, 이 트리플렛 코드들이 여러 개 모이면 궁극적으로 하나의 단백질을 지정하게 된다. 즉, 염기가 3개씩 모이면 트리플렛 코드를 형성하여, 단백질서열로 변환되는 것이다. 인간의 단백질들은 20여 가지의 아미노산을 이용하여 적절하게 펩타이드 결합을 하여 생성되는데, 하나의 아미노산을 지정하는 트리플렛코드가 20여가지의 아미노산을 모두 지정하기 위해 총 4가지의 DNA 염기 또는 RNA염기가 필요할 수밖에 없다. 따라서 염기서열은 총 4가지의 염기 A(아데닌), T(티민) 혹은 U(우라실), G(구아닌), C(사이토신)이 배열되어 이루어져 있을 수 있다.

상기 염기들의 서열을 분석하는 것은 당업자에게 자명한 방법으로 이루어질 수 있고 이는 Single-molecule real-time sequencing, Ion semiconductor, Pyrosequencing, Sequencing by synthesis(Illumina), Sequencing by ligation(SOLiD sequencing), Nanopore sequencing 및 Chain termination(Sanger sequencing)을 포함할 수 있으며 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 단기배양된 면역세포로부터 핵산분자를 분리하여 증폭시키는 것은 다양한 방법으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, multiplex PCR이 핵산분자를 증폭시키는데 사용될 수 있으며, 특히 T세포 수용체(TCR) 또는 B세포 수용체 같은 재조합된 면역분자들을 포함하는 핵산분자 혼합물에 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 증폭은 2단계의 증폭 과정을 거칠수 있으며 각각의 단계는 서로 다른 프라이머를 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 클론형이란, 면역세포의 재조합된 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 본 발명의 일실시예에 따르면, T 세포 수용체(TCR) 혹은 B 세포 수용체를 인코딩하는 T 세포 혹은 B 세포의 재조합된 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 한 개인의 림프구 집단에서 서로 다른 클론형의 집합이 그 집단의 repertoire가 된다(e.g. Arstila et al, Science, 286: 958-961 (1999); Yassai et al, Immunogenetics, 6 1: 493-502 (2009); Kedzierska et al, Mol. Immunol., 45(3): 607-61 8(2008)). 상기 염기서열이 분석된 DNA 혹은 RNA는 TCR유전자와 항체를 인코딩하는 면역글로불린(Ig) 유전자와 일치할 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA 또는 RNA는 TCR의 α, β, γ 또는 δ chain을 인코딩하는 염기서열과 일치할 수 있다. 또한, 상기 DNA 또는 RNA는 constant region(α, δ, ε, γ 또는 μ)을 가지는 면역글로불린heavy chain(IgH) 또는 constant region λ 또는 κ를 가지는 면역글로불린 light chain (IgK 또는 IgL)을 인코딩하는 염기서열과 일치할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 DNA 또는 RNA는 TCR β chain의 CDR3부분의 정보일 수 있다.

상기 클론형 프로필이란, 모든 repertoire의 클론형 및 상대적으로 많은 정도를 포함하는 T 세포 또는/및 B 세포 샘플의 클론형 목록을 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 클론형은 면역글로불린heavy chain(IgH) 혹은 TCR ß chain을 포함한다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 클론형은 다른 재조합 분자, 구체적으로 면역글로불린 light chain이나 TCR chain 혹은 그와 유사한 것들을 기반으로 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 클론형 프로필은 적어도 100개의 클론형을 가지고 있을 수 있고, 바람직하게는 적어도 500개의 클론형을 가지고 있을 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 적어도 1000개의 클론형을 가지고 있을 수 있다.

상기 클론형 프로필의 발생빈도는, 일정 개수 이상의 면역세포들을 포함하는 샘플 분석에서 면역세포의 클론형 프로필이 발생하는 빈도수를 의미한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 일정 개수는, 1000 내지 1,000,000개일 수 있으며, 바람직하게는 100,000개일 수 있다.

