KR20200089864A - 혈중 순환 암dna 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법 - Google Patents

혈중 순환 암dna 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일실시예는 혈중 순환 암DNA(ctDNA) 및 혈중 순환 암세포를 분석하여 폐암을 예측하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈중 순환 암DNA(ctDNA) 및 혈중 순환 암세포를 하나의 혈액 샘플에서 동시에 분리해 내어 혈중 순환 암DNA(ctDNA)의 단일 뉴클레오타이드 변이(single nucleotide variation) 및 복제개수 변이(copy number variations)를 분석하고, 혈중 순환 암세포를 형광분석하여 폐암을 예측하는 방법을 제공한다.

Description

혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법{A METHOD FOR ANTICIPATING LUNG CANCER USING CIRCULATING TUMOR DNA AND CIRCULATING TUMOR CELLS}
본 발명은 폐암 예측방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법에 관한 것이다.
폐암이란 폐에 생긴 악성 종양을 말하는 것으로서， 크게 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 자라는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다. 조직학적으로 크게 비소세포폐암 (NSCLC, non small cell lung cancer)과 소세포폐암 (SCLC, small cell lung cancer)으로 분류되고， 비소세포폐암이 전체 폐암분포의 75%를 차지하고 있다. 폐암은 국제적으로 연간 100만명이 사망하는 것으로 알려져 있다. 특히, 우리나라에서 폐암에 의한 사망률은 전체 암 중 1위를 차지할 만큼 가장 심각한 질병 중 하나이다. 폐암은 최근 수십 년간 그 발생 빈도가 급속히 증가하여 남자에서는 위암 다음으로 많은 악성종양이며, 최근에는 여성에게서도 그 빈도가 증가하고 있다. 폐암은 증상이 없이 정기검진이나 다른 질환의 검사 시에 우연히 발견되는 경우가 많고, 폐암의 양상에 따라 다양하게 나타날 수 있어 조기발견에 어려움이 있다. 흡연에 의해 야기되는 폐암의 91%는 중 약 87%가 나타내는 비소세포 폐암이며, 나머지 13%는 소세포 폐암(SCLC)이다. 소세포 폐암은 드물게 발생하지만, 급속하게 진행(rapidly fatal)되어 조기 발견에 대한 기회가 적다. 폐암은 1기부터 4기까지로 구분되는데, 1기는 암이 폐실질에 국한되어 있고 3cm 이하인 경우, 2기는 암이 주위의 림프절에 퍼져있고 늑막까지 퍼져있는 경우, 3A기는 암이 흉벽과 횡경막까지 퍼져 있고 수술이 가능한 경우, 3B기는 종격동의 혈관, 식도, 기관 등에 침범하여 수술이 불가능 경우, 4기는 암이 타 장기(간, 뼈, 뇌, 골수)까지 퍼진 경우를 말한다.
폐암의 진단의 간편한 검사방법은 흉부 X선, 객담 내 세포검사, 기관지 내시경 그리고 더 정확한 방법으로 CT 등의 영상 분석이 있다. 이러한 1차적인 검사법은 최종 진단이라기 보다는 폐암 의심 환자를 가려내는 것이며, 최종적인 폐암의 진단은 외과적인 수술로 채취한 종양조직 검사를 통하여 이루어진다. 따라서, 1차적으로 폐암의심 환자로 분류되더라도 외과적 수술 후 폐암이 아닌 경우가 대략 ~30%를 차지하며, 이는 불필요한 수술로 노약자들인 환자에게 육체적인 부담을 줄 뿐만 아니라 불필요한 치료비용을 발생시킨다. 이러한 폐암 진단 과정의 비효율적인 배경에서 1차적 검사법에서 폐암 예측율을 높인다면 폐암진단을 위한 불필요한 수술과 치료 비용 절감 효과가 나타날 것이다. 따라서, 폐암 환자를 보다 더 정확히 구분해내는 1차적인 폐암 검사법 연구가 필요한 실정이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 조직생검이 불가능한 환자나 반복적인 조직생검을 필요로 하는 환자를 위해, 하나의 혈액 샘플에서 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포를 동시에 분리해내서 이를 기반으로 폐암 예측방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는
