WO2019235576A1 - ヒトa1アストロサイトの製造方法、ヒトa1アストロサイト、及び被験物質の評価方法 - Google Patents

ヒトa1アストロサイトの製造方法、ヒトa1アストロサイト、及び被験物質の評価方法 Download PDF

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速人 小林
摂 遠藤
彰 鍋谷
義庚 申
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    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • G01N33/5058Neurological cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing human A1 astrocytes and human A1 astrocytes. Furthermore, the present invention relates to a screening method for a test substance using the produced human A1 astrocyte.
  • Astrocytes a type of glial cells that make up the brain, play various roles in maintaining homeostasis of the central nervous system, such as supplying nutrients to neurons and synapse formation and removal. It attracts attention from a viewpoint.
  • astrocytes are activated by neurological diseases and aging. Recently, it has been reported that there are two types of activated astrocytes: neuropathic A1 astrocytes and neuroprotective A2 astrocytes (Non-patent Document 1 and Patent Document 1). Human A1 astrocytes are of great value in terms of drug discovery research because they can be used for screening drugs that suppress nerve damage.
  • Non-Patent Document 1 describes that mouse (non-activated) astrocytes are induced into A1 astrocytes by three components of TNF ⁇ , IL-1 ⁇ , and C1q.
  • Non-Patent Document 2 it has been reported that there is a species difference between mouse and human astrocytes (Non-Patent Document 2), and it is unclear whether it can be induced similarly in human astrocytes.
  • Patent Document 2 suggests that inflammatory cytokines such as TNF ⁇ and IFN ⁇ are involved in the activation of astrocytes, and the three components of TNF ⁇ , IFN ⁇ , and MPTP (not activated) in mice. It is described that the site has been activated. However, as a result of the activation of astrocytes, it is unknown whether it is induced by A1 astrocytes or A2 astrocytes, and it is also unknown whether similar activation occurs in human astrocytes.
  • inflammatory cytokines such as TNF ⁇ and IFN ⁇ are involved in the activation of astrocytes, and the three components of TNF ⁇ , IFN ⁇ , and MPTP (not activated) in mice. It is described that the site has been activated. However, as a result of the activation of astrocytes, it is unknown whether it is induced by A1 astrocytes or A2 astrocytes, and it is also unknown whether similar activation occurs in human astrocytes.
  • Non-Patent Document 3 describes that IFN ⁇ and IL-1 ⁇ are involved in the activation of human astrocytes. However, as a result of astrocyte activation, it was unclear whether it was induced by A1 astrocytes or A2 astrocytes.
  • Human A1 astrocytes have great value from the viewpoint of drug discovery research, and a method for easily obtaining human A1 astrocytes is required. As described above, certain results have been obtained with respect to activation and induction of astrocytes, but a method for reliably inducing human astrocytes to human A1 astrocytes has not been found.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing human A1 astrocytes, which comprises inducing human A1 astrocytes from human astrocytes other than human A1 astrocytes.
  • Another object of the present invention is to provide a human A1 astrocyte obtained by the above-described method for producing human A1 astrocyte.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating a test substance using the above human A1 astrocytes.
  • the present inventors cultured human astrocytes other than human A1 astrocytes in the presence of TNF ⁇ and IFN ⁇ to convert the human astrocytes into human A1 astrocytes. I found that it can be guided. The present invention has been completed based on these findings.
  • a method for producing human A1 astrocytes comprising the step a of culturing human astrocytes other than human A1 astrocytes in the presence of TNF ⁇ and IFN ⁇ .
  • ⁇ 3> The method for producing human A1 astrocytes according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the step a is performed in the presence of any of the following.
  • the step a is Differentiating human pluripotent stem cells or cells capable of differentiating into human astrocytes into human astrocytes other than human A1 astrocytes; and human astrocytes other than human A1 astrocytes obtained in step a1 are transformed into TNF ⁇ and Step a2 of culturing in the presence of IFN ⁇ :
  • ⁇ 6> The method for producing human A1 astrocytes according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the step a is culturing in a serum-free medium.
  • ⁇ 7> The method for producing human A1 astrocytes according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein in the step a, the concentration of TNF ⁇ in the medium is 0.01 ng / mL to 30 ng / mL.
  • ⁇ 8> The method for producing human A1 astrocytes according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein in the step a, the concentration of IFN ⁇ in the medium is 0.1 ng / mL to 20 ng / mL.
  • ⁇ 9> The human A1 astrovirus according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein in the step a, the ratio of the concentration of TNF ⁇ in the medium to the concentration of IFN ⁇ in the medium is 100: 1 to 1: 100.
  • Site manufacturing method ⁇ 10> An isolated human A1 astrocyte obtained by the method for producing human A1 astrocyte according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>.
  • a test substance evaluation method comprising contacting the human A1 astrocyte according to ⁇ 10> with a test substance.
  • ⁇ 12> The test method for a test substance according to ⁇ 11>, wherein the change in neuropathy of the human A1 astrocyte is evaluated after contacting the test substance with the human A1 astrocyte described in ⁇ 10> .
  • human A1 astrocytes can be produced from human astrocytes.
  • the human A1 astrocyte of the present invention and the test substance evaluation method of the present invention are useful in drug discovery research and the like.
  • FIG. 1 shows the state after culturing human astrocytes in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 2 shows the state after culturing human astrocytes (derived from astrocyte progenitor cells) in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 3 shows the results of quantifying the expression of GBP2 and CXCL10 after culturing human astrocytes in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 4 shows the results of quantifying C3 expression after culturing human astrocytes in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 5 shows the results of quantifying C3 expression after culturing human astrocytes (derived from astrocyte progenitor cells) in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 1 shows the state after culturing human astrocytes in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 2 shows the state after culturing human astrocytes (derived from astrocyte progenitor cells) in the
  • FIG. 6 shows the results of quantifying the expression of C3 after culturing human astrocytes (primary culture) in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 7 shows the state of nerve cells when they are cultured with untreated human astrocytes or with human astrocytes cultured in the presence of a specific combination of compounds. Indicates.
  • FIG. 8 shows neuronal cell death when neurons (also referred to as neurons) are cultured with untreated human astrocytes or when cultured with human astrocytes cultured in the presence of a specific combination of compounds. An evaluation result is shown.
  • FIG. 7 shows the state of nerve cells when they are cultured with untreated human astrocytes or with human astrocytes cultured in the presence of a specific combination of compounds.
  • FIG. 8 shows neuronal cell death when neurons (also referred to as neurons) are cultured with untreated human astrocytes or when cultured with human astrocytes cultured in the presence of a specific combination of compounds. An
  • human astrocytes derived from astrocyte progenitor cells
  • untreated human astrocytes derived from astrocyte precursor cells
  • the state of nerve cells and the length of neurites when cultured together are shown.
  • TNF ⁇ indicates Tumor Necrosis Factor ⁇ .
  • IFN ⁇ represents interferon ⁇ .
  • IL-1 ⁇ represents Interleukin-1 ⁇ .
  • IL-1 ⁇ refers to interleukin-1 ⁇ .
  • C1q indicates complement C1q.
  • MPTP represents 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.
  • EMP1 represents epithelial membrane protein 1 (Epithelial membrane protein 1).
  • CD109 indicates a differentiation antigen group 109 (Cluster of Differentiation 109).
  • GBP2 represents guanylate binding protein 2 (guanylate binding protein 2).
