TW202000902A - 細胞凝集體、細胞凝集體之混合物及其等之製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明之目的在於提供一種包含適於移植之多巴胺產生神經前驅細胞之細胞凝集體、其混合物及其等之製造方法。本發明之細胞凝集體包含FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞，且包含1000個以上之細胞。

Description

細胞凝集體、細胞凝集體之混合物及其等之製造方法

本發明係關於一種細胞凝集體等黏著性細胞群、該細胞群之混合物及其等之製造方法。

帕金森氏症係由因中腦黑質之多巴胺產生神經細胞之脫落所引起之神經退化性疾病，目前，全世界有約400萬人之罹患者。作為帕金森氏症之治療，業界進行有利用L-DOPA(Levodopa，左旋多巴)或者多巴胺促效劑之藥物治療、利用定位腦手術之凝固術、深部電刺激治療、及胎兒中腦移植等。胎兒中腦移植有其供給源之組織之倫理上之問題，並且感染之危險性亦較高。

近年來，業界提出有使用自胚胎幹細胞(ES細胞)及人工多能性幹細胞(iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞))等多能性幹細胞分化誘導之多巴胺產生神經細胞或作為其前驅細胞之多巴胺產生神經前驅細胞之治療法(非專利文獻1)，且報告有其製造方法。具體而言，作為多巴胺產生神經前驅細胞之製造方法，業界提出有包括利用多巴胺產生神經細胞或成為多巴胺產生神經前驅細胞之標記物之因子(具體而言，Corin或Lrtm1)篩選出適於移植之細胞之步驟之方法(專利文獻1、非專利文獻2及非專利文獻3)，但為了減少批次差之影響，確保品質均一性，提高產生效率，而要求進一步之改良。 [先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：國際公開第2015/34012號 [非專利文獻]

非專利文獻1：Wernig M, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105: 5856-5861 非專利文獻2：Doi D, et al., Stem Cell Reports. 2014, 2: 337-350 非專利文獻3：Samata B, et al., Nature communication. 2016, 7: 1-11

[發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種於大小及形狀之方面良好之神經細胞之細胞凝集體等黏著性細胞群、包含該細胞群之具有較高之均一性之細胞凝集體或者細胞群之混合物及其等之製造方法、具體而言，包含多巴胺產生神經前驅細胞之細胞凝集體、具有較高之均一性之該細胞凝集體之混合物、及其等之製造方法等。 [解決問題之技術手段]

本發明者等人反覆進行努力研究，結果發現，藉由經過於液體介質之連續流動中，使複數個細胞懸浮，並將該細胞以向各液體介質之連續流動進行流動之方式分離為目標之神經前驅細胞與不為目標之神經前驅細胞之細胞之步驟，篩選出目標之神經前驅細胞，並對其進行培養而製造包含神經系統細胞之細胞凝集體，可獲得要求適當地管理細胞數或細胞狀態，且包含適於人類移植用之數量之神經系統細胞之細胞凝集體、及該細胞凝集體之均勻之混合物，從而完成本發明。

即，本發明係關於以下。 [1] 一種細胞凝集體，其包含FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞，且 包含1000個以上之細胞。 [2] 如[1]中所記載之細胞凝集體，其包含總細胞數之約70%以上之FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞。 [3] 如[1]或[2]中所記載之細胞凝集體，其於培養時可抑制細胞死亡。 [4] 如[1]至[3]中任一項所記載之細胞凝集體，其進而具有選自以下之至少一個特徵： (a1)圓當量徑為100 μm～2000 μm、 (a2)包絡度為0.5以上、 (a3)斐瑞特直徑比為0.5以上、及 (a4)圓形度為0.3以上。 [5] 如[1]至[4]中任一項所記載之細胞凝集體，其於表面不具有碎片層，且於顯微鏡下細胞凝集體之邊界線較清晰。 [6] 一種細胞凝集體之混合物，其為複數個細胞凝集體之混合物，且包含總細胞凝集體數之50%以上之如[1]至[5]中任一項所記載之細胞凝集體。 [7] 如[6]中所記載之細胞凝集體之混合物，其於選自由圓形度、最小直徑、最大直徑、垂直斐瑞特直徑或者水平斐瑞特直徑、斐瑞特直徑比、圓當量徑、周長、面積、及周長之包絡度或者面積之包絡度所組成之群中之指標中之1個以上之指標中，具有15%以下之變異係數。 [8] 一種黏著性細胞群之混合物之製造方法，其具備： (1)於第一分化誘導因子存在下對複數個幹細胞進行分化誘導，而獲得包含1個以上處於第一分化階段之神經前驅細胞之複數個細胞之步驟； (2)自步驟(1)中所獲得之複數個細胞中選擇性地分離處於第一分化階段之神經前驅細胞之步驟，該步驟包括： 於液體介質之連續流動中，使於步驟(1)中所獲得之複數個細胞懸浮；及 識別處於第一分化階段之神經前驅細胞，並將處於第一分化階段之神經前驅細胞與並非此種神經前驅細胞之細胞以向各液體介質之連續流動進行流動之方式分離；以及 (3)於第二分化誘導因子存在下培養於步驟(2)中分離之處於第一分化階段之神經前驅細胞，而獲得黏著性細胞群之混合物之步驟，且 黏著性細胞群之混合物包含總黏著性細胞群數之50%以上之具有以下之(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群： (b1)包含處於第二分化階段之神經系統細胞、及 (b2)包含1000個以上之細胞。 [9] 如[8]中所記載之製造方法，其中具有(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群於培養時可抑制細胞死亡。 [10] 如[9]中所記載之製造方法，其中於將黏著性細胞群培養14～20天之情形時，培養結束時之細胞數為培養開始時之細胞數之5%以上，較佳為10%以上。 [11] 如[8]至[10]中任一項所記載之製造方法，其中黏著性細胞群之混合物為細胞凝集體之混合物。 [12] 如[11]中所記載之製造方法，其中黏著性細胞群為細胞凝集體，且具有上述(b1)及(b2)之特徵之細胞凝集體之圓當量徑為100 μm～2000 μm。 [13] 如[12]中所記載之製造方法，其中具有(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群為細胞凝集體，且進而具有以下之特徵： (b3)包絡度為0.5以上、 (b4)斐瑞特直徑比為0.5以上、及 (b5)圓形度為0.3以上。 [14] 如[11]至[13]中任一項所記載之製造方法，其中細胞凝集體之混合物於選自由圓形度、最小直徑、最大直徑、垂直斐瑞特直徑或者水平斐瑞特直徑、斐瑞特直徑比、圓當量徑、周長、面積、及周長之包絡度或者面積之包絡度所組成之群中之指標中之1個以上之指標中，具有15%以下之變異係數。 [15] 如[8]至[14]中任一項所記載之製造方法，其中於步驟(2)中，使用微流路方式細胞分選儀將處於第一分化階段之神經前驅細胞分離。 [16] 如[8]至[15]中任一項所記載之製造方法，其中於步驟(2)中，將處於第一分化階段之神經前驅細胞於封閉系統中分離。 [17] 如[8]至[16]中任一項所記載之製造方法，其中幹細胞為多能性幹細胞。 [18] 如[8]至[17]中任一項所記載之製造方法，其中處於第一分化階段之神經前驅細胞係註定中腦底板命運之神經前驅細胞。 [19] 如[18]中所記載之製造方法，其中處於第一分化階段之神經前驅細胞為Corin及/或Lrtm1陽性之細胞。 [20] 如[8]至[19]中任一項所記載之製造方法，其中處於第二分化階段之神經系統細胞係選自由TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及TH所組成之群中之標記物之至少1個為陽性之神經系統細胞。 [21] 如[20]中所記載之製造方法，其中處於第二分化階段之神經系統細胞為FOXA2陽性且TUJ1陽性之多巴胺產生神經前驅細胞。 [22] 一種黏著性細胞群之混合物，其係藉由如[8]至[21]中任一項所記載之製造方法而獲得。 [23] 一種黏著性細胞群之製造方法，其包括如下步驟： 自藉由如[8]至[21]中任一項所記載之製造方法所獲得之黏著性細胞群之混合物分離具有上述(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群。 [24] 一種黏著性細胞群，其係藉由如[23]中所記載之製造方法而獲得。 [25] 一種移植用醫藥組合物，其包含如[1]至[5]中任一項所記載之細胞凝集體、如[6]或者[7]中所記載之細胞凝集體之混合物、如[22]中所記載之黏著性細胞群之混合物、或如[24]中所記載之黏著性細胞群之任一種。 [26] 一種需要補充神經系統細胞之疾病之治療劑，其包含如[1]至[5]中任一項所記載之細胞凝集體、如[6]或者[7]中所記載之細胞凝集體之混合物、如[22]中所記載之黏著性細胞群之混合物、或如[24]中所記載之黏著性細胞群之任一種。 [27] 一種需要補充神經系統細胞之疾病之治療方法，其包括將如[1]至[5]中任一項所記載之細胞凝集體、如[6]或者[7]中所記載之細胞凝集體之混合物、如[22]中所記載之黏著性細胞群之混合物、或如[24]中所記載之黏著性細胞群之任一種移植至患者之中樞神經之步驟。 [發明之效果]

根據本發明，可提供一種於大小及形狀之方面良好之神經細胞之細胞凝集體等黏著性細胞群、包含該細胞群之具有較高之均一性之黏著性細胞群之混合物及其等之製造方法。根據本發明，可提供一種可達成作為醫藥品所要求之程度之細胞凝集體等黏著性細胞群之均一性，例如適於向人類移植之神經系統細胞。

I.定義 [細胞群] 於本說明書中，所謂黏著性細胞群係指複數個細胞彼此黏著而形成之細胞塊，係包含細胞沿三維方向以生物學方式結合(即黏著)而成之三維之黏著性細胞群、及細胞沿二維方向以生物學方式結合而成之二維之黏著性細胞群之概念。

三維之黏著性細胞群亦稱為細胞凝集體(Cell Aggregate)，只要為形成立體結構之細胞塊，則並無特別限定，可為球狀亦可為非球狀。本說明書中之細胞凝集體較佳為具有接近球狀之立體之形狀之細胞凝集體。接近球狀之立體之形狀係具有三維結構之形狀，於投影至二維面時，例如表示圓形或橢圓形。

二維之黏著性細胞群亦稱為細胞片，只要為單層或多層之細胞平面性地黏著而形成之單層或多層之結構體，則並無特別限定。藉由黏著培養而製造者及藉由非黏著培養而製造者亦均包含於本說明書中之細胞片中。

於本說明書中，所謂「黏著性細胞群之混合物」或「細胞凝集體之混合物」表示存在2個以上黏著性細胞群或者細胞凝集體之態樣(組合物)。黏著性細胞群或者細胞凝集體分別於容器內可為懸浮於培養基等液體狀介質中、或附著於容器、或沈澱於容器之底中之任一種狀態。又，冷凍之黏著性細胞群或者細胞凝集體亦包含於本說明書中之黏著性細胞群或者細胞凝集體之混合物中。

本說明書中之所謂細胞(包含細胞凝集體、細胞片、細胞群等中之細胞)為哺乳動物之細胞，較佳為嚙齒類(例如小鼠、大鼠)或靈長類(例如人類、猴)之細胞，更佳為人類之細胞。

[神經系統細胞] 於本說明書中，作為神經系統細胞(Neural Cell)，例如可列舉：中樞神經系統之神經系統細胞、或自主神經之神經系統細胞或者運動神經或感覺系統之神經系統細胞等末梢神經系統細胞等所有神經系統細胞，於神經系統細胞中包含神經細胞、源自神經塉之細胞、神經膠細胞、寡樹突膠細胞、微神經膠、及其等之幹細胞或者前驅細胞等。