폐암 의심 환자의 혈액을 준비하는 단계;
상기 혈액에서 혈장을 분리하는 단계;
상기 혈장이 제거된 혈액에 버퍼를 추가한 후 항체 중합체를 혼합시키는 단계;
상기 항체 중합체가 혼합된 혈액에서 원심분리를 통해 말초혈액 단핵세포가 포함된 층을 분리하는 단계;
상기 분리된 말초혈액 단핵세포가 포함된 층의 세포들을 안정화시키는 단계;
고밀도 마이크로 칩을 통해 상기 안정화된 세포들을 통과시켜 혈중 순환 암세포(Circulating tumor cell)를 분리하는 단계;
상기 분리된 혈중 순환 암세포를 폐암 특이적 바이오마커로 형광염색하여 분석하는 단계; 및
상기 분리된 혈장에서 혈장내 DNA의 단일 뉴클레오타이드 변이(single nucleotide variation) 및 복제개수 변이(copy number variations)를 기반으로 혈중 순환 암DNA(circulating tumor DNA)를 분석하는 단계;를 포함하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 혈장을 분리하는 단계는,
상기 혈액을 12 내지 18분동안 1800 내지 2000G에서 원심분리를 통해 상층액을 분리하는 단계; 및
상기 분리된 상층액을 12 내지 18분동안 15000 내지 17000G에서 원심분리하는 단계;
를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 세포들을 안정화시키는 단계는 5 내지 20ml의 버퍼를 1 내지 3분마다 3 내지 5회 혼합시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 혈중 순환 암DNA를 분석하는 단계는 AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, DRBB2, FGFR1, FOXL2, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, NTRK1, NTRK3, PDGFRA, RET, ROS1, SMAD4, TERT 및 TP53으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 3종류 유전자들의 단일 뉴클레오타이드 변이(single nucleotide variation) 및 복제개수 변이(copy number variations)를 분석할 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 고밀도 마이크로칩은 BSA(Bovine serum albumin) 용액 및 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)로 3 내지 7분간 처리하여 코팅될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 고밀도 마이크로칩은 복수개의 사각형 여과 구멍들이 형성될 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 폐암 특이적 바이오마커는 CK(Cytokeratin) 또는 EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포를 암 환자의 혈액으로부터 분리 및 분석하여 폐암인지 여부를 예측할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 혈중 순환 암세포를 DAPI, EpCAM, CK 및 CD45 마커로 형광염색하여 폐암 CTC를 확인한 사진이다.
도2는 본 발명의 실시예에 따른 혈중 순환 암DNA(ctDNA) 및 혈중 순환 암세포(CTC) 기반 폐암 예측방법의 민감도(sensitivity), 특이도(specificity), 양성 예측도(positive predictive value; PPV), 음성 예측도(negative predictive value; NPV) 및 정확도(accuracy)값을 계산하는 방법을 나타낸다.
도3은 본 발명의 실시예에 따른 폐암 예측방법을 확인하기 위해 검증대상이 된 환자들의 정보를 나타낸다.
도4는 종래의 폐암 진단 방법과 ctDNA 또는 CTC기반의 폐암 예측방법을 민감도(sensitivity), 특이도(specificity), 양성 예측도(positive predictive value; PPV), 음성 예측도(negative predictive value; NPV) 및 정확도(accuracy)값으로 비교한 결과값이다.
