JP6937513B2 - 転写因子結合部位特異的なｄｎａ脱メチル化方法 - Google Patents
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Description
本発明は、部位特異的なDNA脱メチル化方法に関する。
DNAのメチル化は遺伝子発現を抑制するエピジェネティックな修飾であり、遺伝子発現のオン・オフを規定している。ゲノムDNA上のCpG部位での正しいDNAメチル化パターンは、発生、配偶子形成、及び体細胞分化において必須である。異常なDNAメチル化はしばしば細胞のがん化を引き起こすことが知られている。そのため近年では、DNAメチル化阻害剤などが抗がん剤として使用され始めている。例えば、DNAメチル化に異常があることが知られている骨髄異形成症候群（MDS）や急性骨髄性白血病（AML）に対し、DNAメチル化をターゲットとしたがん治療戦略が有効であることが分かってきており、DNAメチル化阻害剤であるアザシチジン（商品名ビダーザ）などが治療薬として一定の成果を上げている。しかし、従来のいわゆるエピゲノム薬は非特異的にエピゲノムに作用するため、しばしば深刻な副作用が生じる。さらに、その作用メカニズムが明らかではないため適応は限定的であり、現時点では固形がんへの治療には用いられていない。どの部位のメチル化異常ががんの発生に重要な役割を果たしているのかを明らかにすることができれば、新規の癌マーカーや効率的な治療薬の創薬ターゲットの探索に重要な知見を与えることが期待される。そのためには、部位特異的にDNA脱メチル化を誘導し、その効果を逆遺伝的に調べるアプローチが有効であると考えられる。しかし、部位特異的にDNA脱メチル化を誘導する技術はまだ確立されていない。
また、近年注目されている細胞リプログラミングではその効率の低さや不完全なリプログラミングが問題となっている。細胞リプログラミングにおいては、エピジェネティック因子の初期化がその効率増加や不完全さを回避するために重要である。実際、DNAメチル化阻害剤やヒストン脱アセチル化阻害剤での処理によってiPS細胞の作製効率が上がることが知られている（非特許文献１）。しかし、抗がん剤と同様に従来のそれら薬剤による処理は非特異的に働くため、DNAのどの部位がリプログラミング効率の向上に寄与しているのかは判明していない。
DNA脱メチル化の部位特異性を決定する因子として、NANOG、EBF1、SPI1（PU.1）、PPARγが同定されている（非特許文献２〜５）。また、チミンDNAグリコシラーゼ（TDG）をDNA結合ドメインであるNFκB由来Rel-ホモロジードメイン（RHD）に連結させた融合タンパク質を用いて部位特異的な脱メチル化に成功したという報告がある（非特許文献６）。また、TETタンパク質をTALEドメインと連結させた融合タンパク質を用いて部位特異的な脱メチル化に成功したという報告もある（非特許文献７）。しかしこれらの方法には、脱メチル化誘導効率が十分ではない、又は極めて限られた特定部位をターゲットとした脱メチル化しか誘導できないなどの問題がある。そのため、部位特異的な脱メチル化をより効率的に誘導可能な方法の開発が望まれている。
Theunissen, T.W. et al., (2011) Current Biology 21: p.65-71
Costa Y., et al., (2013) Nature 495: p.370-374
Guilhamon P., et al., (2013) Nature Communications 4: p.2166
de la Rica L., et al., (2013) Genome Biology 14: R99
Fujiki K., et al., (2013) Nature Communications 4: p.2262
Gregory D.J., et al., (2012) Epigenetics 7: p.344-349
Maeder M.L., et al., (2013) Nature Biotechnology 31: p.1137-1142
本発明は、部位特異的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、所定のスクリーニング方法により部位特異的なDNA脱メチル化を誘導できる転写因子を選抜できること、そのような転写因子を細胞中で過剰発現させることにより、転写因子結合部位特異的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導できること、さらにそのような転写因子をTET及びTDGと共に細胞中で過剰発現させることにより転写因子結合部位特異的なDNA脱メチル化をさらに増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] 部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を、細胞中で過剰発現させることを含む、細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強する方法。
[2] 前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、上記[1]に記載の方法。
[3] 前記転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させることを含む、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 前記転写因子が、RUNX1、RUNX3、CEBPA、CEBPB、MAFB、NR4A2、MYOD1、GATA2、及びTBX5からなる群から選択される、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] TET遺伝子がTET2遺伝子又はTET3遺伝子である、上記[3]に記載の方法。
[6] TET遺伝子が全長TETタンパク質又は酵素活性部位を含むその断片をコードする、上記[3]又は[5]に記載の方法。
[7] 転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させ、その細胞中のDNAにおいて脱メチル化された部位を同定し、同定された脱メチル化部位とその上流配列及び下流配列における転写因子結合モチーフの出現頻度分布をその脱メチル化部位からの距離を変数として求め、そこから、ランダムに選択されたメチレーション部位とその上流配列及び下流配列における転写因子結合モチーフの出現頻度分布を差し引き、得られるバックグラウンド補正された出現頻度分布が前記距離X＝0付近を頂点としたピークを形成する転写因子を選抜することを含む、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法。
[8] 転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させる、上記[7]に記載の方法。
[9] TET遺伝子が全長TETタンパク質又は酵素活性部位を含むその断片をコードする、上記[8]に記載の方法。
[10] メチル化アレイを用いたメチローム解析により、脱メチル化された部位を同定する、上記[7]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 細胞が哺乳動物細胞である、上記[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12] 哺乳動物細胞がヒト細胞である、上記[11]に記載の方法。
[13] 上記[7]〜[10]のいずれかに記載の方法によって得られる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子をプロモーターの制御下で導入した、形質転換細胞。
[14] 前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、上記[13]に記載の形質転換細胞。
[15] 上記[13]又は[14]に記載の形質転換細胞を被験物質の存在下で培養し、その細胞中のDNAのメチル化状態を評価し、被験物質不在下の細胞と比較したメチル化状態の変動を検出することを含む、被験物質の脱メチル化活性の測定方法。
[1] 部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を、細胞中で過剰発現させることを含む、細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強する方法。
[2] 前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、上記[1]に記載の方法。
[3] 前記転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させることを含む、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 前記転写因子が、RUNX1、RUNX3、CEBPA、CEBPB、MAFB、NR4A2、MYOD1、GATA2、及びTBX5からなる群から選択される、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5] TET遺伝子がTET2遺伝子又はTET3遺伝子である、上記[3]に記載の方法。
[6] TET遺伝子が全長TETタンパク質又は酵素活性部位を含むその断片をコードする、上記[3]又は[5]に記載の方法。
[7] 転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させ、その細胞中のDNAにおいて脱メチル化された部位を同定し、同定された脱メチル化部位とその上流配列及び下流配列における転写因子結合モチーフの出現頻度分布をその脱メチル化部位からの距離を変数として求め、そこから、ランダムに選択されたメチレーション部位とその上流配列及び下流配列における転写因子結合モチーフの出現頻度分布を差し引き、得られるバックグラウンド補正された出現頻度分布が前記距離X＝0付近を頂点としたピークを形成する転写因子を選抜することを含む、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法。
[8] 転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させる、上記[7]に記載の方法。
[9] TET遺伝子が全長TETタンパク質又は酵素活性部位を含むその断片をコードする、上記[8]に記載の方法。
[10] メチル化アレイを用いたメチローム解析により、脱メチル化された部位を同定する、上記[7]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 細胞が哺乳動物細胞である、上記[1]〜[10]のいずれかに記載の方法。
[12] 哺乳動物細胞がヒト細胞である、上記[11]に記載の方法。
[13] 上記[7]〜[10]のいずれかに記載の方法によって得られる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子をプロモーターの制御下で導入した、形質転換細胞。
[14] 前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、上記[13]に記載の形質転換細胞。
[15] 上記[13]又は[14]に記載の形質転換細胞を被験物質の存在下で培養し、その細胞中のDNAのメチル化状態を評価し、被験物質不在下の細胞と比較したメチル化状態の変動を検出することを含む、被験物質の脱メチル化活性の測定方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-180184号の開示内容を包含する。
本発明によれば、部位特異的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導することができる転写因子を選抜することができ、その転写因子を用いてDNAにおける部位特異的な脱メチル化を増強することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは、分化細胞から別の分化細胞を誘導するダイレクト・リプログラミングではスタート細胞のエピゲノムの状態が、ターゲット細胞への分化転換を阻害する可能性を示唆する知見を得ている。本発明者らは、単球で重要な働きをする転写因子を同定しそれを導入することによりヒト繊維芽細胞から単球様の機能をもつ細胞の誘導に成功したが、その単球様細胞は遺伝子発現が単球とは完全に一致せず、部分的に分化転換した細胞であることが明らかとなった（Suzuki T.,et al., (2012) PLoS ONE 7(3):e33474）。このことから、完全なダイレクト・リプログラミングを実施するためには、DNAの特定部位のエピゲノムを操作する必要が示唆された。しかし、そのような方法はこれまで知られていなかった。部位特異的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導することができる本発明の方法は、本発明者らによって初めて見出された。
DNAのエピジェネティックなメチル化は、DNA中のシトシン塩基のピリミジン環の5位のC（炭素原子）又はアデニン塩基のプリン環の6位のN（窒素原子）へのメチル基の付加反応である。DNA上のメチル化対象となる部位（メチレーション部位）は主としてCpG配列（CpG部位）であるが、CpA配列であることもある。DNAメチル化は遺伝子発現の抑制をもたらし、細胞内ではDNAメチル化や脱メチル化による遺伝子発現の調節が行われている。本発明は、ある種の転写因子を細胞内で過剰発現させた場合、細胞内のTETタンパク質及びTDGタンパク質と相互作用してDNA上の転写因子結合部位又はその近傍を標的とした能動的な脱メチル化を誘導し、結果として、その細胞中のDNAにおいて転写因子結合部位特異的な脱メチル化が増強されること、さらに、そのような転写因子とともにTETタンパク質及びTDGタンパク質を細胞内で過剰発現させると、細胞中のDNAにおいて転写因子結合部位特異的な脱メチル化がさらに増強されることに基本的には基づくものである。
１）部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法
本発明は、第１に、そのような部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法に関する。具体的には、転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させ、その細胞中のDNAにおいて脱メチル化されたメチレーション部位を同定し、同定された脱メチル化部位及びその近傍配列における転写因子結合モチーフの出現頻度のパターンに基づいて、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を選抜することにより、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングすることができる。
本発明は、第１に、そのような部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法に関する。具体的には、転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させ、その細胞中のDNAにおいて脱メチル化されたメチレーション部位を同定し、同定された脱メチル化部位及びその近傍配列における転写因子結合モチーフの出現頻度のパターンに基づいて、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を選抜することにより、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングすることができる。
本発明の転写因子のスクリーニング方法ではまた、転写因子をコードする遺伝子に加えて、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させてもよい。後述の実施例に示すとおり、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させると、転写因子結合部位又はその近傍を標的とした能動的なDNA脱メチル化の誘導が促進され、細胞中のDNAにおける脱メチル化がさらに増強され、結果として、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子の選別感度を向上させることができる。しかし、細胞においてTET遺伝子及びTDG遺伝子のいずれか一方又は両方が本発明の方法のために十分なレベルで発現されている場合は、これらの遺伝子の過剰発現は必ずしも必要ではない。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導するか否かを判定すべき任意の転写因子をコードする遺伝子を、本発明の転写因子のスクリーニング方法に供することができる。
一方、本発明においてTET遺伝子は、メチル化シトシンジオキシゲナーゼであるTET（ten-eleven translocation）タンパク質の全長、又は酵素活性部位を含むその断片をコードする遺伝子を指す。TETタンパク質（例えばTET1、TET2、及びTET3）はいずれも、5-メチルシトシン（5mC）を5-ヒドロキシメチルシトシン（5hmC）、5-ホルミルシトシン（5fC）、5-カルボキシシトシン（5caC）へと順次酸化することができる。TET遺伝子は、限定するものではないが、導入する細胞と同種又は近縁種の生物由来であることが好ましい。TET遺伝子は、限定するものではないが、哺乳動物由来、例えば、霊長類（好ましくはヒト）由来であることが好ましい。本発明で用いるTET遺伝子は、TET1遺伝子、TET2遺伝子又はTET3遺伝子であってよく、例えば、TET2遺伝子又はTET3遺伝子であってよい。TET1遺伝子、TET2遺伝子及びTET3遺伝子のmRNA配列及びそれにコードされるアミノ酸配列は、例えば、それぞれGenBankアクセッション番号NM_030625、NM_001127208.2、及びNM_001287491.1の下で入手できる。