於本說明書中，FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞只要為以可檢測FOXA2或TUJ1之水準表現之神經系統細胞，則並無特別限定。作為該神經系統細胞，可列舉：神經幹細胞、神經前驅細胞、神經細胞、源自中腦腹側部之神經前驅細胞、多巴胺產生神經前驅細胞、多巴胺產生神經細胞、GABA(Gamma Amino Butyric Acid，γ-胺基丁酸)神經前驅細胞、GABA神經細胞、膽鹼神經前驅細胞、膽鹼神經細胞、麩胺酸神經前驅細胞、麩胺酸神經細胞、視網膜細胞(包含視細胞、視細胞前驅細胞、視網膜色素上皮細胞等)、角膜細胞等。

詳細而言，作為FOXA2陽性且TUJ1陰性之神經系統細胞，例如可列舉：神經幹細胞、神經前驅細胞、及源自中腦腹側部之神經前驅細胞。 作為FOXA2陰性且TUJ1陽性之神經系統細胞，例如可列舉：GABA神經前驅細胞、GABA神經細胞、膽鹼神經前驅細胞、膽鹼神經細胞、麩胺酸神經前驅細胞、麩胺酸神經細胞、視網膜細胞(包含視細胞、視細胞前驅細胞、視網膜色素上皮細胞等)、及角膜細胞。 作為FOXA2陽性及TUJ1陽性之神經系統細胞，可列舉多巴胺產生神經前驅細胞及多巴胺產生神經細胞等神經細胞。

於本說明書中，多巴胺產生神經前驅細胞只要未特別說明，則可含有多巴胺產生神經細胞或多巴胺功能性神經元等。多巴胺產生神經前驅細胞含有為FOXA2陽性及TUJ1陽性，進而較佳為OTX2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及TH中之1個以上為陽性之細胞。

作為神經系統細胞之另一態樣，可列舉FOXA2、TUJ1、OTX2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及TH之至少1個為陽性之神經系統細胞。

作為人類FOXA2，可列舉NCBI(National Center of Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)寄存編號NM＿021784或NM＿153675所表示之聚核苷酸及該等所編碼之蛋白質。 作為人類TUJ1(神經元特異性III類β-微管蛋白(Neuron-specific class III beta-tubulin))，可列舉NCBI寄存編號NM＿006086或NM＿001197118所表示之聚核苷酸及該等所編碼之蛋白質。 作為人類OTX2，可列舉：NCBI寄存編號NM＿021728、NM＿172337、NM＿001270523、NM＿001270524或NM＿001270525所表示之聚核苷酸及該等所編碼之蛋白質。 作為人類LMX1A，可列舉：NCBI寄存編號NM＿001174069或NM＿177398所表示之聚核苷酸及該等所編碼之蛋白質。 作為人類LMX1B，可列舉：NCBI寄存編號NM＿002316、NM＿001174146或NM＿001174147所表示之聚核苷酸及該等所編碼之蛋白質。 作為人類EN1，可列舉NCBI寄存編號NM＿001426所表示之聚核苷酸及其所編碼之蛋白質。 作為人類Nurr1，可列舉NCBI寄存編號NM＿006186所表示之聚核苷酸及其所編碼之蛋白質。 作為人類PITX3，可列舉NCBI寄存編號NM＿005029所表示之聚核苷酸及其所編碼之蛋白質。 作為人類DAT(SLC6A3)，可列舉NCBI寄存編號NM＿001044所表示之聚核苷酸及其所編碼之蛋白質。 作為人類GIRK2(KCNJ6)，可列舉NCBI寄存編號NM＿002240所表示之聚核苷酸及其所編碼之蛋白質。 作為人類TH，可列舉NCBI寄存編號NM＿000360、NM＿199292或NM＿199293所表示之聚核苷酸及該等所編碼之蛋白質。

[神經前驅細胞] 所謂神經前驅細胞，係指可分化誘導為分化進一步進展之神經系統細胞之前驅細胞。神經前驅細胞可分化為中樞神經系統之神經系統細胞、或自主神經之神經系統細胞或者運動神經或感覺系統之神經系統細胞等末梢神經系統之神經系統細胞等包含神經細胞之所有神經系統細胞。

[幹細胞] 於本說明書中，所謂幹細胞係具有多向分化能力(可分化為複數種細胞之能力)與自我複製能力之兩者，能夠無限增殖之細胞。作為幹細胞，例如可列舉：胚胎幹細胞(ES細胞)；自源自骨髄、血液、皮膚(表皮、真皮、皮下組織)之細胞藉由基因導入等人工地製作而成之人工多能性幹細胞(iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞))等多能性幹細胞、以及存在於脂肪、毛囊、腦、神經、肝臟、胰臟、腎臟、肌肉及其他組織中，且分化為特定之複數種細胞之成體幹細胞。

[多能性幹細胞] 本說明書中之多能性幹細胞只要為具有可分化為存在於活體中之所有細胞之多能性，且亦兼具增殖能力之幹細胞，則並無特別限定。 多能性幹細胞可自受精卵、選殖胚、生殖幹細胞、組織內幹細胞、體細胞等誘導。作為多能性幹細胞，可列舉：胚胎幹細胞(ES細胞：Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell，胚胎生殖細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞：induced pluripotent stem cell)等。由間葉系幹細胞(MSC，mesenchymal stem cell)獲得之Muse細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell，多系分化持續應激細胞)及由生殖細胞(例如睾丸)製作之精子幹細胞(GS細胞)亦包含於多能性幹細胞中。胚胎幹細胞係於1981年首次建立，1989年以後亦用於製作基因剔除小鼠。1998年建立人類胚胎幹細胞，亦用於再生醫學。胚胎幹細胞可藉由將內部細胞塊於餵養細胞上或包含LIF(白血病抑制因子)之培養基中培養而製造。胚胎幹細胞之製造方法例如係記載於WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200、806、US6,280、718等中。胚胎幹細胞可自特定之機構獲取，又，亦可購買市售品。例如，作為人類胚胎幹細胞之KhES-1、KhES-2及KhES-3可自京都大學再生醫科學研究所獲取。作為人類胚胎幹細胞之Rx：：GFP株(源自KhES-1株)可自國立研究開發法人理化學研究所獲取。作為小鼠胚胎幹細胞之EB5細胞株及D3細胞株可分別自國立研究開發法人理化學研究所及ATCC(American Type Culture Collection，美國菌種保存中心)獲取。

作為胚胎幹細胞之一之核移植胚胎幹細胞(ntES細胞)可自如下選殖胚建立，該選殖胚係將體細胞之核移植至去除了核之卵子中而製作。 EG細胞可藉由於包含mSCF(mouse Stem Cell Factor，小鼠幹細胞因子)、LIF及bFGF(Spermatogenous cell，鹼性成纖維細胞生長因子)之培養基中培養原始生殖細胞而製造(Cell, 70: 841-847, 1992)。

本說明書中之所謂「人工多能性幹細胞」，係藉由利用公知之方法等將體細胞進行細胞重編程(reprogramming)而誘導出多能性之細胞。具體而言，可列舉藉由選自包含Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28、Esrrb等之初始化基因群中之複數個基因之組合之任一種之表現，將纖維母細胞、或末梢血單核細胞等已分化之體細胞進行細胞重編程，而誘導出多向分化能力之細胞。作為較佳之細胞重編程因子之組合，可列舉：(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc(c-Myc或L-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及L-Myc(Stem Cells, 2013; 31: 458-466)。

人工多能性幹細胞係於2006年由山中等人利用小鼠細胞建立(Cell, 2006, 126 (4), pp. 663-676)。人工多能性幹細胞亦於2007年利用人類纖維母細胞建立，與胚胎幹細胞同樣地具有多能性與自我複製能力(Cell, 2007, 131 (5), pp. 861-872; Science, 2007, 318 (5858), pp. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26 (1), pp. 101-106)。

人工多能性幹細胞除可藉由利用基因表現之直接細胞重編程而製造之方法製造以外，亦可藉由利用化合物之添加等自體細胞誘導人工多能性幹細胞之方法製造(Science, 2013, 341, pp. 651-654)。

又，亦可獲取經株化之人工多能性幹細胞，例如於京都大學建立之201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等人類人工多能性幹細胞細胞株可自京都大學獲取。作為經株化之人工多能性幹細胞，例如於京都大學建立之Ff-I01細胞、Ff-I01s04細胞、QHJ-I01及Ff-I14細胞可自京都大學獲取。

作為於製造人工多能性幹細胞時所使用之體細胞，並無特別限定，可列舉：源自組織之纖維母細胞、血球系細胞(例如末梢血單核細胞(PBMC)、T細胞)、肝細胞、胰臟細胞、腸上皮細胞、平滑肌細胞等。

於製造人工多能性幹細胞時，於藉由數種基因之表現進行細胞重編程之情形時，用以表現基因之方法並無特別限定。作為上述方法，可列舉：使用病毒載體(例如反轉錄病毒載體、慢病毒載體、仙台病毒載體、腺病毒載體、或腺相關病毒載體)之感染法、使用質體載體(例如質體載體、或游離型載體)之基因導入法(例如磷酸鈣法、脂質體轉染法、RetroNectin法、或電穿孔法)、使用RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)載體之基因導入法(例如磷酸鈣法、脂質體轉染法、或電穿孔法)、蛋白質之直接注入法(例如使用針之方法、脂質體轉染法、或電穿孔法)等。

人工多能性幹細胞可於餵養細胞存在下或餵養細胞不存在下(無餵養層)製造。於在餵養細胞存在下製造人工多能性幹細胞時，可藉由公知之方法，於未分化維持因子存在下製造人工多能性幹細胞。作為於在餵養細胞不存在下製造人工多能性幹細胞時所使用之培養基，並無特別限定，可使用公知之胚胎幹細胞及/或人工多能性幹細胞之維持培養基、或用以於無餵養層下建立人工多能性幹細胞之培養基。作為用以於無餵養層下建立人工多能性幹細胞之培養基，例如可列舉：Essential 8培養基(E8培養基)、Essential 6培養基、TeSR培養基、mTeSR培養基、mTeSR-E8培養基、Stabilized Essential 8培養基、StemFit培養基等無餵養層培養基。於製造人工多能性幹細胞時，例如可藉由在無餵養層下，使用仙台病毒載體，將Oct3/4、Sox2、Klf4、及Myc之4因子基因導入至體細胞中，而製作人工多能性幹細胞。

本發明中所使用之多能性幹細胞為哺乳動物之多能性幹細胞，較佳為嚙齒類(例如小鼠或大鼠)或靈長類(例如人類或猴)之多能性幹細胞，更佳為人類或小鼠多能性幹細胞，進而較佳為人類人工多能性幹細胞(iPS細胞)或人類胚胎幹細胞(ES細胞)。

[分化誘導因子] 作為分化誘導因子，係指為了自幹細胞分化誘導為神經系統細胞(包含處於第一分化階段之神經前驅細胞及處於第二分化階段之神經系統細胞)而調整細胞內訊號傳遞之因子。可根據神經系統細胞之種類，適當選擇業者所周知之分化誘導因子。

例如，作為自多能性幹細胞向Corin及/或Lrtm1陽性細胞之分化誘導中所使用之分化誘導因子，可例示：BMP(Bone Morphogenetic Protein，骨形態生成蛋白)抑制劑、TGF(Transforming Growth Factor，轉化生長因子)β抑制劑、SHH(Sonic Hedgehog，音蝟因子)訊號刺激劑、FGF(Fibroblast Growth Factor，纖維母細胞生長因子)8及GSK(Glycogen Synthase Kinase，肝糖合成酶激酶)3β抑制劑。