  • C3 represents the complement molecule C3.
  • CXCL10 represents CXC motif chemokine 10.
  • GAPDH refers to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.
  • HBEGF represents a heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor.
  • WST represents water-soluble tetrazolium salt
  • the present invention relates to a method for producing human A1 astrocytes, comprising the step a of culturing human astrocytes other than human A1 astrocytes in the presence of TNF ⁇ and IFN ⁇ .
  • Step a is performed in the presence of TNF ⁇ and IFN ⁇ , or in the presence of at least one cytokine and / or complement selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ and C1q in addition to TNF ⁇ and IFN ⁇ . It is a step of culturing human astrocytes other than A1 astrocytes. Step a is preferably a step of culturing human astrocytes other than human A1 astrocytes in the presence of any of the following.
  • TNF ⁇ , IFN ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ (2) TNF ⁇ , IFN ⁇ , IL-1 ⁇ , C1q (3) TNF ⁇ , IFN ⁇ , IL-1 ⁇ , C1q (4) TNF ⁇ , IFN ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , C1q (5) TNF ⁇ , IFN ⁇
  • Step a is particularly preferably a step of culturing human astrocytes other than human A1 astrocytes in the presence of any of the following. (4) TNF ⁇ , IFN ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , C1q (5) TNF ⁇ , IFN ⁇
  • Step a is preferably a step of culturing human astrocytes other than human A1 astrocytes in the absence of MPTP.
  • Human astrocytes are human astrocytes.
  • Examples of the method for obtaining “human astrocytes other than human A1 astrocytes” used in the present invention include, for example, separation from cerebral cortex and spinal cord surgically obtained from a patient, or induction from cells that can differentiate into human astrocytes. And obtaining from human pluripotent stem cells. Any of these human astrocytes can be used as “human astrocytes other than human A1 astrocytes” in the method of the present invention.
  • human astrocytes other than human A1 astrocytes used in the present invention, preferably, human astrocytes derived from human pluripotent stem cells and human astrocytes derived from cells that can differentiate into human astrocytes are used. Can do.
  • Human astrocytes other than human A1 astrocytes can be used in the method of the present invention either in an isolated state or mixed with other cells. It can also be assumed that induction from pluripotent stem cells to human astrocytes and induction from human astrocytes to human A1 astrocytes are performed continuously.
  • the step a is a step a1 for differentiating human pluripotent stem cells or cells capable of differentiating into human astrocytes into human astrocytes other than human A1 astrocytes, and other than human A1 astrocytes obtained in step a1
  • a step of culturing human astrocytes in the presence of TNF ⁇ and IFN ⁇ is a step a1 for differentiating human pluripotent stem cells or cells capable of differentiating into human astrocytes into human astrocytes other than human A1 astrocytes.
  • human pluripotent stem cells include, but are not limited to, human iPS cells (human induced pluripotent stem cells), human ES cells (human embryonic stem cells), and human mesenchymal stem cells.
  • Examples of cells that can differentiate into human astrocytes include, but are not limited to, neural stem cells, glial neural progenitor cells, glial progenitor cells, astrocyte progenitor cells, fibroblasts, and the like.
  • Activated human astrocytes are human astrocytes activated by the influence of neurological diseases and the like. As activated human astrocytes, human A1 astrocytes characterized by neuropathy and neuroprotective human A2 astrocytes are known. Activated human astrocytes are also included in the human astrocytes of the present invention.
  • Human A1 astrocytes are a type of activated human astrocytes.
  • the human A1 astrocytes produced by the method of the present invention can be detected, confirmed and separated using, for example, morphological changes of cells, characteristic properties of human A1 astrocytes and specific markers.
  • Human A1 astrocytes have a hypertrophic characteristic appearance. Therefore, human A1 astrocytes can be detected by microscopic observation.
  • Specific markers for human A1 astrocytes include, but are not limited to, GBP2, CXCL10, and C3.
  • quarantine methods detection by antibodies
  • protein molecules may be detected by quantifying their mRNA amounts.
  • Human A1 astrocytes show neuronal cytotoxicity. Therefore, human A1 astrocytes can be detected by co-culturing with nerve cells and utilizing the damaging action on nerve cells.
  • Human A2 astrocytes are a type of activated human astrocytes. A2 astrocytes have increased expression of various neurotrophic factors and act on neurons in a protective manner. Specific markers for A2 astrocytes include, but are not limited to, EMP1 and CD109. Human A2 astrocytes have a star-like appearance. In the present invention, human A2 astrocytes can be used as human astrocytes other than human A1 astrocytes cultured in step a.
  • TNF ⁇ is a kind of cytokine and is a substance widely involved in biological defense and activation of immune mechanism during inflammation.
  • Means for achieving the culture conditions of “in the presence of TNF ⁇ ” are not particularly limited.
  • TNF ⁇ is added to the medium, co-cultured with TNF ⁇ -producing cells, and culture supernatant of TNF ⁇ -producing cells is used. Achieved by adding.
  • the concentration of TNF ⁇ may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.01 ng / mL to 30 ng / mL, preferably 0.5 ng / mL to 10 ng / mL.
  • IFN ⁇ is a cytokine that is responsible for induction of cell-mediated immunity.
  • the means for achieving the culture conditions of “in the presence of IFN ⁇ ” are not particularly limited.
  • IFN ⁇ is added to the medium, co-cultured with cells producing IFN ⁇ , or the culture supernatant of cells producing IFN ⁇ is used. Achieved by adding.
  • the concentration of IFN ⁇ may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ng / mL to 20 ng / mL, preferably 0.5 ng / mL to 10 ng / mL.
  • the ratio of the TNF ⁇ concentration to the IFN ⁇ concentration in the medium is not particularly limited, but is preferably 100: 1 to 1: 100, more preferably 10: 1 to 1:10, and even more preferably 5: 1 to 1: 5, particularly preferably 3: 1 to 1: 1.
  • IL-1 ⁇ is a type of interleukin that is a cytokine secreted from leukocytes.
  • Means for achieving the culture conditions of “in the presence of IL-1 ⁇ ” are not particularly limited.
  • IL-1 ⁇ is added to the medium, co-cultured with cells that produce IL-1 ⁇ , This is achieved by adding the culture supernatant of the producing cells.
  • the concentration of IL-1 ⁇ may be appropriately determined and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 1 pg / mL to 5 ng / mL, preferably 0.05 ng / mL to 3 ng / mL.
  • IL-1 ⁇ is a type of interleukin that is a cytokine secreted from leukocytes.
  • Means for achieving the culture conditions of “in the presence of IL-1 ⁇ ” are not particularly limited.
  • IL-1 ⁇ is added to the medium, co-cultured with cells that produce IL-1 ⁇ , This is accomplished by adding the culture supernatant of the producing cells.
  • concentration of IL-1 ⁇ may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 1 pg / mL to 10 ng / mL, preferably 0.5 ng / mL to 5 ng / mL.
  • C1q is one of complements.
  • One of the pathways for complement activation is the classical pathway, and C1q is a factor that is the origin of this pathway.
  • Means for achieving the culture conditions of “in the presence of C1q” are not particularly limited.
  • C1q is added to the medium, C1q-producing cells are co-cultured, and the culture supernatant of the cells producing C1q is used. Achieved by adding.
  • the concentration of C1q may be determined as appropriate, and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 10 ng / mL to 10 ⁇ g / mL, preferably 50 ng / mL to 300 ng / mL.