도5는 는 종래의 폐암 진단 방법과 본 발명의 실시예에 따른 ctDNA 및 CTC기반의 폐암 예측방법을 민감도(sensitivity), 특이도(specificity), 양성 예측도(positive predictive value; PPV), 음성 예측도(negative predictive value; NPV) 및 정확도(accuracy)값으로 비교한 결과값이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일측면에 따른, 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법은 a) 폐암 의심 환자의 혈액을 준비하는 단계; b) 상기 혈액에서 혈장을 분리하는 단계; c) 상기 혈장이 제거된 혈액에 버퍼를 추가한 후 항체 중합체를 혼합시키는 단계; d) 상기 항체 중합체가 혼합된 혈액에서 원심분리를 통해 말초혈액 단핵세포가 포함된 층을 분리하는 단계; e) 상기 분리된 말초혈액 단핵세포가 포함된 층의 세포들을 안정화시키는 단계; f) 고밀도 마이크로 칩을 통해 상기 안정화된 세포들을 통과시켜 혈중 순환 암세포(Circulating tumor cell)를 분리하는 단계; g) 상기 분리된 혈중 순환 암세포를 폐암 특이적 바이오마커로 형광염색하여 분석하는 단계; 및 h) 상기 분리된 혈장에서 혈장내 DNA의 단일 뉴클레오타이드 변이 및 복제개수 변이(copy number variations)를 기반으로 혈중 순환 암DNA(circulating tumor DNA)를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 혈중 순환 암DNA(circulating tumor DNA; ctDNA)는 세포 유리 DNA(cell free DNA; cfDNA)의 돌연변이 서열을 의미할 수 있으며, 상기 cfDNA 는 건강한 사람들에게서는 낮은 범위의 농도(1-10ng/mL)로 유지되며 급성 외상, 뇌경색, 운동, 이식, 감염 및 암 환자와 같이 생리적 현상 혹은 여러 임상적 조건에서 농도는 증가된다. 이러한 특성으로 cfDNA 분석은 비침습성 산전검사(noninvasive prenatal testing, NIPT)에서 활용되고 있으며 멘델리안 장애 혹은 다운증후군(trisomy 21)과 같은 검사가 현재 시연되고 있다. 상기 ctDNA의 분석을 위한 범위는 단일 변이부터 총유전체 분석까지 다양하다. 특정 변이를 지정하여 분석이 필요하거나 적은 범위의 핫스팟 돌연변이(hotspot mutation)들을 검출해낼 시, 적합한 분석 설계를 통해 높은 민감도로 검출해 낼 수 있다.
상기 혈중 순환 암세포(Circulating Tumor Cells;CTC)란, 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포를 의미한다. 상기 혈중 순환 암세포들은 매우 드물고 구할 수 있는 표본의 양이 매우 제한된다. 혈중 순환 암세포의 검출 및 특성해석에서의 기술은 다중역전사정량중합효소연쇄반응 방법들, 영상화 기반 접근법들, 그리고 미세여과법 및 마이크로칩 장치들을 포함하며 이제 국한되지 않는다. 상기 혈중 순환 암세포는 액상 생검검체로 개별화된 치료와 치료 후 경과관찰을 필연적으로 제공할 수 있는 종양생물학적 표지자로 작용할 수 있다. 또한, 혈중 순환 암세포는 종양의 생물학적 특성 및 종양세포의 파종을 이해하기 위한 표적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 혈장을 분리하는 단계는 상기 혈액을 12 내지 18분동안 1800 내지 2000G에서 원심분리를 통해 상층액을 분리하는 단계; 및
상기 상층액을 12 내지 18분동안 15000 내지 17000G에서 원심분리하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 상층액을 분리하는 단계에서, 바람직하게는 상기 혈액을 12 내지 16분동안 1800 내지 2000G에서 원심분리할 수 있으며, 가장 바람직하게는 15분동안 1900G에서 원심분리할 수 있다. 또한, 상기 분리된 상층액을 원심분리하는 단계에서, 바람직하게는 상기 분리된 상층액을 12 내지 16분동안 15000 내지 17000G에서 원심분리할 수 있으며, 가장 바람직하게는 15분동안 16000G에서 원심분리할 수 있다.
상기 항체 중합체는 혈장이 제거된 혈액내에서 추후 분리되는 혈중 순환 암세포의 순도를 높이기 위해 불필요한 세포들을 제거하기 위한 항체들을 포함할 수 있다. 구체적으로, CD45, CD66b 및 글리코포린A(glycophorin A)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나에 특이적인 항체일 수 있으며, 바람직하게는 CD45, CD66b 및 글리코포린A(glycophorin A)에 특이적인 항체들일 수 있다.
