KR101983547B1

KR101983547B1 - 단기배양 혈중 암세포(ctc)를 활용한 개인 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법

Info

Publication number: KR101983547B1
Application number: KR1020170042895A
Authority: KR
Inventors: 전병희
Original assignee: 주식회사 싸이토젠
Priority date: 2016-04-04
Filing date: 2017-04-03
Publication date: 2019-05-29
Also published as: KR20170114958A

Abstract

본 발명의 개인 맞춤형 항암제 선별방법 및 선별방법을 수행할 수 있는 선별시스템에 관한 것이다. 본 발명에서는 단기배양 혈중암세포(CTC)를 활용하여 암세포의 유전정보를 취득한다. 혈중암세포는 암 환자의 채혈된 혈액으로부터 분리하여 획득할 수 있기에 종래의 세포조직으로 항암치료반응을 조사하는 방법보다 위험성이 적고, 필요할 경우 단기간 내에 혈액을 다시 채혈하는 것 또한 용이하다. 본 발명의 단기배양 혈중암세포를 활용한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 이용하면, 한 질병에 대하여 일률적으로 같은 처방을 하는 것이 아니라 개인의 유전형질에 따라 맞춤형 항암제를 처방할 수 있다. 또한 일률적 처방이 아닌 맞춤형 항암제 선별을 선행하여 항암치료에 수반되는 부작용에 대한 위험성을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 항암치료에 따른 비용이나 시간을 절감할 수 있다.

Description

단기배양 혈중 암세포(CTC)를 활용한 개인 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법 {PERSONALIZED ANTICANCER CHEMOTHERAPY SCREENING SYSTEM AND PROCESS USING A SHORT-TERM CULTURE CIRCULATING TUMOR CELL(CTC)}

본 발명은 개인 맞춤형 항암제 선별시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단기배양한 혈중 암세포(CTC)를 활용한 개인 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법에 관한 것이다.

개인들을 특정 질병이나 특정 치료에 대한 반응에 관하여 각 환자의 개별적 특성에 맞춘 의료 치료를 제공하는 것을 맞춤의학이라고 한다. 근대의학에서는 같은 질병의 경우 개개인의 유전형질과 무관하게 같은 의약을 확립된 투여용량 범위 내에서 처방하는 획일적 치료를 해왔었다. 하지만 최근 각종 유전체 프로젝트를 통하여 인체의 질환을 유전자 수준에서 이해할 수 있는 기반이 조성되었으며, 이에 따라 유전적 환경이 다른 환자 개개인에 맞추어 보편적 치료가 아닌 개개인의 유전형질과 각각의 약물반응을 비교해보면서 개인 맞춤형 질병 진단, 치료, 예방하는 맞춤 의학의 시대가 도래하고 있다.

이때, 개별적인 차이를 파악하기 위해서는 개인의 유전형질을 알아야 할 필요가 있고, 이를 위하여 개인의 유전형질에 대해 분석하기 위해서 먼저 개인의 신체조직을 수집할 필요가 있다.

이에, 한국등록특허 제10-0897714호(항우울제의 선택적 선별을 위한 모노아민수송체 유전자다형성의 조합)에서는 우울증 환자를 대상으로 항우울제를 처방할 때에 개인유전정보에 기초한 약물 선별방법을 제안하였다.

그러나 이러한 기술은 DNA 샘플의 수득 단계에 대해서는 정확하게 제시되어 있지 않고, 제한적인 항우울제의 종류 내에서만 반응검사를 해볼 수밖에 없다는 점에 따라, 처방에 따른 부작용을 최소화하기 어렵다는 한계가 있었다.