本発明におけるTET1遺伝子は、例えば、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をはじめとするTET1タンパク質をコードする核酸であってよいし、その酵素活性部位（活性ドメイン）を含むTET1部分断片をコードする核酸であってもよい。本発明のTET1遺伝子はまた、配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５の部分配列であって1580位〜2052位（酵素活性部位）を含むアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、例えば1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは数個（1〜10個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。TET1遺伝子はまた、配列番号１５で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５の部分配列であって1580位〜2052位（酵素活性部位）を含むアミノ酸配列と、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上、99％以上、又は99.5％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。本発明で用いるTET1遺伝子はまた、配列番号１５で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号１４で示される塩基配列を含む核酸でもよい。TET1遺伝子はまた、配列番号１４で示される塩基配列、又は配列番号１４の部分配列であって4738位〜6156位（酵素活性部位に相当）を含む塩基配列と、70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは98％以上、99％以上、又は99.5％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつ酸化活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。一実施形態では、上記のTET1遺伝子にコードされるタンパク質は、配列番号１５の1580位〜2052位のアミノ酸配列を保持することが好ましく、すなわち1580位〜2052位の当該アミノ酸配列内に欠失、置換又は付加を有しないことが好ましい。一実施形態では、TET1遺伝子は、配列番号１４の4738位〜6156位の塩基配列を保持することが好ましく、すなわち4738位〜6156位の当該塩基配列内に欠失、置換又は付加を有しないことが好ましい。TET1部分断片をコードするTET1遺伝子には、限定するものではないが、例えば、酵素活性部位のアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端にタンパク質タグや他の追加配列が付加されたアミノ酸配列をコードする核酸が包含される。TET1部分断片をコードするTET1遺伝子の例としては、配列番号４９で示される塩基配列からなる核酸、又は配列番号５０で示されるアミノ酸配列をコードする核酸が挙げられる。TET1部分断片をコードするTET1遺伝子は、一実施形態では、1419〜3000塩基長、例えば、1419〜2220塩基長であってよい。一実施形態では、TET1部分断片をコードするTET1遺伝子はまた、473〜1000アミノ酸長、例えば、473〜740アミノ酸長のアミノ酸配列をコードするものであってよい。
本発明におけるTET2遺伝子については、上記TET1遺伝子に関する説明における配列番号１５を配列番号１７に、その1580位〜2052位（酵素活性部位）を1290位〜1905位（酵素活性部位）に、配列番号１４を配列番号１６に、その4738位〜6156位（酵素活性部位に相当）を3868位〜5715位（酵素活性部位に相当）にそれぞれ置き換えて同様に説明することができる。
本発明におけるTET3遺伝子については、上記TET1遺伝子に関する説明における配列番号１５を配列番号１９に、その1580位〜2052位（酵素活性部位）を985位〜1697位（酵素活性部位）に、配列番号１４を配列番号１８に、その4738位〜6156位（酵素活性部位に相当）を2953位〜5091位（酵素活性部位に相当）にそれぞれ置き換えて同様に説明することができる。
本発明において、TDG遺伝子は、チミンDNAグリコシラーゼ（TDG）タンパク質の全長をコードする遺伝子、又は酵素活性部位を含むその断片をコードする遺伝子を指す。TDGは、ミスマッチ部位の不対塩基を除去するDNAグリコシラーゼ活性により、DNA中のG/Tミスマッチ部位のチミンをシトシンへと塩基除去修復し、また5fCや5caCをシトシンへと塩基除去修復する。TDG遺伝子は、限定するものではないが、導入する細胞と同種又は近縁種の生物由来であることが好ましい。TDG遺伝子は、限定するものではないが、哺乳動物由来、例えば、霊長類（好ましくはヒト）由来であることが好ましい。
本発明におけるTDG遺伝子は、例えば、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をはじめとするTDGタンパク質をコードするものであってよい。本発明のTDG遺伝子は、配列番号２３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、例えば1〜50個、より好ましくは1〜20個、さらに好ましくは数個（1〜10個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつDNAグリコシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。そのような核酸としては、限定するものではないが、例えば、TDGタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端にタンパク質タグや他の追加配列が付加されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。TDG遺伝子はまた、配列番号２３で示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつDNAグリコシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。本発明で用いるTDG遺伝子はまた、配列番号２３で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号２２で示される塩基配列を含むものでもよい。TDG遺伝子はまた、配列番号２２で示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつDNAグリコシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。
本発明において「遺伝子」とは、限定するものではないが、ゲノムDNA、cDNA、及び修飾塩基を一部に含むDNA等のDNA、又はRNAであり得る。本発明において「遺伝子」は、典型的には開始コドン及び終止コドンを含むコーディング配列（CDS）を含む核酸断片であるが、目的の遺伝子産物（タンパク質等）が生成されるように細胞内に導入される限り、開始コドン及び／又は終止コドンを含まなくてもよい。本発明において「遺伝子」はまた、非翻訳領域（UTR）、プロモーター、ターミネーターなどをさらに含んでもよい。
転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の細胞中での過剰発現は、任意の方法により誘導すればよい。本発明において、遺伝子の「過剰発現」とは、過剰発現を誘導していない細胞（野生型細胞）と比較して当該遺伝子の発現量を有意に増加させることを意味する。典型的には、転写因子をコードする遺伝子を、プロモーターの制御下で細胞に導入することにより、当該遺伝子を細胞中で過剰発現させることができる。またTET遺伝子を、プロモーターの制御下で細胞に導入することにより、細胞中で過剰発現させることができる。またTDG遺伝子を、プロモーターの制御下で細胞に導入することにより、細胞中で過剰発現させることができる。
転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の細胞への導入は、プロモーターの制御下に当該遺伝子を含むベクター（発現ベクター）を用いて常法により行うことができる。遺伝子導入する細胞において遺伝子発現を誘導可能な任意のプロモーターを用いることができ、そのようなプロモーターは、過剰発現プロモーターであることが好ましく、例えば、構成的（恒常的）な発現を誘導する構成的プロモーター、特定の因子の刺激により一過性の発現を誘導する誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター等であってよいが、これらに限定されない。プロモーターの例として、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、CAプロモーター、EF-1αプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
プロモーターの制御下に転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を含むベクターは、ウイルスベクター又はプラスミドベクターであり得る。転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子は、プロモーターの下流に配置されることが好ましい。転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞内で共発現させる場合は、それぞれの遺伝子が別個のベクターに含まれていてもよいし、導入された細胞内でそれぞれの遺伝子の発現が誘導される限り、２つ又は３つの遺伝子が１つのベクターに同時に含まれていてもよい。後者の場合、遺伝子と遺伝子の間にはIRES（internal ribosomal entry site; 内部リボソーム進入部位）が含まれることが好ましい。IRESとしては、以下に限定するものではないが、例えば脳心筋炎ウイルス（ECMV）、口蹄疫ウイルス（FMDV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）等のウイルス由来のIRESが挙げられる。
例えば、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及びTDG遺伝子のうち１つ以上を含む核酸増幅断片を、制限酵素処理後にプラスミドベクター中のプロモーター下流の任意のクローニングサイトに挿入及び連結することにより、当該遺伝子をプロモーターの制御下に含むベクターを作製することができる。あるいは、Gateway（登録商標）技術を用いて、当該遺伝子を含むエントリークローン（組換えベクター）から発現ベクターへと、それら遺伝子を単独で又は組み合わせてクローニングすることにより、当該遺伝子をプロモーターの制御下に含むベクターを作製することもできる。本発明において遺伝子を「プロモーターの制御下に含む」とは、典型的にはプロモーターによる遺伝子発現誘導が可能な範囲内のプロモーターの下流に遺伝子が配置されることを意味する。
ベクターは、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子とともに、選択マーカー遺伝子及び／又はリポーター遺伝子を含んでもよい。選択マーカー遺伝子としては、限定するものではないが、例えば、グルホシネート耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、バンコマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。リポーター遺伝子としては、蛍光タンパク質コード遺伝子（GFP遺伝子、Venus遺伝子、YFP遺伝子、RFP遺伝子、CFP遺伝子、BFP遺伝子等）、ルシフェラーゼ遺伝子、lacZ等が挙げられる。
本発明では、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子をプロモーターの制御下に含むウイルスベクターも、細胞への遺伝子導入に好適に用いることができる。本発明において、「ウイルスベクター」とは、細胞に感染することにより、保持する目的の遺伝子を細胞に導入する能力を有する、ウイルス粒子（偽型ウイルス等のウイルス様粒子を包含する）である。偽型ウイルスとは、異種ウイルス由来エンベロープ成分を含むエンベロープを有するようにパッケージングされたウイルス粒子である。ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターであってよい。ウイルスベクターは、市販の様々なウイルスベクター作製キットを用いて当業者であれば容易に作製することができる。例えば、導入遺伝子（転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子）、パッケージングに必要なウイルス構造遺伝子（gag、pol、rev等）、及び偽型化のための水泡性口内炎ウイルス（Vesicular Stomatitis Virus; VSVG）由来エンベロープG糖タンパク質（VSV-G）をコードする遺伝子をプロモーターの制御下に含む単一の又は別個の発現ベクターを、宿主細胞（例えば、293T細胞）にトランスフェクションし、一定時間（例えば12時間〜60時間、好ましくは24時間〜48時間）培養した後、生成した偽型ウイルス粒子を含む培養上清を回収することにより、プロモーターの制御下に転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を含むレンチウイルスベクターを作製することができる。一実施形態では、導入遺伝子を含む自己不活化（self inactivating; SIN）レンチウイルスプラスミドベクター、ウイルス（例えばHIV）構造タンパク質gag及びpolを発現するがアクセサリー遺伝子及び調節遺伝子は削除されているパッケージングベクター、及び偽型化のためのVSV-G及びRevを発現するプラスミドベクターを宿主細胞（例えば、293T細胞）にトランスフェクションし、培養し、生成した偽型ウイルス粒子を含む培養上清を回収することにより、レンチウイルスベクターを作製することができる。得られた培養上清は（例えば0.45μmフィルターで）ろ過し、ろ液を遠心分離（例えば、50,000 x g、2時間）にかけ、上清を廃棄してペレット化したウイルス粒子を回収し、適当な溶液、例えば、生理的等張緩衝塩溶液（Hank's Balanced Salt Solution; HBSS）中に再懸濁することが好ましい。このようにして得られたウイルス粒子をレンチウイルスベクターとして細胞への遺伝子導入用に用いることができる。
本発明では、細胞に、転写因子をコードする遺伝子をプロモーターの制御下に含む発現ベクターを導入し、その導入遺伝子を発現させることにより、細胞内での当該遺伝子の過剰発現を引き起こすことができ、それによりその細胞中でのDNAの転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強することができる。
本発明ではまた、細胞に、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子をプロモーターの制御下に含む単一の又は別個の発現ベクターを導入し、それらの導入遺伝子を発現させることにより、細胞内での当該遺伝子の過剰発現を引き起こすことができ、それによりその細胞中でのDNAの転写因子結合部位特異的な脱メチル化をさらに増強することができる。
上記遺伝子を導入する細胞（宿主細胞）は、特に限定されないが、上記遺伝子と同種又は近縁種由来（例えば上記遺伝子がヒト由来であればヒト又は霊長類由来の細胞）であることが好ましい。上記遺伝子を導入する細胞は、任意の生物由来であってよいが、動物由来、特に哺乳動物由来であることが好ましく、例えばヒト、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、ラット、マウス、モルモット、ハムスター等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギ等に由来する細胞が挙げられる。細胞は、任意の組織又は臓器由来であってよく、例として、骨髄、血液、筋肉、皮膚、精巣、卵巣、脳、脂肪組織、消化管、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、粘膜等に由来するものが挙げられる。上記遺伝子を導入する細胞の好ましい例として、上皮細胞（例えば、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞293T）が挙げられる。上記遺伝子を導入する細胞の別の好ましい例として、造血系細胞が挙げられる。本発明において造血系細胞とは、造血幹細胞及び造血幹細胞から生成される血液系細胞（特に有核細胞）を指し、例えば、造血幹細胞、巨核球、白血球、例えば、リンパ球（T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞等）、単球、樹状細胞、マクロファージ、及び顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）等、並びにそれらの前駆細胞などを包含する。本発明に係る造血系細胞は、CD34+造血幹細胞／前駆細胞、CD14+単球、末梢血単核細胞（PBMC）等であってもよい。上記遺伝子を導入する細胞は、生体から採取した細胞であってもよいし、生体から採取した細胞から樹立した細胞株であってもよい。上記遺伝子を導入する細胞は、外来遺伝子が予め導入された細胞であってもよい。上記遺伝子を導入する細胞は培養細胞であってもよい。上記遺伝子を導入する細胞は、癌細胞であってもよいし、万能細胞（ES細胞、iPS細胞等）や幹細胞であってもよい。レンチウイルスベクター以外のベクターを用いる場合には、増殖期の細胞を用いることが好ましい。
細胞への遺伝子導入は、転写因子をコードする遺伝子をプロモーターの制御下に含むウイルスベクターを細胞に感染させることにより、又は、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子をプロモーターの制御下に含む単一の又は別個のウイルスベクターを細胞に感染させることにより、引き起こすことができる。ウイルスベクターの細胞への感染の際には、遺伝子導入促進剤、例えばポリブレン、レトロネクチン等を使用することも好ましい。
あるいは細胞への遺伝子導入は、転写因子をコードする遺伝子をプロモーターの制御下に含むウイルスベクター、又は、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子をプロモーターの制御下に含む単一の若しくは別個の発現プラスミドベクターを細胞に物理的又は化学的手法により導入することにより、実施してもよい。細胞へのプラスミドベクターの導入は、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（PEG）法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、プロトプラスト融合法等の任意の方法を用いて行うことができる。