도 6 내지 8을 참조해보면, 각각의 그래프에서 세로축은 비소세포폐암 환자의 암조직샘플에서 얻은 T세포 수용체의 발생빈도크기에 따른 클론형이고, 가로축은 비소세포폐암 환자의 혈액을 본 발명에 따른 분리방법 및 따라 분리하고 본 발명에 따른 단기배양방법으로 혈중 순환 암세포와 동시 배양된 T세포 수용체의 발생빈도 크기에 따른 클론형을 나타내고 있다. 도6 내지 8를 분석해보면, 비소세포폐암 환자에서 채취한 암조직샘플에서 얻은 T세포 수용체의 클론형과, 비소세포폐암 환자의 혈액을 본 발명에 따른 분리방법 및 따라 분리되고, 본 발명에 따른 단기배양방법으로 혈중 순환 암세포와 동시 배양된 T세포 수용체의 클론형이 상당 부분 겹치는 것을 알 수 있다. 즉, 도6 내지 8에서 그래프내의 spot이 많이 찍힐수록 그만큼 각 발생빈도별로T세포 수용체의 클론형이 일치하는 것이 많다는 것을 의미한다.

도9를 참조해보면, 각 환자의 비소세포폐암 조직샘플에서 수득한 T세포 수용체의 클론형과, 혈중 순환 암세포와 동시배양된 T세포 수용체의 클론형들을 비교해보면, 다른 환자의 클론형들과는 일치하지 않고 같은 환자의 클론형들끼리만 서로 일치하고 있다.

따라서, 도6 내지 9를 참조해보면, 본 발명에 따른 T세포 수용체의 클론형 분석은, 종래의 기술인 고체조직생검을 통해 얻은 T세포 수용체의 클론형 분석과 비교해보면 그 정확도가 대등하다. 하지만, 종래의 기술이 환자로부터 고체조직생검을 반복적으로 얻기가 상당히 힘들어서 상기 T세포 수용체의 클론형 분석을 위한 충분한 확보가 어려운 반면, 본 발명에 따른 분석은 혈액에서 채취한 혈중 순환 암세포 및 T세포를 분석하기에 T세포 수용체의 클론형 확보가 용이하기 때문에 종래의 기술보다 효율성이 더 크다. 게다가, 혈중 순환 암세포는 혈액에서 상당히 희귀한데, 이를 본 발명에 따른 단기배양을 통해 양을 증가시킴과 동시에 T세포도 함께 배양시킴으로써 T세포가 혈중 순환 암세포와 상호작용하여 환자가 지닌 암에 대한 정보를 더욱 정확하게 반영시킬 수 있다.

상기 클론형 프로필의 발생빈도는 통상의 지식을 가진 당업자가 실시할 수 있는 분석방법으로 분석될 수 있으며, 구체적으로는 Czekanowski's 인덱스(index) 방법 또는, 거리 측정(distance measures) 및 상관관계(correlations) 분석, Spearman rank correlation 분석이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Spearman rank correlation 분석일 수 있다.

상기 Spearman rank(스피어만 rank분석)은 spearman correlation coefficient(스피어만 상관계수)를 이용한 분석방법을 의미한다. 스피어만 상관계수(Spearman correlation coefficient) 는 데이터가 서열척도인 경우, 즉 자료의 값 대신 순위를 이용하는 경우의 상관계수로서, 데이터를 작은 것부터 차례로 순위를 매겨 서열 순서로 바꾼 뒤 순위를 이용해 상관계수를 구한다. 두 변수 간의 연관 관계가 있는지 없는지를 밝혀주며 자료에 이상점이 있거나 표본크기가 작을 때 유용하다. 스피어만 상관계수는 -1과 1 사이의 값을 가지는데 두 변수 안의 순위가 완전히 일치하면 +1이고, 두 변수의 순위가 완전히 반대이면 -1이 된다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 상관관계는 미리 결정되어 있는 최소값보다 높은 클론형 발생빈도를 기초로 분석된다. 만약 상기 최소값보다 작은 발생빈도를 가지는 클론형은 계산에 사용되지 않을 수 있으며 만약 사용된다고 하더라도 상기 최소값과 동일한 값이 부여될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 동일한 개수의 클론형들이 2가지 클론형 프로필간의 상관관계 분석에 사용된다.