다만, 종래에는 신체에 천공(구멍)을 내서 생체조직(특히 암 조직과 같은 질병 조직)을 수집하는 침생검병리조직검사(invasive tissue biopsy)를 이용하여 생체조직 수집할 수밖에 없었다. 이는 고가의 방법임은 물론, 환자 신체 내에 침습 기구가 침습해야 하는 점에서 환자가 채집과정에서 고통스러움은 물론, 암세포의 경우에는 골수 내 암세포를 수집할 필요가 있어서 침습 과정이 환자에게 위험할 수도 있다는 단점이 있었다. 그러나 혈중암세포(CTC)를 수집하는 경우에 단순히 환자의 혈액만 채취하면 되므로 침습 기구가 환자의 신체 내에 침습하지 않아 간편하고, 안전하다. 나아가, 혈액을 채취하는 것은 단시간 내에 가능하므로 시간도 절약되어 항암제 반응의 결과에 기초하여 개개인에게 맞는 항암제 선별하는 전체 과정의 시간이 단축되어 경제적인 측면 또한 존재한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 단기배양 혈중암세포(CTC)를 활용하여 개인 맞춤형 항암제 선별용 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 다른 목적은 상기 단기배양 혈중암세포(CTC)를 이용하여 개인 맞춤형 항암제 선별용 시스템을 이용하여 개인 맞춤형 항암제 선별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따른 개인 맞춤형 항암제 선별방법은

암 환자의 혈액을 채혈하는 단계;

상기 채혈된 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계;

상기 백혈구가 제거된 용액에 피콜용액(Ficoll-solution)을 넣고 원심분리하는 단계;

상기 원심분리된 용액으로부터 혈중암세포(Circulating Tumor Cells)를 분리하는 단계;

상기 분리된 혈중암세포를 단기 배양하는 단계;

상기 배양된 혈중암세포와 후보 항암제를 반응시키는 단계;

상기 후보 항암제 반응을 검사하는 단계;

상기 검사결과를 토대로 후보 항암제 관련 정보를 분석하는 단계; 및

상기 분석된 후보 항암제 관련 정보를 토대로 맞춤형 항암제를 선별하는 단계를 포함하고,

상기 혈중암세포를 분리하는 단계는 사이즈 선택성 칩(chip)을 이용하여 분리되는 것을 포함하고,

상기 사이즈 선택성 칩은 상기 시료의 반복 통과가 가능하며,

상기 단기 배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어진 것을 특징으로 하는 것을 포함하고,

상기 후보 항암제 관련 정보를 분석하는 단계는,

상기 혈중암세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 취합하여 반응정보 클러스터를 구축하는 단계;

상기 반응정보 클러스터를 이용하여 혈중암세포의 유전정보와 후보 항암제 간의 반응정보를 데이터마이닝 하는 단계; 및

상기 데이터마이닝한 반응정보를 기초로 개인별 반응 효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계를 포함한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 인슐린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 트랜스페린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 상피성장인자는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 3 내지 30μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 단기 배양하는 단계는 혈중암세포 접착을 막아주는 표면을 가진 배양플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 배양플레이트는 히드로겔층이 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 히드로겔층은 중성전하를 가지면서 친수성인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 일측면에 따른 개인 맞춤형 항암제 선별 시스템은

채혈된 암 환자의 혈액으로부터 혈중암세포를 분리하는 분리장치;

상기 분리장치에 의해 분리된 혈중암세포를 단기 배양하는 배양장치;

상기 배양장치에 의해 배양된 혈중암세포와 후보 항암제 간의 반응을 검사하는 반응검사장치;

상기 반응검사장치의 검사결과를 분석하는 분석장치; 및

상기 분석장치에 의한 분석결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치를 포함하고,

상기 분리장치는, 상기 채혈된 암 환자의 혈액을 주입할 수 있는 주입구;

상기 주입된 혈액을 수송하는 제1 도관;

상기 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 여과구멍들을 갖는 여과 망;

상기 여과 망을 통하여 통과된 혈중암세포를 제외한 혈액 내 성분이 배출되는 제2도관;