遺伝子導入により得られた、プロモーターの制御下にある転写因子をコードする遺伝子を保持する細胞は、当該プロモーターの活性により当該遺伝子を発現することができる。また、遺伝子導入により得られた、プロモーターの制御下にある転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を保持する細胞は、当該プロモーターの活性によりそれら遺伝子を発現することができる。構成的プロモーターを用いた場合には、単に細胞を培養することにより、導入遺伝子の恒常的な発現を誘導することができ、その結果、導入遺伝子を（野生型細胞と比較して）過剰発現させることができる。誘導性プロモーターを用いた場合には、プロモーター活性の誘導因子の存在下で細胞を培養することにより、導入遺伝子の一過性発現を誘導することができ、その結果、導入遺伝子を一過性に（野生型細胞と比較して）過剰発現することができる。導入遺伝子を発現している細胞は、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の機能に基づいて常法により選択することができる。本発明は、そのようにして得られる、転写因子をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞、及び、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子が導入された形質転換細胞も提供する。なおウイルスベクター等の感染を介して外来遺伝子が導入された細胞を形質導入細胞と呼ぶことがある。
転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞に導入して共発現させる場合、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の細胞への導入は、同時に行ってもよいし、逐次行ってもよい。例えば、TET遺伝子を含むベクターとTDG遺伝子を含むベクターを細胞に導入し、形質転換細胞を選択した後、得られた形質転換細胞に転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを導入することにより、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及びTDG遺伝子を同じ細胞に導入してもよい。あるいは、転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及びTDG遺伝子をそれぞれ含む別個のベクター中の選択マーカー遺伝子が同一である場合には、それら３種のベクターを同時に細胞に感染させて同じ条件で選択を行ってもよい。
以上のようにして作製された、転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞では、細胞中のDNAの脱メチル化が増強される。また転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞では、細胞中のDNA（ゲノムDNA又は染色体外DNA）の脱メチル化がさらに増強される。それらの細胞では、特に、導入した転写因子が認識及び結合するDNA部位（転写因子結合部位）に特異的な脱メチル化がより高頻度に誘導される。本発明において、転写因子結合部位に特異的な（部位特異的な）脱メチル化は、転写因子結合部位の近傍、具体的には転写因子結合部位を中心として約500bp幅（±250bp）の領域内、好ましくは約400bp幅（±200bp）の領域内に存在するメチレーション部位（典型的にはCpG部位）が脱メチル化されることを指す。転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞、並びに、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞では、転写因子結合部位特異的な脱メチル化以外の脱メチル化も生じてもよいが、転写因子結合部位特異的な脱メチル化の割合を顕著に増加させることができる。これは過剰発現した転写因子が、転写因子結合部位特異的な脱メチル化を強力に誘導するためである。
本発明では、転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞、並びに転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞における脱メチル化された部位及びその近傍における転写因子結合モチーフの出現頻度のパターンに基づいて、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を選抜することができる。
転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞、並びに転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞において脱メチル化された部位は、当業者に公知の任意のメチル化解析技術を用いて同定することができる。まず、転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞におけるメチレーション部位（典型的にはCpG部位）のメチル化状態を、転写因子をコードする遺伝子を過剰発現しない細胞（野生型細胞）におけるメチレーション部位のメチル化状態と比較し、有意にメチル化が低減した（又は、脱メチル化が増加した）メチレーション部位を、部位特異的な脱メチル化部位と判定することができる。あるいは、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞におけるメチレーション部位のメチル化状態を、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現するが転写因子をコードする遺伝子を過剰発現しない細胞におけるメチレーション部位のメチル化状態と比較して、有意にメチル化が低減した（又は、脱メチル化が増加した）メチレーション部位を、部位特異的な脱メチル化部位と判定することができる。本明細書において脱メチル化の「増強」とは、上記のように転写因子をコードする遺伝子の過剰発現が存在しない場合に比較してメチレーション部位のメチル化が低減する（又は、脱メチル化が増加する）ことを指す。メチル化状態（メチル化プロファイル）の検出及び脱メチル化部位の同定は、メチル化アレイを用いたメチローム解析及び／又はバイサルファイトシークエンス法により実施することができる。メチル化アレイとは、DNA上のメチレーション部位を検出するためのプローブが固定されたアレイ（ビーズ、マイクロアレイ等）である。メチローム解析とは、メチル化状態のゲノムワイドな（ゲノム上の広範囲な）網羅的解析を意味する。様々なメチローム解析用メチル化アレイが市販されており、本発明において好適に用いることができる。メチル化アレイを用いたメチローム解析は、用いるメチル化アレイにより様々な手法で行うことができる。また、バイサルファイトシークエンス法でDNA上のメチレーション部位の塩基配列を調べることにより、脱メチル化部位を同定することもできる。メチル化アレイを用いたメチローム解析及びバイサルファイトシークエンス法は市販のメチル化アレイ及びキット、メチル化検出キット等を用いて実施することができ、具体的な実験手順については後述の実施例も参照することができる。
続いて、細胞中のゲノムDNA上で同定された脱メチル化部位とその上流配列及び下流配列（例えば、脱メチル化部位を位置0として上流及び下流に±10kbp以下、好ましくは±5kbp以下）の領域における転写因子結合モチーフの出現頻度を調べる。具体的には、まず、転写因子結合配列データベース、例えばJASPAR（http://jaspar.genereg.net/）、TRANSFAC（http://www.gene-regulation.com/index2.html）、Genomatix等を用いて、前記領域について、過剰発現させた転写因子の転写因子結合モチーフを検索すればよい。一方、ランダムに、好ましくはゲノムワイドに選択されたメチレーション部位とその上流配列及び下流配列（例えば、メチレーション部位を位置0として上流及び下流に±10kbp以下、好ましくは±5kbp以下であり、上記の脱メチル化部位の場合と好ましくは同じ長さである）の領域における転写因子結合モチーフの出現頻度も求める。一定長（例えば50bp〜100bp）ずつスライドさせた配列内の転写因子結合モチーフの出現回数（出現頻度）に基づいて、ランダム選択したメチレーション部位とその近傍（上流配列及び下流配列）での一定長配列内の転写因子結合モチーフの出現回数をλとする以下の式：
で表される出現確率分布（ピアソン分布）モデルに基づいて、脱メチル化部位から同距離にある一定長の転写因子結合モチーフの出現確率を求める。ここで出現確率分布のピーク（出現頻度が有意に増加した位置）が脱メチル化部位と重なることを確認することが好ましい。本発明では「脱メチル化部位と重なる」とは、出現確率分布のピークが例えば脱メチル化部位から±500bpの距離内に位置することをいう。さらに、脱メチル化部位とその近傍（上流配列及び下流配列）における各転写因子結合モチーフの位置を中心とするカーネル関数（正規分布、均等化等）を足し合わせた混合分布から、ランダム選択したメチレーション部位とその近傍（上流配列及び下流配列）における転写因子結合モチーフの位置を中心とするカーネル関数（正規分布、均等化等）を足し合わせた混合分布を差し引いた混合頻度分布を得る。このようにして得られた混合頻度分布が、バックグラウンド補正された出現頻度分布に相当する。得られた混合頻度分布が脱メチル化部位からの距離（X）＝0付近を頂点としたピークを形成するかどうかを判定し、そのようなピークを形成する転写因子を選抜する。得られた混合頻度分布が脱メチル化部位からの距離（X）＝0付近を頂点としたピークを形成する場合、過剰発現させた転写因子を、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子の有力な候補として選抜できる。なお本発明において、脱メチル化部位からの距離（X）＝0「付近」とは、脱メチル化部位から±100bpの範囲を指す。さらに、得られた混合頻度分布において、混合頻度分布のピークの最大値（最大頻度）が、得られた混合頻度分布全体の四分位範囲×3＋第3四分位の値を超えることを確認することにより、過剰発現させた転写因子が、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子であることをさらに確実に同定することができる。選抜された転写因子については、転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させるか、又は、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させて、バイサルファイトシークエンス法等により、転写因子結合部位特異的な脱メチル化の誘導が生じていることを確認することが好ましい。本発明は、このような転写因子の選抜により、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法を提供する。
２）転写因子結合部位特異的なDNA脱メチル化の増強方法
上記のスクリーニングにより選抜される転写因子は、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することができる。そして、上記のようなスクリーニング方法により得られる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を用いれば、細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強することができる。本発明はそのような部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を、細胞中で過剰発現させ、それにより転写因子結合部位又はその近傍を標的とした能動的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導し、その結果として細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強する方法も提供する。
上記のスクリーニングにより選抜される転写因子は、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することができる。そして、上記のようなスクリーニング方法により得られる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を用いれば、細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強することができる。本発明はそのような部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を、細胞中で過剰発現させ、それにより転写因子結合部位又はその近傍を標的とした能動的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導し、その結果として細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強する方法も提供する。
この本発明の脱メチル化増強方法では、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子と共に細胞中で過剰発現させることにより、転写因子結合部位又はその近傍を標的とした能動的なDNA脱メチル化の誘導を促進し、その結果、細胞中のDNAの部位特異的な脱メチル化をさらに増強することもできる。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の過剰発現は、任意の方法により誘導すればよい。これらの遺伝子の「過剰発現」は、スクリーニング方法について上述したとおりである。典型的には、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、又は転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を、プロモーターの制御下で細胞に導入することにより、それらの遺伝子を細胞中で過剰発現させることができる。遺伝子の細胞への導入についても、スクリーニング方法について上述したのと同じである。
本発明で用いる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子は細胞分化にはたらく因子であってよく、一例として造血系転写因子が挙げられる。本発明において造血系転写因子とは、造血幹細胞の維持や血球細胞の分化に働く転写因子をいう。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子は、以下に限定するものではないが、RUNX（Runt-related transcription factor）ファミリー、MYOD（Myogenic differentiation）ファミリー、C/EBP（CCAAT/enhancer binding protein）ファミリー、GATA（GATA binding protein）ファミリー、MAF（v-maf avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog）ファミリー、NR4A（nuclear receptor subfamily 4, group A）ファミリー（例えば、NR4A2）、及びTBX（T-box）ファミリー（例えば、TBX5）等の転写因子であり得る。RUNXファミリーの転写因子の例としては、RUNX1、RUNX2及びRUNX3が挙げられる。C/EBPファミリーの転写因子の例としては、CEBPA、CEBPB、CEBPG、CEBPD、CEBPE及びCEBPZが挙げられる。MAFファミリーの転写因子の例としてはMAFが挙げられる。NR4Aファミリーの転写因子の例としては、NR4A1、NR4A2及びNR4A3が挙げられる。MYODファミリーの転写因子の例としては、MYOD、MYRF、MYF5、MYOG及びMYF6が挙げられる。GATAファミリーの転写因子の例としては、GATA1、GATA2、GATA3、GATA4、GATA5及びGATA6が挙げられる。TBXファミリーの転写因子の例としては、TBX1〜TBX6、TBX10、TBX15、及びTBX18等が挙げられる。本発明で用いる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子の例としては、例えば、RUNX1、RUNX3、CEBPA、CEBPB、MAFB、NR4A2、MYOD1、GATA2、及びTBX5が挙げられる。また、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子の別の例として、engrailed（EN）ファミリー、HANDファミリー、IRFファミリー、FOXDファミリー、FOXOファミリー、TALファミリー、TCFファミリー、NFE2Lファミリー、ELFファミリー、NFATCファミリー、HLFファミリー、NFIL3ファミリー、AP1ファミリー、BRCAファミリー、SPIファミリーの転写因子も挙げられる。本発明において部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子は、公知のアミノ酸配列に変異を有していてもよいが、DNA結合ドメイン及び脱メチル化活性を保持する。
本発明において部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を、転写因子が結合する転写因子結合モチーフで規定することもできる。本発明では、部位特異的なDNA脱メチル化の誘導／増強、及びそれによる細胞分化の促進等のために、後述の実施例で示されるような転写因子結合モチーフに結合する任意の転写因子を使用することができる。本発明の一実施形態では、限定するものではないが、例えば、iPS細胞（iPSC）から造血前駆細胞（HPC）への分化の促進のために転写因子結合モチーフHand1::Tcfe2a、IRF1、FOXD1、FOXO3、IRF2、TAL1::TCF3、NFE2L2、ELF5、NFATC2、BRCA1、RUNX1、SPI1及びSPIBからなる群より選択されるモチーフに結合する任意の転写因子を使用することができ；HPCから単球（MON）への分化の促進のために転写因子結合モチーフELF5、NFATC2、HLF、NFIL3、AP1、BRCA1、RUNX1、SPI1及びSPIBからなる群より選択されるモチーフに結合する任意の転写因子を使用することができ；HPCからB細胞（BC）への分化の促進のために転写因子結合モチーフIRF1及びELF5からなる群より選択されるモチーフに結合する任意の転写因子を使用することができ；そしてHPCからT細胞（TC）への分化の促進のために転写因子結合モチーフEn1、NR4A2、Hand1::Tcfe2a、IRF1、BRCA1、RUNX1、SPI1及びSPIBからなる群より選択されるモチーフに結合する任意の転写因子を使用することができる。これらのモチーフに結合する転写因子は当業者に公知であり、下記の表９に例示されている。