  • the culture of human astrocytes in the present invention may be carried out in the presence of the above-mentioned various cytokines and / or complements, selecting a medium, temperature, and other conditions according to the origin and state of the human astrocytes used. .
  • the medium may contain components other than the various cytokines and / or complements described above.
  • the medium can be selected from a known medium or a commercially available medium.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DMEM / F12 or a medium in which these are modified are added to a common medium (serum, protein, amino acid, sugar, vitamins, Fatty acids, antibiotics, etc.)
  • a serum-free medium serum-free medium
  • culture conditions general cell culture conditions may be selected. Examples include conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . During culture, it is preferable to change the medium at an appropriate interval (preferably once every 1 to 7 days, more preferably once every 2 to 3 days). When the method of the present invention is carried out using human astrocytes as a material, human A1 astrocytes appear in 1 day to 1 week under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Cell culture containers such as plates, dishes, cell culture inserts, cell culture flasks, cell culture bags, and the like can be used for somatic cell culture.
  • a cell culture bag a gas permeable bag is suitable.
  • a large culture tank may be used. Culturing can be performed in either an open system or a closed system.
  • human A1 astrocytes can be produced by culturing human astrocytes in a medium containing the various cytokines and / or complements described above.
  • an isolated human A1 astrocyte obtained by the method for producing human A1 astrocyte according to the present invention.
  • the human A1 astrocytes produced by the method of the present invention can also be used for screening of drug candidate compounds that act on human A1 astrocytes and for evaluating the safety of drug candidate compounds.
  • a test substance evaluation method comprising contacting the human A1 astrocyte of the present invention with a test substance.
  • the test substance may be evaluated by contacting the human A1 astrocyte with the test substance and then evaluating the change in neuronal cytotoxicity of the human A1 astrocyte.
  • the change in neuronal cytotoxicity of human A1 astrocytes can be achieved by, for example, coculturing human A1 astrocytes with nerve cells according to the method described in Examples below, and utilizing the damage action on nerve cells, Can be evaluated.
  • Test Example 1 Induction from human astrocytes to human A1 astrocytes (1) Human astrocytes (1-1) Human iPS cell-derived astrocytes Human astrocytes are derived from human iPS cells of Cellular Dynamics International Japan An astrocyte iCell (R) Astrocycles (CDI, ASC-100-020-001-PT) was purchased and used. iCell (registered trademark) Astrocycles was confirmed to be a human astrocyte other than human A1 astrocyte from its appearance.
  • (1-2) Astrocytes derived from astrocyte progenitor cells
  • human astrocytes commercially available human astrocyte progenitor cells (Axol Bioscience, AX0083) derived under conditions such as the method attached to the kit were also used.
  • the induced human astrocytes were confirmed to be human astrocytes other than human A1 astrocytes from the appearance.
  • Human-derived primary cultured astrocytes Furthermore, commercially available primary cultured human astrocytes (LONZA, CC-2565) were also used.
  • iCell registered trademark
  • astrocytos was suspended in a serum-free medium, seeded in a 6-well plate at a density of 30 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours.
  • the astrocytes were synthesized using the compounds described in Table 1 (TNF ⁇ (Cell Signaling Technology, 8902SC), IFN ⁇ (R & D Systems, 285-IF), IL-1 ⁇ (Sigma-Aldrich, SRP3310), IL-1 ⁇ (R & D Systems, 201). -LB), C1q (MyBioSource, MBS143105)) was replaced with a medium added to serum-free medium, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 day.
  • Guidance method 2 Matrigel® basement membrane matrix (Corning, 356234) diluted 120-fold with DMEM (Life technologies, 11960-044) was added to a 96-well plate at 65 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. After 24 hours, the same serum-free medium as in the induction method 1 was used.
  • iCell registered trademark
  • astrocytos was suspended in a serum-free medium, seeded at a density of 3 ⁇ 10 4 cells / well in a 96-well plate, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours.
  • the astrocytes were replaced with a medium in which two of the compounds listed in Table 1 were added to a serum-free medium, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 day.
  • Example 6 astrocytes derived from commercially available human astrocyte progenitor cells were seeded, and in Example 7, primary cultured human astrocytes were seeded in a 96-well plate at a density of 3 ⁇ 10 4 cells / well, at 37 ° C., 5% CO 2. It was cultured under 2 conditions for 24 hours. The astrocytes were replaced with a medium supplemented with two of the compounds listed in Table 1, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 day.
  • GFAP staining which is an astrocyte marker, was performed by immunostaining. 80% ethanol was added at 100 ⁇ L / well to astrocytes derived from human astrocyte progenitor cells induced by induction method 3, and fixed at ⁇ 30 ° C. for 24 hours. After washing 3 times with PBS, blocking was performed by adding 1% BSA to PBS (1% BSA), and the primary antibody (Millipore, MAB3402) diluted 3000 times in 1% BSA at 24 ° C. Treated for hours. After washing with PBS three times, a secondary antibody (Thermo Fisher Scientific, A11005) diluted 1000 times in 1% BSA was treated at room temperature for 1 hour. After washing 3 times with PBS, images were taken using IncuCyte S3 (Essen BioScience, 4647).
  • FIGS. 3 Evaluation of cell morphology
  • the numerical values of the long axis / short axis evaluation results are shown in FIGS. 2 shows a typical star-shaped (left side in the figure) and hypertrophic (right side in the figure) cells.
  • FIG. 1, FIG. 2 and Table 2 show that in Examples 1 to 6, almost all cells show a hypertrophic morphology characteristic of human A1 astrocytes. On the other hand, in Comparative Examples 1 to 4, it can be seen that there are few or very few cells showing a hypertrophic morphology.
  • RNeasy (registered trademark) mini kit Qiagen, 74104
  • reverse transcription of Total RNA PrimeScript (registered trademark) RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Takara Bio, RR047A) was used according to the package insert.
  • TB Green Premix Ex TaqII Tli RNase H Plus
  • Takara Bio, RR820B was used according to the attached protocol.
  • Mx3005P (Stratagene) was used, and one cycle of 95 ° C. for 30 seconds, 45 cycles of 95 ° C. for 5 seconds and 60 ° C. for 30 seconds were performed.
  • the primer sequences are shown below.
  • GBP2 forward primer tttcaccctggaactggaag (SEQ ID NO: 1)
  • Reverse primer gacgaagcacttcctcttgg (SEQ ID NO: 2)
  • CXCL10 forward primer cccgtgttgagatcattgc (SEQ ID NO: 3)
  • Reverse primer cctctgtgtggtccatcctt (SEQ ID NO: 4)
  • GAPDH Forward primer gtcagtggtggacctgacct (SEQ ID NO: 5)
  • Reverse primer tgctgtagccaaattcgttg (SEQ ID NO: 6)
  • Quantitative PCR method 2 Quantification of mRNA was performed from the cells one day after induction using Fastlane cell Multiplex NR Kit (Qiagen, 216513) according to the package insert. Primers and fluorescent probes were synthesized using the Dual Labeled Probe design set (Takara Bio). As the cycle program, a CFX384 Touch real-time PCR analysis system (Bio-Rad) was used. One cycle of 50 ° C. for 20 minutes, 95 ° C. for 15 minutes, 94 ° C. for 45 seconds, and 60 ° C. for 75 seconds were performed for 45 cycles. The sequences of the primer and fluorescent probe are shown below.