상기 제2 도관을 통해 통과된 상기 혈중암세포를 제외한 혈액 내 성분을 수집하는 실린더를 포함한다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 개개인이 가지고 있는 유전형질을 분석하여 처방에 따른 부작용이 발생하는 것을 미리 방지할 수 있다. 또한, 환자에게 질병에 대해 우선 처방한 후 반응경과에 따라 처방을 비로소 변경하는 것이 아니라, 처방하기 전에 미리 치료방향을 결정하여 처방 후 치료과정에서 발생할 수 있는 부작용을 줄일 수 있다. 나아가, 환자의 혈액으로부터 혈중암세포(CTC)를 분리하여 분석의 대상으로 하는바, 기존의 침습법에 따른 조직 채취 방법보다 비용과 시간을 절감할 수 있고, 반복적인 채혈이 가능하여 항암제와의 반응결과에 대한 자료를 많이 축적할 수 있어 반응결과 및 자료 분석의 정확도가 증가하고, 채혈과정에서 환자의 신체에 침습할 염려가 없어, 위험성을 낮출 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명에 따른 항암제 선별 방법의 일 예를 도시한 도면,
도 2는 본 발명에 따른 항암제 선별 방법 중 후보 항암제 반응정보 검사방법의 일 예를 도시한 도면,
도 3은 본 발명에 따른 항암제 선별 시스템의 일 예를 도시한 도면, 그리고,
도 4는 본 발명에 따른 항암제 선별 시스템 중 분리장치의 일 예를 도시한 도면이다.
도5는 사이즈 선택성 칩에 의해 분리된 혈중암세포를 찍은 사진이다.
도6은 본 발명에 따른 배양액에서 배양된 혈중암세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양액에서 배양된 혈중암세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도7은 본 발명에 따른 배양액을 이용하여, 본 발명에서 사용된 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중암세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양플레이트에서 배양된 혈중암세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하 첨부된 도면을 참고하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

도 1은 본 발명에 따른 항암제 선별 방법의 일 예를 도시한 도면이다.

도 1을 참조하면, 맞춤형 항암제 선별을 하기 위해 우선, 암 환자의 혈액을 채혈해야 한다(S110). 채혈이란, 질병의 진단 등을 위하여 피를 뽑는 것을 의미하는 것으로서, 유전자 정보를 얻기 위해 조직채취방법보다 간단하고, 반복적인 채혈이 가능하다. 조직채취의 경우, 채취기구가 신체 내에 침입해야 하므로, 채취방법 자체가 환자의 신체에 상해를 가할 수 있어서 위험하고, 시간적, 비용적 측면에서 비경제적이다.

반면, 채혈은 주사기 등을 이용하여 팔꿈치 부분의 정맥이 짚이는 부분(주정증피정맥, 요추피정맥, 척추피정맥 등)이나 손가락 등 채혈이 가능한 부위 어느 곳에서나 쉽게 혈액을 채취할 수 있으므로, 1일 내지 30일 혹은 채혈한 당일에도 연속적으로 채혈할 수 있다. 연속적으로 채혈할 수 있다면 혈중암세포 분리과정이나 배양과정에서 반응검사를 할 만한 양의 혈중암세포를 획득하지 못했거나, 선별된 항암제의 효과가 예상보다 좋지 않을 때, 신속하게 채혈을 통해 혈중암세포를 획득할 수 있어서 반응의 정확도를 높일 수 있다.

암 환자의 혈액을 채혈한 이후에는 전처리할 수 있다.

전처리 방법의 일 예로서, 채혈된 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계, 백혈구가 제거된 용액에 피콜용액 (Ficoll-solution)을 넣고 20분 동안 원심분리하는 단계를 거치면, 전처리된 혈액인 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell, 말초 혈액 단핵구) 분리액을 회수할 수 있다. 피콜용액 (Ficoll-solution)은 에피클로로히드린과 수크로오스의 반응으로 만들어진 합성 다당류 같은 중합체용액으로, 부유 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 적혈구(RBC; red blood cell)와 백혈구(WBC; white blood cell)가 제거된 혈중암세포를 분리할 수 있게 한다.

전처리 방법의 다른 일 예로서, 상기 방법으로부터 백혈구를 제거하는 단계를 제외하고, 상기 원심분리 단계만으로 전처리된 혈액을 회수할 수 있다.

전처리 방법의 또 다른 일 예로서, 채혈된 혈액의 적혈구(RBC)를 용해하는 단계, 피콜용액을 넣고 20분 동안 원심분리하는 단계를 거쳐 전처리된 혈액을 회수할 수 있다.

상기 3가지 전처리 방법에 따라 회수된 PBMC 분리액을 여과하기 전에 버퍼(buffer)로 희석하여 전처리를 완료한다. 따라서, 여과단계 이전인 전처리 단계에서 백혈구가 제거될 수도 있고, 여과단계에서 걸러질 수도 있음을 알 수 있다.