상기 세포들을 안정화시키는 단계는 급작스러운 환경의 변화를 최소화함으로써 세포의 생존율을 높이고자 하기 위한 단계로서, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 세포들을 안정화시키는 단계는 5 내지 20ml의 버퍼를 1 내지 3분마다 3 내지 5회 혼합시킬 수 있다. 바람직하게는 2분마다 5ml, 5ml 및 15ml(총 3회)을 혼합시킬 수 있다.
상기 고밀도 마이크로 칩은 바이오칩의 작용 원리를 기반으로 특정 사이즈의 물질을 분리해낼 수 있는 바이오칩을 말한다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로 칩은 복수개의 사각형 여과 구멍들이 형성되어 있을 수 있다. 바람직하게는 상기 여과구멍들은 정사각형일 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩은 금속재질일 수 있으며, 바람직하게는 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리재질일 수 있다. 가장 바람직하게는 니켈재질일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 사각형 모양의 여과구멍의 크기는 각 변이 5 내지 25㎛일 수 있다. 바람직하게는 상기 사각형 모양의 여과구멍의 크기는 각 변이 8 내지 20㎛일 수 있다. 본 발명의 또다른 일실시예에 따르면, 상기 사각형 모양의 여과구멍은 대각선 길이가 5.5 내지 8.5㎛일 수 있다. 상기 여과구멍의 크기가 5.5μm보다 작을 경우 백혈구와 적혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 상기 여과구멍의 크기가 8.5 ㎛보다 클 경우에는 여과구멍의 크기가 암 세포의 크기보다 커서 암세포가 칩을 통과하여 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 바람직하게는 상기 여과구멍의 대각선 크기는 6.5㎛일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩에 형성된 복수의 여과구멍들은 균일한 간격으로 형성될 수 있다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩에 형성된 복수의 여과구멍들의 간격은 6~24㎛일 수 있고, 바람직하게는 4~21㎛일 수 있다.
상기 BSA(Bovine Serum Albumin)용액이란, 소혈청 알부민을 말한다. 분자량은 약 66.4 kDa 정도 되는 단백질로써 대부분의 동물에 많이 존재하는 단백질이다. BSA는 생화학/생물학에서 세포 배양시에 세포의 영양분으로써 첨가해줄 수 있고, 또한 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물로도 많이 쓰이며 제한효소를 사용할때 적은양의 효소(단백질)를 사용해야 하므로 용액내의 단백질 농도를 보완해주기 위하여 첨가해줄 수도 있다. 그리고 여러 생화학적 실험(Western blot , Immunocytochemistry , ELISA 등) 에서 특정 항체를 검출하고자 하는 단백질이 붙여주기 전에 nonspecific binding 즉 원하지 않는 단백질, 혹은 원치 않는 위치에 항체가 달라붙는 비특이적 결합을 막아 주기 위해 사용될 수도 있다.
상기 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)는 유기화합물의 일종으로서, 여섯 자리 리간드로 작용할 수 있으며 금속 이온과 결합하여 카이랄성을 가진 킬레이트 화합물을 만든다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA 및 EDTA를 상기 고밀도 마이크로 칩에 처리함으로써 불필요한 세포의 흡착을 막고 상기 고밀도 마이크로 칩에 닿는 세포들의 데미지를 최소화시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 원심분리법을 이용하여 상기 안정화된 세포들을 상기 BSA용액 및 EDTA로 코팅된 상기 고밀도 마이크로칩에 반응시켜서 혈중순환 암세포를 제외한 기타 생체고분자를 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 BSA용액은 0.05내지 0.15% 농도로 이루어 질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 BSA용액코팅은 0.08 내지 0.012% 농도로 이루어질 수 있으며 가장 바람직하게는 0.1%농도로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 EDTA는 0.5 내지 4mM 농도로 이루어질 수 있으며 바람직하게는 0.5 내지 3mM로 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는 2mM로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액 및 EDTA코팅은 3내지 7분동안 처리될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 BSA용액 및 EDTA코팅은 4내지 7분동안 처리될 수 있다. 가장 바람직하게는 5분동안 처리될 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 고밀도 마이크로 칩에서 상기 세포들이 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중 순환 암세포가 상기 고밀도 마이크로 칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중 순환 암세포를 다시 한번 상기 고밀도 마이크로 칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 고밀도 마이크로 칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포가 포함된 용액을 고밀도 마이크로 칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중암세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 고밀도 마이크로 칩을 통한 혈중 순환 암세포 분리는 혈중 순환 암세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로칩을 이용한 분리는 대기압 1000 내지 1020Pa에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 1000 내지 1014 Pa에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 마이크로칩에 의해 분리된 세포들은 손상이 최소화될 수 있기 때문에 그 수득률이 99%이상이 될 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 고밀도 마이크로 칩으로 여과된 혈중 순환 암세포는 단기배양 단계를 거칠 수 있다. 상기 단기배양은 배양을 시작하는 시점부터 1내지15일동안 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는 5내지 15일일수 있으며 바람직하게는 10 내지 15일일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 12내지 15일일 수 있으며 가장 바람직하게는 14일수 있다.
