JP6476127B2

JP6476127B2 - ヒト多能性幹細胞由来肝細胞様細胞の成熟

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Publication number: JP6476127B2
Application number: JP2015544465A
Authority: JP
Inventors: キッパーズ−マンター，バーバラ; エドスバッゲ，ジョセフィーナ
Original assignee: タカラバイオヨーロッパアーベー
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2019-02-27
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: WO2014083132A1; US20190194609A1; JP6780216B2; EP3401391A1; US20150307839A1; CN105143445B; CN105143445A; EP2925859A1; JP2019088308A; JP2016503304A; US10294457B2; EP2925859B1

Description

本発明は、肝細胞様細胞の定方向分化及び成熟に関する。本発明に従って得られた肝細胞様細胞は、以前に示したよりも初代肝細胞の表現型に類似する表現型を示す。特に、本発明は、任意にＧＳＫ−３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）の阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤と組み合わせて、及び／又は、哺乳動物細胞外マトリクスの特徴的な１つ以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）と組み合わせて、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に肝細胞様細胞を曝露することに関する。また、本発明は、任意にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤と組み合わせて、及び／又は、哺乳動物細胞外マトリクスの特徴的な１つ以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）と組み合わせて、レチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に肝細胞様細胞を曝露することに関する。本明細書に開示されるように、本発明者らは、肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することが、現在利用可能な状態の技法と比較して、肝細胞様細胞のために、より成熟し、機能的な特性の開発をもたらしたり、肝細胞様細胞のより高純度で均一な集団をもたらすことを発見した。

新規医薬品の開発は、多くの課題、少なくとも有害な毒性効果を克服する問題に直面している。確かに、有害な肝反応は最も顕著な副作用となっている。大部分の低分子薬物の代謝と最終的なクリアランスは肝臓で起こり、したがって、創薬での焦点主要領域の一つは、そのような化合物又はその代謝物が、肝毒性作用を有するかどうかに関連する。さらに、薬物が臨床試験プログラムを開始する前に、かかる化合物の二次代謝産物が細胞毒性作用を示すかどうかを発見するためにも極めて重要である。

したがって、ヒト肝細胞を模倣し、新規薬物又は化学物質の開発で候補分子の効果を予測することができるモデル肝システムが喫緊に必要である。伝統的に、研究者はそのようなスクリーニングのために肝臓由来初代肝細胞に頼ることを余儀なくされてきたが、これらは、長期培養で細胞を維持することの難しさや、一貫した、均一な細胞集団を得ることの難しさを含む多くの重大な欠点を有する。これに対する解決法は、ヒト多能性幹細胞由来の肝細胞様細胞の形で提供されている。ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）は、関連するヒト細胞タイプを得ることが可能な方法を既に根本的に変え始めている。多能性ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞及びヒト人工多能性幹（ｈｉＰＳ）細胞を無限に増殖し、続いて、それらを所望の標的細胞タイプに分化できることは、現在、ｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏの適用範囲に対して安定的かつ実質的に無制限の細胞供給を提供している。

残念ながら、現在利用可能な肝細胞の細胞タイプは、形態及び機能の違いに起因して、肝臓の環境を必ずしも正確にモデル化しているとは限らない。例えば、初代細胞に代替的にたいてい用いられる１つは、非常に低レベルの代謝酵素をたいてい含み（又は完全に欠いており）、ｉｎｖｉｖｏで天然の肝細胞と実質的に異なる他の重要なタンパク質を発現する肝細胞株である。肝細胞株の主要な欠点の一つは、薬物スクリーニングの目的に不可欠である薬物輸送体タンパク質がないか、又は異常に高発現しているため、これは薬物代謝に関して特に関係する。他の利用可能な肝細胞株は、より臨床的に関連する成体肝細胞よりも、胎児又は若年肝細胞をより彷彿とさせる形態や生理機能を有することに悩まされる。これらの理由のため、培養し、増殖することが容易なだけでなく、より成熟した表現型を有し、成体初代肝細胞により類似する方法で働く、肝細胞細胞株を開発することが強く求められている。