상기 항암 치료 전과 후의 면역세포 클론형 프로필에 대한 상기 상관관계 분석 결과값은 기결정된 특정값과 비교할 수 있으며, 상기 비교를 통해 항암 치료제 대한 예후를 분석할 수 있다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1 : 고밀도 마이크로칩 제작

실험에서 사용되는 고밀도 마이크로칩은 기공의 크기(pore-size)가 5.5~8.5μm로 형성되어 있어, 5.5μm보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 5.5 μm보다 큰 사이즈의 표적 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.

참고로, 고밀도 마이크로칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	스파이킹 세포 수	회수 된 세포 수	세포 회수율(%)
1	10	9	90
2	100	86	86
3	1000	850	85

칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.

실시예 2 : 혈중 순환 암세포(CTC) 및 면역세포 분리과정

1. 혈액 5㎖를 Ficoll 용액 5㎖가 담긴 tube에 조심스럽게 올린다.

2. 용액을 30분간 400g에서 원심분리 하여 1차적으로 혈구세포를 제거한다.

3. 불필요한 세포의 흡착을 방지하기 위하여 고밀도 마이크로칩(HD Microporous chip, 여과망)을 0.1% BSA 용액으로 10 분간 처리하여 코팅한 다음 PBS로 린스한다.

5. Ficoll 의 상층용액을 여과망위에 올리고 미량 존재하는 적혈구를 중력으로 여과하여 2차적으로 순도가 높은 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 분리한다. 이는 원심분리나 immunobead와 같은 처리를 하지 않음으로써 혈중 순환 암세포 및 면역세포가 손상되는 것을 방지해 준다.

6. 분리된 혈중 순환 암세포 및 면역세포는 염색을 통해 동정한다.

실시예 3. 분리된 혈중 순환 암세포 및 면역세포의 단기 배양

본 발명에 따른 고밀도 마이크로칩에 의해 분리된 혈중 순환 암세포를 중성전하를가지면서 친수성을 띄는 히드로겔로 코팅된 Ultra low attachment 배양플레이트에 seeding을 했다. 상기 배양플레이트는 11ng/ml 인슐린, 22ng/ml 트랜스페린, 2ng/ml EGF 및 8μM ROCK 억제제를 포함하고 있는 배양액이 들어 있으며 상기 단기 배양은 배양한 시점부터 14일동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5~10% CO₂ 조건하에서 배양을 실시했다.

실시예 4. 혈중 순환 암세포의 확인

상기 실시예3에 따라 단기 배양된 혈중 순환 암세포는 염색 방법을 통해 암 세포임을 확인하기 위하여, 하기 방법을 이용하여 세포 염색과정을 수행한다.

1. 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 회수된 세포들을 염색용 슬라이드에 고정시킨다.

2. 항체가 세포 내부로 들어갈 수 있도록 투과(permeabilization)과정을 수행한다.

3. PBS로 워싱(washing) 과정을 수행한다.

4. PBS를 이용하여 1% BSA(bovine serum albumin)를 만들고, 비특이적 반응(non-specific binding)과 내인성 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)를 줄이기 위해 블록킹(blocking) 과정을 수행한다.

5. 1차 항체로 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CK(cytokeratin) 및 CD(cluster of differentiation) 45를 상온에서 60분간 반응시킨다.

6. 상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 상온에서 60분간 반응시킨다.