본 발명의 실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, EGF(Epidermal Growth Factor) 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어질 수 있다.
상기 인슐린은 인간의 물질대사 체계의 호르몬 중 하나이며 이자 (기관)의 랑게르한스 섬 베타 세포에서 분비되어, 혈액 속의 포도당 수치인 혈당량을 일정하게 유지시키는 역할을 한다. 혈당량이 일정 이상으로 높아지면 인슐린이 분비되며, 혈액내의 포도당을 세포 내로 유입해 다시 다당류(글리코겐)의 형태로 저장하는 작용을 촉진시킨다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 인슐린을 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인슐린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40ng/ml, 3~30ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.
상기 트랜스페린은 β글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2분자의 3가철이온과 결합하여 세포증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린수용체를 매개로 하여 세포 내로 공급하는 철운반단백질이다. 혈청 속의 철 99% 이상은 트랜스페린과 결합하며 정상적으로는 트랜스페린의 약 1/3이 철과 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 트랜스페린을 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 트랜스페린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40 ng/ml, 3~30 ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.
상기 상피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 상피성장인자 수용체에 결합하여 세포의 성장 및 분열을 촉진시키는 폴리펩티드성 성장인자이다. 또한, 상기 상피성장인자는 단백질합성이나 RNA합성을 촉진하는 것 외에 오르니틴 탈카르복실효소를 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 상피성장인자를 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 상피성장인자는 0.5~10ng/ml, 0.5~9 ng/ml, 0.5~8ng/ml, 0.5~7ng/ml, 0.5~6ng/ml, 0.5~5ng/ml, 0.7~10ng/ml, 0.7~9ng/ml, 0.7~8ng/ml, 0.7~7ng/ml, 0.7~6ng/ml, 0.7~5ng/ml, 1~10ng/ml, 1~9ng/ml, 1~8ng/ml, 1~7ng/ml, 1~6ng/ml 또는 1~5ng/ml 일 수 있다.
상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho 키나제(ROCK)를 타겟으로 하여그 기능을 억제시키거나 저하시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 여기서, Rho키나제는 세린-트레오닌 키나제의 AGC패밀리(PKA/PKG/PKC)에 속하는 키나제이다. 상기 Rho 키나제는 사이토스켈레톤에 작용함으로써 세포의 운동 및 형태를 제어하는 과정에 관련되어 있다. 구체적으로는 상기 Rho 키나제는 세포의 이동 및 액틴 조직화의 조절인자로 작용할 수 있다. 상기 Rho 키나제는 당뇨병, 출혈성 뇌혈관질환, 파킨스씨 병 같은 신경변성 질환에 관련되어 있고, 상기 Rho 키나제 억제제 가 상기 Rho 키나제관련 질병들에 대한 치료 및 억제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 파수딜은 ROCK 억제제의 하나로서, 뇌혈관경련 치료를 위해 사용될 수 있으며 폐고혈압 치료에도 효과를 나타낼 수 있다. 상기 리파수딜은 상기 파수딜의 유도체로서 ROCK 억제제로 작용할 수 있으며 녹내장 또는 고안압증 치료에도 사용될 수 있다. 상기 RKI-1447은 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 상기 Y27632은 세포를 통과하여 효소의 촉매부위 결합을 위해 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 3~30μM, 3~27μM, 3~24μM, 3~21μM, 4~20μM, 4~30μM, 4~27μM, 4~24μM, 4~21μM, 4~20μM, 5~30μM, 5~27μM, 5~24μM, 5~21μM 또는 5~20μM일 수 있다.
