JPWO2019160148A5 - - Google Patents
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Claims (29)
- 1000個以上の細胞を含むこと、及びFOXA2陽性又はTUJ1陽性の神経系細胞を全細胞数の70%以上含むことを特徴とする細胞凝集体を、全細胞凝集体数の50%以上含む、細胞凝集体の混合物。
- 培養時に細胞死が抑制され得る、請求項1に記載の混合物。
- 細胞凝集体が、以下から選択される少なくとも一つの特徴を更に有する細胞凝集体である、請求項1又は2に記載の混合物:
(a1)円相当径が100μm~2000μmであること、
(a2)包絡度が0.5以上であること、
(a3)フェレ径比が0.5以上であること、及び
(a4)円形度が0.3以上であること。 - 細胞凝集体が、表面にデブリ層を有さず、顕微鏡下で細胞凝集体の境界線が明瞭な細胞凝集体である、請求項1~3のいずれか一項に記載の混合物。
- 円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選択される指標のうち1以上の指標において、15%以下の変動係数を有する、請求項1~4のいずれか一項に記載の混合物。
- 接着性細胞集団の混合物の培養時における細胞死を抑制する方法であって、
該接着性細胞集団の混合物を、以下の工程(1)~(3)を備える方法により製造することを含み、
接着性細胞集団の混合物は、神経系細胞を含み、1000個以上の細胞からなる接着性細胞集団の混合物である、方法:
(1)複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程;
(2)工程(1)で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離する工程であって、
液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び
第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程;並びに
(3)工程(2)で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程。 - 接着性細胞集団の混合物が細胞凝集体の混合物である、請求項6に記載の方法。
- 細胞凝集体の混合物が、請求項1~5のいずれか一項に記載の混合物である、請求項7に記載の方法。
- 接着性細胞集団の混合物の製造方法であって、
(1)複数の幹細胞を第一の分化誘導因子存在下で分化誘導し、第一分化段階にある神経前駆細胞を1以上含む複数の細胞を得る工程;
(2)工程(1)で得られた複数の細胞から第一分化段階にある神経前駆細胞を選択的に分離する工程であって、
液体媒体の連続的な流れの中に、工程(1)で得られた複数の細胞を浮遊させること、及び
第一分化段階にある神経前駆細胞を識別し、第一分化段階にある神経前駆細胞とそうでない細胞とを、別々の液体媒体の連続的な流れへ流れるように分離することを含む、工程;並びに
(3)工程(2)で分離された第一分化段階にある神経前駆細胞を第二の分化誘導因子存在下で培養して、接着性細胞集団の混合物を得る工程であって、
接着性細胞集団の混合物は、以下の(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を、全接着性細胞集団数の50%以上含む工程を備える、製造方法:
(b1)第二分化段階にある神経系細胞を含むこと、及び
(b2)1000個以上の細胞を含むこと。 - (b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団が、培養時に細胞死が抑制され得る接着性細胞集団である、請求項9に記載の製造方法。
- 接着性細胞集団を14~20日間培養した場合に、培養終了時における細胞数が、培養開始時における細胞数の10%以上である、請求項10に記載の製造方法。
- 接着性細胞集団の混合物が細胞凝集体の混合物である、請求項9~11のいずれか一項に記載の製造方法。
- (b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団が、(b1)及び(b2)の特徴を有する細胞凝集体であり、(b1)及び(b2)の特徴を有する細胞凝集体の円相当径が100μm~2000μmである、請求項12に記載の製造方法。
- (b1)及び(b2)の特徴を有する細胞凝集体が、以下の特徴を更に有する、請求項13に記載の製造方法:
(b3)包絡度が0.5以上であること
(b4)フェレ径比が0.5以上であること、及び
(b5)円形度が0.3以上であること。 - 細胞凝集体の混合物が、円形度、最小径、最大径、垂直フェレ径もしくは水平フェレ径、フェレ径比、円相当径、周囲長、面積、及び、周囲長の包絡度もしくは面積の包絡度からなる群より選ばれる指標のうち1以上の指標において、15%以下の変動係数を有する、請求項12~14のいずれか一項に記載の製造方法。
- 細胞凝集体の混合物が、請求項1~5のいずれか一項に記載の混合物である、請求項12に記載の製造方法。
- 工程(2)において、第一分化段階にある神経前駆細胞が、マイクロ流路方式セルソーターを用いて分離される、請求項9~16のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(2)において、第一分化段階にある神経前駆細胞が閉鎖系で分離される、請求項9~17のいずれか一項に記載の製造方法。
- 幹細胞が多能性幹細胞である、請求項9~18のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第一分化段階にある神経前駆細胞が、中脳底板へ運命づけられた神経前駆細胞である、請求項9~19のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第一分化段階にある神経前駆細胞が、Corin及び/又はLrtm1陽性の細胞である、請求項20に記載の製造方法。
- 第二分化段階にある神経系細胞が、TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PITX3、DAT、GIRK2及びTHからなる群より選ばれるマーカーの少なくとも1つについて陽性の神経系細胞である、請求項9~21のいずれか一項に記載の製造方法。
- 第二分化段階にある神経系細胞が、FOXA2陽性かつTUJ1陽性のドーパミン産生神経前駆細胞である、請求項22に記載の製造方法。
- 請求項9~23のいずれか一項に記載の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物。
- 接着性細胞集団の製造方法であって、
請求項9~23のいずれか一項に記載の製造方法により得られる接着性細胞集団の混合物から、(b1)及び(b2)の特徴を有する接着性細胞集団を分離する工程を備える、製造方法。 - 請求項25に記載の製造方法により得られる接着性細胞集団。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞凝集体の混合物、請求項24に記載の接着性細胞集団の混合物、又は請求項26に記載の接着性細胞集団のいずれかを含む、移植用医薬組成物。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞凝集体の混合物、請求項24に記載の接着性細胞集団の混合物、又は請求項26に記載の接着性細胞集団のいずれかを含む、神経系細胞の補充を必要とする疾患の治療剤。
- 疾患がパーキンソン病である、請求項28に記載の治療剤。
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