又，作為自Corin及/或Lrtm1陽性細胞向多巴胺產生神經前驅細胞之分化誘導中所使用之分化誘導因子，可列舉神經營養因子等。

[BMP抑制劑] 於本說明書中，所謂BMP抑制劑，只要為阻礙由BMP引起之訊號傳遞之物質，則並無特別限定，可為核酸、蛋白質、或低分子有機化合物中之任一種。此處，作為BMP，可列舉BMP2、BMP4、BMP7及GDF7(Growth differentiation factor 7，生長分化因子7)。作為BMP抑制劑，可列舉：直接作用於BMP之物質(例如抗體、適體等)、抑制編碼BMP之基因之表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA(Small Interfering Ribonucleic Acid，小干擾核糖核酸)等)、阻礙BMP受體(BMPR)與BMP之結合之物質、阻礙由BMP受體之訊號傳遞所引起之生理活性之物質。作為BMPR，可列舉ALK(Anaplastic Lymphoma Kinase，間變性淋巴瘤激酶)2或ALK3。作為BMP訊號傳遞途徑阻礙物質，可使用業者所周知之化合物，可例示：腱蛋白(Chordin)、頭蛋白(Noggin)、卵泡抑素(Follistatin)等蛋白質性抑制劑、Dorsomorphin(即，6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine))及其衍生物(P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; P. B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3 (8): e2904)、以及LDN193189(即，4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline；4-[6-(4-哌𠯤-1-基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)。此處，LDN193189係作為BMPR(ALK2/3)抑制劑(以下，稱為BMPR抑制劑)而眾所周知，例如係以鹽酸鹽之形態於市面上有售。Dorsomorphin及LDN193189分別可自Sigma-Aldrich公司及Stemgent公司獲取。作為BMP抑制劑，可適當選擇該等之一種或二種以上而使用。本發明中所使用之BMP抑制劑較佳可為LDN193189。

[TGFβ抑制劑] 於本說明書中，所謂TGFβ抑制劑係阻礙TGFβ之向TGFβ之受體之結合至向SMAD持續之訊號傳遞之物質，只要為阻礙起因之訊號傳遞途徑之物質，則並無特別限定，可為核酸、蛋白質、或低分子有機化合物中之任一種。作為該物質，例如可列舉：直接作用於TGFβ之物質(例如蛋白質、抗體、適體等)、抑制編碼TGFβ之基因之表現之物質(例如反義寡核苷酸、siRNA等)、阻礙TGFβ受體與TGFβ之結合之物質、及阻礙由TGFβ受體之訊號傳遞所引起之生理活性之物質(例如TGFβ受體之抑制劑、Smad之抑制劑等)。可列舉阻礙向作為受體之ALK家族之結合之物質、或阻礙由ALK家族所引起之SMAD之磷酸化之物質，例如可例示：Lefty-1(作為NCBI寄存編號，可例示小鼠：NM＿010094、人類：NM＿020997)、Lefty-2(作為NCBI寄存編號，可例示小鼠：NM＿177099、人類：NM＿003240及NM＿001172425)、SB431542、SB202190(以上為R. K. Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2: 20)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO2009/146408)及該等之衍生物等。作為本發明中所使用之TGFβ抑制劑，較佳為可列舉：SB431542(4-(5-苯[1,3]二氧雜環戊烯-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲醯胺)或A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲醯胺)，該等係作為TGFβ受體(ALK5)及活化素(Activin)受體(ALK4/7)之抑制劑而公知。作為TGFβ抑制劑，可適當選擇該等之一種或二種以上而使用。本發明中所使用之TGFβ抑制劑進而較佳可為A83-01。

再者，TGFβ抑制劑或BMP抑制劑等之SMAD訊號傳遞阻礙活性可藉由利用業者所周知之方法、例如西方墨點法檢測Smad之磷酸化而決定(Mol Cancer Ther. (2004) 3, 737-45.)。

[SHH訊號刺激劑] 於本說明書中，作為SHH(Sonic hedgehog)訊號刺激劑，係定義為引起與SHH為受體之Patched(Ptch1)結合所引起之Smoothened(Smo)之脫抑制及進而持續之Gli2之活化之物質，例如可例示屬於Hedgehog家族之蛋白質、具體而言，SHH或者IHH(Indian Hedgehog，印度刺蝟因子)、SHH受體、SHH受體促效劑、Hh-Ag1.5(Li, X., et al., Nature Biotechnology, 23, 215～221 (2005).)、Smoothened促效劑、SAG(N-Methyl-N'-(3-pyridinylbenzyl)-N'-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane；N-甲基-N'-(3-吡啶基苄基)-N'-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二胺基環己烷)、20-羥基膽固醇(20a-hydroxycholesterol)、2,6,9-三元取代嘌呤(Purmorphamine、PMA；9-環己基-N-[4-(4-嗎啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)、及該等之衍生物等(Stanton BZ, Peng LF., Mol Biosyst. 6: 44-54, 2010)。作為SHH訊號刺激劑，可適當選擇該等之一種或二種以上而使用。

作為本發明中所使用之SHH訊號刺激劑，較佳為可列舉：SHH蛋白質(基因庫(Genbank)寄存編號：NM＿000193、NP＿000184)、2,6,9-三元取代嘌呤、及SAG。作為本發明中所使用之SHH訊號刺激劑，進而較佳可為2,6,9-三元取代嘌呤。

[FGF8] 於本說明書中，所謂FGF8，並無特別限定，於人類FGF8之情形時，可例示FGF8a、FGF8b、FGF8e或FGF8f之4個剪切形式，更佳為FGF8b。FGF8例如係由Wako公司或R＆D systems公司等於市面上銷售，可容易地利用，但亦可藉由業者所公知之方法於細胞中強制表現而獲得。

[GSK3β抑制劑] 於本說明書中，所謂GSK3β抑制劑係定義為阻礙GSK3β蛋白質之激酶活性(例如對於β連環蛋白(catenin)之磷酸化能力)之物質，已知有多數者，例如可列舉：作為靛紅衍生物之BIO(別名、GSK3β抑制劑IX；6-溴靛紅3'-肟)、作為順丁烯二醯亞胺衍生物之SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、作為苯基α-溴甲基酮化合物之GSK3β抑制劑VII(4-二溴苯乙酮)、細胞膜穿透式之磷酸化肽之L803-mts(別名、GSK3β肽抑制劑；Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH₂ (序列編號1))及具有較高之選擇性之CHIR99021(6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基胺基]乙基胺基]吡啶-3-甲腈(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)。作為GSK3β抑制劑，可適當選擇該等之一種或二種以上而使用。該等化合物例如係由Calbiochem公司或Biomol公司等於市面上銷售，可容易地利用，但亦可自其他獲取源獲取，或亦可自己製作。本發明中所使用之GSK3β抑制劑較佳可為CHIR99021。

[細胞外基質] 於本說明書中，所謂細胞外基質(亦稱為extracellular matrix)係存在於細胞之外之超分子結構體，可源自天然亦可為人工物(重組體)。例如可列舉：膠原蛋白、蛋白多糖、纖維黏連蛋白、透明質酸、腱生蛋白、巢蛋白(entactin)、彈力蛋白、肌原纖維蛋白(fibrillin)及層黏連蛋白等物質或該等之片段。該等細胞外基質可組合使用，例如可為利用BD Matrigel(商標)等細胞之製備物。較佳為層黏連蛋白或其片段。於本說明書中，所謂層黏連蛋白係具有分別具有各1條α鏈、β鏈、γ鏈之異型三聚物結構之蛋白質，係存在次單元鏈之組成不同之同功異型物(isoform)之細胞外基質蛋白質。層黏連蛋白以5種α鏈、4種β鏈及3種γ鏈之異型三聚物之組合計具有約15種同功異型物(isoform)。並無特別限定，例如，α鏈可例示：α1、α2、α3、α4或α5，β鏈可例示：β1、β2、β3或β4，以及γ鏈可例示：γ1、γ2或γ3。於本發明中所使用之層黏連蛋白更佳為包含α5、β1及γ1之層黏連蛋白511(Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010))。

於本發明中，層黏連蛋白可為片段，只要為具有整合素結合活性之片段，則並無特別限定，例如可為作為利用彈性蛋白酶進行消化而獲得之片段之E8片段(EMBO J., 3: 1463-1468, 1984、J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987)。因此，於本發明中，較佳為可例示利用彈性蛋白酶消化層黏連蛋白511而獲得之WO2011/043405中所記載之層黏連蛋白511E8(較佳為人類層黏連蛋白511E8)。再者，於本發明中所使用之層黏連蛋白511E8等層黏連蛋白E8片段不需要為層黏連蛋白之彈性蛋白酶消化產物，可為重組體。又，層黏連蛋白511E8於市面上有售，例如可自NIPPI股份有限公司等購買。

就避免未鑑定成分之混入之觀點而言，於本發明中所使用之層黏連蛋白或層黏連蛋白片段較佳為進行單離。

[神經營養因子] 於本說明書中，所謂神經營養因子係對在運動神經元之生存與功能維持方面發揮重要作用之膜受體之配體，例如可列舉：神經生長因子(NGF，Nerve Growth Factor)、腦源性神經營養因子(BDNF，Brain-derived Neurotrophic Factor)、神經營養因子3(NT-3，Neurotrophin 3)、神經營養因子4/5(NT-4/5，Neurotrophin 4/5)、神經營養因子-6(NT-6，Neurotrophin 6)、鹼性纖維母細胞增殖因子(basic FGF)、酸性纖維母細胞增殖因子(acidic FGF)、纖維母細胞增殖因子-5(FGF-5)、上皮生長因子(EGF，Epidermal Growth Factor)、肝細胞生長因子(HGF，Hepatocyte Growth Factor)、似胰島素生長因子1(IGF 1，Insulin、Insulin Like Growth Factor 1)、似胰島素生長因子2(IGF 2，Insulin Like Growth Factor 2)、神經膠質細胞源性之神經營養因子(GDNF，Glia cell line-derived Neurotrophic Factor)、TGF-β2、TGF-β3、介白素-6(IL-6，Interleukin 6)、睫狀神經營養因子(CNTF，Ciliary Neurotrophic Factor)及LIF(Leukemia Inhibitory，白血病抑制因子)等。又，可適當選擇該等之一種或二種以上而使用。於本發明中較佳之神經營養因子係選自包含GDNF及BDNF之組中之因子。神經營養因子例如係由Wako公司或R＆D systems公司等於市面上銷售，可容易地利用，可藉由業者所公知之方法於細胞中強制表現而獲得。

[ROCK抑制劑] 於本發明中，所謂ROCK抑制劑，只要可抑制Rho激酶(ROCK)之功能者，則並無特別限定，例如可列舉：Y-27632(例如參照Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000); Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284 (2000))、Fasudil/HA1077(例如參照Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997))、H-1152(例如參照Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002))、Wf-536(例如參照Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003))及其等之衍生物、以及對於ROCK之反義核酸、RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)干涉誘導性核酸(例如siRNA)、顯性負性變異體、及其等之表現載體。又，作為ROCK抑制劑，亦已知有其他低分子化合物，故而於本發明中，亦可使用此種化合物或其等之衍生物(例如參照美國專利申請公開第20050209261號、美國專利申請公開第20050192304號、美國專利申請公開第20040014755號、美國專利申請公開第20040002508號、美國專利申請公開第20040002507號、美國專利申請公開第20030125344號、美國專利申請公開第20030087919號、及國際公開第2003/062227號、國際公開第2003/059913號、國際公開第2003/062225號、國際公開第2002/076976號、國際公開第2004/039796號)。於本發明中，可使用1種或2種以上之ROCK抑制劑。於本發明中所使用之ROCK抑制劑較佳可為Y-27632。

[培養基] 於本說明書中，細胞之培養中所使用之培養基可將於動物細胞之培養中通常所使用之培養基製備為基礎培養基，作為基礎培養基，例如可列舉：BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、格拉斯哥最小必需培養基(GMEM，Glasgow's Minimal Essential Medium)、Improved MEM Zinc Option培養基、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，思考夫改良杜貝可營養基)培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium，杜貝可改良伊格爾營養基)培養基、F-12培養基、DMEM/F12培養基、StemFit培養基、IMDM/F12培養基、Ham's培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、Neurobasal培養基或該等之混合培養基等可用於動物細胞之培養之培養基。可利用該等基礎培養基，製備於本發明之製造方法之各步驟中所使用之培養基。