  • C3 probe 5 '-(FAM) CACAGCGGCACAGTTCATCACGGCA (BHQ1) -3' (SEQ ID NO: 7)
  • Forward primer GCCTATTACAACCTGGAGGAAAG (SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer GTGACCTTGTCATCCGACTTTTG (SEQ ID NO: 9)
  • CXCL10 probe 5 '-(Cyanine5) TCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCT (BHQ1) -3' (SEQ ID NO: 10)
  • Forward primer GCCATTCTGATTTGCTGCCTTA (SEQ ID NO: 11)
  • Reverse primer ACAGGTTGATTACTAATGCTGATGC (SEQ ID NO: 12)
  • GAPDH probe 5 '-(HEX) CATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAA (BHQ1) -3' (SEQ ID NO: 13)
  • Forward primer GAACCATGAGAAGTATGACAACAGC (SEQ ID NO: 14)
  • Reverse primer TGGGTGGCAGTGATGGCA (SEQ ID NO: 15)
  • MRNA expression level was quantified by ⁇ Ct method (comparative Ct method) using GAPDH as an internal standard. The results are shown in FIG. 3, FIG. 4, FIG. 5 and FIG.
  • FIG. 3 shows that in Examples 1 to 4, both GBP2 and CXCL10 are sufficiently expressed.
  • Comparative Examples 1 to 4 it can be seen that both GBP2 and CXCL10 are hardly expressed, or even if expressed, the amount is small compared to the Examples.
  • FIG. 4 shows that in Examples 1 and 5, the expression of C3 is increased by stimulation. 5 and 6, it can be seen that in Examples 6 and 7, the expression of C3 is increased by stimulation.
  • Test Example 2 Co-culture of human A1 astrocytes and nerve cells (1) Inoculation of human astrocytes on cell culture insert As for human astrocytes, iCell (registered trademark) astrocytos was used as in Test Example 1. Matrigel (registered trademark) diluted 120-fold with DMEM was added to a cell culture insert (Corning, 353104) at 100 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. After 24 hours, the same serum-free medium as in the induction method 1 was replaced.
  • iCell registered trademark
  • astrocytos was suspended in a serum-free medium, seeded on a cell culture insert at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free or serum-free medium was treated with IL-1 ⁇ (0.75 ng / mL), TNF ⁇ (7.5 ng / mL), C1q (100 ng / mL), IL-1 ⁇ (2.5 ng / mL), The medium was replaced with IFN ⁇ (5 ng / mL).
  • Neurogenin2 was forcibly expressed to differentiate iPS cells into neurons.
  • the obtained nerve cells were suspended in a serum-free medium, seeded in a 24-well plate at a density of 10 ⁇ 10 4 cells / well, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • human astrocytes replaced with serum-free medium have a protective effect on neurons, and the co-cultured neurons have a larger number of living cells and firm neurites than nerve cells alone.
  • human astrocytes replaced with serum-free medium containing 5 compounds showed neurotoxicity, and co-cultured nerve cells had more dead cells than nerve cells co-cultured with astrocytes replaced with serum-free medium, It can be seen that living cells and neurites are decreased.
  • the number of viable cells was evaluated using a Cellstein (registered trademark) CytoRed solution (Dojindo Laboratories, C410) and IncuCyte (registered trademark) S3 (Essen Bioscience, 4647) using samples after the WST test. Each 0.5 ⁇ L of 1 mmol / l CytoRed solution was added to the culture plate, and the viable cells were stained by performing a color reaction at 37 ° C. under 5% CO 2 for 30 minutes to 2 hours. Thereafter, the number of viable cells was counted using IncuCyte (registered trademark) S3.
  • Test Example 3 Neuropathy of various human astrocytes (1) Seeding of astrocytes derived from human astrocyte precursor cells Matrigel (registered trademark) basement membrane matrix diluted 120-fold with DMEM (Life technologies, 11960-044) Corning, 356234) was added to a 96-well plate at 65 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. After 24 hours, astrocytes derived from commercially available human astrocyte precursor cells were seeded at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well.

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Abstract

本発明の課題は、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトから、ヒトA1アストロサイトを誘導することを含む、ヒトA1アストロサイトの製造方法;上記したヒトA1アストロサイトの製造方法により得られるヒトA1アストロサイト;及び上記したヒトA1アストロサイトを用いた、被験物質の評価方法を提供することである。本発明によれば、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、TNFα及びIFNγの存在下において培養する工程aを含む、ヒトA1アストロサイトの製造方法が提供される。

Description

ヒトA1アストロサイトの製造方法、ヒトA1アストロサイト、及び被験物質の評価方法
 本発明は、ヒトA1アストロサイトの製造方法及びヒトA1アストロサイトに関する。さらに本発明は、製造したヒトA1アストロサイトを用いた被験物質のスクリーニング方法に関する。
 脳を構成するグリア細胞の一種であるアストロサイトは、ニューロンへの栄養供給、シナプス形成や除去など、中枢神経系の恒常性を維持する様々な役割を果たしており、疾病のメカニズム解明や創薬の観点から注目を集めている。
 アストロサイトは、神経疾病や老化等により活性化することが分かっている。活性化アストロサイトには、神経障害性のA1アストロサイトと、神経保護性のA2アストロサイトの二種類が存在することが近年報告されている(非特許文献1及び特許文献1)。ヒトのA1アストロサイトは、神経傷害を抑制する薬剤のスクリーニングに利用できるなど、創薬研究の面から価値が大きい。
 アストロサイトの活性化について、非特許文献1には、マウスの(活性化されていない)アストロサイトをTNFα、IL-1α、C1qの三成分によりA1アストロサイトに誘導することが記載されている。しかし、マウスとヒトのアストロサイトでは種差があることが報告されており(非特許文献2)、ヒトアストロサイトにおいて同様に誘導できるかは不明である。