본 발명에 따른 단기 배양에서 사용되는 배양플레이트는 세포 접착을 막아주는 표면을 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중 순환 암세포는 부유상태에서 배양을 시킬 수 있으므로 상기 배양플레이트의 표면이 세포 접착을 막아주도록 코팅이 될 수 있다. 상기 배양플레이트의 표면 코팅은 히드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 히드로겔은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하며, 히드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성된다. 구체적으로 보면, 상기 히드로겔은 공유 결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 이렇게 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 비슷한 거동을 보인다. 상기 히드로겔은 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할수 있으며 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 상기 배양플레이트에 공유결합으로 코팅되어 혈중암세포가 배양플레이트 표면에 접착되는 것을 막아줄 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 중성전하를 가지면서 친수성을 가질 수 있다. 상기 중성전하를 가진다는 것은 전하가 플러스도 아니고 마이너스도 아닌 상태를 가진다는 것을 의미하며, 상기 친수성이란, 물에 대한 강한 친화력을 말하는 것으로서 물에 잘 용해될 수 있다는 것을 의미한다.
상기 분리된 혈중 순환 암세포를 폐암 특이적 바이오마커로 형광염색하여 분석하는 단계는, 상기 고밀도 마이크로 칩을 통해 분리된 혈중 순환 암세포를 폐암에 특이적인 바이오마커로 형광염색하여 동정하는 단계로서, 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 폐암 특이적 바이오마커는 CK(Cytokeratin) 또는 EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)일 수 있다. 즉, 상기 분리된 혈중 순환 암세포가 CK+ 또는 EpCAM+인 경우 폐암 관련 혈중 순환 암세포라고 규정할 수 있다. 본 발명의 또다른 일실시예에 따르면 분석의 정확도를 높이기 위해서, 상기 폐암 특이적 바이오마커 이외에 백혈구 바이오마커인 CD45로 추가로 형광염색할 수 있다. 즉, CK+ 또는 EpCAM+이면서 CD45-로 나타나는 세포를 폐암 관련 혈중 순환 암세포로 규정할 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 폐암 관련 혈중 순환 암세포로 규정된 세포가 2개이상 검출되면 폐암 환자라고 예측할 수 있다.
상기 분리된 혈장에서 혈장내 DNA의 단일 뉴클레오타이드 변이 및 복제개수 변이(copy number variations)를 기반으로 혈중 순환 암DNA(circulating tumor DNA)를 분석하는 단계에서는, 혈장내에 존재하는 cfDNA 중에서 뉴클레오타이드 변이 및 복제개수 변이를 분석하여 폐암을 예측할 수 있다. 즉, 혈중 순환 암DNA는 상기 cfDNA에서 돌여변이 서열을 의미하는 것이기 때문에 상기 단계를 혈중 순환 암DNA를 기반으로 분석된다고 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 폐암 예측을 위해서, 상기 분리된 혈장에서 얻은 DNA는 폐암에서 돌연변이가 나올 가능성이 높은 유전자들의 DNA일 수 있다. 구체적으로 상기 혈중 순환 암DNA는 AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, DRBB2, FGFR1, FOXL2, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, NTRK1, NTRK3, PDGFRA, RET, ROS1, SMAD4, TERT 및 TP53으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 3종류의 유전자들일 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예1. 고밀도 마이크로 칩 제작 단계
실험에서 사용되는 고밀도 마이크로 칩은 기공의 크기(pore-size)가 6.5μm로 형성되어 있어, 6.5μm 보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 6.5μm 보다 큰 사이즈의 암 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.
참고로, 고밀도 마이크로 칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시료 스파이킹 세포 수 회수 된 세포 수 세포 회수율(%)
1 10 9 90
2 100 86 86
3 1000 850 85
칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 99% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.