7. PBS로 워싱 과정을 수행한다.

8. 최종적으로 세포 핵을 염색하기 위해, DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution을 넣은 후 커버글라스를 덮고 상온에서 10분간 반응시킨다.

9. 염색된 세포들을 관찰하면서, 염색된 비율 및 회수율을 매뉴얼로 계산한다.

비교예 1. 배양액에 따른 혈중 순환 암세포의 배양된 세포수 변화

일반적으로 세포 배양에 사용되는 세포 배양액과 본 발명에 따른 배양액에서 혈중 순환 암세포의 분열 및 성장 정도를 비교실험하였다. 일반적으로 세포 배양에 사용되는 배양액은 25 nM sodium selenite, 50 nM Hydrocortisone, 0.01 mM ethanolamine, 0.01 mM phosphorylethanolamine, 100 pM triiodothyronine, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 10 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, 4.5mM L-glutamine 및 1X antibiotic-antimycotic 을 포함하고 있으며, 본 발명의 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다. 또한 배양 조건은 일반적인 플레이트를 이용한 점을 제외하고는 실시예3과 동일하다.

도3을 보면, CD45-는 배양되는 혈중순환 암세포에 대한 바이오마커이며, Normal growth media는 일반적인 세포 배양액, CG growth media는 본 발명에 따른 배양액을 의미한다. 도3은 본 발명에 따른 배양액에서 혈중 순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 본 발명에 따른 배양액이 일반적인 배양액보다 혈중 순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.

비교예 2. 히드로겔이 코팅된 배양플레이트에서 배양액에 따른 혈중 순환 암세포의 배양된 세포수 변화

본 발명에 따른 배양액이 사용된 상황에서, 혈중 순환 암세포의 세포 성장 및 분열에 대한 히드로겔 코팅된 배양플레이트 효과를 측정하기 위해 일반적인 배양플레이트와 비교배양을 실시하였다. 본 발명에 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다.

도4를 보면, Normal culture type은 일반적인 세포 배양플레이트(세포가 배양플레이트 표면에 붙음)를 나타낸 것이고, Low attachment type은 본 발명에서 사용된 히드로겔이 코팅된 배양플레이트이다. 도4를 본 발명에 따른 배양액을 이용하여 히드로겔 코딩된 배양플레이트에서 배양된 혈중순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서의 배양이 혈중순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

비교예 3. 본 발명에 따른 배양방법으로 혈중 순환 암세포와 동시 배양된 T세포 수용체 DNA양과 조직에서 얻은 T세포 수용체 DNA양 비교

6명의 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)환자로부터 각각 암조직과 혈액을 채취하였으며, T세포 수용체의 DNA 분석을 위해 QIAamp DNA micro kit를 이용하여 다음의 방법으로 T세포 수용체의 DNA를 추출하였다.

(1) 암 조직을 액체질소와 막대사발을 이용하여 잘게 분쇄한다.

(2) 분쇄한 암 조직 샘플을 15ml 튜브에 옮겨 담은 후 ATL 버퍼와 proteinase K을 이용하여 조직이 완전히 녹인다.

(3) AL 버퍼를 섞는다.

(4) 100% 에탄올을 상기 용액에 첨가한 후 상온에서 5분간 둔다.

(5) 컬럼으로 이동한 후 6000xg로 상온에서 1분간 원심 분리를 한 후 내려진 용액을 버리고, AW1 용액을 첨가 후 상온에서 6000xg로 원심 분리를 재 실시 후 떨어진 용액을 버린다.

(6) 컬럼에 AW2을 첨가한 후 상온에서 6000xg로 원심 분리하고 내려진 용액을 버리고, 다시 20,000xg로 컬럼이 완전히 마를? 까지 원심분리를 약 3분간 진행한다.

(7) 컬럼을 회수 튜브로 이동한 후 컬럼 멤브레인에AE 버퍼 혹은 초순수를 넣은 후 상온에서 약 1분간 둔 다음, 20,000xg로 1분간 상온에서 원심 분리를 통하여 DNA를 회수한다.