 特許文献2には、TNFαやIFNγのような炎症性サイトカインがアストロサイトの活性化に関与していることの示唆や、TNFα、IFNγ及びMPTPの三成分でマウスの(活性化されていない)アストロサイトを活性化したことが記載されている。しかし、アストロサイトの活性化の結果、A1アストロサイトまたはA2アストロサイトの何れに誘導されるかについては不明であり、またヒトアストロサイトにおいても同様の活性化が起きるかについても不明であった。
 非特許文献3には、IFNγ及びIL-1βがヒトのアストロサイトの活性化に関与することが記載されている。しかし、アストロサイト活性化の結果、A1アストロサイトまたはA2アストロサイトの何れに誘導されるかについては不明であった。
米国特許出願公開US2016/0340648 米国特許出願公開US2010/0087504
Nature,2017年,541巻,481-487頁 Neurron,2016年,89巻,1号,37-53頁 GliA2014年,62巻,999-1013頁
 ヒトのA1アストロサイトは創薬研究の面から価値が大きく、ヒトのA1アストロサイトを容易に入手するための方法が求められている。上記の通り、アストロサイトの活性化及び誘導に関して一定の成果が得られているが、ヒトアストロサイトからヒトA1アストロサイトへ確実に誘導するための方法は見出されていない。本発明は、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトから、ヒトA1アストロサイトを誘導することを含む、ヒトA1アストロサイトの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記したヒトA1アストロサイトの製造方法により得られるヒトA1アストロサイトを提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記したヒトA1アストロサイトを用いた、被験物質の評価方法を提供することを解決すべき課題とする。
 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、TNFα及びIFNγの存在下で、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養することによって、上記ヒトアストロサイトをヒトA1アストロサイトに誘導できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
 即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
<1> ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、TNFα及びIFNγの存在下において培養する工程aを含む、ヒトA1アストロサイトの製造方法。
<2> 上記工程aを、さらにIL-1α、IL-1β及びC1qからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカイン及び/又は補体の存在下で行う、<1>に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<3> 上記工程aを、下記のいずれかの存在下で行う、<1>又は<2>に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
(1)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β
(2)TNFα、IFNγ、IL-1α、C1q
(3)TNFα、IFNγ、IL-1β、C1q
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
(5)TNFα、IFNγ
<4> 上記工程aが、
ヒト多能性幹細胞又はヒトアストロサイトに分化できる細胞を、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトへと分化させる工程a1;及び工程a1で得られたヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトをTNFα及びIFNγの存在下において培養する工程a2:
を含む、<1>から<3>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<5> 上記工程aで培養する、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトが、ヒトA2アストロサイトである、<1>から<4>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<6> 上記工程aが、無血清培地における培養である、<1>から<5>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<7> 上記工程aにおいて、TNFαの培地中濃度が、0.01ng/mL~30ng/mLである、<1>から<6>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<8> 上記工程aにおいて、IFNγの培地中濃度が、0.1ng/mL~20ng/mLである、<1>から<7>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<9> 上記工程aにおいて、TNFαの培地中濃度とIFNγの培地中濃度の比が、100:1~1:100である、<1>から<8>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
<10> <1>から<9>のいずれか一に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法により得られる単離されたヒトA1アストロサイト。
<11> <10>に記載のヒトA1アストロサイトと被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
<12> <10>に記載のヒトA1アストロサイトと被験物質とを接触させた後に、上記ヒトA1アストロサイトが有する神経障害性の変化を評価する、<11>に記載の被験物質の評価方法。
 本発明によれば、ヒトアストロサイトからヒトA1アストロサイトを製造することができる。本発明のヒトA1アストロサイト及び本発明の被験物質の評価方法は、創薬研究などにおいて有用である。
図1は、ヒトアストロサイトを特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後の様子を示す。 図2は、ヒトアストロサイト(アストロサイト前駆細胞から誘導)を特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後の様子を示す。 図3は、ヒトアストロサイトを特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にGBP2及びCXCL10の発現を定量した結果を示す。 図4は、ヒトアストロサイトを特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にC3の発現を定量した結果を示す。 図5は、ヒトアストロサイト(アストロサイト前駆細胞から誘導)を特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にC3の発現を定量した結果を示す。 図6は、ヒトアストロサイト(初代培養)を特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にC3の発現を定量した結果を示す。 図7は、神経細胞(ニューロンとも表記する)を、未処置のヒトアストロサイトと共に培養した場合、または特定の組み合わせの化合物の存在下で培養するヒトアストロサイトと共に培養した場合における、神経細胞の様子を示す。 図8は、神経細胞(ニューロンとも表記する)を、未処置のヒトアストロサイトと共に培養した場合、または特定の組み合わせの化合物の存在下で培養するヒトアストロサイトと共に培養した場合における、神経細胞死の評価結果を示す。 図9は、神経細胞を、未処置のヒトアストロサイト(アストロサイト前駆細胞から誘導)と共に培養した場合、または特定の組み合わせの化合物の存在下で培養するヒトアストロサイト(アストロサイト前駆細胞から誘導)と共に培養した場合における、神経細胞の様子及び神経突起の長さを示す。
 以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
 TNFαは、腫瘍壊死因子α(Tumor Necrosis Factorα)を示す。
 IFNγは、インターフェロンγ(Interferonγ)を示す。
 IL-1αは、インターロイキン1α(Interleukin-1α)を示す。
 IL-1βは、インターロイキン1β(Interleukin-1β)を示す。
 C1qは、補体C1qを示す。
 MPTPは、1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンを示す。
 EMP1は、上皮膜タンパク質1(Epithelial membrane protein 1)を示す。
 CD109は、分化抗原群109(Cluster of Differentiation 109)を示す。
 GBP2は、グアニレート結合プロテイン2(guanylate binding protein 2)を示す。
 C3は、補体分子C3を示す。
 CXCL10は、C-X-C モチーフケモカイン10(C-X-C motif chemokine 10)を示す。
 GAPDHは、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素を示す。
 HBEGFは、ヘパリン結合上皮成長因子様増殖因子(heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor )を示す。
 WSTは、水溶性テトラゾリウム塩(Water soluble Tetrazolium salts)を示す。
 本発明は、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、TNFα及びIFNγの存在下において培養する工程aを含む、ヒトA1アストロサイトの製造方法に関する。
 工程aは、TNFα及びIFNγの存在下、または、TNFα及びIFNγに加え、IL-1α、IL-1β及びC1qからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカイン及び/又は補体の存在下において、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
 工程aは、好ましくは、下記の何れかの存在下において、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
(1)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β