於本說明書中，於包含多能性幹細胞之細胞群之培養中所使用之培養基為了抑制多能性幹細胞之細胞死亡，較理想為包含未分化維持因子之培養基(未分化維持培養基)。又，包含多能性幹細胞之細胞群之培養中所使用之培養基較理想為無餵養層之無血清培養基。該培養基例如可藉由向基礎培養基中添加未分化維持因子、血清代替物及適當營養源等而製備。具體而言，可藉由向DMEM/F12培養基中添加bFGF、KSR(KnockOut Serum Replacement，KnockOut血清替代物)、非必須胺基酸(NEAA，non essential amino acid)、L-麩醯胺及2-巰基乙醇而製備。

本說明書中之所謂「無血清培養基」，係指不含未調整或未純化之血清之培養基。於本發明中，混入有源自經純化之血液之成分或源自動物組織之成分(例如增殖因子)之培養基亦只要不含未調整或未純化之血清，則包含於無血清培養基中。 無血清培養基可含有血清代替物。作為血清代替物，例如可列舉適當含有白蛋白、轉鐵蛋白、脂肪酸、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇或3'硫醇甘油、或該等之均等物等者。該血清代替物例如可藉由WO98/30679中所記載之方法而製備。作為血清代替物，可利用市售品。作為該市售之血清代替物，例如可列舉：Life Technologies公司(現ThermoFisher)製造之KnockOut Serum Replacement(KSR)、Chemically-defined Lipid concentrated、Glutamax、B-27補充劑、N2補充劑、ITS補充劑。

無血清培養基可適當含有脂肪酸或脂質、胺基酸(例如非必須胺基酸)、維生素、增殖因子、細胞激素、抗氧化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。

為了避免製備之繁雜性，作為該無血清培養基，可使用添加有適量(例如約0.5%至約30%，較佳為約1%至約20%)之市售之KSR之無血清培養基(例如於GMEM培養基中添加有約8%KSR、化學成分確定之脂質濃縮物(Chemically-defined Lipid concentrated)之培養基)、或於Neurobasal培養基中添加有適量(例如約0.1～5%)之市售之B-27無血清培養基。又，作為KSR同等品，可列舉日本專利特表2001-508302公報中所揭示之培養基。

培養較佳為於無血清培養基中進行。作為無血清培養基，較佳為包含KSR、或B-27之無血清培養基、或於不含異源成分(xeno-free)條件之培養基中進行。此處，所謂「不含異源成分」係指排除源自與培養對象之細胞之生物種不同之生物種之成分之條件。

於本說明書中，所謂餵養細胞係於培養幹細胞時共存之該幹細胞以外之細胞。作為餵養細胞，例如可列舉：小鼠纖維母細胞(MEF等)、人類纖維母細胞、SNL細胞、STO細胞等。餵養細胞可為經增殖抑制處理之餵養細胞，此處，作為增殖抑制處理，可列舉：增殖抑制劑(例如絲裂黴素C)處理或利用伽馬射線照射或者UV(Ultra Violet，紫外線)照射等之處理。其中，於本發明中，較佳為於餵養細胞不存在下(無餵養層)進行培養。

於本說明書中，所謂於餵養細胞不存在下(無餵養層)係於餵養細胞不存在下進行培養。所謂於餵養細胞不存在下，例如可列舉：未添加如上所述之餵養細胞之條件、或實質上不含餵養細胞(例如餵養細胞數相對於總細胞數之比率為3%以下，較佳為0.5%以下)之條件。 作為可用作未分化維持培養基之無餵養層培養基，業界開發、銷售有大量合成培養基，例如可列舉Essential 8培養基。Essential 8培養基於DMEM/F12培養基中，包含L-抗壞血酸-2-磷酸酯鎂(L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium)(64 mg/l)、亞硒酸鈉(sodium selenium)(14 μg/l)、胰島素(insulin)(19.4 mg/l)、NaHCO₃ (543 mg/l)、運鐵蛋白(transferrin)(10.7 mg/l)、bFGF(100 ng/mL)、及TGFβ抑制劑(TGFβ1(2 ng/mL)或Nodal(100 ng/mL))(Nature Methods, 8, 424-429 (2011))作為添加劑。作為市售之無餵養層培養基，例如可列舉：Essential 8(Life Technologies公司製造；現ThermoFisher)、S-medium(DS Pharma Biomedical公司製造)、StemPro(Life Technologies公司製造；現ThermoFisher)、hESF9(Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9; 105 (36): 13409-14)、mTeSR1(STEMCELL Technologies公司製造)、mTeSR2(STEMCELL Technologies公司製造)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies公司製造)。又，除此以外，作為無餵養層培養基，可列舉StemFit(Ajinomoto公司製造)。於上述步驟(1)中，藉由使用該等，可簡便地實施本發明。

再者，於本說明書中，所謂「包含物質X之培養基」、「於物質X之存在下」係指添加有外源性(exogenous)之物質X之培養基或包含外源性之物質X之培養基、或於外源性之物質X之存在下。即，認為，於存在於該培養基中之細胞或組織內源性(endogenous)地表現、分泌或者產生該物質X之情形時，內源性之物質X與外源性之物質X加以區別，不含外源性之物質X之培養基即便含有內源性之物質X亦不符合「包含物質X之培養基」之範疇。

II.細胞凝集體及其混合物 作為本發明之一態樣，可列舉包含FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞，且每1個細胞凝集體之細胞數為1000個以上之細胞凝集體。作為細胞凝集體之混合物，為複數個細胞凝集體之混合物，且係包含總細胞凝集體數之50%以上之本發明之細胞凝集體之混合物。

於該細胞凝集體中，關於FOXA2陽性之神經系統細胞或TUJ1陽性之神經系統細胞之數量，於將該細胞凝集體或源自該細胞凝集體之物移植至活體中之情形時，只要可發揮該神經系統細胞之功能，則並無特別限定，雖然取決於該神經系統細胞之種類，但較佳為總細胞數之約70%以上，進而較佳為約80%以上，更佳為約90%以上。

作為本發明之一態樣，可列舉包含FOXA2陽性且TUJ1陽性之神經細胞，且每1個細胞凝集體之細胞數為1000個以上之細胞凝集體。

於神經系統細胞為多巴胺產生神經前驅細胞之情形時，本發明中之細胞凝集體較佳為包含總細胞數之約50%以上之FOXA2陽性且TUJ1陽性之神經細胞，進而較佳為包含約70%以上，更佳為包含約80%以上。

於本發明之一態樣中，細胞凝集體之特徵在於：於培養時可抑制細胞死亡。此處，所謂「於培養時可抑制細胞死亡」係指可抑制於分化誘導因子等存在下於37℃左右下進行細胞培養時通常所產生之神經細胞之細胞死亡。

例如，於將細胞凝集體於37℃下，於分化誘導因子之存在下培養14～20天之情形時，於培養結束時之細胞數為培養開始時之細胞數之5%以上，較佳為8%以上，進而較佳為10%以上，進而較佳為15%以上，進而較佳為30%以上之情形時，該細胞凝集體可判定為「於培養時可抑制細胞死亡」。

於本發明之一態樣中，細胞凝集體具有選自以下之(a1)～(a4)中之至少1個特徵。細胞凝集體可具有(a1)～(a4)之特徵之全部。 (a1)圓當量徑為100 μm～2000 μm、 (a2)包絡度為0.5以上、 (a3)斐瑞特直徑比為0.5以上、及 (a4)圓形度為0.3以上。

此處，上述(a1)～(a4)可藉由在顯微鏡或數位顯微鏡中，利用相機拍攝藉由自垂直於觀察面之方向之平行之透過照明產生之像，並分析所獲得之圖形(即，於將細胞凝集體投影至平面之情形時所形成之圖形)而進行測定。

此處，所謂圓當量徑係具有與上述圖形之面積相同之面積之圓之直徑。圓當量徑較佳為100 μm～1000 μm，進而較佳為200 μm～600 μm，較佳為300 μm～600 μm，進而更佳為450 μm～600 μm。

所謂包絡度，表示上述圖形與包絡該圖形之凸多角形之周長或面積之比。具體而言，包絡度有周長之包絡度及面積之包絡度，周長之包絡度為圖形之周長相對於包絡圖形之周長之比，面積之包絡度為圖形之面積相對於包絡圖形之面積之比。包絡度較佳為0.7～1.0，進而較佳為0.8～1.0。

所謂斐瑞特直徑比，係與上述圖形外接之四角形之水平方向之長度與和其正交之垂直方向之長度之比，係以垂直方向之長度相對於水平方向之長度之比所表示。斐瑞特直徑比較佳為0.6～1.0，進而較佳為0.7～1.0。

所謂圓形度，係於上述圖形為真圓時達到1，越變得細長越接近0，且以4π×(面積)÷(周長)² 表示之值。圓形度較佳為0.5～1.0，進而較佳為0.7～1.0。

作為本發明之細胞凝集體之一態樣，可列舉於孤立之細胞凝集體之表面未形成碎片層，且於顯微鏡下細胞凝集體之邊界線較清晰之細胞凝集體。 此處所使用之顯微鏡只要為倍率4～10倍左右之業者所周知之顯微鏡，則並無特別限定，具體而言，可列舉ThermoFisher EVOS XL。

所謂「孤立之細胞凝集體」係指不與其他細胞凝集體接觸，可觀察細胞凝集體之外緣之狀態之細胞凝集體。

所謂碎片層係指存在於細胞凝集體之表面，且能夠觀察到為單一粒子之粒子群(例如死細胞之群)以層狀連續地集合之結構。於在細胞凝集體之表面形成有碎片層之情形時，該細胞凝集體之邊界線與不具有碎片層或具有少量之碎片層之細胞凝集體相比不清晰。

包含複數個上述本發明之細胞凝集體之細胞凝集體之混合物亦為本發明之範疇。於本說明書中，細胞凝集體之混合物包含至少2個以上、較佳為5個以上之細胞凝集體，且包含總細胞凝集體數之約20%以上、較佳為約40%以上，進而較佳為約50%以上、尤佳為60%以上之本發明之細胞凝集體。細胞凝集體之混合物亦可含有以衛星點狀存在之可進行測定之大小之微小之細胞群。

此處，所謂「以衛星點狀存在之微小之細胞群」係指與不細胞凝集體結合而獨立地存在，包含複數個細胞(例如死細胞)之較小之細胞群。

本發明之細胞凝集體之混合物至少於大小及形狀之方面上具有良好之均一性，且於選自由圓形度、最小直徑、周長、斐瑞特直徑(垂直斐瑞特直徑或水平斐瑞特直徑)、斐瑞特直徑比、最大直徑、包絡度(周長包絡度或面積包絡度)、面積及圓當量徑所組成之群中之指標中之1個以上之指標中，變異係數(CV值)為15%以下，較佳為12%以下或10%以下，更佳為8%以下或5%以下。此處，各指標可藉由於顯微鏡或數位顯微鏡中，利用相機拍攝藉由自垂直於觀察面之方向之平行透過照明所產生之圖像，並分析所獲得之圖形而進行測定，但只要為能夠以與該方法相同程度之精度進行測定之方法，則測定方法並無限定。

此處，所謂最小直徑，係以平行之2直線夾著圖形時之2直線間之距離之最小值。本發明之細胞凝集體之最小直徑例如為200 μm～600 μm，較佳為300 μm～600 μm，進而較佳為400 μm～600 μm。

所謂周長係圖形之周長，即，意指於將細胞凝集體投影至平面之情形時所形成之圖形之周長。本發明之細胞凝集體之周長例如為800 μm～2700 μm，較佳為1600 μm～2700 μm。

所謂斐瑞特直徑(垂直斐瑞特直徑或水平斐瑞特直徑)係與圖形外接之四邊形之垂直方向或水平方向之長度。即，所謂斐瑞特直徑係指假定為將細胞凝集體投影至平面之情形時所形成之圖形所外接之四邊形之情形時該四邊形之各邊之長度。本發明之細胞凝集體之垂直斐瑞特直徑或水平斐瑞特直徑例如為200 μm～800 μm，較佳為300 μm～600 μm，進而較佳為400 μm～800 μm。