상기 채혈된 혈액 또는 상기 전처리한 혈액으로부터 혈중암세포를 분리한다(S120). 분리된 혈중암세포는 혈액 내 극 소수의 살아있는 암세포를 포획한 것으로서, 암세포를 배양하여 짧은 시간에 다량 확보하여 후보 항암제와 반응시킬 수 있을 정도의 양을 확보할 수 있다(S130).

본 발명의 실시예에서 상기 혈중암세포는 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 이용하여 분리될 수 있다. 이 칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 순환 종양세포를 포착할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5μm이 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5 μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5μm보다 작을 경우 백혈구와 적혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5 μm보다 클 경우에는 기공의 크기가 암 세포의 크기보다 커서 암세포가 칩을 통과하여 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 모양은 원형, 사각형 또는 타원 모양일 수 있으며, 바람직하게는 사각형일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩의 기공은 규칙적인 패턴으로 배열될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩은 구체적으로 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리를 소재로 제작될 수 있다. 상기 기공들은 멤스(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)기술을 이용한 에칭(etching)에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩에서 상기 시료가 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중암세포가 상기 사이즈 선택성 칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중암세포를 다시 한번 상기 사이즈 선택성 칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩을 통한 혈중암세포 분리는 혈중암세포가 포함된 용액을 사이즈 선택성 칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중암세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 사이즈 선택성 칩을 통한 혈중암세포 분리는 혈중암세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩은, 혈중암세포가 분리될 때 상기 사이즈 선택성 칩에 의한 혈중암세포 데미지를 최소화시키거나 상기 사이즈 선택성 칩이 반복사용이 더 효율적으로 되도록 하기 위해, 또는 혈중암세포 회수율을 보다 더 효율적으로 하기 위해 특정 물질로 코팅될 수 있다. 상기 특정 물질은, 구체적으로 혈중암세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 세포에 물리적 또는 화학적으로 데미지를 주지 않는 생체재료이면 가능하다.

본 발명의 실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스퍼린, EGF(Epidermal Growth Factor) 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어질 수 있다.

상기 인슐린은 인간의 물질대사 체계의 호르몬 중 하나이며 이자 (기관)의 랑게르한스 섬 베타 세포에서 분비되어, 혈액 속의 포도당 수치인 혈당량을 일정하게 유지시키는 역할을 한다. 혈당량이 일정 이상으로 높아지면 인슐린이 분비되며, 혈액내의 포도당을 세포 내로 유입해 다시 다당류(글리코겐)의 형태로 저장하는 작용을 촉진시킨다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 인슐린을 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인슐린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40ng/ml, 3~30ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 트랜스페린은 β글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2분자의 3가철이온과 결합하여 세포증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린수용체를 매개로 하여 세포 내로 공급하는 철운반단백질이다. 혈청 속의 철 99% 이상은 트랜스페린과 결합하며 정상적으로는 트랜스페린의 약 1/3이 철과 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 트랜스페린을 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 트랜스페린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40 ng/ml, 3~30 ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 상피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 상피성장인자 수용체에 결합하여 세포의 성장 및 분열을 촉진시키는 폴리펩티드성 성장인자이다. 또한, 상기 상피성장인자는 단백질합성이나 RNA합성을 촉진하는 것 외에 오르니틴 탈카르복실효소를 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 상피성장인자를 포함함으로써 혈중암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 상피성장인자는 0.5~10ng/ml, 0.5~9 ng/ml, 0.5~8ng/ml, 0.5~7ng/ml, 0.5~6ng/ml, 0.5~5ng/ml, 0.7~10ng/ml, 0.7~9ng/ml, 0.7~8ng/ml, 0.7~7ng/ml, 0.7~6ng/ml, 0.7~5ng/ml, 1~10ng/ml, 1~9ng/ml, 1~8ng/ml, 1~7ng/ml, 1~6ng/ml 또는 1~5ng/ml 일 수 있다.