(2)TNFα、IFNγ、IL-1α、C1q
(3)TNFα、IFNγ、IL-1β、C1q
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
(5)TNFα、IFNγ
 工程aは、特に好ましくは、下記の何れかの存在下において、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
(4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
(5)TNFα、IFNγ
 工程aは、好ましくは、MPTPの非存在下において、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
<ヒトアストロサイト>
 「ヒトアストロサイト」とは、ヒトのアストロサイトである。
 本発明で用いる「ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイト」の入手方法としては、例えば、患者から外科的に取得した大脳皮質や脊髄等から分離すること、ヒトアストロサイトに分化できる細胞から誘導すること、ヒト多能性幹細胞から誘導すること等により入手することが挙げられる。これらのヒトアストロサイトはいずれも、本発明の方法における「ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイト」として使用することができる。
 本発明で用いる「ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイト」としては、好ましくは、ヒト多能性幹細胞から誘導したヒトアストロサイト及びヒトアストロサイトに分化できる細胞から誘導したヒトアストロサイトを使用することができる。
 ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトは、単離した状態でも、他の細胞と混ざった状態でも、本発明の方法において使用することができる。また、多能性幹細胞からヒトアストロサイトへの誘導と、ヒトアストロサイトからヒトA1アストロサイトへの誘導を連続的に行うことも想定することができる。この場合、工程aは、ヒト多能性幹細胞又はヒトアストロサイトに分化できる細胞を、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトへと分化させる工程a1、及び工程a1で得られたヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトをTNFα及びIFNγの存在下において培養する工程a2を含む。
 ヒト多能性幹細胞としては、ヒトiPS細胞(human induced pluripotent stem cells)、ヒトES細胞(human embryonic stem cells)、ヒト間葉系幹細胞などを挙げることができるが特に限定されない。
 ヒトアストロサイトに分化できる細胞としては、神経幹細胞、グリア系神経前駆細胞、グリア前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、線維芽細胞などを挙げることができるが特に限定されない。
<活性化ヒトアストロサイト>
 「活性化ヒトアストロサイト」とは、神経疾病等の影響により活性化したヒトアストロサイトである。活性化ヒトアストロサイトには、神経障害性が特徴であるヒトA1アストロサイトと、神経保護性のヒトA2アストロサイトが知られている。活性化ヒトアストロサイトも、本発明のヒトアストロサイトに含まれる。
<ヒトA1アストロサイト>
 「ヒトA1アストロサイト」とは、活性化されたヒトアストロサイトの一種である。
 本発明の方法により製造されるヒトA1アストロサイトは、例えば、細胞の形態的変化、ヒトA1アストロサイトの特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
 ヒトA1アストロサイトは、肥大型の特徴的な外観を有する。従って、顕微鏡による観察で、ヒトA1アストロサイトを検出することができる。
 ヒトA1アストロサイトの特異的マーカーとしては、GBP2、CXCL10及びC3等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
 特異的マーカーの検出には、検疫的方法(抗体による検出)を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのmRNA量の定量により検出を実施してもよい。
 ヒトA1アストロサイトは、神経細胞障害性を示す。従って、ヒトA1アストロサイトを神経細胞と共培養し、神経細胞に対する障害作用を利用して、検出することができる。
<ヒトA2アストロサイト>
 「ヒトA2アストロサイト」とは、活性化されたヒトアストロサイトの一種である。
 A2アストロサイトは様々な神経栄養因子が発現上昇しており、神経細胞に保護的に作用する。A2アストロサイトの特異的マーカーとしてはEMP1やCD109等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
 ヒトA2アストロサイトは、星型の外観を有する。
 本発明においては、工程aで培養する、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトとして、ヒトA2アストロサイトを使用することができる。
<TNFα>
 TNFαとは、サイトカインの一種であり、炎症時における生体防御や免疫機構の賦活化に広く関わる物質である。「TNFαの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばTNFαを培地に加えること、TNFαを産生する細胞と共培養すること、TNFαを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
 TNFαの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、0.01ng/mL~30ng/mL、好ましくは0.5ng/mL~10ng/mLの範囲で使用することができる。
<IFNγ>
 IFNγとは、細胞媒介性免疫の誘導を司っているサイトカインである。「IFNγの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばIFNγを培地に加えること、IFNγを産生する細胞と共培養すること、IFNγを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
 IFNγの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、0.1ng/mL~20ng/mL、好ましくは0.5ng/mL~10ng/mLの範囲で使用することができる。
 培地中におけるTNFαの濃度とIFNγの濃度の比は特に限定されないが、好ましくは100:1~1:100であり、より好ましくは10:1~1:10であり、さらに好ましくは5:1~1:5であり、特に好ましくは3:1~1:1である。
<IL-1α>
 IL-1αとは、白血球から分泌されるサイトカインであるインターロイキンの一種である。「IL-1αの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばIL-1αを培地に加えること、IL-1αを産生する細胞と共培養すること、IL-1αを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
 IL-1αの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、1pg/mL~5ng/mL、好ましくは0.05ng/mL~3ng/mLの範囲で使用することができる。
<IL-1β>
 IL-1βとは、白血球から分泌されるサイトカインであるインターロイキンの一種である。「IL-1βの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばIL-1βを培地に加えること、IL-1βを産生する細胞と共培養すること、IL-1βを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
 IL-1βの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、1pg/mL~10ng/mL、好ましくは0.5ng/mL~5ng/mLの範囲で使用することができる。
<C1q>
 C1qとは、補体の一つである。補体活性化の経路の一つとして古典経路があるが、C1qはこの経路の起点となる因子である。「C1qの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばC1qを培地に加えること、C1qを産生する細胞と共培養すること、C1qを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
 C1qの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、10ng/mL~10μg/mL、好ましくは50ng/mL~300ng/mLの範囲で使用することができる。
<ヒトアストロサイトの培養>
 本発明におけるヒトアストロサイトの培養は、使用するヒトアストロサイトの由来及び状態に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種サイトカイン及び/又は補体の存在下において実施すればよい。本発明におけるヒトアストロサイトの培養を妨害しない限り、培地中には上記の各種サイトカイン及び/又は補体以外の成分が含まれていてもよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるMEM(最少必須培地)、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、DMEM/F12、又はこれらを改変した培地に、適切な成分(血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等)を添加して使用することができる。培地としては、血清を含まない培地(無血清培地)を使用することが好ましい。
 培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。37℃、5%CO2の条件などが例示される。培養中は適切な間隔(好ましくは1日から7日に1回、より好ましくは2日から3日に1回)で培地を交換することが好ましい。ヒトアストロサイトを材料として本発明の方法を実施する場合、37℃、5%CO2の条件では1日間から1週間でヒトA1アストロサイトが出現する。
 体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、セルカルチャーインサート、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができる。