所謂最大直徑係圖形之內周上之任意2點間距離成為最大之長度。即，所謂最大直徑，意指於將細胞凝集體投影至平面之情形時所形成之圖形之內周之任意2點間距離中最大者之長度。本發明之細胞凝集體之最大直徑例如為200 μm～900 μm，較佳為300 μm～600 μm，進而較佳為400 μm～900 μm。

所謂面積，係以2維計算出之圖形之面積，即，係指於將細胞凝集體投影至平面之情形時形成之圖形之面積。本發明之細胞凝集體之面積例如為46000 μm² ～278000 μm² ，較佳為165000 μm² ～278000 μm² 。

上述各指標根據將細胞凝集體投影至平面之情形時之方向而具有複數個值，為方便起見，只要採用於任意方向上所測得之值即可。各指標之中，關於斐瑞特直徑比、包絡度及圓形度，細胞凝集體越接近真球體，即，投影至平面之情形時之圖形越接近真圓，越顯示均勻之值。

III.黏著性細胞群之混合物之製造方法 作為本發明之一態樣，可列舉包括以下之步驟之包含神經系統細胞之黏著性細胞群之混合物之製造方法： (1)於第一分化誘導因子存在下對複數個幹細胞進行分化誘導，而獲得包含1個以上處於第一分化階段之神經前驅細胞之複數個細胞之步驟； (2)自步驟(1)中所獲得之複數個細胞中選擇性地分離處於第一分化階段之神經前驅細胞之步驟，該步驟包括：於液體介質之連續流動中，使於步驟(1)中所獲得之複數個細胞懸浮；及識別處於第一分化階段之神經前驅細胞，並將處於第一分化階段之神經前驅細胞與並非此種神經前驅細胞之細胞以向各液體介質之連續流動進行流動之方式分離；以及 (3)於第二分化誘導因子存在下培養於步驟(2)中分離之處於第一分化階段之神經前驅細胞，而獲得黏著性細胞群之混合物之步驟，且 黏著性細胞群之混合物包含總黏著性細胞群數之50%以上之具有以下之(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群： (b1)包含處於第二分化階段之神經系統細胞、 (b2)包含1000個以上之細胞。

[步驟(1)] 步驟(1)係於第一分化誘導因子存在下對複數個幹細胞進行分化誘導，而獲得包含1個以上處於第一分化階段之神經前驅細胞之複數個細胞之步驟。於本說明書中，所謂處於第一分化階段之神經前驅細胞，只要為自幹細胞、較佳為多能性幹細胞分化誘導為處於第二分化階段之神經系統細胞時相當於中間物之神經前驅細胞，則並無特別限定，例如可列舉可分化為神經細胞之神經前驅細胞。

作為神經前驅細胞，具體而言，可列舉註定中腦底板(floor plate)命運之神經前驅細胞等。作為註定中腦底板命運之神經前驅細胞，可列舉Corin及/或Lrtm1陽性之細胞。該細胞可藉由業者所周知之方法進行製造。

用於自幹細胞獲得處於第一分化階段之神經前驅細胞之分化誘導方法只要適當根據神經前驅細胞之種類，使用業者所公知之方法即可。即，只要於業者所周知之第一分化誘導因子之存在下於適當之培養基中進行培養即可。此處，第一分化誘導因子意指對細胞之分化狀態(與分化相關之轉錄因子或基因、蛋白質之表現)造成影響之因子，可列舉：低分子化合物、蛋白質、蛋白質之肽片段、及二氧化碳、氧分壓或者壓力等物理因子。具體而言，已知有使用SMAD抑制劑(BMP抑制劑、TGFβ抑制劑)、SHH訊號刺激劑、GSK3β抑制劑或神經營養因子之方法等。

例如，於註定中腦底板命運之神經前驅細胞之情形時，可列舉Stem cell reports, vol. 2 337-350, 2014中所記載之公知之方法。

於本說明書中，作為註定中腦底板命運之神經前驅細胞，具體而言，可列舉Corin及/或Lrtm1陽性之細胞。所謂Corin及/或Lrtm1陽性之細胞，係表現Corin蛋白質及/或Lrtm1蛋白質可利用抗Corin抗體或抗Lrtm1抗體識別之量之細胞。

列舉處於第一分化階段之神經前驅細胞係包含Corin及/或Lrtm1陽性之細胞之神經前驅細胞之情形為例，而對幹細胞之分化誘導方法具體地進行說明。

自多能性幹細胞向Corin及/或Lrtm1陽性之細胞之分化誘導可使用包含第一分化誘導因子之培養基而進行。作為第一分化誘導因子，例如可例示：上述BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、SHH訊號刺激劑、FGF8及GSK3β抑制劑。自多能性幹細胞向Corin及/或Lrtm1陽性之細胞之分化誘導較理想為藉由以下之多階段之步驟進行： (1a)於包含BMP抑制劑及TGFβ抑制劑之培養基中，於細胞外基質(亦稱為extracellular matrix)上黏著培養多能性幹細胞之步驟； (1b)於包含BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、SHH訊號刺激劑及FGF8之培養基中，於細胞外基質上黏著培養上述步驟(1a)中所獲得之細胞之步驟； (1c)於包含BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、SHH訊號刺激劑、FGF8及GSK3β抑制劑之培養基中，於細胞外基質上黏著培養上述步驟(1b)中所獲得之細胞之步驟； (1d)於包含BMP抑制劑及GSK3β抑制劑之培養基中，於細胞外基質上黏著培養上述步驟(1c)中所獲得之細胞之步驟。

此處所使用之培養基可將動物細胞之培養中所使用之培養基製備為基礎培養基。作為基礎培養基，例如包含GMEM培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培養基、StemFit培養基、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、Neurobasal Medium(Life Technologies；現ThermoFisher)及該等之混合培養基等。較佳為GMEM培養基。於培養基中可含有血清，或亦可為無血清。培養基視需要例如可含有白蛋白、轉鐵蛋白、KnockOut Serum Replacement(KSR)(血清代替物)、N2補充劑、B-27補充劑、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3'-硫醇甘油等1種以上之血清代替物，亦可含有脂質、胺基酸、L-麩醯胺、Glutamax、非必須胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等1種以上之物質。較佳之培養基係含有KSR、2-巰基乙醇、非必須胺基酸及丙酮酸之GMEM培養基。可向該培養基中適當添加選自由BMP抑制劑、TGFβ抑制劑、SHH訊號刺激劑、FGF8及GSK3β抑制劑所組成之群中之試劑而進行培養。 再者，培養基之組成亦可於培養之中途適當進行調整或變更。

所謂於細胞外基質上進行黏著培養，可藉由使用利用細胞外基質進行了塗佈處理之培養容器培養而進行。塗佈處理可藉由將含有細胞外基質之溶液添加至培養容器中後，適當去除該溶液而進行。

通常上述步驟(1a)係利用進而包含ROCK抑制劑之培養基進行。即，步驟(1a)可為「於包含ROCK抑制劑、BMP抑制劑及TGFβ抑制劑之培養基中於細胞外基質上黏著培養多能性幹細胞之步驟」。

關於培養條件，培養溫度並無特別限定，較佳為約37℃，於含CO₂ 之空氣之氣氛下進行培養，CO₂ 濃度較佳為約2～5%。

培養期間只要為出現Corin及/或Lrtm1陽性之細胞之期間，則並無特別限定，較理想為於上述步驟(1)之結束後所獲得之細胞群中所含之Corin及/或Lrtm1陽性之細胞之比率成為10%以上之期間進行培養，較佳為進行至少10天、更佳為12天至16天。

作為複數個多能性幹細胞，可使用細胞彼此進行瞭解離者。作為使細胞彼此解離之方法，例如可列舉：力學性地解離之方法、使用具有蛋白酶活性與膠原酶活性之解離溶液(例如Accutase(商標)及Accumax(商標)等)或僅具有膠原酶活性之解離溶液之解離方法。較佳為使用胰蛋白酶利用其代替物(可例示TrypLE CTS(Life Technologies；現ThermoFisher))使人類多能性幹細胞解離之方法。於使細胞解離之情形時，較理想為於解離後適當添加ROCK抑制劑而進行培養。於添加ROCK抑制劑之情形時，只要添加至少1天進行培養即可，更佳為1天。

再者，於一態樣中，人類多能性幹細胞(例如人類iPS細胞)可於上述步驟(1)之前，於餵養細胞不存在下，於含有bFGF及SHH訊號刺激劑之無血清培養基中進行黏著培養。該黏著培養較佳為於利用層黏連蛋白511、層黏連蛋白511之E8片段或玻璃連結蛋白(vitronectin)塗佈表面之細胞容器中實施。該黏著培養較佳為使用Essential 8、TeSR培養基、mTeSR培養基、mTeSR-E8培養基、或StemFit培養基、進而較佳為Essential 8或StemFit培養基作為無餵養層培養基而實施(WO2017/183736)。

[步驟(2)] 步驟(2)包括如下操作：於液體介質之連續性流向中，使於步驟(1)中所獲得之複數個細胞懸浮；及識別處於第一分化階段之神經前驅細胞，並以向各液體介質之連續性流向流動之方式分離處於第一分化階段之神經前驅細胞與不為目標之神經前驅細胞之細胞。

於本發明中，為了自步驟(1)中所獲得之複數個細胞中，選擇性地分離處於第一分化階段之神經前驅細胞，基於特定之指標識別該神經前驅細胞。此處所使用之指標並無特別限定，可適當使用業者所周知之指標。即，可列舉：於處於第一分化階段之神經前驅細胞中特異性地表現之標記物基因、蛋白質、細胞大小、細胞之密度等。

於將於該神經前驅細胞中特異性地表現之標記物設為指標之情形時，只要使用與其特異性地結合之物質及細胞分離裝置(細胞分選儀)分離出標記物陽性細胞即可。

作為標記物，可使用於目標之處於第一分化階段之神經前驅細胞之表面進行表現之蛋白質。作為與該標記物特異性地結合之物質，可使用抗體、適體，較佳為可使用抗體或者其抗原結合片段。

上述抗體可為多株或單株抗體。該等抗體可使用業者所周知之技術而製作(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13)。具體而言，於抗體為多株抗體之情形時，可依據常法將於大腸桿菌或哺乳類細胞株等中表現並純化所得之標記物之蛋白質、具有標記物之部分胺基酸序列之寡肽或糖脂質純化，對家兔等非人類動物進行免疫，並依據常法自該免疫動物之血清獲得。另一方面，於單株抗體之情形時，可自使自上述已免疫之非人類動物獲得之脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合而製備之融合瘤細胞中獲得(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11)。作為抗體之抗原結合片段，可例示抗體之一部分(例如Fab片段)或合成抗體片段(例如單鏈Fv片段「ScFv」)。Fab及F(ab)₂ 片段等抗體之片段亦可藉由在基因工程方面周知之方法而製作。

為了識別或分離表現標記物之細胞，該結合之物質例如可與螢光標記、放射性標記、化學發光標記、酵素、生物素或抗生蛋白鏈菌素等可檢測之物質或蛋白質A、蛋白質G、珠粒或磁珠等可進行單離萃取之物質結合或接合。

又，該結合之物質亦可間接地進行標記。可使用業者所公知之各種方法而進行，例如可列舉使用與該抗體特異性地結合之預先標記之抗體(二次抗體)之方法。

於本說明書中，與標記物特異性地結合之適體可使用業者所周知之技術而製作(SELEX(systematic evolution of ligand by exponential enrichment，指數富集之配體系統進化技術)法: Ellington, A. D. ＆ Szostak, J. W. (1990) Nature, 346, 818-822., Tuerk, C. ＆ Gold, L. (1990) Science, 249, 505-510)。