실시예2. 혈중 순환 암세포(CTCs)와 혈중 순환 암DNA(ctDNA) 분리방법
폐암이 의심되는 환자 혈액 (~10 ml)으로 부터 혈장(Plasma)과 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMC)를 동시에 분리하여, 혈장은 혈액 순환 암DNA(ctDNA) 분석용으로, 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 혈중 순환 암세포 분석용으로 사용했다. 분리 방법은 다음과 같다.
1) 혈액(5 ml)을 15분간 1900G에서 원심분리 후 상층액을 새로운 튜브에 담아 15분간 16000G에서 원심분리하여 혈장층을 회수했다.
2) 회수한 혈장층의 부피만큼 PBS버퍼를 추가하여 혼합한 후 혈액 5㎖에 CD45, CD66b 및 글리코포린A(glycophorin A)에 특이적인 항체들의 중합체 250㎕를 넣은 뒤 3초 정도 혼합한 후 상온에서 20분간 반응시켰다.
3) 2% FBS가 추가된 PBS를 5ml 추가하여 ficoll 15ml이 담긴 50㎖ tube에 반응용액 10㎖을 조심스럽게 올렸다.
4) 용액을 20분간 1200G에서 원심분리 하여, 용액 중간의 말초혈액 단핵세포층을 회수했다
5) 10% PEG 버퍼를 2분마다 5/5/15ml 추가하여 세포를 안정화시켰다.
6) 고밀도 마이크로칩(HD Microporous chip)을 0.1% BSA, 2mM EDTA가 추가된 용액으로 5분간 처리하여 코팅한 다음 안정화시킨 세포를 포함하는 말초혈액 단핵세포층을 여과시켜서 순도가 높은 혈중 순환 암세포를 분리하였다.
실시예3. 분리된 혈중암세포의 단기 배양
본 발명에 따른 고밀도 마이크로 칩에 의해 분리된 혈중 순환 암세포를 중성전하를가지면서 친수성을 띄는 히드로겔로 코팅된 Ultra low attachment 배양플레이트에 seeding을 했다. 상기 배양플레이트는 11ng/ml 인슐린, 22ng/ml 트랜스페린, 2ng/ml EGF 및 ROCK 억제제 (종류별로 각각 ROCK억제제 사용한 경우: 1) 6μM 파수딜(Fasudil); 2) 8μM 리파수딜(Ripasudil); 3) 7.5μM RKI-1447; 4) 8μM Y27632)를 포함하고 있는 배양액이 들어 있으며 상기 단기 배양은 배양한 시점부터 14일동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5~10% CO2 조건하에서 배양을 실시했다.
실시예4. 혈중 순환 암세포(CTC) 분석
분리된 CTC는 형광염색을 통해 동정하였다. 즉, CK와 EpCAM 바이오마커를 이용하여서 CK-positive 또는 EpCAM-positive 및 CD45-negative cells을 CTC로 규정하였다. CTC 분석에 의한 폐암환자의 예측은 Cut-off: 2 cells or more (positive), 0 or 1 cell (negative)으로 규정하였고, 형광염색 동정 분석은 Smart BiopsyTM Cell Image Analyzer (Cat# CIA030, Cytogen, Inc., Seoul, Korea)을 이용하여 진행하였다. 결과는 도1에 나타내었다.
실시예5. 혈중 순환 암DNA(ctDNA) 분석
폐암 의심 환자 혈액에서 분리한 혈장에서 유전자들(AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, DRBB2, FGFR1, FOXL2, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, NTRK1, NTRK3, PDGFRA, RET, ROS1, SMAD4, TERT, TP53)의 single nucleotide variants, copy number alterations을 NGS기반 분석 장치인 EDSCAN-S(㈜이원 다이애그노믹스, 한국)로 분석하여 폐암환자를 예측하였다. 즉, 위에 기술된 유전자들의 single nucleotide variants 및 copy number alterations가 정상세포 비교군에 비하여 통계적으로 유의한 경우 폐암환자로 규정하였다. 참고로, 위에 기술된 유전자들은 폐암에서 돌연변이가 일어날 확률이 높은 유전자들로 구성하였다.
시험예1. 본 발명에 따른 폐암 예측방법과 종래 폐암 진단방법과의 비교
데이터 분석을 위해 먼저 CTCs와 ctDNA 각각의 분석 결과 혹은 둘의 조합된 결과는 통계처리를 통해 폐암 진단 예측의 민감도, 특이도, 양성 예측도, 음성 예측도, 정확도의 값을 계산하였다(계산방법은 도2 참조).