転写因子をコードする遺伝子は、限定するものではないが、導入する細胞と同種又は近縁種由来（例えば、導入する細胞がヒトであればヒト又は霊長類由来の遺伝子）であることが好ましい。転写因子をコードする遺伝子は、限定するものではないが、哺乳動物由来、例えば、霊長類（好ましくはヒト）由来であることが好ましい。
RUNX1遺伝子は、典型的には、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるRUNX1タンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるRUNX1遺伝子はまた、配列番号１２で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号１１で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のRUNX1遺伝子は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列の47位〜184位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号１３）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号Q01196で得られる情報に基づく。
RUNX3遺伝子は、典型的には、配列番号２９で示されるアミノ酸配列からなるRUNX3タンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるRUNX3遺伝子はまた、配列番号２９で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号２８で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のRUNX3遺伝子は、配列番号２９で示されるアミノ酸配列の52位〜188位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号３０）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号Q13761で得られる情報に基づく。
MYOD1遺伝子は、典型的には、配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるMYOD1タンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるMYOD1遺伝子はまた、配列番号３２で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号３１で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のMYOD1遺伝子は、配列番号３２で示されるアミノ酸配列の100位〜170位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号３３）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号P15172で得られる情報に基づく。
CEBPA遺伝子は、典型的には、配列番号３５で示されるアミノ酸配列からなるCEBPAタンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるCEBPA遺伝子はまた、配列番号３５で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号３４で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のCEBPA遺伝子は、配列番号３５で示されるアミノ酸配列の280位〜345位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号３６）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号P49715で得られる情報に基づく。
CEBPB遺伝子は、典型的には、配列番号３８で示されるアミノ酸配列からなるCEBPBタンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるCEBPB遺伝子はまた、配列番号３８で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号３７で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のCEBPB遺伝子は、配列番号３８で示されるアミノ酸配列の269位〜334位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号３９）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号P17676で得られる情報に基づく。
GATA2遺伝子は、典型的には、配列番号４１で示されるアミノ酸配列からなるGATA2タンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるGATA2遺伝子はまた、配列番号４１で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号４０で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のGATA2遺伝子は、配列番号４１で示されるアミノ酸配列の289位〜401位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号４２）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号P23769で得られる情報に基づく。
MAFB遺伝子は、典型的には、配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるMAFBタンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるMAFB遺伝子はまた、配列番号４４で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号４３で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のMAFB遺伝子は、配列番号４４で示されるアミノ酸配列の211位〜301位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号４５）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号Q9Y5Q3で得られる情報に基づく。
NR4A2遺伝子は、典型的には、配列番号４７で示されるアミノ酸配列からなるNR4A2タンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるNR4A2遺伝子はまた、配列番号４７で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号４６で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のNR4A2遺伝子は、配列番号４７で示されるアミノ酸配列の260位〜335位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号４８）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号P43354で得られる情報に基づく。
TBX5遺伝子は、典型的には、配列番号７３で示されるアミノ酸配列からなるTBX5タンパク質をコードするものでありうる。本発明で用いるTBX5遺伝子はまた、配列番号７３で示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号７２で示される塩基配列を含むものでもよい。本発明のTBX5遺伝子は、配列番号７３で示されるアミノ酸配列の53位〜237位に位置するDNA結合ドメインの配列（配列番号７４）を保持しているタンパク質をコードすることが好ましい。DNA結合ドメインの位置はInterProデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）のアクセッション番号Q99593で得られる情報に基づく。
本発明で用いるRUNX1遺伝子、RUNX3遺伝子、MYOD1遺伝子、CEBPA遺伝子、CEBPB遺伝子、GATA2遺伝子、MAFB遺伝子、NR4A2遺伝子、又はTBX5遺伝子はまた、それぞれ、配列番号１２、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、又は配列番号７３で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、例えば1〜50個、好ましくは1〜20個、より好ましくは数個（1〜10個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつDNA結合活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。そのようなDNAとしては、限定するものではないが、例えば、配列番号１２、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、又は配列番号７２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端又はカルボキシ末端にタンパク質タグが付加されたアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられる。RUNX1遺伝子、RUNX3遺伝子、MYOD1遺伝子、CEBPA遺伝子、CEBPB遺伝子、GATA2遺伝子、MAFB遺伝子、NR4A2遺伝子、又はTBX5遺伝子はまた、それぞれ、配列番号１２、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４７、又は配列番号７３で示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつDNA結合活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。RUNX1遺伝子、RUNX3遺伝子、MYOD1遺伝子、CEBPA遺伝子、CEBPB遺伝子、GATA2遺伝子、MAFB遺伝子、NR4A2遺伝子、又はTBX5遺伝子はまた、それぞれ、配列番号１１、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４６、又は配列番号７２で示される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、かつDNA結合活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。これらの遺伝子にコードされる転写因子はまた、脱メチル化活性を有する。
TET遺伝子及びTDG遺伝子は、上記スクリーニング方法に関して記載したものと同じである。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の細胞中での過剰発現は、上記スクリーニング方法に関して記載したのと同様に、任意の方法により誘導すればよい。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の細胞への導入は、プロモーターの制御下に当該遺伝子を含むベクター（発現ベクター）を用いて常法により行うことができる。
本発明ではまた、細胞に、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子をプロモーターの制御下に含む単一の又は別個の発現ベクターを導入し、その導入遺伝子を発現させることにより、細胞内での当該遺伝子の過剰発現を引き起こすことができ、それによりその細胞中でのDNAの転写因子結合部位特異的な脱メチル化をさらに増強することができる。
用いるプロモーター、ベクター、細胞、細胞への遺伝子導入方法は、上記スクリーニング方法に関して記載したものと同じである。
遺伝子導入により得られた、プロモーターの制御下にある上記転写因子をコードする遺伝子を保持する細胞は、当該プロモーターの活性により当該遺伝子を発現することができる。また、遺伝子導入により得られた、プロモーターの制御下にある上記転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を保持する細胞は、当該プロモーターの活性によりそれら遺伝子を発現することができる。構成的プロモーターを用いた場合には、単に細胞を培養することにより、それら遺伝子の恒常的な発現を誘導することができ、その結果、それら遺伝子を（野生型細胞と比較して）過剰発現させることができる。誘導性プロモーターを用いた場合には、プロモーター活性の誘導因子の存在下で細胞を培養することにより、それら遺伝子の一過性発現を誘導することができ、その結果、それら遺伝子を一過性に（野生型細胞と比較して）過剰発現することができる。導入遺伝子を発現している細胞は、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の機能に基づいて常法により選択することができる。本発明は、そのようにして得られる、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子が導入された形質転換細胞、及び、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子が導入された形質転換細胞も提供する。なおウイルスベクター等の感染を介して外来遺伝子が導入された細胞を形質導入細胞と呼ぶことがある。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞に導入して共発現させる場合、その転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の細胞への導入は、同時に行ってもよいし、逐次行ってもよい。例えば、TET遺伝子を含むベクターとTDG遺伝子を含むベクターを細胞に導入し、形質転換細胞を選択した後、得られた形質転換細胞に上記転写因子をコードする遺伝子を含むベクターを導入することにより、上記転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及びTDG遺伝子を同じ細胞に導入してもよい。あるいは、上記転写因子をコードする遺伝子、TET遺伝子及びTDG遺伝子をそれぞれ含む別個のベクター中の選択マーカー遺伝子が同一である場合には、それら３種のベクターを同時に細胞に感染させて同じ条件で選択を行ってもよい。
以上のようにして作製された、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞では、細胞中のDNAの脱メチル化が増強される。また部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞では、細胞中のDNA（ゲノムDNA又は染色体外DNA）の脱メチル化がさらに増強される。それらの細胞では、特に、導入した転写因子が認識及び結合するDNA部位（転写因子結合部位）に特異的な脱メチル化が高頻度に誘導される。本発明において、転写因子結合部位に特異的な（部位特異的な）脱メチル化とは、転写因子結合部位を中心として約500bp幅の領域内、好ましくは約400bp幅（±200bp）の領域内に存在するメチレーション部位（典型的にはCpG部位）が脱メチル化されることを意味する。上記転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞、並びに上記転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞では、転写因子結合部位特異的な脱メチル化以外の脱メチル化も生じてもよいが、転写因子結合部位特異的な脱メチル化の割合を顕著に増加させることができる。これは過剰発現した転写因子が、転写因子結合部位特異的な脱メチル化を強力に誘導するためである。好ましい実施形態では、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子をTET遺伝子及びTDG遺伝子とともに細胞で過剰発現させることにより、細胞中のDNAの転写因子結合部位特異的に、メチル化部位を、以下に限定するものではないが、例えば10％以上、より好ましくは20％以上、特に好ましくは50％以上低減することができる。
DNA中の転写因子結合部位は、例えば、Cloverプログラム（Frith et al., (2004) Nucleic Acids Res., 32: p.1372-1381）、及びJASPAR COREデータベース（ver. 2009）を用いて、あるいはTRANSFAC（http://www.gene-regulation.com/index2.html）、Genomatix等を用いて、容易に同定することができる。
例えば、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子がRUNX1遺伝子の場合、DNA配列中のRUNX1結合モチーフは、A(0.1435, 0.1170, 0.0615, 0.0285, 0.0000, 0.0435, 0.0000, 0.0085, 0.0050, 0.0655, 0.2500), C(0.2480, 0.2425, 0.5360, 0.0000, 0.0375, 0.0635, 0.0000, 0.0210, 0.2000, 0.2315, 0.0790), G(0.3480, 0.2335, 0.0745, 0.0035, 0.9360, 0.0350, 0.9935, 0.9240, 0.1255, 0.0405, 0.1445), T(0.2605, 0.4070, 0.3280, 0.9680, 0.0265, 0.8580, 0.0065, 0.0465, 0.6695, 0.6625 0.526 5)で表される位置特異的重み行列で表され、特定のDNA配列について算出されたスコアが6以上となる場合に、当該DNA配列を候補RUNX1結合部位として同定することができる。