상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho 키나제(ROCK)를 타겟으로 하여그 기능을 억제시키거나 저하시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 여기서, Rho키나제는 세린-트레오닌 키나제의 AGC패밀리(PKA/PKG/PKC)에 속하는 키나제이다. 상기 Rho 키나제는 사이토스켈레톤에 작용함으로써 세포의 운동 및 형태를 제어하는 과정에 관련되어 있다. 구체적으로는 상기 Rho 키나제는 세포의 이동 및 액틴 조직화의 조절인자로 작용할 수 있다. 상기 Rho 키나제는 당뇨병, 출혈성 뇌혈관질환, 파킨스씨 병 같은 신경변성 질환에 관련되어 있고, 상기 Rho 키나제 억제제 가 상기 Rho 키나제관련 질병들에 대한 치료 및 억제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 파수딜은 ROCK 억제제의 하나로서, 뇌혈관경련 치료를 위해 사용될 수 있으며 폐고혈압 치료에도 효과를 나타낼 수 있다. 상기 리파수딜은 상기 파수딜의 유도체로서 ROCK 억제제로 작용할 수 있으며 녹내장 또는 고안압증 치료에도 사용될 수 있다. 상기 RKI-1447은 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 상기 Y27632은 세포를 통과하여 효소의 촉매부위 결합을 위해 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 3~30μm, 3~27μm, 3~24μm, 3~21μm, 4~20μm, 4~30μm, 4~27μm, 4~24μm, 4~21μm, 4~20μm, 5~30μm, 5~27μm, 5~24μm, 5~21μm 또는 5~20μm일 수 있다.

본 발명에 따른 단기 배양에서 사용되는 상기 배양플레이트는 세포 접착을 막아주는 표면을 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중암세포는 부유상태에서 배양을 시킬 수 있으므로 상기 배양플레이트의 표면이 세포 접착을 막아주도록 코팅이 될 수 있다. 상기 배양플레이트의 표면 코팅은 히드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 히드로겔은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하며, 히드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성된다. 구체적으로 보면, 상기 히드로겔은 공유 결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 이렇게 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 비슷한 거동을 보인다. 상기 히드로겔은 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할수 있으며 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 상기 배양플레이트에 공유결합으로 코팅되어 혈중암세포가 배양플레이트 표면에 접착되는 것을 막아줄 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 중성전하를 가지면서 친수성을 가질 수 있다. 상기 중성전하를 가진다는 것은 전하가 플러스도 아니고 마이너스도 아닌 상태를 가진다는 것을 의미하며, 상기 친수성이란, 물에 대한 강한 친화력을 말하는 것으로서 물에 잘 용해될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 실시예에서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1내지15일동안 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는 5내지 15일일수 있으며 바람직하게는 10 내지 15일일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 12내지 15일일 수 있다.

일반적으로 항암제 치료를 받는 경우 환자가 항암제를 처음 투약한 후 3주 정도를 항암치료의 일반적인 주기로 보는데, 이는 항암제의 독성이 커서 연속적으로 치료할 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 선별방법에 따른 항암제가 환자에게 적합하지 않으면 1차 항암치료를 한 이후 2차 항암치료를 준비할 수 있도록, 배양 기간을 더 길게 설정할 수도 있다.

혈중암세포의 배양이 끝나면 환자의 암의 종류와 암의 경과 시기 등을 고려한 후보 항암제 군을 선별하고, 상기 후보 항암제군, 모두를 환자의 혈중암세포와 반응시킨다(S140).

이후, 혈중암세포와 후보 항암제 군과의 반응결과를 검사하면서, 부작용이 있는지, 반응에 따른 암세포의 사멸 정도를 비교해가며 후보 항암제의 반응을 검사한다(S150).

후보 항암제 반응 검사의 결과를 토대로 후보 항암제와 혈중암세포 간의 반응을 비교 분석한다(S160).

도 2는 본 발명에 따른 항암제 선별 방법 중 후보 항암제 반응정보 검사방법의 일 예를 도시한 도면이다.

상기 분석과정은 우선적으로, 혈중암세포의 유전정보 및 혈중암세포와 후보 항암제 간의 반응 경과, 부작용여부, 혈중암세포의 사멸 정도 등을 비교해서 내린 반응 검사 결과를 취합한다(S161).

상기 취합된 반응 검사 결과를 토대로 항암제와 관련된 정보클러스터를 구축한다(S162). 정보클러스터란 상기 취합했던 반응 검사 결과를 모두 모은 정보의 집합체로 본다.