 本発明の方法においては、上記した各種のサイトカイン及び/又は補体を含む培地においてヒトアストロサイトを培養することにより、ヒトA1アストロサイトを製造することができる。
<ヒトA1アストロサイト及びそれを用いた被験物質の評価方法>
 本発明によれば、本発明によるヒトA1アストロサイトの製造方法により得られる単離されたヒトA1アストロサイトが提供される。
 本発明の方法により製造されるヒトA1アストロサイトは、ヒトA1アストロサイトに作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。
 本発明によれば、本発明のヒトA1アストロサイトと被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法が提供される。例えば、ヒトA1アストロサイトと被験物質とを接触させた後に、ヒトA1アストロサイトが有する神経細胞障害性の変化を評価することによって、被験物質を評価してもよい。ヒトA1アストロサイトが有する神経細胞障害性の変化は、例えば、後記の実施例に記載の方法に準じて、ヒトA1アストロサイトを神経細胞と共培養し、神経細胞に対する障害作用を利用して、評価することができる。
 以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
試験例1:ヒトアストロサイトからヒトA1アストロサイトへの誘導
(1)ヒトアストロサイト
(1-1)ヒトiPS細胞由来アストロサイト
 ヒトアストロサイトは、セルラー・ダイナミクス・インターナショナル・ジャパンの、ヒトiPS細胞由来アストロサイトであるiCell(登録商標)Astrocytes(CDI, ASC-100-020-001-PT)を購入して使用した。iCell(登録商標)Astrocytesは、その外観から、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトであることを確認した。
(1-2)アストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイト
 また、ヒトアストロサイトとして、市販のヒトアストロサイト前駆細胞(Axol Bioscience、AX0083)をキットに添付の方法等の条件で誘導したものも使用した。誘導したヒトアストロサイトは、その外観から、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトであることを確認した。
(1-3)ヒト由来の初代培養アストロサイト
 さらに、市販の初代培養ヒトアストロサイト(LONZA、CC-2565)も使用した。
(2)ヒトA1アストロサイトへの誘導
 ヒトA1アストロサイトへの誘導は、実施例1~4及び比較例1~4は誘導手法1で行い、実施例5は誘導手法2で行った。実施例6及び7は誘導手法3で行った。
誘導手法1
 DMEM(Life technologies,11960-044)で120倍希釈したMatrigel(登録商標)基底膜マトリックス(Corning,356234)を6ウエルプレートに1.5mL/ウエルにて添加し、4℃に静置した。24時間後、以下の無血清培地(Serum-free medium)に置換して使用した。
無血清培地の組成
Neurobasal(登録商標)medium(50%,Life technologies,21103049)
DMEM(50%)
Penicillin/Streptomycin (×100)(1×,Life technologies, 15140-122)
Sodium pyruvate(1mM,Life technologies,11360-070)
L-glutamine(292μg/mL,Life technologies,25030-081)
N2 Supplement with Transferrin(Apo)(1×,Wako,141-09041)N-acetyl cysteine(5μg/mL,Sigma-Aldrich,A8199)
HBEGF(5ng/mL,Peprotech,100-47)
 iCell(登録商標)astrocytesを無血清培地に懸濁し,6ウエルプレートに30x104cells/ウエルの密度で播種し、37℃,5%CO2条件下で24時間培養した。
 上記アストロサイトを、表1に記載した化合物(TNFα(Cell Signaling Technology,8902SC)、IFNγ(R&D Systems,285-IF)、IL-1α(Sigma-Aldrich,SRP3310)、IL-1β(R&D Systems,201-LB)、C1q(MyBioSource,MBS143105))の内2~5つを無血清培地に加えた培地に交換し、37℃、5%CO2条件下で1日間培養した。
誘導手法2
 DMEM(Life technologies,11960-044)で120倍希釈したMatrigel(登録商標)基底膜マトリックス (Corning,356234)を96ウエルプレートに65μL/ウエルにて添加し、4℃に静置した。24時間後、誘導手法1と同様の無血清培地に置換して使用した。
 iCell(登録商標)astrocytesを無血清培地に懸濁し、96ウエルプレートに3x104cells/ウエルの密度で播種し、37℃、5%CO2条件下で24時間培養した。
 上記アストロサイトを、表1に記載した化合物の内2つを無血清培地に加えた培地に交換し、37℃、5%CO2条件下で1日間培養した。
誘導手法3
 DMEM(Life technologies,11960-044)で120倍希釈したMatrigel(登録商標)基底膜マトリックス (Corning,356234)を96ウエルプレートに65μL/ウエルにて添加し、4℃に静置し、24時間後に使用した。
 実施例6では、市販のヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトを、実施例7では、初代培養ヒトアストロサイトを、96ウエルプレートに3x104cells/ウエルの密度で播種し、37℃、5%CO2条件下で24時間培養した。
 上記アストロサイトを、表1に記載した化合物の内2つを加えた培地に交換し、37℃、5%CO2条件下で1日間培養した。
免疫染色
 実施例6では、免疫染色によりアストロサイトのマーカーであるGFAP染色を行った。誘手法3で誘導したヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトに80%エタノールを100μL/ウエル加え、-30℃で24時間固定した。PBSで3回洗浄後、PBSに1%のBSAを加えたもの(1%BSA)を加えてブロッキングし、一次抗体(Millipore、MAB3402)を1%BSAに3000倍希釈したものを4℃で24時間処置した。PBSで3回洗浄後、二次抗体(Thermo Fisher Scientific、A11005)を1%BSAに1000倍希釈したものを室温で1時間処置した。PBSで3回洗浄後、IncuCyte S3(Essen BioScience、4647)を用いて撮影し画像を取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
(3)細胞の形態の評価
 培養後の細胞の形態を顕微鏡又は撮影画像にて観察した。結果を図1、図2に示す。また、図1、図2から形態を評価した結果を下記表に示す。形態の判定は典型的な細胞を10細胞/視野選択し、長軸と短軸を比較して行った。長軸/短軸が10以下のものを肥大型とし、10を超え線維状の形状のものを線維型とし、10を超え突起が複数ある形状のものを星型とした。長軸/短軸の評価結果の数値は図1、図2に示す。図2の枠中で拡大して示したのは、典型的な星型(図左側)、肥大型(図右側)の細胞である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 図1、図2及び表2から、実施例1~6では、ほぼすべての細胞が、ヒトA1アストロサイトに特徴的な肥大型の形態を示していることが分かる。一方、比較例1~4の場合、肥大型の形態を示している細胞は存在しないか、ごくわずかであることが分かる。
(4)mRNA発現量の評価
 培養後の細胞が発現する遺伝子の量を定量PCR(Polymerase chain reaction)で測定した。定量PCRは、実施例1~4及び比較例1~4は定量PCR手法1で行い、実施例5~7は定量PCR手法2で行った。
定量PCR手法1
 誘導1日後の細胞からTotal RNAを抽出した。Total RNAの抽出にはRNeasy(登録商標)mini kit(Qiagen,74104)を添付文書に従い使用した。Total RNAの逆転写にはPrimeScript(登録商標)RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(タカラバイオ,RR047A)を添付文書に従い使用した。定量PCRはTB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(タカラバイオ,RR820B)を添付のプロトコールに従って使用した。サイクルプログラムはMx3005P(Stratagene)を用いて95℃30秒を1サイクル、95℃5秒、60℃30秒を45サイクル実施した。プライマーの配列を以下に示す。
GBP2フォワードプライマー:tttcaccctggaactggaag(配列番号1)
リバースプライマー:gacgaagcacttcctcttgg(配列番号2)
CXCL10フォワードプライマー:ccacgtgttgagatcattgc(配列番号3)
リバースプライマー:cctctgtgtggtccatcctt(配列番号4)
GAPDH
フォワードプライマー:gtcagtggtggacctgacct(配列番号5)
リバースプライマー:tgctgtagccaaattcgttg(配列番号6)
定量PCR手法2
 誘導1日後の細胞からFastLane cell Multiplex NR Kit(Qiagen,216513)を添付文書に従い用いてmRNAの定量を実施した。プライマー及び蛍光プローブはDual Labeled Probeデザインセット (タカラバイオ)にて合成した。サイクルプログラムはCFX384 TouchリアルタイムPCR解析システム(Bio-Rad)を用いて50℃20分、95℃15分を1サイクル、94℃45秒、60℃75秒を45サイクル実施した。プライマー及び蛍光プローブの配列を以下に示す。
C3プローブ: 5’-(FAM)CACAGCGGCACAGTTCATCACGGCA(BHQ1)-3’ (配列番号7)
フォワードプライマー: GCCTATTACAACCTGGAGGAAAG(配列番号8)
リバースプライマー: GTGACCTTGTCATCCGACTTTTG(配列番号9)
CXCL10プローブ: 5’-(Cyanine5)TCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCT(BHQ1)-3’ (配列番号10)