部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞や、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞において脱メチル化されるDNA部位は、メチル化アレイ解析及び／又はバイサルファイトシークエンス法により同定することができる。より具体的には、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を過剰発現する細胞におけるメチレーション部位（典型的にはCpG部位）のメチル化状態を、上記転写因子をコードする遺伝子を過剰発現しない細胞（野生型細胞）におけるメチレーション部位のメチル化状態と比較し、有意にメチル化が低減した（又は、脱メチル化が増加した）メチレーション部位を、部位特異的な脱メチル化部位と判定することができる。あるいは、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現する細胞におけるメチレーション部位（典型的にはCpG部位）のメチル化状態を、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現するが上記転写因子をコードする遺伝子を過剰発現しない細胞におけるメチレーション部位（典型的にはCpG部位）のメチル化状態と比較して、有意にメチル化が低減した（又は、脱メチル化が増加した）メチレーション部位を、部位特異的な脱メチル化部位と判定することができる。メチル化状態（メチル化プロファイル）の検出及び脱メチル化部位の同定は、メチル化アレイ解析及び／又はバイサルファイトシークエンス法により実施することができる。メチル化アレイ解析で脱メチル化部位として同定されたメチレーション部位についてバイサルファイトシークエンス法で塩基配列を調べることにより、脱メチル化をさらに確認することもできる。メチル化アレイ解析及びバイサルファイトシークエンス法は市販のメチル化解析アレイ及びキット、メチル化検出キット等を用いて実施することができ、具体的な実験手順については後述の実施例も参照することができる。RUNX1遺伝子、TET遺伝子及びTDG遺伝子を過剰発現する細胞において脱メチル化されるDNA部位（CpG）の例を、後掲の表１及び表２に示す。
以上のようにして部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させることにより、細胞中のDNAの部位特異的な脱メチル化を増強することができる。また、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させることにより、細胞中のDNAの部位特異的な脱メチル化をさらに増強することができる。この系は、転写因子結合部位特異的な脱メチル化の増強に基づく遺伝子発現の変化を細胞にもたらすことから、DNA脱メチル化の機能を調べるための研究ツールとして有利に用いることができる。
この系はまた、造血系細胞におけるDNA脱メチル化を増強し、血液細胞の分化を促進するために用いることもできる。特に万能細胞（ESC、iPS細胞など）や造血幹細胞又は造血前駆細胞において転写因子をコードする遺伝子を過剰発現させるか、又は、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現させることにより、造血系遺伝子を活性化し（すなわち遺伝子のプロモーター領域における発現抑制を解除して遺伝子発現を誘導し）、当該細胞の造血系への運命決定を強く促すことができる。過剰発現させる転写因子コード遺伝子としては、以下に限定するものではないが、例えば、engrailed（EN）ファミリー、NR4Aファミリー、HANDファミリー、IRFファミリー、FOXDファミリー、FOXOファミリー、TALファミリー、TCFファミリー、NFE2Lファミリー、ELFファミリー、NFATCファミリー、HLFファミリー、NFIL3ファミリー、AP1ファミリー、BRCAファミリー、RUNXファミリー、SPIファミリーの転写因子をコードするものが挙げられる。
この系はまた、転写因子結合部位特異的な脱メチル化に影響を及ぼす薬剤（脱メチル化調節剤）のスクリーニングに有利に用いることができる。そのようなスクリーニング方法では、転写因子をコードする遺伝子を過剰発現させた細胞、又は、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現させた細胞を、被験物質（好ましくは脱メチル化調節剤の候補となり得る物質）の存在下で培養することにより被験物質で処理し、処理したその細胞中のDNAのメチル化状態を評価し、被験物質不在下の細胞と比較したメチル化状態の変動を検出すればよい。コントロールとしては、それぞれ、転写因子をコードする遺伝子を細胞中で過剰発現させた細胞、又は、転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を細胞中で過剰発現させた細胞を、被験物質の不在下で培養し、細胞中のDNAのメチル化状態を評価すればよい。ここでDNAのメチル化状態の評価とは、メチル化レベル（メチル化されたメチレーション部位（CpG部位等）の数、相対量又は割合）の測定、又はメチル化されたメチレーション部位（CpG部位等）又はその分布の特定等の任意のメチル化指標等の評価であってよいが、これらに限定されない。被験物質で処理した細胞のDNAメチル化レベルが、被験物質で処理しなかった細胞のDNAメチル化レベルと比較して有意に増加した場合、その被験物質を、当該転写因子結合部位特異的な脱メチル化を抑制する作用を有する脱メチル化調節剤（脱メチル化抑制剤）として同定することができる。あるいは、被験物質で処理した細胞のDNAメチル化レベルが、被験物質で処理しなかった細胞のDNAメチル化レベルと比較して有意に低下した場合、その被験物質を、その転写因子結合部位特異的な脱メチル化をさらに増強する作用を有する脱メチル化調節剤（脱メチル化増強剤）として同定することができる。あるいは、被験物質で処理した細胞においてメチル化された特定部位が、被験物質で処理しなかった細胞において脱メチル化された場合には、その被験物質を、その特定部位での脱メチル化を促進する作用を有する脱メチル化調節剤（脱メチル化促進剤）として同定することもできる。このような脱メチル化調節剤のスクリーニング方法は、メチル化又は脱メチル化の異常に起因する疾患の治療・予防薬候補物質の探索のために有用である。本スクリーニング方法に適用する被験物質は、特に限定されないが、例えば、低分子又は高分子の有機化合物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、siRNAやshRNA等の核酸分子、無機化合物等が挙げられる。被験物質はまた、抗がん剤等の既知の薬剤であってもよい。また、このスクリーニング方法と同様の手順を用いて、被験物質の脱メチル化活性を検出することもできる。ここで、被験物質の「脱メチル化活性」とは、DNA中のメチレーション部位の脱メチル化を促進する活性を意味する。転写因子をコードする遺伝子を過剰発現させた細胞、又は転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を過剰発現させた細胞を、被験物質の存在下で培養することにより被験物質で処理し、処理したその細胞中のDNAのメチル化状態を評価し、被験物質不在下の細胞と比較したメチル化状態の変動を検出することにより、被験物質の脱メチル化活性を検出することができる。そのDNAのメチル化状態の評価において、被験物質で処理した細胞のDNAメチル化レベルが、被験物質で処理しなかった細胞のDNAメチル化レベルと比較して有意に低下した場合、被験物質の脱メチル化活性が検出されたものと判定することができ、その脱メチル化活性は、測定されたメチル化低下レベルを指標として表すことができる。一方、DNAのメチル化状態の評価において、被験物質で処理した細胞のDNAメチル化レベルが、被験物質で処理しなかった細胞のDNAメチル化レベルと比較して有意な変化がない又は有意に増加した場合、被験物質の脱メチル化活性は検出されなかったものと判定することができる。したがって本発明は、このような被験物質の脱メチル化活性の検出方法も提供する。この方法に適用する被験物質やDNAのメチル化状態の評価方法は上記脱メチル化調節剤のスクリーニング方法と同じである。
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
以下の実施例において用いる293T細胞は理化学研究所バイオリソースセンター（理研BRC）（日本）から入手した。293T細胞は、ポリ-D-リシンコートした培養プレート（Beckton Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA）中、10％ウシ胎仔血清、ペニシリン及びストレプトマイシン（それぞれ最終濃度100 U/mL、100 μg/mL; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Osaka, Japan）で培養したものを用いた。
［実施例１］RUNX1過剰発現細胞の構築
１）プラスミドベクターの構築
理研BRCの三好浩之博士から譲渡された第三世代自己不活化（self inactivating; SIN）レンチウイルスプラスミドベクターCSII-EF-RfAに転写因子遺伝子RUNX1と抗生物質耐性遺伝子をクローン化した発現ベクターを作製した。具体的には、抗生物質耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号YP_009062988）及びピューロマイシン耐性遺伝子（RefSeq proteinアクセッション番号YP_006732174）を、ベクターpIREShyg3及びpIRESpuro3（Clontech）から、それぞれプライマーペアhyg（フォワード: 5'-AATATGGCCACAACCGCGGCCGCGACTCTAGAT-3'（配列番号１）及びリバース: 5'-TAGAGTCGCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGG-3'（配列番号２））、又はプライマーペアpuro（フォワード: 5'-AATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCACG-3'（配列番号３）及びリバース: 5'-TAGAGTCGCGGCCGCTCAGGCACCGGGCTTGCG-3'（配列番号４））を用いてKOD-plus DNAポリメラーゼ（Toyobo Co）により増幅した。得られたPCR産物をそれぞれ線状化pIRES2プラスミドDNAにIn-Fusion（登録商標）クローニング技術（Clontech）を用いて挿入及び連結し、組換えプラスミドpIRES2-hyg及びpIRES2-puroを作製した。なお線状化pIRES2プラスミドDNAは、pIRES2-DsRed-Express2（Clontech）のDsRed-Express2配列を除く全長配列をフォワードプライマー 5'-GCGGCCGCGACTCTAGATCATAATC-3'（配列番号５）及びリバースプライマー 5'-GGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3'（配列番号６）を用いて増幅することにより作製した。
１）プラスミドベクターの構築
理研BRCの三好浩之博士から譲渡された第三世代自己不活化（self inactivating; SIN）レンチウイルスプラスミドベクターCSII-EF-RfAに転写因子遺伝子RUNX1と抗生物質耐性遺伝子をクローン化した発現ベクターを作製した。具体的には、抗生物質耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号YP_009062988）及びピューロマイシン耐性遺伝子（RefSeq proteinアクセッション番号YP_006732174）を、ベクターpIREShyg3及びpIRESpuro3（Clontech）から、それぞれプライマーペアhyg（フォワード: 5'-AATATGGCCACAACCGCGGCCGCGACTCTAGAT-3'（配列番号１）及びリバース: 5'-TAGAGTCGCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGG-3'（配列番号２））、又はプライマーペアpuro（フォワード: 5'-AATATGGCCACAACCATGACCGAGTACAAGCCCACG-3'（配列番号３）及びリバース: 5'-TAGAGTCGCGGCCGCTCAGGCACCGGGCTTGCG-3'（配列番号４））を用いてKOD-plus DNAポリメラーゼ（Toyobo Co）により増幅した。得られたPCR産物をそれぞれ線状化pIRES2プラスミドDNAにIn-Fusion（登録商標）クローニング技術（Clontech）を用いて挿入及び連結し、組換えプラスミドpIRES2-hyg及びpIRES2-puroを作製した。なお線状化pIRES2プラスミドDNAは、pIRES2-DsRed-Express2（Clontech）のDsRed-Express2配列を除く全長配列をフォワードプライマー 5'-GCGGCCGCGACTCTAGATCATAATC-3'（配列番号５）及びリバースプライマー 5'-GGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3'（配列番号６）を用いて増幅することにより作製した。
得られたプラスミドpIRES2-hyg及びpIRES2-puroから、それぞれIRES2-hyg用プライマーペア（フォワード: 5'-CCGCGGATCCTCTAGGCCCCTCTCCCTCCCCCC-3'（配列番号７）、リバース: 5'-CGATGTTAACTCTAGCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTG-3'（配列番号８））又は IRES-puro用プライマーペア（フォワード: 5'-CCGCGGATCCTCTAGGCCCCTCTCCCTCCCCCC-3'（配列番号９）及びリバース: 5'-CGATGTTAACTCTAGTCAGGCACCGGGCTTGCGGGT-3'（配列番号１０））を用いて、IRES2-hyg断片及びIRES2-puro断片を増幅させた。これら断片を、SINレンチウイルスプラスミドベクターCSII-EF-RfAのXbaI部位に挿入してそれぞれプラスミドベクターCSII-EF-RfA-IRES2-hyg及びCSII-EF-RfA-IRES2-puroを作製した。
得られたレンチウイルスプラスミドベクターCSII-EF-RfA-IRES2-puroに、転写因子RUNX1（配列番号１２）をコードするヒト遺伝子（RUNX1遺伝子；配列番号１１）のGateway（登録商標）エントリークローンからGateway技術のLR反応によりRUNX1遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子の両方をEF-1αプロモーターの制御下で構成的に発現可能なプラスミドベクターRUNX1-PuroRを作製した。
同様に、上記で作製したCSII-EF-RfA-IRES2-hygに、ヒトTET2遺伝子（配列番号１６；コードされるアミノ酸配列を配列番号１７に示す；GenBankアクセッション番号NP_001120680）又はヒトTET3遺伝子（配列番号１８；コードされるアミノ酸配列を配列番号１９に示す；GenBankアクセッション番号NP_001274420）のGateway（登録商標）エントリークローン（Thermo Scientific, Gene Copoiea）からGateway技術のLR反応により、TET2遺伝子又はTET3遺伝子とブラストサイジン耐性遺伝子の両方をEF1αプロモーターの制御下で構成的に発現可能なプラスミドベクターTET2-HygR及びTET3-HygRを作製した。
また、CSII-EF-RfA中にブラストサイジン耐性遺伝子（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号XP_002849617）をクローン化したプラスミドベクターとして、上記と同様の方法で以前に作製したCSII-EF-RfA-IRES2-Bsd（Suzuki et al., PLos ONE, (2012) Vol.7, (3) e33474）を用意した。なおブラストサイジン耐性遺伝子は、ベクターpCMV-Bsd（Life Technologies）から、プライマーペア（フォワード: 5'-AATATGGCCACAACCATGGCCAAGCCTTTGTCTCAAGAAG-3'（配列番号２０）及びリバース: 5'-TAGAGTCGCGGCCGCTTAGCCCTCCCACACATAACCAG-3'（配列番号２１））を用いてKOD-plus DNAポリメラーゼ（Toyobo Co）を使用したPCR法により増幅されたものである。このCSII-EF-RfA-IRES2-Bsdに、ヒトTDG遺伝子（配列番号２２；コードされるアミノ酸配列を配列番号２３に示す；GenBankアクセッション番号NP_003202）のGateway（登録商標）エントリークローン（Thermo Scientific）からGateway技術のLR反応によりTDG遺伝子とブラストサイジン耐性遺伝子の両方をEF1αプロモーターの制御下で構成的に発現可能なプラスミドベクターTDG-BsdRを作製した。
さらに、理研BRCの三好浩之博士から譲渡されたプラスミドベクターCSII-EF-RfA-IRES2-Venusに、RUNX1遺伝子のGateway（登録商標）エントリークローンからGateway技術のLR反応により、RUNX1遺伝子とVenus遺伝子の両方をEF1αプロモーターの制御下で構成的に発現可能なプラスミドベクターRUNX1-Venusを作製した。
以上のプラスミドベクターの概略図を図１に示す。
２）レンチウイルスベクター（偽型ウイルス粒子）の作製
レンチウイルスベクターの作製はSuzuki et al., PLos ONE, (2012) Vol.7, (3) e33474に記載の方法に従って行った。簡単に説明すると、293T細胞（4 x 106細胞）をポリ-D-リシンでコートした10cmディッシュ（Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA）にトランスフェクションの24時間前に播種した。トランスフェクションの１時間前に培地を5％ウシ胎仔血清と25μM クロロキンを添加した新鮮培地（ペニシリン及びストレプトマイシンをそれぞれ最終濃度100 U/mL、100 μg/mLで添加したOpti-MEM（Thermo Fisher Scientific Inc.））に交換した。上記で作製したRUNX1遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含むレンチウイルス発現プラスミドベクターRUNX1-PuroRを、パッケージングプラスミドpCMV-VSV-G-RSV-Rev及びpCAG-HIVgp（いずれも理研BRCの三好浩之博士から譲渡）と共に、Fugene（登録商標） HDトランスフェクション試薬（Promega Corp., Madison, WI, USA）を用いて293T細胞へとトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、培地を新鮮培地Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific Inc.）に交換した。培地交換の24時間後及び48時間後にパッケージングされた偽型レンチウイルス粒子を含有する上清を回収した。取得した上清（偽型ウイルス原液）を0.45μmシリンジフィルター（NIPPON Genetics Co. Ltd, Tokyo, Japan）を用いてろ過し、20℃で2時間、50,000 x g（Beckman SW28ローターで19400 rpm）にて遠心分離した。ペレット化偽型ウイルス粒子（レンチウイルスベクターRUNX1-puroVP）を100μl HBSS中に再懸濁し、-80℃で保存した。