상기 항암제와 관련된 정보클러스터를 이용하여 데이터마이닝(data mining)을 한다(S163). 데이터마이닝이란 취합했던 환자의 유전정보와 혈중암세포와 후보 항암제 간의 반응에 따른 무수한 정보 가운데 숨겨져 있는 유용한 상관관계를 발견하여, 실행 가능한 정보를 추출하고 선별 결정에 이용하는 과정을 의미한다.

상기 상관관계를 발견하는 과정에서 혈중암세포와 후보 항암제 간의 반응 효과에 따른 알고리즘을 구축할 수 있다(S164). 본 발명에서의 알고리즘은 환자의 유전정보에 맞는 항암제를 선별하기 위하여 후보 항암제 중에 가장 적합한 항암제를 발견하기 위해 거치는 일련의 순서화된 절차를 의미한다.

상기 후보 항암제 반응정보 분석 전 단계(S160)를 거쳐, 환자에게 가장 적합한 맞춤형 항암제를 선별한다(S170).

도 3은 본 발명에 따른 항암제 선별 시스템의 일 예를 도시한 도면이다(200).

상기 항암제 선별 시스템은 개인 맞춤형 항암제를 선별하기 위하여 갖춰져야 하는 장치들을 조합한 집합체를 의미한다.

도 3에서는 분리장치(210)를 통하여 전처리 된 혈액으로부터 혈중암세포만을 분리한다.

도4는 본 발명에 따른 항암제 선별 시스템 중 분리장치의 일 예를 도시한 도면이다.

혈중암세포 분리장치의 주입구(211)를 통하여 상기 전처리 된 혈액을 주입할 수 있는데, 주입구(211)는 긴 원통형 구조로 되어 있으므로, 상기 전처리 된 혈액을 한꺼번에 많이 주입할 수 있도록 해주며, 시료 주입 시와 회수 시 탈부착이 가능한 구조로 세척이나 회수가 용이하다.

주입구(211)를 통하여 상기 전처리 된 혈액이 주입되면 제1 도관(212)를 통해서 상기 전처리 된 혈액이 여과 망(213)까지 수송되게 된다.

상기 여과 망(214)은 복수의 여과구멍들이 있는 얇은 판으로서, 상기 복수의 여과구멍들의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나일 수 있다. 나아가, 상기 여과구멍의 크기(pore size)는 위에서 언급한 바와 같이5.5 내지 8.5μm일 수 있다. 여과구멍의 크기에 따라, 전처리 된 혈액의 구성성분 중 크기가 큰 혈중암세포를 제외하고 나머지 유체들을 여과 망 아래로 분리한다.

상기 여과 망을 통하여 분리된 나머지 유체들은 제2 도관(214)을 통하여 배출되고, 배출된 나머지 유체들은 실린더(215)에 의하여 수집되어 폐기된다.

분리장치를 거쳐 분리된 혈중암세포는 배양장치(220)에서 반응실험에 필요한 수준이 될 때까지 배양된다.

배양장치(221) 내에서 배양된 혈중암세포는 반응검사장치(230) 내에서 후보 항암제와 반응을 한다.

후보 항암제와의 반응결과를 기초로 분석장치(240)를 활용하여 상기 항암제와 관련된 정보 클러스터를 생성하고, 상기 정보 클러스터를 기초로 데이터마이닝을 한다. 상기 데이터마이닝을 통하여 혈중암세포와 후보 항암제 간의 반응 효과에 따른 알고리즘을 구축할 수 있다. 상기 분석장치의 분석을 더 정확하게 하기 위하여, 정량적 중합효소 연쇄반응기기(q-pcr machine), 플레이트 리더기(plate reader), 공초점 현미경 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine)란 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 것으로 DNA 또는 RNA를 시간에 따라 모니터링하는 기기이다. 나아가, 플레이트 리더기(plate reader)는 세포 수준의 반응을 미량으로 실행하고, 상기 변화를 감지하여 분석하는 기기이다. 공초점 현미경은 바늘구멍 조리개를 통해 여러 단면에 초점을 맞추는 현미경으로, 세포를 깊이감 있는 3차원 구조로 관찰할 수 있는 기기이다.

상기 분석장치(240)를 이용하여 나온 상기 알고리즘을 토대로 상기 선별장치(250)에서 환자에게 가장 적합한 항암제를 선별할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 기재한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.