본 발명의 실시예에 따른 폐암 예측방법을 확인하기 위해, 36명의 환자들을 대상으로 분석했으며 이 환자들의 정보는 표3과 같다. (구체적인 정보는 도3 참조).
대상 임상적으로 폐암의심 환자 또는 폐암 진단을 받았던 환자
나이 18세이상 80세 미만
특징 최근 5년이내 항암치료를 받지 않은 환자
현재 임상에서 폐암환자 진단에 사용되고 있는 바이오마커 Carcinoembryonic antigen (CEA), Cytokeratin 19 Fragment (Cyfra 21-1), Neuron-Specific Enolase (NSE)의 성분을 동시에 혈액에서 분석하여 그 결과를 CTCs, cfDNA의 분석 결과와 비교하였다. 그 결과, 기존의 혈액의 암진단 마커인 CEA, cyfra21-1, NSE 혹은 이들의 조합 결과보다도 ctDNA와 CTCs 분석의 폐암 진단 민감도, 양성 예측도 그리고 정확도가 높게 나타났고 결과값은 도4에 나타내었다.
각각의 분석을 다양하게 조합하여 폐암 진단을 예측하였을 때에 CTCs와 ctDNA 분석 결과를 조합하였을 때에 특이도를 제외한 폐암진단의 민감도, 양성 예측도, 음성 예측도 그리고 정확도가 다른 조합에 비하여 높게 나타났고 그 결과는 도5 및 도6에 나타내었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 폐암 의심 환자의 혈액을 준비하는 단계;
    상기 혈액에서 혈장을 분리하는 단계;
    상기 혈장이 제거된 혈액에 버퍼를 추가한 후 항체 중합체를 혼합시키는 단계;
    상기 항체 중합체가 혼합된 혈액에서 원심분리를 통해 말초혈액 단핵세포가 포함된 층을 분리하는 단계;
    상기 분리된 말초혈액 단핵세포가 포함된 층의 세포들을 안정화시키는 단계;
    고밀도 마이크로 칩을 통해 상기 안정화된 세포들을 통과시켜 혈중 순환 암세포(Circulating tumor cell)를 분리하는 단계;
    상기 분리된 혈중 순환 암세포를 폐암 특이적 바이오마커로 형광염색하여 분석하는 단계; 및
    상기 분리된 혈장에서 혈장내 DNA의 단일 뉴클레오타이드 변이(single nucleotide variation) 및 복제개수 변이(copy number variations)를 기반으로 혈중 순환 암DNA(circulating tumor DNA)를 분석하는 단계;
    를 포함하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈장을 분리하는 단계는,
    상기 혈액을 12 내지 18분동안 1800 내지 2000G에서 원심분리를 통해 상층액을 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 상층액을 12 내지 18분동안 15000 내지 17000G에서 원심분리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포들을 안정화시키는 단계는 5 내지 20ml의 버퍼를 1 내지 3분마다 3 내지 5회 혼합시키는 것을 특징으로 하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
  4. 제1하에 있어서,
    상기 혈중 순환 암DNA를 분석하는 단계는 AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, DRBB2, FGFR1, FOXL2, GNAS, HRAS, IDH1, IDH2, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MTOR, NRAS, NTRK1, NTRK3, PDGFRA, RET, ROS1, SMAD4, TERT 및 TP53으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 3종류 유전자들의 단일 뉴클레오타이드 변이(single nucleotide variation) 및 복제개수 변이(copy number variations)를 분석하는 것을 특징으로 하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 고밀도 마이크로칩은 BSA(Bovine serum albumin) 용액 및 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)로 3 내지 7분간 처리하여 코팅된 것을 특징으로 하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 고밀도 마이크로칩은 복수개의 사각형 여과 구멍들이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폐암 특이적 바이오마커는 CK(Cytokeratin) 또는 EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule)인 것을 특징으로 하는 혈중 순환 암DNA 및 혈중 순환 암세포 기반 폐암 예측방법.
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