於處於第一分化階段之神經前驅細胞係註定中腦底板命運之神經前驅細胞之情形時，作為標記物，可使用Corin及/或Lrtm1。人類Corin可利用NCBI之寄存編號NM＿006587獲得其序列。同樣地，人類Lrtm1可利用NM＿020678而獲得其序列。例如，針對Corin之抗體可藉由WO2004/065599、WO2006/009241中所記載之製作法而獲得，針對Lrtm1之抗體可藉由WO2013/015457中所記載之製作法而獲得。

於步驟(2)中所使用之細胞分離裝置包含於液體介質之連續性流向中，使於步驟(1)中所獲得之複數個細胞懸浮，識別處於第一分化階段之神經前驅細胞，並以向各液體介質之連續性流向流動之方式分離處於第一分化階段之神經前驅細胞與不為目標之神經前驅細胞之細胞之機構。

於本說明書中，上述細胞分離裝置(亦稱為細胞分選儀)係用以於標記物等處於第一分化階段之神經前驅細胞中檢測特徵性指標之裝置及具備可不形成液滴而連續地輸送液體之液體流路之裝置。藉由使用該細胞分離裝置，可於不形成液滴之連續性溶液系統內將細胞分離。

本說明書中之細胞分離裝置較佳為完全封閉系統。作為該細胞分離裝置，具體而言，可列舉Hulspas R等人著之Cytotherapy. 2014 Oct; 16 (10): 1384-9(Hulspas文獻)中所記載之微流路方式細胞分選儀。該文獻之細胞分離裝置為完全封閉系統之微流路方式，且可不形成液滴而將細胞分離。又，作為該細胞分離裝置，較佳為可於高速(例如5000粒子/秒左右以上、以一次之施行總量計處理1000萬細胞以上)下將細胞分離之裝置。

具體而言，可利用Cytonome公司Gigasort細胞分選儀(參照https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25065635(Hulspas文獻)、及http://www.cytonome.com/)。該細胞分選儀為完全封閉系統之微流路方式，且藉由利用氣壓使標記物等檢測裝置通過後之分離對象細胞之流路彎曲，可於不形成液滴之連續性溶液系統內將細胞分離。

[步驟(3)] 步驟(3)係於第二分化誘導因子存在下培養於步驟(2)中分離之處於第一分化階段之神經前驅細胞，而獲得黏著性細胞群之混合物之步驟。該黏著性細胞群之混合物包含總黏著性細胞群數之50%以上之具有以下之(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群： (b1)包含處於第二分化階段之神經系統細胞、 (b2)包含1000個以上之細胞。

於本說明書中，所謂處於第二分化階段之神經系統細胞係於進行步驟(2)之篩選後，進而繼續培養而進行分化階段之細胞，包含被賦予向特定之神經系統細胞分化之命運之前驅細胞。此處，處於第二分化階段之神經系統細胞只要為與處於第一分化階段之神經前驅細胞相比進行了分化之狀態，則並無特別限定，分化之進行狀態取決於目標之神經系統細胞。

作為處於第二分化階段之神經系統細胞，可列舉TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、En1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及TH之至少1個、較佳為至少2個、進而較佳為至少3個為陽性之神經細胞。作為處於第二分化階段之神經系統細胞之一態樣，可列舉FOXA2陽性及/或TUJ1陽性之細胞。

較佳為，作為處於第二分化階段之神經系統細胞，可列舉源自中腦腹側之神經細胞、具體而言，多巴胺產生神經前驅細胞或者多巴胺產生神經細胞。作為處於第二分化階段之神經系統細胞，較佳為可列舉FOXA2陽性且TUJ1陽性之多巴胺產生神經前驅細胞。

用以自步驟(2)中所獲得之細胞獲得處於第二分化階段之神經系統細胞之分化誘導方法只要根據目標之神經系統細胞之種類，適當使用業者所公知之方法即可。即，只要於業者所周知之第二分化誘導因子之存在下利用適當之培養基進行培養即可。此處，作為第二分化誘導因子，係指對細胞之分化狀態(與分化相關之轉錄因子或基因、蛋白質之表現)帶來影響之因子，可列舉：低分子化合物、蛋白質、蛋白質之肽片段、及二氧化碳、氧分壓或者壓力等物理因子。例如，於多巴胺產生神經前驅細胞之情形時，可列舉Stem cell reports, vol. 2 337-350, 2014中所記載之公知之方法。

列舉第二分化階段之神經系統細胞係包含多巴胺產生神經前驅細胞之神經細胞之情形為例，而對分化誘導方法具體地進行說明。 此處所使用之培養基可將動物細胞之培養中所使用之培養基製備為基礎培養基。作為基礎培養基，例如包含GMEM培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培養基、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、Neurobasal Medium(Life Technologies；現ThermoFisher)及該等之混合培養基等。較佳為Neurobasal Medium。於培養基中可含有血清，或亦可為無血清。視需要培養基例如可含有白蛋白、轉鐵蛋白、KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時之FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)之血清代替物)、N2補充劑、B-27補充劑、脂肪酸、胰島素、膠原蛋白前驅物、微量元素、2-巰基乙醇、3'-硫醇甘油等1種以上之血清代替物，亦可含有脂質、胺基酸、L-麩醯胺、Glutamax、非必須胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、核酸(例如二丁酸環單磷酸腺苷酸(dbcAMP，Dibutyryl cyclic AMP))等1種以上之物質。較佳之培養基係含有B-27補充劑、抗壞血酸及dbcAMP之Neurobasal Medium。可向該培養基中適當添加神經營養因子而進行培養。

分化誘導可藉由懸浮培養進行，此處，所謂懸浮培養，係對細胞於不黏著培養容器之狀態下進行培養，並無特別限定，可使用為了提高與細胞之黏著性而未人工地進行處理(例如利用細胞外基質等之塗佈處理)之培養容器、或進行了人工地抑制黏著之處理(例如利用多羥基乙基甲基丙烯酸(poly-HEMA)、非離子性之界面活性多元醇(Pluronic F-127等)或磷脂質類似結構物(例如將2-甲基丙烯醯氧乙基磷酸膽鹼作為結構單元之水溶性聚合物(Lipidure))之塗佈處理)之培養容器而進行。

關於培養條件，培養溫度並無特別限定，為約30～40℃，較佳為約37℃，於含CO₂ 之空氣之氣氛下進行培養，CO₂ 濃度較佳為約2～5%。

培養期間只要為出現Foxa2陽性細胞之期間，則並無特別限定，培養較理想為進行至少7天。更佳為7天至30天，進而較佳為14天至21天、或14天至20天、或14天至18天、或14天至16天，最佳為16天。

培養較理想為適當添加ROCK抑制劑而進行培養。於添加ROCK抑制劑之情形時，只要添加至少1天進行培養即可，更佳為1天。

IV.黏著性細胞群及其混合物 藉由黏著性細胞群之混合物之製造方法，可製造包含總黏著性細胞群數之50%以上之具有以下之(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群之黏著性細胞群之混合物： (b1)包含處於第二分化階段之神經系統細胞、 (b2)包含1000個以上之細胞。 又，藉由包括自藉由上述黏著性細胞群之混合物之製造方法而獲得之黏著性細胞群之混合物中，分離具有上述(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群之步驟之黏著性細胞群之製造方法，可獲得具有上述(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群。

黏著性細胞群之混合物可為三維之黏著性細胞群之混合物(即細胞凝集體之混合物)，亦可為二維之單層或者多層之黏著性細胞群之混合物(即細胞片)。於三維之黏著性細胞群中，圓當量徑為100 μm～2000 μm，較佳為100 μm～1000 μm，進而較佳為200 μm～600 μm，進而較佳為300 μm～600 μm。 該黏著性細胞群或其混合物於培養時可抑制細胞死亡。於將該黏著性細胞群培養14-20天之情形時，培養結束時之細胞數為培養開始時之細胞數之5%以上，較佳為8%以上，進而較佳為10%以上，進而較佳為15%以上，進而較佳為60%以上，進而較佳為約100%。

再者，由培養所引起之細胞數之變動取決於細胞之種類，已知於第二分化階段中之神經系統細胞為多巴胺產生神經前驅細胞之情形時，通常殺滅約80%以上之細胞。然而，藉由使用本發明之製造方法，於第二分化階段中於培養14-20天之情形時培養結束時之細胞數為第二分化階段之培養開始時之細胞數之5%以上，較佳為8%以上，進而較佳為10%以上，進而較佳為15%以上，進而較佳為20%以上，具體而言，例如為15%～80%、或15%～50%。

另一方面，已知於第二分化階段中之神經系統細胞為神經幹細胞之情形時，通常即便細胞數暫時減少其後細胞數亦會恢復。於此種神經系統細胞之情形時，於第二分化階段中於培養14-20天之情形時培養結束時之細胞數為第二分化階段之培養開始時之細胞數之80%以上、或約100%。

作為三維之黏著性細胞群之一態樣，可列舉細胞凝集體，該細胞凝集體較佳為進而具有以下之特徵： (b3)包絡度為0.5以上，較佳為0.7～1.0，進而較佳為0.8～1.0； (b4)斐瑞特直徑比為0.5以上，較佳為0.6～1.0，進而較佳為0.7～1.0；及 (b5)圓形度為0.3以上，較佳為0.5～1.0，進而較佳為0.7～1.0。

作為較佳之一態樣，可列舉具有以下之特徵之細胞凝集體： ・圓當量徑為100 μm～1000 μm， ・包絡度為0.8～1.0， ・斐瑞特直徑比為0.7～1.0， ・圓形度為0.7～1.0。

該細胞凝集體進而較佳為具有以下之特徵： 於所獲得之細胞凝集體之混合物中，於選自由圓形度、最小直徑、最大直徑、垂直斐瑞特直徑或者水平斐瑞特直徑、斐瑞特直徑比、圓當量徑、周長、面積、及周長之包絡度或者面積之包絡度所組成之群中之指標之中，於1個以上之指標中變異係數為15%以下。

於上述製造方法中，作為成為原料之幹細胞，只要為可分化為神經系統細胞之幹細胞，則並無特別限定，較佳為可列舉：多能性幹細胞、神經幹細胞、間葉系幹細胞、Muse細胞等。

作為幹細胞，進而較佳為可列舉多能性幹細胞，進而更佳為可列舉ES細胞或iPS細胞。

藉由上述本發明之製造方法而獲得之黏著性細胞群亦為本發明之概念。

進而，於上述製造方法中之步驟(2)中所獲得之神經前驅細胞係藉由在第二分化誘導因子之存在下進行培養，可分化誘導為本發明之細胞凝集體或黏著性細胞群之非黏著性細胞群、即孤立之細胞之混合物。該細胞之混合物亦為本發明之範疇。

具體而言，可列舉包含約70%以上之Corin或者Lrtm1陽性之細胞，且藉由在第二分化誘導因子之存在下進行培養，可分化誘導為本發明之細胞凝集體或黏著性細胞群之細胞之混合物。

藉由對該細胞之混合物進行懸浮培養，可獲得上述本發明之第二分化階段中之神經系統細胞之細胞凝集體。又，藉由對該細胞之混合物進行黏著培養，可製造單層之細胞片，該細胞片亦為本發明之範疇。

V.醫藥組合物 本發明之細胞凝集體或者其混合物或黏著性細胞群作為用於罹患有需要神經細胞或者可分化為神經細胞之神經系統細胞之移植之疾病之患者之移植用醫藥組合物較有用，可用作伴有神經細胞之變性、損傷或者功能障礙之疾病之治療藥等醫藥。即，本發明之細胞凝集體或者黏著性細胞群、及包含作為醫藥而容許之載體之醫藥組合物亦為本發明之範疇。

作為需要神經細胞之移植之疾病、或伴有神經細胞之損傷或者功能障礙之疾病，例如可列舉：脊髄損傷、運動神經疾病、多發性硬化症、肌萎縮性側軸硬化症萎縮性側索硬化症、漢廷頓氏舞蹈病、多系統萎縮症、脊髄小腦變性症、阿茲海默症、視網膜色素變性症、老年黃斑變性、帕金森氏症候群，較佳為可列舉帕金森氏症。