실시예 1. 사이즈 선택성을 가지는 칩 제작 단계

실험에서 사용되는 사이즈 선택성을 가지는 칩은 기공의 크기(pore-size)가 5.5~8.5μm로 형성되어 있어, 5.5μm보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 5.5 μm보다 큰 사이즈의 암 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.

참고로, 사이즈 선택성을 가지는 칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	스파이킹 세포 수	회수 된 세포 수	세포 회수율(%)
1	10	9	90
2	100	86	86
3	1000	850	85

칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.

실시예 2. 혈중암세포 준비 단계

1. 암 환자의 말초혈액을 추출하여 혈액 추출용 ACDA(acid citrate dextrose solution 'A') 튜브에 담는다.

2. 말초혈액과 동일 볼륨의 피콜(ficoll) 용액을 새로운 튜브에 담고, PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)로 희석시킨 말초혈액을 피콜 용액 층 위로 조심스럽게 옮긴다.

3. 400xg의 스피드로 상온에서 30분간 원심분리 한다.

4. 원심분리 후, 형성된 말초혈액 단핵세포 층을 새로운 튜브로 옮겨 담고, 제 3 버퍼(buffer)를 이용해 희석시킨다.

5. 사이즈 선택성을 가지는 칩을 고정대에 고정시킨 후, 제 4 버퍼를 이용하여 칩을 미리 적셔 놓는다.

6. 위 실험방법 5에서, 제 3 버퍼로 희석된 말초혈액 단핵세포를 칩으로 통과시킨다.

7. 세포의 회수율을 높이기 위해, 튜브에 남아있는 세포들을 제 3 버퍼로 헹군 후, 칩으로 통과시키는 과정을 반복 수행한다.

8. 칩으로부터 세포를 회수한다.

실시예 3. 분리된 혈중암세포의 단기 배양

본 발명에 따른 사이즈 선택성 칩에 의해 분리된 혈중순환 종양세포를 중성전하를가지면서 친수성을 띄는 히드로겔로 코팅된 Ultra low attachment 배양플레이트에 seeding을 했다. 상기 배양플레이트는 11ng/ml 인슐린, 22ng/ml 트랜스페린, 2ng/ml EGF 및 8μm ROCK 억제제를 포함하고 있는 배양액이 들어 있으며 상기 단기 배양은 배양한 시점부터 14일동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5~10% CO2 조건하에서 배양을 실시했다.

실시예 4. 혈중암세포의 확인 단계

상기 실시예3에 따라 단기 배양된 혈중암세포는 염색 방법을 통해 암 세포임을 확인하기 위하여, 하기 방법을 이용하여 세포 염색과정을 수행한다.

1. 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 회수된 세포들을 염색용 슬라이드에 고정시킨다.

2. 항체가 세포 내부로 들어갈 수 있도록 투과(permeabilization)과정을 수행한다.

3. PBS로 워싱(washing) 과정을 수행한다.

4. PBS를 이용하여 1% BSA(bovine serum albumin)를 만들고, 비특이적 반응(non-specific binding)과 내인성 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)를 줄이기 위해 블러킹(blocking) 과정을 수행한다.

5. 1차 항체로 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CK(cytokeratin) 및 CD(cluster of differentiation) 45를 상온에서 60분간 반응시킨다.

6. 상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 상온에서 60분간 반응시킨다.

7. PBS로 워싱 과정을 수행한다.

8. 최종적으로 세포 핵을 염색하기 위해, DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution을 넣은 후 커버글라스를 덮고 상온에서 10분간 반응시킨다.

9. 염색된 세포들을 관찰하면서, 염색된 비율 및 회수율을 매뉴얼로 계산한다.

비교예 1. 배양액에 따른 혈중순환 암세포의 배양된 세포수 변화

일반적으로 세포 배양에 사용되는 세포 배양액과 본 발명에 따른 배양액에서 혈중순환 암세포의 분열 및 성장 정도를 비교실험하였다. 일반적으로 세포 배양에 사용되는 배양액은 25 nM sodium selenite, 50 nM Hydrocortisone, 0.01 mM ethanolamine, 0.01 mM phosphorylethanolamine, 100 pM triiodothyronine, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 10 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, 4.5mM L-glutamine 및 1X antibiotic-antimycotic 을 포함하고 있으며, 본 발명의 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다. 또한 배양 조건은 일반적인 플레이트를 이용한 점을 제외하고는 실시예3과 동일하다.