レンチウイルスベクターの作製はSuzuki et al., PLos ONE, (2012) Vol.7, (3) e33474に記載の方法に従って行った。簡単に説明すると、293T細胞（4 x 106細胞）をポリ-D-リシンでコートした10cmディッシュ（Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA）にトランスフェクションの24時間前に播種した。トランスフェクションの１時間前に培地を5％ウシ胎仔血清と25μM クロロキンを添加した新鮮培地（ペニシリン及びストレプトマイシンをそれぞれ最終濃度100 U/mL、100 μg/mLで添加したOpti-MEM（Thermo Fisher Scientific Inc.））に交換した。上記で作製したRUNX1遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を含むレンチウイルス発現プラスミドベクターRUNX1-PuroRを、パッケージングプラスミドpCMV-VSV-G-RSV-Rev及びpCAG-HIVgp（いずれも理研BRCの三好浩之博士から譲渡）と共に、Fugene（登録商標） HDトランスフェクション試薬（Promega Corp., Madison, WI, USA）を用いて293T細胞へとトランスフェクションした。トランスフェクションの24時間後、培地を新鮮培地Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific Inc.）に交換した。培地交換の24時間後及び48時間後にパッケージングされた偽型レンチウイルス粒子を含有する上清を回収した。取得した上清（偽型ウイルス原液）を0.45μmシリンジフィルター（NIPPON Genetics Co. Ltd, Tokyo, Japan）を用いてろ過し、20℃で2時間、50,000 x g（Beckman SW28ローターで19400 rpm）にて遠心分離した。ペレット化偽型ウイルス粒子（レンチウイルスベクターRUNX1-puroVP）を100μl HBSS中に再懸濁し、-80℃で保存した。
上記２）で作製した他のレンチウイルス発現プラスミドベクターTET2/TET3-HygR、TDG-BsdR、及びRUNX1-Venusについても、上記と同様にパッケージングプラスミドと共に293T細胞へとトランスフェクションし、培養後に得られた上清からパッケージングされた偽型ウイルス粒子を取得し、保存した。得られたレンチウイルスベクターをそれぞれTET2-hygVP、TDG-bsdVP、及びRUNX1-venusVPと名付けた。
３）レンチウイルスベクターを用いた細胞への形質導入
293T細胞（1 x 105細胞）を、ポリ-D-リシンでコートした6ウェル培養ディッシュ（Becton, Dickinson and Co.）にレンチウイルス感染の１日前に播種した。上記で作製したレンチウイルスベクターRUNX1-puroVP、又は空ベクターを、8μg/mLポリブレンを用いて1 MOI（Multiplicity Of Infection）で293T細胞に感染させ、形質導入することにより、293T-RUNX1細胞及び293T-mock細胞をそれぞれ作製した（図２Ａ）。形質導入細胞は2μg/mLのピューロマイシンを添加した培地で7日間培養することにより選択した（図２Ａ）。なお空ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むがRUNX1遺伝子を含まない点以外は上記と同じレンチウイルス発現プラスミドベクターを、上記パッケージングプラスミドと共に293T細胞へとトランスフェクションして得られたレンチウイルスベクター（偽型ウイルス粒子）である。得られた293T-RUNX1細胞はRUNX1を構成的（恒常的）に過剰発現する。
293T細胞（1 x 105細胞）を、ポリ-D-リシンでコートした6ウェル培養ディッシュ（Becton, Dickinson and Co.）にレンチウイルス感染の１日前に播種した。上記で作製したレンチウイルスベクターRUNX1-puroVP、又は空ベクターを、8μg/mLポリブレンを用いて1 MOI（Multiplicity Of Infection）で293T細胞に感染させ、形質導入することにより、293T-RUNX1細胞及び293T-mock細胞をそれぞれ作製した（図２Ａ）。形質導入細胞は2μg/mLのピューロマイシンを添加した培地で7日間培養することにより選択した（図２Ａ）。なお空ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むがRUNX1遺伝子を含まない点以外は上記と同じレンチウイルス発現プラスミドベクターを、上記パッケージングプラスミドと共に293T細胞へとトランスフェクションして得られたレンチウイルスベクター（偽型ウイルス粒子）である。得られた293T-RUNX1細胞はRUNX1を構成的（恒常的）に過剰発現する。
同様に、上記で作製したレンチウイルスベクターTET2-hygVP又はTET3-hygVP、及びレンチウイルスベクターTDG-BsdVPの双方を、8μg/mLポリブレンを用いて1 MOI（Multiplicity Of Infection）で293T細胞に感染させ、形質導入することにより293T-TET2-TDG細胞及び293T-TET3-TDG細胞をそれぞれ作製した（図２Ｂ）。形質導入細胞は、ハイグロマイシン（最終濃度100μg/mL）及びブラストサイジン（最終濃度20μg/mL）の存在下で７日間培養することにより選択した（図２Ｂ）。得られた293T-TET2-TDG細胞及び293T-TET3-TDG細胞はTET2又はTET3とTDGとを構成的（恒常的）に過剰発現する。
さらに、上記で作製したRUNX1遺伝子とVenus遺伝子とを含むレンチウイルスベクター（RUNX1-Venusレンチウイルスベクター）を、8μg/mLポリブレンを用いて1 MOIで、上記で作製した293T-TET2-TDG細胞又は293T-TET3-TDG細胞に感染させ、形質導入することにより293T-TET2-TDG-RUNX1細胞及び293T-TET3-TDG-RUNX1細胞をそれぞれ作製した（図２Ｂ）。形質導入細胞は、感染処理の７日後に、SORP FACSAriaTMIIセルソーター（Becton, Dickinson and Co.）を用いてVenusの蛍光を利用したFACS（登録商標）ソーティングにより、Venus陽性細胞を純化した（図２Ｂ）。
このようにして、導入遺伝子を構成的（恒常的）に発現（過剰発現）する形質導入細胞を作製した。
［実施例２］メチル化アレイ解析
実施例１で作製した形質導入細胞について、Infinium（登録商標） HumanMethylation450 BeadsChip array（Illumina Inc.）を使用してゲノムワイドなDNAメチル化状態をプロファイルした。形質導入細胞からゲノムDNAを常法により抽出した。EZ DNA Methylation-GoldTM Kit（Zymo Research Corp.）で処理したゲノムDNAを製造業者の指示書に従ってメチル化アレイにハイブリダイズした。得られたメチル化アレイシグナルデータから、Illuminaマイクロアレイデータ処理用のBioconductorパッケージのlumiを用いてメチル化度を示すM値をメチル化アレイ上の各プローブについて算出した。
実施例１で作製した形質導入細胞について、Infinium（登録商標） HumanMethylation450 BeadsChip array（Illumina Inc.）を使用してゲノムワイドなDNAメチル化状態をプロファイルした。形質導入細胞からゲノムDNAを常法により抽出した。EZ DNA Methylation-GoldTM Kit（Zymo Research Corp.）で処理したゲノムDNAを製造業者の指示書に従ってメチル化アレイにハイブリダイズした。得られたメチル化アレイシグナルデータから、Illuminaマイクロアレイデータ処理用のBioconductorパッケージのlumiを用いてメチル化度を示すM値をメチル化アレイ上の各プローブについて算出した。
RUNX1存在下で脱メチル化されたプローブを同定するため、293T-mock細胞と293T-RUNX1細胞の間、293T-TET2-TDG細胞と293T-TET2-TDG-RUNX1細胞の間、293T-TET3-TDG細胞と293T-TET3-TDG-RUNX1細胞の間で各プローブのM値を比較した。M値に基づくスキャッタープロットを図３に示す。図３中、各プローブ（ドット）のM値の差（ΔM; ΔM＝RUNX1を導入した細胞のM値−RUNX1を未導入の細胞のM値）＝２（上）又は−２（下）となるラインをそれぞれ点線で示した。ΔM＜−２を指標としてRUNX1導入細胞における脱メチル化プローブを同定したところ、293T-mock細胞と293T-RUNX1細胞の間、293T-TET2-TDG細胞と293T-TET2-TDG-RUNX1細胞の間、293T-TET3-TDG細胞と293T-TET3-TDG-RUNX1細胞の間で、それぞれ145個、363個、及び364個の脱メチル化プローブが同定された。293T-TET2-TDG-RUNX1細胞と293T-TET3-TDG-RUNX1細胞の間で274個の脱メチル化プローブが重複していた。この結果から、RUNX1をTET及びTDGと共に過剰発現させることにより、RUNX1単独の過剰発現の場合と比較してDNA脱メチル化が増強されることが示された。
293T-TET2-TDG-RUNX1細胞で同定された脱メチル化プローブを表１に示す。293T-TET3-TDG-RUNX1細胞で同定された脱メチル化プローブを表２に示す。
なお表１及び表２中、プローブIDはInfinium（登録商標）HumanMethylation450 BeadsChipのプローブIDの番号である。またCpG位置は、ヒトゲノム参照配列バージョンhg19（UCSC Genome Bioinformatics; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html）を基準として定められるCの塩基番号である。
一方、RUNX1の不在下、すなわち293T-TET2-TDG細胞及び293T-TET3-TDG細胞におけるメチル化プローブ及び脱メチル化プローブも同定した。293T-TET2-TDG細胞及び293T-TET3-TDG細胞における各プローブのM値を293T-mock細胞でのM値と比較した。M値に基づくスキャッタープロットを図４に示す。図４中、各プローブ（ドット）のM値の差（ΔM＝293T-TET2-TDG細胞又は293T-TET3-TDG細胞のM値−293T-mock細胞のM値）＝２（上）又は−２（下）となるラインをそれぞれ点線で示した。ΔM＞２を指標として、メチル化プローブが、293T-TET2-TDG細胞-293T-mock細胞間では1548個、293T-TET3-TDG細胞-293T-mock細胞間では1597個同定され、ΔM＜−２を指標として、脱メチル化プローブが、293T-TET2-TDG細胞-293T-mock細胞間では1373個、293T-TET3-TDG細胞-293T-mock細胞間では1361個同定された。このように293T-TET2-TDG細胞及び293T-TET3-TDG細胞では、メチル化増強と脱メチル化増強の両方が生じた。
図３から、RUNX1を過剰発現させることにより脱メチル化が誘導されることが示された。さらに、図３と図４の比較から、RUNX1をTET及びTDGと共に過剰発現させると、TET及びTDGを過剰発現させた場合と比較して、メチル化増強よりも脱メチル化増強にシフトすることが示された。
［実施例３］DNA脱メチル化の部位特異性の解析
メチル化アレイ解析によるRUNX1媒介脱メチル化誘導の結果を確認し、かつそのDNA脱メチル化の部位特異性を解析するため、293T-RUNX1において脱メチル化された２つのプローブ（PTPN22遺伝子とRUNX3遺伝子にそれぞれ関連する）をランダムに選択し、それらプローブの近傍をバイサルファイトシークエンスによって解析した。
メチル化アレイ解析によるRUNX1媒介脱メチル化誘導の結果を確認し、かつそのDNA脱メチル化の部位特異性を解析するため、293T-RUNX1において脱メチル化された２つのプローブ（PTPN22遺伝子とRUNX3遺伝子にそれぞれ関連する）をランダムに選択し、それらプローブの近傍をバイサルファイトシークエンスによって解析した。
バイサルファイトシークエンスに用いるゲノムDNAは、293T-mock細胞及び293T-RUNX1細胞から、NucleoSpin（登録商標） Tissue Kit（Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Duren, Germany）を用いて製造業者の説明書に従って単離した。メチル化検出キットであるEZ DNA Mathylation-GoldTM Kit（Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA）を用いて、バイサルファイト処理によりゲノムDNAの非メチル化シトシンをウラシルに変換した。次いで変換後のゲノムDNAを鋳型として、標的ゲノム領域を、PPN22遺伝子に対するプライマーペア（フォワード: 5'-TTGTTTTGGGTTTTATTTAGGA-3'（配列番号２４）、リバース: 5'-AATAATCTCAATTAAACAAACCACA-3'（配列番号２５））、又はRUNX3遺伝子に対するプライマーペア（フォワード: 5'-TTAAGGAAAGTAAGTTTTTGTTTGT-3'（配列番号２６）; リバース: 5'-ACTAAAAAAACCTAATCCCTCA-3'（配列番号２７））を使用し、EpiTaqTMHS（Takara Bio Inc.）を製造業者の説明書に従って用いて増幅した。得られたPCR産物はTArgetTM Clone KIt（Toyobo Co., Ltd.）を用いてpTA2プラスミドにクローン化し、BigDye（登録商標） Terminator Ver3.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて3730x1 DNA Analyzer（Thermo Fisher Scientific Inc.）でシークエンスを行った。各標的について24個のクローンをシークエンスした。得られた塩基配列においてメチル化CpGの配列はCG、非メチル化CpGの配列はTGとして検出された。図５にその結果を模式的に示す。図５中、黒丸がメチル化CpG、白丸が非メチル化CpGを示し、矢印は顕著に脱メチル化されたプローブのCpGを示す。293T-RUNX1細胞において、293T-mock細胞と比較して、プローブ部位、隣接部位、又はその両方が有意に脱メチル化されたことが示された（PTPN22についてP<10-11、RUNX3についてP<10-17；フィッシャーの正確検定）。
続いて、実施例２でそれぞれの形質導入細胞について得られた、メチル化アレイ上の脱メチル化プローブ145個及び全プローブからランダムに選択されたプローブ145個のそれぞれのCpG部位から±500bpの領域の塩基配列を、ヒトゲノム参照配列バージョンhg19（UCSC Genome Bioinformatics; http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html）から抽出した。得られた塩基配列について、Cloverプログラム（Frith et al., (2004) Nucleic Acids Res., 32: p.1372-1381）を用いて、JASPAR COREデータベース（ver. 2009）中の転写因子結合モチーフの検索及び統計学的検定を行った。その結果、293T-mock細胞と比較して293T-RUNX1細胞で同定された脱メチル化プローブについて、有意に過剰出現した27個の転写因子結合モチーフが同定された（P< 0.001のカットオフ値）（表３）。
293T-TET2-TDG細胞と比較して293T-TET2-TDG-RUNX1細胞で同定された脱メチル化プローブについては、有意に過剰出現した55個の転写因子結合モチーフが同定された（P< 0.001のカットオフ値）（表４）。
293T-TET3-TDG細胞と比較して293T-TET3-TDG-RUNX1細胞で同定された脱メチル化プローブについては、有意に過剰出現した51個の転写因子結合モチーフが同定された（P< 0.001のカットオフ値）（表５）。
いずれの細胞で同定された脱メチル化CpG部位周辺でも、RUNX1結合モチーフが最も高頻度に出現していた。
さらにRUNX1結合モチーフの位置分布を調べたところ、293T-RUNX1細胞、293T-TET2-TDG-RUNX1細胞、及び293T-TET3-TDG-RUNX1細胞のいずれにおいても、RUNX1結合モチーフは脱メチル化プローブのCpG部位（脱メチル化CpG）を中心として濃縮されていた（図６実線）。かなり多数のRUNX1結合モチーフが脱メチル化CpGの近傍、特に±200 bpの範囲内に位置していた。対照的に、全プローブからランダムに選択された145個のプローブのCpG部位に対してはRUNX1結合モチーフは均等に分布していた（図６点線）。
以上の結果から、RUNX1は、RUNX1結合モチーフを含む概ね400bp幅の領域内でRUNX1結合部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することが示された。
［実施例４］RUNX1による造血系遺伝子に対する脱メチル化作用の解析
RUNX1は造血系遺伝子の発現調節において重要な役割を果たす（Zhang et al., (1996) Mol. Cell Biol. 16: p.1231-1240; Uchida et al., (1997) J. Immunol., 158: p.2251-2258; Huang et al., (2008) Nat. Genet. 40: p.51-61）。そこで、造血におけるRUNX1媒介DNA脱メチル化の生物学的意義を明らかにするため、ヒト胚性幹細胞（ESC）と造血系細胞について、上記で同定した脱メチル化部位におけるDNAメチル化状態を調べた。調査対象の脱メチル化部位は、293T-TET2-TDG-RUNX1細胞及び293T-TET3-TDG-RUNX1細胞で同定した451個の脱メチル化プローブ（以下、RUNX1標的プローブと称する）のCpGである。比較のため、アレイ上の全プローブにおけるDNAメチル化状態も調べた。