作為本發明之一態樣，可列舉包含含有本發明之多巴胺產生神經前驅細胞之細胞凝集體或者其混合物或黏著性細胞群之帕金森氏症治療藥。該帕金森氏症治療劑中所含之多巴胺產生神經前驅細胞之細胞數只要移植片可於投予後存活，則並無特別限定，例如，每1次之移植可包含1.0×10⁴ 個以上。又，可根據症狀或軀體之大小適當進行增減而製備。多巴胺產生神經前驅細胞向疾病部位之移植例如可藉由如Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999)或者N Engl J Med.; 344: 710-9 (2001)中所記載之方法而進行。

作為醫藥而容許之載體只要為用以維持細胞之生存之物質，則可並無特別限定地使用業者所周知之物質。具體而言，可使用生理性之水性溶劑(生理鹽水、緩衝液、無血清、培養基等)。視需要亦可於移植醫療中，向包含移植之組織或細胞之醫藥中調配通常所使用之保存劑、穩定劑、還原劑、等張劑等。

本發明之醫藥組合物藉由使本發明之細胞凝集體或者其混合物、或黏著性細胞群懸浮於適當之生理性之水性溶劑中，可製造為細胞懸浮液。若需要則亦可添加冷凍保存劑進行冷凍保存，於使用時解凍並洗淨而用於移植。

VI.治療方法 作為本發明之一態樣，可列舉如下需要神經系統細胞之補充之疾病之治療方法，其包括向罹患有需要神經系統細胞之移植之疾病之患者移植本發明之細胞凝集體或者其混合物或黏著性細胞群之步驟。

作為本發明之一態樣，於本發明中所獲得之包含多巴胺產生神經前驅細胞之細胞凝集體或者其混合物或黏著性細胞群可製成製劑、具體而言，移植用製劑而向帕金森氏症患者投予。藉由使所獲得之多巴胺產生神經前驅細胞懸浮於生理鹽水等中，並向患者之多巴胺神經不足之區域、例如紋狀體移植而進行。

VII.移植 於移植時，可將本發明之細胞凝集體保存於為了維持該細胞凝集體之生存能力而所需之介質中。作為「為了維持生存能力而所需之介質」，可列舉培養基、生理學緩衝溶液等，只要包含多巴胺產生神經前驅細胞之細胞群生存，則並無特別限定，只要為業者則可適當選擇。作為一例，可列舉將於動物細胞之培養中通常所使用之培養基作為基礎培養基而製備之培養基。作為基礎培養基，例如可列舉：BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、GMEM培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、Neurobasal培養基、IMDM培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基、F-12培養基、DMEM/F12培養基、IMDM/F12培養基、Ham's培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基或該等之混合培養基等可用於動物細胞之培養之培養基。

此處，本說明書中之所謂「存活」係指所移植之細胞於活體內長時間(例：30天以上、60天以上、90天以上)生存，且黏著於器官內而留下。 本說明書中之所謂「功能性存活」係指移植之細胞存活，且於活體內發揮本來之功能之狀態。

本說明書中之所謂「功能性存活率」係指所移植之細胞之中，實現功能性存活之細胞之比率。所移植之多巴胺產生神經前驅細胞之功能性存活率例如可藉由移植片中之TH陽性細胞數之測量而求出。

藉由移植上述細胞凝集體，所移植之細胞(包含多巴胺產生神經前驅細胞及於移植後被誘導之多巴胺產生神經前驅細胞)之功能性存活率為0.1%以上，較佳為0.2%以上，進而較佳為0.4%以上，進而較佳為0.5%以上，進而較佳為0.6%以上。

於本說明書中，作為成為移植對象之哺乳動物，例如可列舉：人類、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、山羊、猴等，較佳為嚙齒類(例如小鼠、大鼠)或靈長類(例如人類、猴)，更佳為可列舉人類。 [實施例]

以下列舉實施例詳細地說明本發明，但本發明並不受到該等之任何限定。

(試驗1) ＜細胞及培養＞ 將用以將人類iPS細胞分化誘導為多巴胺產生神經前驅細胞之操作說明示於圖1。至分化誘導開始為止之擴大培養(day -7～0)、分化誘導開始至第12天為止(day 0～12)之第一分化階段、及分化誘導開始後第12天～28天(day 12～28)之第二分化階段中之培養條件分別係示於圖1。再者，分選係於分化誘導開始後第12天(day12)進行。

作為人類iPS細胞之QHJ-I01係作為利用游離型載體將Oct3/4、Sox2、Klf4、L-MYC、LIN28及p53之顯性負性體(Okita, K., et al. Stem Cells 31, 458-66, 2013)導入至人類PBMC中而獲得之細胞，由京都大學之山中教授等人收置。 藉由依據Miyazaki T et al., Nat Commun. 3: 1236, 2012之記載之方法培養該iPS細胞。即，簡潔而言，於利用Laminin511E8塗佈之6孔板上利用包含FGF2(bFGF)之未分化維持培養基(AK03N)，維持培養iPS細胞。

使用TrypLE CTS(Life Technologies)使維持培養iPS細胞而獲得之細胞群解離，於另外準備之利用Laminin511E8(iMatrix-511、Nippi)塗佈之6孔板上每1孔接種5×10⁶ 個，將培養基更換成分化培養基(分化誘導開始：第0天)。作為分化培養基，係於基本培養基A中添加10 μM Y-27632(WAKO)、0.1 μM LDN193189(STEMGENT)及0.5 μM A83-01(WAKO)而使用。再者，基本培養基A係含有8%KSR(Invitrogen)、1 mM丙酮酸鈉(Invitrogen)、0.1 mM MEM非必須胺基酸(Invitrogen)及0.1 mM 2-巰基乙醇(WAKO)之GMEM(Invitrogen)。次日(day 1)，將培養基更換成含有0.1 μM LDN193189、0.5 μM A83-01、2 μM 2,6,9-三元取代嘌呤(WAKO)及100 ng/mL FGF8(WAKO)之基本培養基A。2天後(day 3)，將培養基更換成含有0.1 μM LDN193189、0.5 μM A83-01、2 μM 2,6,9-三元取代嘌呤、100 ng/mL FGF8及3 μM CHIR99021(WAKO)之基本培養基A。4天後(day 7)，將培養基更換成含有0.1 μM LDN193189及3 μM CHIR99021之基本培養基A。於該等期間，培養基更換係1天進行一次。於分化誘導開始後第12天(day12)，實施使用抗Corin抗體之細胞分選。

＜分選預處理＞ 自利用含有0.1 μM LDN193189及3 μM CHIR99021之基本培養基A之培養起5天後，即於分化誘導開始後第12天(day12)，使用TrypLE CTS將細胞解離，並使之懸浮於含有2%FBS、30 μM Y-27632(WAKO)、20 mM D葡萄糖及50 μg/ml 青黴素/鏈黴素)之Ca2+Mg2+-free HBSS(Invitrogen)。添加上述抗Corin抗體，於4℃下培養20分鐘，進行螢光活化細胞分選(FACS)，回收Corin陽性細胞，並實施各種分析。 再者，抗Corin抗體係藉由以下之方法而製作。將食蟹獼猴Corin基因中之編碼細胞外區域之一部分(79-453胺基酸)之基因序列導入至293E細胞中，使之表現Corin蛋白質之細胞外區域片段並進行回收。於對小鼠免疫所回收之蛋白質後，取出淋巴細胞並使之與骨髓瘤細胞融合。自融合之細胞群中，選擇對Corin具有反應性之選殖。將該選殖之培養上清液作為抗Corin單株抗體並於實施螢光標記後使用。 ＜分選＞ 作為用於FACS之細胞分選儀，使用作為Stream-In-Air方式之機型之BD公司之FACSJazz(商標)、或作為微流路方式之機型之Cytonome公司之Gigasort。回收Corin陽性細胞，並實施各種分析。 於FACSJazz(商標)之情形時，分選條件為通常神經細胞之細胞分選中所使用之噴嘴徑100 μm，鞘壓力為29 PSI。又，於Gigasort之情形時，分選條件為製造商標準之流路內徑約200 μm，鞘壓力為14-20 PSI。

＜分選後之懸浮培養＞ 將所回收之Corin陽性細胞以20000個/孔轉移至PrimeSurface 96U板(SUMITOMO BAKELITE)，並使用添加有基本培養基B(B-27(商標) Supplement minus vitamin A(Invitrogen)、20 ng/mL BDNF(WAKO)、10 ng/mL GDNF(WAKO)、200 mM抗壞血酸(WAKO)及0.4 mM dbcAMP(Sigma)之Neurobasal(註冊商標)medium(Invitrogen))進行懸浮培養。此時，作為最初之培養基，使用添加有30 μM之Y-27632之培養基，於3天一次更換一半培養基時，係使用未添加Y-27632之培養基。自分選至16天後(分化誘導結束：day28)實施懸浮培養而對多巴胺產生神經前驅細胞進行分化誘導。將於該期間使用顯微鏡培養每4天進行懸浮培養細胞凝集體之拍攝所得之觀察像示於圖2。

於使用Jazz篩選出之群之細胞凝集體中，分化誘導開始後第16天至第28天(day 16～day 28)於懸浮培養細胞凝集體之大小方面未觀察到變化。對照性地，於使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體中，可知分化誘導開始後自第20天(day 20)附近起細胞凝集體之直徑增大。又，於第16天、第20天、第24天、及第28天，使用Jazz之細胞凝集體之死細胞、碎片、衛星點之細胞群均多於使用Gigasort之細胞凝集體。例如，關於使用Jazz之情形時之「day 16」左起第3個之凝集體，於細胞凝集體以外觀察到較小之黑色之粒(即衛星點之細胞群)、或包圍細胞凝集體之類的碎片。相對於此，於使用Gigasort之情形時，碎片及衛星點之細胞群顯著地較少。若對使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體進行觀察，則細胞凝集體之邊界線較清晰，未觀察到於使用Jazz篩選出之細胞凝集體之周圍觀察到之碎片層、或以衛星點狀存在之微細之細胞群之形成，可知存在於細胞凝集體之周圍之死細胞或死細胞之細胞群較少。進而，源自Gigasort之第24天以後之細胞凝集體之直徑為約450 μm～約600 μm，大於源自Jazz之細胞凝集體(外緣不清晰且除碎片部分以外之細胞凝集體之直徑為約350 μm～約400 μm)。

＜細胞數測量＞ 使用微吸管自96孔U底板將於第28天表1中所記載之數量之細胞凝集體連同培養基一併回收，並等待細胞凝集體因自重而沈澱。去除上清液培養基，添加PBS 1 mL，並等待細胞凝集體因自重而沈澱。去除上清液，添加神經細胞分散套組之酵素液1 mL並利用37℃水浴進行培養。每隔10分鐘進行移液，於培養開始起經過30分鐘之時刻提取細胞懸浮液10 μL，並與台盼藍(Thermo Fisher Scientific)10 μL混合而注入至血球計中。於顯微鏡下測量細胞數。將其結果示於表1之「酵素液中」之欄。又，算出台盼藍非陽性細胞數/總細胞數，並設為細胞之生存率。其次，添加神經細胞分散套組之分散液、去除液而進行離心。於去除上清液後，利用PBS 1 mL進行再懸浮，將10 μL與台盼藍(Thermo Fisher Scientific)10 μL混合而注入至血球計中。於顯微鏡下測量細胞數。將其結果示於表1之「洗淨後[血球計]」之欄。又，利用自動細胞計數器(chemometec，NC-200)測定再懸浮之樣品。將其結果示於表1之「洗淨後[NC-200]」之欄。

[表1]

如表1所示，可知，於任一種測定法中，使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體之每1個細胞凝集體之細胞數均為使用Jazz篩選出之群之細胞凝集體之約3倍。再者，細胞數測量時之生存率均為100%。