도6을 보면, CD45-는 배양되는 혈중순환 암세포에 대한 바이오마커이며, Normal growth media는 일반적인 세포 배양액, CG growth media는 본 발명에 따른 배양액을 의미한다. 도6은 본 발명에 따른 배양액에서 혈중순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 본 발명에 따른 배양액이 일반적인 배양액보다 혈중순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.

비교예 2. 히드로겔이 코팅된 배양플레이트에서 배양액에 따른 혈중순환 암세포의 배양된 세포수 변화

본 발명에 따른 배양액이 사용된 상황에서, 혈중암세포의 세포 성장 및 분열에 대한 히드로겔 코팅된 배양플레이트 효과를 측정하기 위해 일반적인 배양플레이트와 비교배양을 실시하였다. 본 발명에 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다.

도7을 보면, Normal culture type은 일반적인 세포 배양플레이트(세포가 배양플레이트 표면이 붙음)를 나타낸 것이고, Low attachment type은 본 발명에서 사용된 히드로겔이 코팅된 배양플레이트이다. 도7은 본 발명에 따른 배양액을 이용하여 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서의 배양이 혈중순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

200 : 개인 맞춤형 항암제 선별 시스템
210 : 분리장치
211 : 주입구
212: 제1도관
213 : 여과 망
214 : 제2도관
215 : 실린더
220 : 배양장치
230 : 반응검사장치
240 : 분석장치
250 : 선별장치

Claims

암 환자의 혈액을 채혈하는 단계;
상기 채혈된 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계;
상기 백혈구가 제거된 용액에 피콜용액(Ficoll-solution)을 넣고 원심분리하는 단계;
상기 원심분리된 용액으로부터 혈중암세포(Circulating Tumor Cells)를 분리하는 단계;
상기 분리된 혈중암세포를 단기 배양하는 단계;
상기 배양된 혈중암세포와 후보 항암제를 반응시키는 단계;
상기 후보 항암제 반응을 검사하는 단계;
상기 검사결과를 토대로 후보 항암제 관련 정보를 분석하는 단계; 및
상기 분석된 후보 항암제 관련 정보를 토대로 맞춤형 항암제를 선별하는 단계를 포함하고,
상기 혈중암세포를 분리하는 단계는 사이즈 선택성 칩(chip)을 이용하여 분리되는 것을 포함하고,
상기 사이즈 선택성 칩은 상기 혈액 시료의 반복 통과가 가능하며,
상기 단기 배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 이루어진 것을 특징으로 하는 것을 포함하고,
상기 ROCK 억제제는 리파수딜(Ripasudil) 또는 RKI-1447인 것을 특징으로 하며,
상기 단기 배양하는 단계는 혈중암세포 접착을 막아주는 표면을 가진 배양플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하고,
상기 배양플레이트는 히드로겔층이 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하며,
상기 히드로겔층은 중성전하를 가지면서 친수성인 것을 특징으로 하고,
상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하며,
상기 인슐린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하고,
상기 트랜스페린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하며,
상기 상피성장인자는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하고,
상기 ROCK 억제제는 3 내지 30μm인 것을 특징으로 하며,
상기 사이즈 선택성 칩은 10분이내에 90%의 회수율로 혈중암세포를 포착하는 것을 특징으로 하고,
상기 사이즈 선택성 칩의 기공크기는 6.5 내지 7.5μm인 것을 특징으로 하며,
상기 사이즈 선택성 칩의 기공 모양은 사각형인 것을 특징으로 하고,
상기 사이즈 선택성 칩은 중력을 이용하여 혈중암세포를 분리하는 것을 특징으로 하며,
상기 후보 항암제 관련 정보를 분석하는 단계는,
상기 혈중암세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 취합하여 반응정보 클러스터를 구축하는 단계;
상기 반응정보 클러스터를 이용하여 혈중암세포의 유전정보와 후보 항암제 간의 반응정보를 데이터마이닝 하는 단계; 및
상기 데이터마이닝한 반응정보를 기초로 개인별 반응 효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계를 포함하는 개인 맞춤형 항암제 선별방법.
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