RUNX1は造血系遺伝子の発現調節において重要な役割を果たす（Zhang et al., (1996) Mol. Cell Biol. 16: p.1231-1240; Uchida et al., (1997) J. Immunol., 158: p.2251-2258; Huang et al., (2008) Nat. Genet. 40: p.51-61）。そこで、造血におけるRUNX1媒介DNA脱メチル化の生物学的意義を明らかにするため、ヒト胚性幹細胞（ESC）と造血系細胞について、上記で同定した脱メチル化部位におけるDNAメチル化状態を調べた。調査対象の脱メチル化部位は、293T-TET2-TDG-RUNX1細胞及び293T-TET3-TDG-RUNX1細胞で同定した451個の脱メチル化プローブ（以下、RUNX1標的プローブと称する）のCpGである。比較のため、アレイ上の全プローブにおけるDNAメチル化状態も調べた。
ヒト胚性幹細胞（ESC）、CD34+造血幹細胞／前駆細胞（CD34）、CD14+単球（CD14）、及び末梢血単核細胞（PBMC）について、Infinium（登録商標） HumanMethylation450 BeadsChip arrayによるメチル化アレイデータをGEO ID: GSE40790の下でGEO（Gene Expression Omnibus）のデータベースより入手し、上記実施例と同様にしてM値を算出した。ESCとCD34、ESCとCD14、及びESCとPBMCの間で各RUNX1標的プローブのM値を比較した。M値に基づくスキャッタープロットを図７に示す。M値は、非メチル化とメチル化にそれぞれ対応する低いピークと高いピークの明確な二峰性分布を示したため、RUNX1標的プローブを、M＜0を指標として非メチル化プローブ、M≧0を指標としてメチル化プローブに分類した。図７では、点線のように４つの領域に分けたとき、ESCと、CD34、CD14、又はPBMCの両方でメチル化されたプローブが右上（M-M）に、ESCでメチル化されたがCD34、CD14、又はPBMCでメチル化されなかったプローブが右下（M-U）にプロットされている。ESCでは451個のRUNX1標的プローブのうち409個（メチル化率: 90.7％）がメチル化され、そのメチル化率は全プローブにおけるメチル化率（60.5％）よりも有意に高かった。一方、ESCよりも分化が進んだCD34、CD14、及びPBMCにおけるRUNX1標的プローブのメチル化率は、それぞれ66.3％、60.6％、及び60.4％であったことから、CD34、CD14、及びPBMCでの脱メチル化誘導が示された。これらの結果はRUNX1媒介DNA脱メチル化が血液細胞の分化において極めて重要な役割を果たすことを示している。特に、脱メチル化が、最終分化したCD14やPBMCではもちろん、その前段階のCD34において既に顕著に誘導されていることは注目に値する。これはすなわち、RUNX1が血液細胞の最終分化というよりはむしろ造血系への運命決定において重要な役割を果たすことを意味している。
そこでFANTOM5プロジェクト（Forrest et al., (2014) Nature, 507: p.462-470）で取得されたCAGE発現データを用いて、遺伝子発現の変化を比較した。一方、プロモーター領域に位置し、ESCでメチル化された60個のRUNX1標的プローブを選択し、ESCでメチル化されたがCD34でメチル化されなかった（脱メチル化された）群（M-U群）とESCとCD34の両方でメチル化された群（M-M群）に分類した。これらの結果を対応させたところ、ESCと比較したCD34において、M-U群のプローブに対応する遺伝子群の発現が、M-M群の遺伝子群の発現と比較して有意な増加を示すことが明らかとなった。この遺伝子発現の増加は、ESCとCD14、ESCとPBMCの間でも同様であった。したがってRUNX1は、プロモーター領域のCpG部位の脱メチル化により造血の際の遺伝子活性化に直接関与することが示された。
ESCと比較してCD34、CD14又はPBMCにおいて遺伝子発現の上昇が示されたM-U群のRUNX1標的プローブに対応する遺伝子を表６に示す。
以上の結果から、RUNX1は、脱メチル化を介した造血系遺伝子の活性化により、造血系細胞の分化に寄与することが示された。
［実施例５］各種転写因子とTET及びTDGの共発現による部位特異的な脱メチル化誘導の促進
本実施例ではRUNX1以外の転写因子とTET及びTDGの共発現が脱メチル化に及ぼす影響を調べた。RUNX1遺伝子の代わりに他の転写因子をコードする遺伝子（表７）を用いる点、及びTET遺伝子として酵素活性部位を含むTET1部分断片（TET改変体；配列番号１５の1402〜2136位に相当）をコードするTET遺伝子改変体（塩基配列：配列番号４９、アミノ酸配列：配列番号５０；配列番号１４の4204〜6408位に相当）を用いる点以外は実施例１と同様にして、TET遺伝子及びTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞（293T-TcdT）、及び各種ヒト転写因子をコードする遺伝子、ヒトTET遺伝子、及びヒトTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞を作製した。なお用いたTDG遺伝子は実施例１と同じである。さらに実施例２と同様にしてInfinium（登録商標） HumanMethylation450 BeadsChip arrayを用いてメチル化アレイ解析を行い、各プローブのM値を算出し、上記細胞間でM値を比較することにより、脱メチル化が増強されたことを確認し、脱メチル化プローブを同定した。続いて、実施例３と同様に、各プローブの脱メチル化CpG部位から±5kbpの領域の塩基配列について、転写因子結合モチーフの検索を行った。さらに、各転写因子について、実施例３に記載の方法によって得られた転写因子結合モチーフの検索結果について統計学的解析を行った。具体的には、各転写因子をTDG及びTET若しくはTET改変体とともに293T細胞で過剰発現させた場合の、脱メチル化プローブ中の脱メチル化CpG部位の近傍配列（±5kbp）における転写因子結合モチーフの位置を中心とする標準正規分布を足し合わせた混合分布から、ランダムに選択されたプローブの近傍配列（±5kbp）における転写因子結合モチーフの位置を中心とする標準正規分布を足し合わせた混合分布を差し引いて、混合頻度分布を得た。この混合頻度分布は、脱メチル化プローブの近傍における転写因子結合モチーフのバックグラウンド補正された出現頻度分布である。また実施例３で転写因子結合モチーフの検索を行ったRUNX1についても同様の解析を行った。得られた混合頻度分布を、図８〜１１に示した。一方、PAX4（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号NP_006184）及びNKX2-5（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号NP_004378）についても同様の転写因子結合モチーフの検索及び解析を行った。その結果を図１２に示す。なお「293T-TcdT」はTET改変体（Tcd; TET catalytic domain）とTDG（T）を過剰発現する293T細胞を表す。また「293T-TcdT-RUNX1」はTET改変体とTDGとRUNX1を過剰発現する293T細胞を表す。他の転写因子遺伝子を過剰発現させた293T細胞も同様に表記する。
本実施例ではRUNX1以外の転写因子とTET及びTDGの共発現が脱メチル化に及ぼす影響を調べた。RUNX1遺伝子の代わりに他の転写因子をコードする遺伝子（表７）を用いる点、及びTET遺伝子として酵素活性部位を含むTET1部分断片（TET改変体；配列番号１５の1402〜2136位に相当）をコードするTET遺伝子改変体（塩基配列：配列番号４９、アミノ酸配列：配列番号５０；配列番号１４の4204〜6408位に相当）を用いる点以外は実施例１と同様にして、TET遺伝子及びTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞（293T-TcdT）、及び各種ヒト転写因子をコードする遺伝子、ヒトTET遺伝子、及びヒトTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞を作製した。なお用いたTDG遺伝子は実施例１と同じである。さらに実施例２と同様にしてInfinium（登録商標） HumanMethylation450 BeadsChip arrayを用いてメチル化アレイ解析を行い、各プローブのM値を算出し、上記細胞間でM値を比較することにより、脱メチル化が増強されたことを確認し、脱メチル化プローブを同定した。続いて、実施例３と同様に、各プローブの脱メチル化CpG部位から±5kbpの領域の塩基配列について、転写因子結合モチーフの検索を行った。さらに、各転写因子について、実施例３に記載の方法によって得られた転写因子結合モチーフの検索結果について統計学的解析を行った。具体的には、各転写因子をTDG及びTET若しくはTET改変体とともに293T細胞で過剰発現させた場合の、脱メチル化プローブ中の脱メチル化CpG部位の近傍配列（±5kbp）における転写因子結合モチーフの位置を中心とする標準正規分布を足し合わせた混合分布から、ランダムに選択されたプローブの近傍配列（±5kbp）における転写因子結合モチーフの位置を中心とする標準正規分布を足し合わせた混合分布を差し引いて、混合頻度分布を得た。この混合頻度分布は、脱メチル化プローブの近傍における転写因子結合モチーフのバックグラウンド補正された出現頻度分布である。また実施例３で転写因子結合モチーフの検索を行ったRUNX1についても同様の解析を行った。得られた混合頻度分布を、図８〜１１に示した。一方、PAX4（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号NP_006184）及びNKX2-5（NCBI RefSeq proteinアクセッション番号NP_004378）についても同様の転写因子結合モチーフの検索及び解析を行った。その結果を図１２に示す。なお「293T-TcdT」はTET改変体（Tcd; TET catalytic domain）とTDG（T）を過剰発現する293T細胞を表す。また「293T-TcdT-RUNX1」はTET改変体とTDGとRUNX1を過剰発現する293T細胞を表す。他の転写因子遺伝子を過剰発現させた293T細胞も同様に表記する。
図８〜１１に示すとおり、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することが示されたRUNX1と同様に、転写因子RUNX3、CEBPB、CEBPA、MAFB、NR4A2、MYOD1及びGATA2についても、混合頻度分布で示される転写因子結合モチーフの出現頻度分布は、脱メチル化CpG部位の位置（X軸の0）付近を頂点としたピークを形成した。なお、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導するとされているSPI1も同様の解析で脱メチル化CpG部位の位置（X軸の0）付近を頂点としたピークを形成した（図２３）。さらに、得られた出現頻度分布（混合頻度分布）に基づいてピーク最大値を出現頻度全体の四分位範囲×3＋第3四分位（(IQRx3)+Q3）の値と比較したところ、表７に示すようにピーク最大値が上回っていた。
これらの結果は、導入した転写因子の結合モチーフが脱メチル化CpG部位を中心に濃縮されていること、すなわち、これらの転写因子が部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することを示している。
また実施例２及び実施例３と同様にして、脱メチル化プローブの近傍をバイサルファイトシークエンスによって解析し、実際に部位特異的に脱メチル化が起こっていることを確認した。バイサルファイトシークエンスに用いた脱メチル化領域増幅用プライマーペアは以下のとおりである。
・RUNX1
フォワードプライマー：5'-GTGATGTTTTTGGATAGGTTAGGAG-3'（配列番号５１）
リバースプライマー：5'-ATCACTCAATTTCATCATATTTCTCAA-3'（配列番号５２）
・RUNX3
フォワードプライマー：5'-GGGTTAGGGGTTGAAGGAGTTATTA-3'（配列番号５３）
リバースプライマー：5'-AAAACCACCACCTTAACAACAAAAA-3'（配列番号５４）
・CEBPB
フォワードプライマー：5'-TTTAGTTGTTTGTGTTATTTTTTTTGT-3'（配列番号５５）
リバースプライマー：5'-TAAATCATCCATTATTATATCACTCCTTAT-3'（配列番号５６）
・CEBPA
フォワードプライマー：5'-AGTTTTTTTGTATGAGGGAAGTTTTTAAAA-3'（配列番号５７）
リバースプライマー：5'-CTATATTCCCAAAAAACCTTACCCC-3'（配列番号５８）
・MAFB
フォワードプライマー：5'-TGTTAGGTTTTAGATAGAAATATAATTGAG-3'（配列番号５９）
リバースプライマー：5'-TCTAAAAATAAAAAAACTACATTCTCATAC-3'（配列番号６０）
・NR4A2
フォワードプライマー：5'-GGTGGGTATTGTAAAGGTATTTG-3'（配列番号６１）
リバースプライマー：5'-AAATTCACAATAAAAACAATAAAAAACTAA-3'（配列番号６２）
・MYOD1
フォワードプライマー：5'-TTTGATAGTTGAGGGGGAAATT-3'（配列番号６３）
リバースプライマー：5'-ACCTAACCAAAAACCTCTACAAAAC-3'（配列番号６４）
・GATA2
フォワードプライマー：5'-GTTGTTATGGTTTAATATAAGGG-3'（配列番号６５）
リバースプライマー：5'-AACCCATTTCACAAATAAAACTATC-3'（配列番号６６）
・SPI1
フォワードプライマー：5'-TTGTTTTTATATAAGAGGAGGAAAATAGAG-3'（配列番号６７）
リバースプライマー：5'-AAAAAACCAAATTCACAATCCATAC-3'（配列番号６８）
バイサルファイトシークエンス解析の結果を図１４〜２２に示す。
・RUNX1
フォワードプライマー：5'-GTGATGTTTTTGGATAGGTTAGGAG-3'（配列番号５１）
リバースプライマー：5'-ATCACTCAATTTCATCATATTTCTCAA-3'（配列番号５２）
・RUNX3
フォワードプライマー：5'-GGGTTAGGGGTTGAAGGAGTTATTA-3'（配列番号５３）
リバースプライマー：5'-AAAACCACCACCTTAACAACAAAAA-3'（配列番号５４）
・CEBPB
フォワードプライマー：5'-TTTAGTTGTTTGTGTTATTTTTTTTGT-3'（配列番号５５）
リバースプライマー：5'-TAAATCATCCATTATTATATCACTCCTTAT-3'（配列番号５６）
・CEBPA
フォワードプライマー：5'-AGTTTTTTTGTATGAGGGAAGTTTTTAAAA-3'（配列番号５７）
リバースプライマー：5'-CTATATTCCCAAAAAACCTTACCCC-3'（配列番号５８）
・MAFB
フォワードプライマー：5'-TGTTAGGTTTTAGATAGAAATATAATTGAG-3'（配列番号５９）
リバースプライマー：5'-TCTAAAAATAAAAAAACTACATTCTCATAC-3'（配列番号６０）
・NR4A2
フォワードプライマー：5'-GGTGGGTATTGTAAAGGTATTTG-3'（配列番号６１）
リバースプライマー：5'-AAATTCACAATAAAAACAATAAAAAACTAA-3'（配列番号６２）
・MYOD1
フォワードプライマー：5'-TTTGATAGTTGAGGGGGAAATT-3'（配列番号６３）
リバースプライマー：5'-ACCTAACCAAAAACCTCTACAAAAC-3'（配列番号６４）
・GATA2
フォワードプライマー：5'-GTTGTTATGGTTTAATATAAGGG-3'（配列番号６５）
リバースプライマー：5'-AACCCATTTCACAAATAAAACTATC-3'（配列番号６６）
・SPI1
フォワードプライマー：5'-TTGTTTTTATATAAGAGGAGGAAAATAGAG-3'（配列番号６７）
リバースプライマー：5'-AAAAAACCAAATTCACAATCCATAC-3'（配列番号６８）
バイサルファイトシークエンス解析の結果を図１４〜２２に示す。
以上の結果に基づき、TET及びTDGと共に発現させることによって転写因子結合部位特異的に脱メチル化を高効率に誘導することができる転写因子群が同定された。同定された転写因子群を表８に示す。
［実施例６］RUNX1過剰発現によるSPI1遺伝子制御領域の脱メチル化
RUNX1を過剰発現させた細胞においてゲノムDNAのSPI1遺伝子制御領域の脱メチル化を誘導した。具体的には、実施例１と同様にして、RUNX1を過剰発現する293T細胞及び陰性対照として空のレンチウイルスベクターを導入した293T細胞（形質導入細胞）を作製した。作製した形質導入細胞から実施例３と同様に、SPI1制御領域に対するプライマーペア（フォワード: 5'-GTTGGATATTTTTTTGAGGTTTGG-3'（配列番号６９）、リバース: 5'-TAAAACCTAAAACTACTAAACCCA-3'（配列番号７０））を用いてバイサルファイトシークエンスによりSPI1制御領域のメチル化状態を解析した。
RUNX1を過剰発現させた細胞においてゲノムDNAのSPI1遺伝子制御領域の脱メチル化を誘導した。具体的には、実施例１と同様にして、RUNX1を過剰発現する293T細胞及び陰性対照として空のレンチウイルスベクターを導入した293T細胞（形質導入細胞）を作製した。作製した形質導入細胞から実施例３と同様に、SPI1制御領域に対するプライマーペア（フォワード: 5'-GTTGGATATTTTTTTGAGGTTTGG-3'（配列番号６９）、リバース: 5'-TAAAACCTAAAACTACTAAACCCA-3'（配列番号７０））を用いてバイサルファイトシークエンスによりSPI1制御領域のメチル化状態を解析した。
得られた結果を図２３に示す。図２３に示されるように、RUNX1過剰発現により、SPI1遺伝子制御領域の脱メチル化が促進された。さらに、配列解析により、このSPI1遺伝子制御領域はRUNX1結合部位を２つ含むことが示された（図２４）。これらの結果は、RUNX1をはじめとする部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子を細胞で過剰発現させることにより、細胞中のDNAにおいて転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強できることをさらに裏付けている。