＜細胞形態測量＞ 於第28天使用微吸管自96孔U底板將48個細胞凝集體連同培養基一併回收，並轉移至6 cm低黏著皿(SUMITOMO BAKELITE)。使用數位顯微鏡(基恩士；VHX-5000)藉由透過照明對細胞凝集體進行拍攝，而獲得圖3之圖像。於視野內利用Gigasort篩選出之細胞之細胞凝集體為47個(B)，利用Jazz篩選出之細胞之細胞凝集體為48個(A)。

進行利用內置於數位顯微鏡之VHX-5000(Ver1.3.2.4)軟體取得之圖像之分析，並測定細胞凝集體之圓形度、最小直徑、周長、斐瑞特直徑(水平)、斐瑞特直徑(垂直)、斐瑞特直徑比、包絡度(面積)、最大直徑、包絡度(周長)、面積、及圓當量徑(圖4)。其中，將對圓當量徑、包絡度、面積、斐瑞特直徑比、圓形度，利用Jazz(淺灰色)與Gigasort(深灰色)進行比較所得之圖表示於圖4。又，根據所取得之資料計算標準偏差及變異係數(CV值)。CV值係示於圖5。

如圖3所示，可知，與使用Jazz篩選出之群之細胞凝集體相比，使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體視覺上亦較大。又，如圖4所示，使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體與使用Jazz篩選出之群之細胞凝集體相比，圓當量徑及面積較大，作為球形之周圍之平滑性之指標之表示缺口或突起之包絡度之不均明顯較小。

根據該等結果顯示，藉由使用Gigasort篩選細胞，可使更多之細胞損傷較少地生存，由其等細胞形成之細胞凝集體更大且接近真球，且為平滑之球形。

又，算出所測定之各參數之變異係數(CV值)，結果如圖5所示，使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體與使用Jazz篩選出之群之細胞凝集體相比，於大小(最小直徑、周長、斐瑞特直徑、斐瑞特直徑比、最大直徑、面積、及圓當量徑)、球形狀(圓形度)、表面之狀態(包絡度)等所有參數中CV值較小。即，可知，使用Gigasort篩選出之群之細胞凝集體之均一性較高。

＜流式細胞儀分析＞ 於第28天向用於細胞數測量而於酵素液添加後分散之細胞中，添加分散液及去除液進行離心。去除上清液，利用PBS進行再懸浮，並利用Live/Dead試劑(Thermo Fisher Scientific)、Foxa2(R＆D)/Alexa647-anti-goat(Thermo Fisher Scientific)、Alexa488-Tuj1(BD)、Alexa647-Oct3/4(BD)、FITC-TRA2-49(Millipore)、PerCP-Cy5.5-Sox1(BD)、Alexa647-Pax6(BD)、Alexa488-Ki67(BD)進行染色。使用流式細胞儀Gallios(Beckman Coulter)，算出FOXA2陽性且TUJ1陽性之細胞、FOXA2陽性細胞、或TUJ1陽性細胞相對於細胞懸浮液中所含之全部細胞之比率(表2)。於使用Jazz及Gigasort中之任一者之情形時，FOXA2及/或TUJ1標記物之陽性率均較高，又，作為多能性標記物之OCT3/4及/或TRA-2-49之陽性率較低。

[表2]

根據表2可知，於使用Gigasort篩選後進行了成熟培養之細胞中，與使用Jazz之細胞群相比，表現基因之陽性率亦為相同程度。

＜免疫染色＞ 於第28天使用微吸管自96孔U底板將10個細胞凝集體連同培養基一併回收，並等待細胞凝集體因自重而沈澱。去除上清液培養基，添加PBS 1 mL，並等待因自重而沈澱。去除上清液後，利用PFA(Paraformaldehyde，多聚甲醛)固定細胞凝集體，利用OCT化合物進行包埋及冷凍。繼而，使用低溫恆溫器(Leica)將細胞凝集體薄切為10 μm，並將切片貼附於載玻片。利用封閉緩衝液(2%正常驢血清、0.3%TritonX100/PBS)進行阻斷，利用抗Nurr1小鼠IgG(Immunoglobulin G，免疫球蛋白G)抗體(Perseus蛋白質組)、抗Foxa2山羊IgG抗體(R＆D systems)、及抗TH兔IgG抗體(Millipore)進行一次染色，並利用Alexa488標記抗小鼠抗體、Alexa594標記抗山羊抗體、Alexa647標記抗兔抗體、及DAPI(均為Thermo Fisher Scientific製造)進行二次染色。利用VECTASHIELD Hard set封入染色後之切片，並利用共聚聚焦顯微鏡(Olympus FV1200)進行觀察(圖6)。

於使用Gigasort篩選後進行了成熟培養之細胞中，與使用Jazz之細胞群相比，可知於標記物之表現量方面亦無較大之差。即，分化度為同等。 [產業上之可利用性]

本發明對再生醫療、尤其是帕金森氏症之治療較有用。

圖1表示用以將人類iPS細胞分化誘導為多巴胺產生神經前驅細胞之操作說明。 圖2係對使用Jazz或Gigasort進行分選之各細胞群，表示第二分化階段之懸浮培養時之第16、20、24、28天(day 16、day 20、day 24、day 28)之細胞凝集體顯微鏡觀察像(n＝3)。 圖3表示分化誘導開始後第28天(day 28)之細胞凝集體於數位顯微鏡下之形態觀察像。(A)表示Jazz之結果，(B)表示Gigasort之結果。 圖4表示對圖3中之各細胞凝集體，測定各圓當量徑(A)、包絡度(B)、面積(C)、斐瑞特直徑比(D)及圓形度(E)，並利用Jazz(淺灰色)與Gigasort(深灰色)進行比較所得之圖表。 圖5表示對圖3中之各細胞凝集體，分別測定各最小直徑、周長、斐瑞特直徑(水平)、斐瑞特直徑(垂直)、斐瑞特直徑比、包絡度(面積)、包絡度(周長)面積、最大直徑、圓形度、圓當量徑，算出變異係數(CV值)，並利用Jazz(淺灰色)與Gigasort(深灰色)進行比較所得之圖表。 圖6表示使用分化誘導開始後第28天(day 28)之抗FOXA2抗體、抗Nurr1抗體、抗TH抗體及DAPI(diamidino-phenyl-indole，二脒基苯基吲哚)所獲得之免疫染色像。

Claims (27)

1. 一種細胞凝集體，其包含FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞，且 包含1000個以上之細胞。
2. 如請求項1之細胞凝集體，其包含總細胞數之約70%以上之FOXA2陽性或TUJ1陽性之神經系統細胞。
3. 如請求項1或2之細胞凝集體，其於培養時可抑制細胞死亡。
4. 如請求項1至3中任一項之細胞凝集體，其進而具有選自以下之至少一個特徵： (a1)圓當量徑為100 μm～2000 μm、 (a2)包絡度為0.5以上、 (a3)斐瑞特直徑比為0.5以上、及 (a4)圓形度為0.3以上。
5. 如請求項1至4中任一項之細胞凝集體，其於表面不具有碎片層，且於顯微鏡下細胞凝集體之邊界線清晰。
6. 一種細胞凝集體之混合物，其為複數個細胞凝集體之混合物，且包含總細胞凝集體數之50%以上之如請求項1至5中任一項之細胞凝集體。
7. 如請求項6之細胞凝集體之混合物，其於選自由圓形度、最小直徑、最大直徑、垂直斐瑞特直徑或者水平斐瑞特直徑、斐瑞特直徑比、圓當量徑、周長、面積、及周長之包絡度或者面積之包絡度所組成之群中之指標中之1個以上之指標中，具有15%以下之變異係數。
8. 一種黏著性細胞群之混合物之製造方法，其具備： (1)於第一分化誘導因子存在下對複數個幹細胞進行分化誘導而獲得包含1個以上處於第一分化階段之神經前驅細胞之複數個細胞之步驟； (2)自步驟(1)中所獲得之複數個細胞中選擇性地分離處於第一分化階段之神經前驅細胞之步驟，且該步驟包括： 於液體介質之連續流動中，使於步驟(1)中所獲得之複數個細胞懸浮；及 識別處於第一分化階段之神經前驅細胞，並將處於第一分化階段之神經前驅細胞與並非此種神經前驅細胞之細胞以向各液體介質之連續流動進行流動之方式分離；以及 (3)於第二分化誘導因子存在下培養於步驟(2)中分離之處於第一分化階段之神經前驅細胞，而獲得黏著性細胞群之混合物之步驟，且 黏著性細胞群之混合物包含總黏著性細胞群數之50%以上之具有以下之(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群： (b1)包含處於第二分化階段之神經系統細胞、及 (b2)包含1000個以上之細胞。
9. 如請求項8之製造方法，其中具有(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群於培養時可抑制細胞死亡。
10. 如請求項9之製造方法，其中於將黏著性細胞群培養14～20天之情形時，培養結束時之細胞數為培養開始時之細胞數之5%以上。
11. 如請求項8至10中任一項之製造方法，其中黏著性細胞群之混合物為細胞凝集體之混合物。
12. 如請求項11之製造方法，其中黏著性細胞群為細胞凝集體，且具有上述(b1)及(b2)之特徵之細胞凝集體之圓當量徑為100 μm～2000 μm。
13. 如請求項12之製造方法，其中具有(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群為細胞凝集體，且進而具有以下之特徵： (b3)包絡度為0.5以上、 (b4)斐瑞特直徑比為0.5以上、及 (b5)圓形度為0.3以上。
14. 如請求項11至13中任一項之製造方法，其中細胞凝集體之混合物於選自由圓形度、最小直徑、最大直徑、垂直斐瑞特直徑或者水平斐瑞特直徑、斐瑞特直徑比、圓當量徑、周長、面積、及周長之包絡度或者面積之包絡度所組成之群中之指標中之1個以上之指標中，具有15%以下之變異係數。
15. 如請求項8至14中任一項之製造方法，其中於步驟(2)中，使用微流路方式細胞分選儀將處於第一分化階段之神經前驅細胞分離。
16. 如請求項8至15中任一項之製造方法，其中於步驟(2)中，將處於第一分化階段之神經前驅細胞於封閉系統中分離。
17. 如請求項8至16中任一項之製造方法，其中幹細胞為多能性幹細胞。
18. 如請求項8至17中任一項之製造方法，其中處於第一分化階段之神經前驅細胞係註定中腦底板命運之神經前驅細胞。
19. 如請求項18之製造方法，其中處於第一分化階段之神經前驅細胞為Corin及/或Lrtm1陽性之細胞。
20. 如請求項8至19中任一項之製造方法，其中處於第二分化階段之神經系統細胞係選自由TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及TH所組成之群中之標記物之至少1個為陽性之神經系統細胞。
21. 如請求項20之製造方法，其中處於第二分化階段之神經系統細胞為FOXA2陽性且TUJ1陽性之多巴胺產生神經前驅細胞。
22. 一種黏著性細胞群之混合物，其係藉由如請求項8至21中任一項之製造方法所獲得。
23. 一種黏著性細胞群之製造方法，其具備如下步驟： 自藉由如請求項8至21中任一項之製造方法所獲得之黏著性細胞群之混合物分離具有上述(b1)及(b2)之特徵之黏著性細胞群。
24. 一種黏著性細胞群，其係藉由如請求項23之製造方法所獲得。
25. 一種移植用醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之細胞凝集體、如請求項6或7之細胞凝集體之混合物、如請求項22之黏著性細胞群之混合物、或如請求項24之黏著性細胞群之任一種。
26. 一種需要補充神經系統細胞之疾病之治療劑，其包含如請求項1至5中任一項之細胞凝集體、如請求項6或7之細胞凝集體之混合物、如請求項22之黏著性細胞群之混合物、或如請求項24之黏著性細胞群之任一種。
27. 一種需要補充神經系統細胞之疾病之治療方法，其包括將如請求項1至5中任一項之細胞凝集體、如請求項6或7之細胞凝集體之混合物、如請求項22之黏著性細胞群之混合物、或如請求項24之黏著性細胞群之任一種移植至患者之中樞神經之步驟。

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