또한, 각 비소세포폐암환자로부터 얻은 혈액샘플에서 상기 실시예2의 분리방법에 따라 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cell, CTC) 및 T세포를 분리한 다음, 상기 실시예3의 배양방법으로 혈중 순환 암세포와 T세포를 함께 배양했다. 배양이 끝난 뒤, 세포를 채취하여 T세포 수용체의 DNA를 상기 암조직에서 T세포 수용체의 DNA를 분석하는 방법과 동일한 방법으로 추출 및 정량화하였다.

하기 표2는 6명의 비소세포폐암환자로부터 채취한 조직샘플에서 수득한 T세포 수용체의 DNA양과 혈액샘플에서 수득하여 혈중 순환 암세포와 함께 배양된 T세포 수용체의 DNA양을 비교한 것이다. 이를 살펴보면, 혈액샘플에서 수득하여 혈중 순환 암세포와 함께 배양된 T세포 수용체의 DNA양이 조직샘플에 비해서도 충분하다는 것을 보여준다.

환자 ID	CTC를 포함하는 PBMCs	보고된 농도 (ng/ul)	측정된 농도 (ng/ul)	수득량 (ng)	조직	보고된 농도 (ng/ul)	측정된 농도 (ng/ul)	수득량 (ng)
104	C104	103.7	101.1	5052.8	T104	271.4	263.8	13187.5
105	C105	90	88.2	4410.8	T105	113.2	111.3	5565.3
106	C106	60.7	57.9	2892.8	T106	112.2	111.5	5572.5
107	C107	50	49.3	2463.5	T107	490.4	243.1	24310.5
108	C108	58.3	57.1	2855.3	T108	197.6	196.0	9801.8
109	C109	89.4	86.6	4329.5	T109	180.4	175.3	8764.0

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

암환자로부터 획득한 액상생검샘플을 제공하는 단계;
상기 액상생검샘플로부터 바이오칩을 이용하여 면역세포 및 혈중 순환 암세포를 분리하는 단계;
상기 분리된 면역세포 와 혈중 순환 암세포를 단기배양하는 단계;
상기 단기배양된 면역세포로부터 핵산분자를 분리하여 증폭시키는 단계;
상기 증폭된 핵산분자의 염기서열을 분석하여 상기 액상생검샘플의 클론형 프로필을 생성하는 단계;
상기 생성된 클론형 프로필을 기반으로 클론형 발생빈도를 분석하는 단계;
상기 분석된 클론형 발생빈도를 빈도수에 따라 순위를 결정하는 단계; 및
상기 결정된 순위를 기반으로 상기 면역세포의 클론형을 분석하는 단계;
를 포함하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 액상생검샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 혈중 순환 암세포 및 면역세포를 분리하는 단계는 대기압 1000내지 1020hPa하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 단기배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제4항에 있어서,
상기 인슐린의 농도는 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제4항에 있어서,
상기 트랜스페린의 농도는 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제4항에 있어서,
상기 상피성장인자의 농도는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제4항에 있어서,
상기 ROCK 억제제의 농도는 3 내지 30μM인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제4항에 있어서,
상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 단기배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제 1항에 있어서,
상기 바이오칩은 BSA용액으로 코팅된 고밀도 마이크로칩인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제11항에 있어서,
상기 고밀도 마이크로칩은 사이즈 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제11항에 있어서,
상기 BSA용액 코팅은 0.05내지0.15% 농도로 코팅되는 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 면역세포는 T 세포인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 핵산분자 염기서열은 면역세포 수용체의 핵산분자 염기서열인 것을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 면역세포 분석방법은 암환자를 진단, 스크리닝, 모니터링 또는 예후예측을 위한 것임을 특징으로 하는 맞춤형 암치료를 위한 면역세포 분석방법.