［実施例７］TBX5による部位特異的な脱メチル化誘導の促進
転写因子TBX5（GenBankアクセッション番号Q99593）をコードする遺伝子を用いる点以外は、実施例５と同様にして、TET遺伝子及びTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞（293T-TcdT）、及びヒトTBX5をコードする遺伝子、ヒトTET遺伝子、及びヒトTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞を作製し、脱メチル化プローブを同定し、同定された脱メチル化CpG部位から±5kbpの領域の塩基配列について転写因子結合モチーフの検索を行い、その検索結果について統計学的解析を行った。得られた結果を図２５に示す。ピーク最大値は173.200、(IQRx3)+Q3は71.141であった。図２５に示されるように、TBX5を用いた場合でも、結合モチーフは脱メチル化CpG部位を中心に濃縮されていた。このことは、TBX5が部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することを示している。
転写因子TBX5（GenBankアクセッション番号Q99593）をコードする遺伝子を用いる点以外は、実施例５と同様にして、TET遺伝子及びTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞（293T-TcdT）、及びヒトTBX5をコードする遺伝子、ヒトTET遺伝子、及びヒトTDG遺伝子を過剰発現する293T細胞を作製し、脱メチル化プローブを同定し、同定された脱メチル化CpG部位から±5kbpの領域の塩基配列について転写因子結合モチーフの検索を行い、その検索結果について統計学的解析を行った。得られた結果を図２５に示す。ピーク最大値は173.200、(IQRx3)+Q3は71.141であった。図２５に示されるように、TBX5を用いた場合でも、結合モチーフは脱メチル化CpG部位を中心に濃縮されていた。このことは、TBX5が部位特異的なDNA脱メチル化を誘導することを示している。
［実施例８］造血系における脱メチル化領域中の転写因子結合モチーフの濃縮
造血発生におけるDNAメチル化を全体的に解析するために、iPS細胞（iPSC）（iPSC-253G1; RIKEN Bio-resource Center（BRC）, HPS0002）、CD34+造血前駆細胞（HPC）（Poietics, 2M-101c）、CD14+単球（MON）（Poietics Ltd, 2W-400C）、CD3+ T細胞（TC）（HemaCare BioResearch, PB03C-2）及びCD19+ B細胞（BC）（HemaCare BioResearch, PB19C-2）について、単一塩基分解DNAメチル化解析を行った。
造血発生におけるDNAメチル化を全体的に解析するために、iPS細胞（iPSC）（iPSC-253G1; RIKEN Bio-resource Center（BRC）, HPS0002）、CD34+造血前駆細胞（HPC）（Poietics, 2M-101c）、CD14+単球（MON）（Poietics Ltd, 2W-400C）、CD3+ T細胞（TC）（HemaCare BioResearch, PB03C-2）及びCD19+ B細胞（BC）（HemaCare BioResearch, PB19C-2）について、単一塩基分解DNAメチル化解析を行った。
製造業者の使用説明書に従って、NucleoSpin（登録商標） Tissueキット（Macherey-Nagel）を用いてゲノムDNAを単離し、Infinium（登録商標） HumanMethylation450 BeadsArray（Illumina）によるメチル化解析を行った。lumi Bioconductorパッケージ（Du et al., 2008; Yousefi et al., 2013）を使用し、正規化及びM値（M-value）の算出を行った。
Bioconductor Biostringsパッケージを用いて、JASPER COREに登録されているヒト及びマウスモチーフをhg19ゲノム配列に基づき、80％ミニマムスコアで示差的にメチル化されたCpG（DMC）から±5 kbpの領域内で転写因子結合モチーフを検索した。50bpずつずらした100bpのスライディングウィンドウ中の転写因子結合モチーフをカウントし、ポアソン分布モデルでの正確検定（p < 0.00001）を用いて同じ個数のランダムに選択されたプローブとの比較を行った。次いで有意に異なるモチーフについて濃縮スコア（enrichment score）を以下の式を用いて算出した。
上記式中、i及びjはDMC領域及びランダムに選択された対照中で同定された転写因子結合モチーフをそれぞれ表し、χt及びχcはDMC領域及びランダムに選択された対照中の転写因子結合モチーフの位置をそれぞれ表す。平滑パラメーターhは50、Kはガウシアンカーネル関数として算出した。
最大濃縮スコアが(IQRx3)+Q3を超える場合には、過剰出現モチーフ（overrepresented motif）として選択した。
メチル化解析によって示されたDNAメチル化状態を、iPS細胞とHPCの間（iPSC-HPC）、並びにHPCと3つの終末分化した造血細胞種のいずれかとの間（HPC-MON、HPC-BC及びHPC-TC）で比較したところ、iPSC-HPC、HPC-MON、HPC-BC、及びHPC-TCにおいてそれぞれ32,434個、12,410個、10,278個及び26,376個の脱メチル化CpGが同定された。
さらに、JASPAR COREデータベース（Sandelin, A. et al., (2004) Nucleic Acids Res., 32, D91-94）に登録された113個のヒト又はマウス転写因子結合モチーフ（TFBM）のうち、iPSC-HPC、HPC-MON、HPC-BC及びHPC-TCにおいてそれぞれ13個、9個、2個及び8個の過剰出現モチーフが脱メチル化領域中で同定された（図２６）。図２６では、DMC近傍で見出された過剰出現転写因子結合モチーフの最大濃縮スコアを、脱メチル化領域に対するヒートマップとして可視化した。
図２６の右側に示された転写因子結合モチーフは、iPSC-HPC、HPC-MON、HPC-BC及びHPC-TCのいずれかの細胞分化過程で濃縮されていた。図中、濃縮レベルは濃縮スコアに応じた濃さで示している。濃縮スコアが高いほど、脱メチル化を誘導しやすいと考えられる。図中に示された濃縮は、各細胞分化過程における転写因子結合モチーフの脱メチル化との関連性を示している。例えば、NR4A2は造血前駆細胞（HPC）からT細胞（TC）への分化に関与しており、NFATC2はiPS細胞（iPSC）から造血前駆細胞（HPC）への分化及びHPCから単球（MON）への分化に関与していることが図２６から示される。
造血又は免疫機能に関して著名な主たる系統特異的転写因子結合モチーフ（RUNX1、SPIB、NR4A2、IRF1、IRF2及びAP-1（Liebermann, D.A., et al., (1998) Int. J. Oncol., 12, p.685-700; Lohoff, M., and Mak, T.W. (2005) Nat. Rev. Immunol., 5, p.125-135; Okuda, T., et. al., (2000) Mol. Cell Biol., 20, p.319-328; Schotte et al., (2003) Blood 101, p.1015-1023; Sekiya et al., (2011) Nat. Commun., 2, p.269）がこの試験で同定されたことは重要である。このことは、系統特異的転写因子が造血発生においてトランス活性化活性だけでなくDNA脱メチル化活性を有することを示唆している。
以上の結果から、図２６の右側に示された各転写因子結合モチーフに結合する転写因子は、図２６に関連が示された細胞分化過程において脱メチル化活性を有することが示された。
造血前駆細胞（HPC）は様々な血球系細胞の起源となる細胞である。したがってHPCへの分化、及びHPCから単球（MON）、T細胞（TC）及びB細胞（BC）への分化で濃縮されている転写因子結合モチーフに結合する転写因子は、血液細胞分化において脱メチル化に重要な役割を果たし、血球系細胞のダイレクトリプログラミングや万能細胞（iPS細胞やES細胞）からの分化を促進すると考えられる。また終末分化（HPC-MON、HPC-BC、及びHPC-TC）において濃縮している転写因子結合モチーフは、全体として各分化過程に特異的である。したがって各転写因子結合モチーフに結合する転写因子のHPCへの導入は、HPCからの特異的な終末分化誘導を促進すると考えられる。
図２６に示した転写因子結合モチーフに結合し得る転写因子の代表例を表９に示す。
なお、転写因子結合モチーフSPIB、IRF1及びIRF1のJasper IDは、それぞれMA0081.1、MA0050.1、MA0051.1である。
本発明は、転写因子結合部位特異的なDNA脱メチル化を高レベルに誘導する転写因子を取得し、細胞内DNAにおける部位特異的なDNA脱メチル化を増強するためのツールとして用いることができる。本発明はまた、転写因子結合部位特異的なDNA脱メチル化を抑制又は増強する薬剤のスクリーニングや被験物質の脱メチル化活性の検出に用いることができる。本発明は、特定部位に高効率に作用する副作用の少ない抗がん剤の開発や細胞リプログラミング又はダイレクト・リプログラミングの効率向上のために用いることができる。
配列番号１〜１０：プライマー
配列番号１１：RUNX1遺伝子の塩基配列
配列番号１２：RUNX1アミノ酸配列
配列番号１３：RUNX1のDNA結合ドメイン
配列番号１４：TET1遺伝子の塩基配列
配列番号１５：TET1アミノ酸配列
配列番号１６：TET2遺伝子の塩基配列
配列番号１７：TET2アミノ酸配列
配列番号１８：TET3遺伝子の塩基配列
配列番号１９：TET3アミノ酸配列
配列番号２０及び２１：プライマー
配列番号２２：TDG遺伝子の塩基配列
配列番号２３：TDGアミノ酸配列
配列番号２４〜２７：プライマー
配列番号２８：RUNX3遺伝子の塩基配列
配列番号２９：RUNX3アミノ酸配列
配列番号３０：RUNX3のDNA結合ドメイン
配列番号３１：MYOD1遺伝子の塩基配列
配列番号３２：MYOD1アミノ酸配列
配列番号３３：MYOD1のDNA結合ドメイン
配列番号３４：CEBPA遺伝子の塩基配列
配列番号３５：CEBPAアミノ酸配列
配列番号３６：CEBPAのDNA結合ドメイン
配列番号３７：CEBPB遺伝子の塩基配列
配列番号３８：CEBPBアミノ酸配列
配列番号３９：CEBPBのDNA結合ドメイン
配列番号４０：GATA2遺伝子の塩基配列
配列番号４１：GATA2アミノ酸配列
配列番号４２：GATA2のDNA結合ドメイン
配列番号４３：MAFB遺伝子の塩基配列
配列番号４４：MAFBアミノ酸配列
配列番号４５：MAFBのDNA結合ドメイン
配列番号４６：NR4A2遺伝子の塩基配列
配列番号４７：NR4A2アミノ酸配列
配列番号４８：NR4A2のDNA結合ドメイン
配列番号４９：酵素活性部位をコードするTET遺伝子改変体の塩基配列
配列番号５０：TET遺伝子改変体にコードされるアミノ酸配列
配列番号５１〜７０：プライマー
配列番号７１：SPI1遺伝子制御領域の塩基配列
配列番号７２：TBX5遺伝子の塩基配列
配列番号７３：TBX5アミノ酸配列
配列番号７４：TBX5のDNA結合ドメイン
配列番号１１：RUNX1遺伝子の塩基配列
配列番号１２：RUNX1アミノ酸配列
配列番号１３：RUNX1のDNA結合ドメイン
配列番号１４：TET1遺伝子の塩基配列
配列番号１５：TET1アミノ酸配列
配列番号１６：TET2遺伝子の塩基配列
配列番号１７：TET2アミノ酸配列
配列番号１８：TET3遺伝子の塩基配列
配列番号１９：TET3アミノ酸配列
配列番号２０及び２１：プライマー
配列番号２２：TDG遺伝子の塩基配列
配列番号２３：TDGアミノ酸配列
配列番号２４〜２７：プライマー
配列番号２８：RUNX3遺伝子の塩基配列
配列番号２９：RUNX3アミノ酸配列
配列番号３０：RUNX3のDNA結合ドメイン
配列番号３１：MYOD1遺伝子の塩基配列
配列番号３２：MYOD1アミノ酸配列
配列番号３３：MYOD1のDNA結合ドメイン
配列番号３４：CEBPA遺伝子の塩基配列
配列番号３５：CEBPAアミノ酸配列
配列番号３６：CEBPAのDNA結合ドメイン
配列番号３７：CEBPB遺伝子の塩基配列
配列番号３８：CEBPBアミノ酸配列
配列番号３９：CEBPBのDNA結合ドメイン
配列番号４０：GATA2遺伝子の塩基配列
配列番号４１：GATA2アミノ酸配列
配列番号４２：GATA2のDNA結合ドメイン
配列番号４３：MAFB遺伝子の塩基配列
配列番号４４：MAFBアミノ酸配列
配列番号４５：MAFBのDNA結合ドメイン
配列番号４６：NR4A2遺伝子の塩基配列
配列番号４７：NR4A2アミノ酸配列
配列番号４８：NR4A2のDNA結合ドメイン
配列番号４９：酵素活性部位をコードするTET遺伝子改変体の塩基配列
配列番号５０：TET遺伝子改変体にコードされるアミノ酸配列
配列番号５１〜７０：プライマー
配列番号７１：SPI1遺伝子制御領域の塩基配列
配列番号７２：TBX5遺伝子の塩基配列
配列番号７３：TBX5アミノ酸配列
配列番号７４：TBX5のDNA結合ドメイン
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
Claims (19)
- 部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子を、TET遺伝子及びTDG遺伝子を発現する細胞中で過剰発現させることを含む、細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化を増強する方法であって、前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、方法。
- 前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、及びGATAファミリーの転写因子、並びにMAFB、及びTBX5からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を前記細胞中で過剰発現させることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記転写因子が、RUNX1、RUNX3、CEBPA、CEBPB、MAFB、NR4A2、MYOD1、GATA2、及びTBX5からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- TET遺伝子がTET2遺伝子又はTET3遺伝子である、請求項３に記載の方法。
- TET遺伝子が全長TETタンパク質又は酵素活性部位を含むその断片をコードする、請求項３又は５に記載の方法。
- 転写因子をコードする遺伝子を、TET遺伝子及びTDG遺伝子を発現する細胞中で過剰発現させ、その細胞中のDNAにおいて脱メチル化された部位を同定し、同定された脱メチル化部位とその上流配列及び下流配列における転写因子結合モチーフの出現頻度分布をその脱メチル化部位からの距離を変数として求め、そこから、ランダムに選択されたメチレーション部位とその上流配列及び下流配列における転写因子結合モチーフの出現頻度分布を差し引き、得られるバックグラウンド補正された出現頻度分布が前記距離X＝0付近を頂点としたピークを形成する転写因子を選抜することを含む、部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をスクリーニングする方法。
- 前記転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子を前記細胞中で過剰発現させる、請求項７に記載の方法。
- TET遺伝子が全長TETタンパク質又は酵素活性部位を含むその断片をコードする、請求項８に記載の方法。
- TET遺伝子がTET2遺伝子又はTET3遺伝子である、請求項８又は９に記載の方法。
- メチル化アレイを用いたメチローム解析により、脱メチル化された部位を同定する、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１２に記載の方法。
- 請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法によって得られる部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びにTET遺伝子及び／又はTDG遺伝子をプロモーターの制御下で過剰発現するように導入した、形質転換細胞であって、前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、形質転換細胞。
- 前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、及びGATAファミリーの転写因子、並びにMAFB、及びTBX5からなる群から選択される、請求項１４に記載の形質転換細胞。
- 前記転写因子が、RUNX1、RUNX3、CEBPA、CEBPB、MAFB、NR4A2、MYOD1、GATA2、及びTBX5からなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の形質転換細胞。
- 請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の形質転換細胞を被験物質の存在下で培養し、その細胞中のDNAのメチル化状態を評価し、被験物質不在下の細胞と比較したメチル化状態の変動を検出することを含む、被験物質の脱メチル化活性の検出方法。
- 部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子の、TET遺伝子及びTDG遺伝子を発現する細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化の増強のための使用であって、前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、使用。
- 部位特異的なDNA脱メチル化を誘導する転写因子をコードする遺伝子、並びに、TET遺伝子及び／又はTDG遺伝子の、細胞中のDNAにおける転写因子結合部位特異的な脱メチル化の増強のための使用であって、前記転写因子が、RUNXファミリー、C/EBPファミリー、MAFファミリー、NR4Aファミリー、MYODファミリー、GATAファミリー、及びTBXファミリーの転写因子からなる群から選択される、使用。
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