フォワードプライマー: GCCATTCTGATTTGCTGCCTTA(配列番号11)
リバースプライマー: ACAGGTTGATTACTAATGCTGATGC(配列番号12)
GAPDHプローブ: 5’-(HEX)CATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAA(BHQ1)-3’ (配列番号13)
フォワードプライマー: GAACCATGAGAAGTATGACAACAGC(配列番号14)
リバースプライマー: TGGGTGGCAGTGATGGCA(配列番号15)
 GAPDHを内部標準として、mRNAの発現量をΔΔCt法(比較Ct法)にて定量した。結果を図3、図4、図5及び図6に示す。
 図3から、実施例1~4では、GBP2及びCXCL10のいずれも十分に発現していることが分かる。一方、比較例1~4では、GBP2、CXCL10のいずれもほとんど発現していないか、発現しているとしても実施例と比べ少量であることが分かる。図4から実施例1及び5においてC3の発現が刺激により発現上昇していることが分かる。図5、図6から、実施例6及び7においてC3の発現が刺激により発現上昇していることが分かる。
試験例2:ヒトA1アストロサイトと神経細胞の共培養
(1)セルカルチャーインサートへのヒトアストロサイトの播種
 ヒトアストロサイトは、試験例1と同様iCell(登録商標)astrocytesを使用した。
 DMEMで120倍希釈したmatrigel(登録商標)をセルカルチャーインサート(Corning,353104)に100μL/ウエルにて添加し、4℃に静置した。24時間後、誘導手法1と同様の無血清培地に置換した。iCell(登録商標)astrocytesを無血清培地に懸濁し、セルカルチャーインサートに5x104cells/ウエルの密度で播種し、37℃、5%CO2条件下で培養した。
 24時間後、無血清培地または無血清培地にIL-1α(0.75ng/mL)、TNFα(7.5ng/mL)、C1q(100ng/mL)、IL-1β(2.5ng/mL)、IFNγ(5ng/mL)を加えた培地に交換した。
(2)培養プレートへの神経細胞の播種
 リン酸緩衝液(PBS)で10倍希釈したPoly-L-Lysine solution(Sigma aldrich,P4707)を24ウエルプレートに500μL/ウエルにて添加し、室温に静置した。24時間後、PBSで166倍希釈したiMatrix-511(ニッピ,892012)を24ウエルプレートに500μL/ウエルにて添加し、37℃で1時間インキュベート後、無血清培地に置換した。
 WO2014/148646A1に記載の方法に従い、Neurogenin2を強制発現することで、iPS細胞を神経細胞に分化した。得られた神経細胞を無血清培地に懸濁し、24ウエルプレートに10x104cells/ウエルの密度で播種し37℃、5%CO2条件下で培養した。
(3)神経細胞との共培養
 ヒトアストロサイトを播種したセルカルチャーインサートと神経細胞を播種した培養プレートの培地を無血清培地、もしくは5つの化合物を加えた無血清培地に交換し、組み合わせて共培養を開始した。対照として、神経細胞の単独培養も同時に開始した。37℃、5%CO2条件下で5日間培養したのち、神経細胞の様子を観察した。結果を図7に示す。
 無血清培地にて置換したヒトアストロサイトは神経細胞に保護的に作用し、共培養した神経細胞は神経細胞単独と比較して生細胞数が多く、神経突起もしっかりしているのが分かる。一方、5つの化合物を加えた無血清培地に置換したヒトアストロサイトは神経毒性を示し、共培養した神経細胞は無血清培地に置換したアストロサイトと共培養した神経細胞に比べ死細胞が多く、生細胞、及び神経突起が減少しているのが分かる。
(4)神経細胞死の定量評価
 5日間共培養した後に生細胞をWST試験、及び生細胞数のカウントにて定量評価した。WST試験はCell Counting Kit-8(同仁化学研究所,CK04)を用いて評価した。セルカルチャーインサートを取り除いた後、Cell Counting Kit溶液を50μLずつ培養プレートに加え、37℃、5%CO2条件下で1~4時間呈色反応を行った。その後100μLの反応液をマイクロプレートリーダーを用いて450nm、及び650nmの吸光度を測定し、450nmの値から650nmの値を引いた値にて定量を行った。生細胞数はWST試験実施後のサンプルを使用してCellstain(登録商標)CytoRed solution(同仁化学研究所,C410)、及びIncuCyte(登録商標)S3(エッセンバイオサイエンス,4647)を用いて評価した。1mmol/lのCytoRed溶液を0.5 μLずつ培養プレートに加え、37℃、5%CO2条件下で30分~2時間呈色反応を行うことで生細胞を染色した。その後IncuCyte(登録商標)S3を用いて生細胞数をカウントした。
 結果を図8に示す。
 WST試験、及び生細胞数の定量の結果、無血清培地にて置換したヒトアストロサイトと共培養した神経細胞は神経細胞単独と比較して生細胞が多いことが確認できた。一方、5つの化合物を加えた無血清培地に置換したヒトアストロサイトと共培養した神経細胞は無血清培地に置換したアストロサイトと共培養した神経細胞と比べ生細胞が減少していることが確認できた。
試験例3:各種ヒトアストロサイトの神経障害性
(1)ヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトの播種
 DMEM(Life technologies,11960-044)で120倍希釈したMatrigel(登録商標)基底膜マトリックス (Corning,356234)を96ウエルプレートに65μL/ウエルにて添加し、4℃に静置した。24時間後、市販のヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトを5x104cells/ウエルの密度で播種した。
 (A)無刺激、(B)TNFα(7.5ng/mL)、IFNγ(5ng/mL)にて刺激、又は(C)TNFα(7.5ng/mL)、IL-1α(0.75ng/mL)、C1q(100ng/mL)にて刺激し、48時間後に神経細胞を播種した。
(2)培養プレートへの神経細胞の播種
 WO2014/148646A1に記載の方法に従い、Neurogenin2を強制発現することで、iPS細胞を神経細胞に分化した。得られた神経細胞をA1誘導後のアストロサイトの上に3x104cells/ウエルの密度で播種し、3日間37℃、5%CO2条件下で培養した。
(3)免疫染色
 3日間培養した細胞に80%エタノールを100μL/ウエル加え、-30℃で24時間固定した。PBSで3回洗浄後、1%BSAを加えてブロッキングし、一次抗体(Covance、MRB-435P)を1%BSAに2000倍希釈したものを4℃で24時間処置した。PBSで3回洗浄後、二次抗体(Thermo Fisher Scientific、A11008)を1%BSAに1000倍希釈したものを室温で1時間処置した。PBSで3回洗浄後、IncuCyte S3(Essen BioScience、4647)を用いて撮影し画像を取得した。結果を図9に示す。
 (A)無刺激のヒトアストロサイト、(B)にて刺激したヒトアストロサイト、(C)にて刺激したヒトアストロサイトそれぞれと共培養した神経細胞を比較すると、(B)と共培養した神経細胞は、神経突起が減少していることが確認できた。

Claims (12)

  1. ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、TNFα及びIFNγの存在下において培養する工程aを含む、ヒトA1アストロサイトの製造方法。
  2. 前記工程aを、さらにIL-1α、IL-1β及びC1qからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカイン及び/又は補体の存在下で行う、請求項1に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  3. 前記工程aを、下記のいずれかの存在下で行う、請求項1又は2に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
    (1)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β
    (2)TNFα、IFNγ、IL-1α、C1q
    (3)TNFα、IFNγ、IL-1β、C1q
    (4)TNFα、IFNγ、IL-1α、IL-1β、C1q
    (5)TNFα、IFNγ
  4. 前記工程aが、
    ヒト多能性幹細胞又はヒトアストロサイトに分化できる細胞を、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトへと分化させる工程a1;及び工程a1で得られたヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトをTNFα及びIFNγの存在下において培養する工程a2:
    を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  5. 前記工程aで培養する、ヒトA1アストロサイト以外のヒトアストロサイトが、ヒトA2アストロサイトである、請求項1から4のいずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  6. 前記工程aが、無血清培地における培養である、請求項1から5のいずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  7. 前記工程aにおいて、TNFαの培地中濃度が、0.01ng/mL~30ng/mLである、請求項1から6いずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  8. 前記工程aにおいて、IFNγの培地中濃度が、0.1ng/mL~20ng/mLである、請求項1から7のいずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  9. 前記工程aにおいて、TNFαの培地中濃度とIFNγの培地中濃度の比が、100:1~1:100である、請求項1から8のいずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法。
  10. 請求項1から9のいずれか一項に記載のヒトA1アストロサイトの製造方法により得られる単離されたヒトA1アストロサイト。
  11. 請求項10に記載のヒトA1アストロサイトと被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
  12. 請求項10に記載のヒトA1アストロサイトと被験物質とを接触させた後に、前記ヒトA1アストロサイトが有する神経障害性の変化を評価する、請求項11に記載の被験物質の評価方法。
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