多能性幹細胞由来の肝細胞様細胞誘導は、当該技術分野で十分に確立されている。ｉｎｖｉｔｒｏの目的のために、多くのグループが、ｈＥＳ細胞（Hayら、2007; Hayら、2008; Brolenら、2010; Funakoshiら、2011）と同様にｈｉＰＳ細胞（US8148151 B; Songら、2009; Sullivanら、2010; Si-Tayebら、2010; Chenら、2012）から肝細胞様細胞を誘導するためのプロトコールを開発した。しかし、これらのすべてに対する共通点は、第Ｉ相及び第ＩＩ相の遺伝子（例えば、ＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｄ６、３Ａ４）、核内受容体（例えば、ＣＡＲ及びＰＸＲ）、及び、他の成体肝マーカー（例えば、アルブミン）のように、成熟肝細胞に典型的な遺伝子の特異的なｍＲＮＡ及びタンパク質の低発現である。さらに、それらに記載される細胞タイプが胎児の表現型で、成体の表現型ではないという結果とともに、これらのｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＣＹＰ３Ａ７のような胎児肝遺伝子を高発現する（概要については、例えば、Baxterら、2010を参照のこと）。さらに、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞での発表された研究のほとんで、薬物輸送体の発現及び機能が全く検討されていない。

ＲＡシグナル伝達調節が、初期肝細胞分化と、特に、胚体内胚葉（ＤＥ）が肝内胚葉となるように特定（specified）される際の段階とで重要であることが以前に示された（Touboulら、2010）。さらに、ＲＡ応答エレメントは、ＡＦＰ及びＨＮＦ４ａなどの、初期肝細胞特定期間に重要な多くの遺伝子で同定されている（Qianら、2000; Mageeら、1998及びHatzisら、2001を参照のこと）。しかし、この初期の段階で、ＲＡは、多様な効果を有することが知られており、また、多能性幹細胞由来の膵臓内胚葉誘導で重要であることが発見されている（Mfopouら、2010）。米国特許出願公開US2012/0143316A1は、内胚葉様細胞由来の肝臓分化誘導で全トランスレチノイン酸を使用することを開示する。明らかなように、これらの開示の全てが、内胚葉及び初期肝細胞分化期間でのＲＡシグナル伝達調節に関する。しかし、これらの文献のいずれもが、肝細胞成熟促進剤としてレチノイン酸を適用すること、肝細胞分化の後期で単独でそれを使用することを教示も示唆もしていない。

内胚葉への初期分化に対してＧＳＫ３阻害剤を使用することが、以前に記載されている。WO2008094597（Dalton）は、分化培地でｐＰＳＣを有効量のＧＳＫ３阻害剤と接触させることによって霊長類の多能性幹細胞（ｐＰＳＣ）から中内胚葉を作製する方法を記載する。WO2007050043（Stanton）は、多能性幹細胞から中胚葉又は内胚葉細胞を作製する方法を記載し、多能性幹細胞のＷｎｔシグナル伝達経路を含む。US2006003446（Keller）は、血清の非存在下で、かつアクチビン及びＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下で、胚性幹細胞を培養して内胚葉細胞を濃縮した細胞集団を作製する方法を記載する。また、ＧＳＫ３阻害剤の使用を通じてＷｎｔシグナル伝達を調節することは、ＤＥ細胞がこの処理に曝露されるときに、肝細胞の細胞運命を特定する際に有益であることが示されている（WO2011/116930）。また、これらの開示の全ては、内胚葉又は肝臓特定の比較的初期段階でのＧＳＫ３シグナル伝達の調節に関する。

特定のマトリクス成分で細胞を培養することは、これらの増殖に影響し、多能性細胞の場合には、それらの最終的な分化に影響することが知られている。例えば、多能性幹細胞は、特定のマトリクス成分とともに幹細胞のオーバーレイを通じて、上皮から間葉への転換を経て、そこから、心臓細胞タイプへと発達することが示されている（WO2011060342）。さらに、マトリクス成分の定義した「サンドイッチ」で、成体の初代肝細胞を培養することは、それらの表現型及び代謝活性を維持するのに役立つことが長い間知られている（Dunnら、1991）、（Pageら、2007）。

本発明は、ｈｉＰＳ細胞及びｈＥＳ細胞に限定されるものなどではないヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞に由来する肝細胞様細胞であって、より密接にｅｘｖｉｖｏでの初代肝細胞に似た表現型を有する肝細胞様細胞にさらに成熟させることができる改良された方法を記載する。

本発明は、第一の態様において、肝細胞様細胞が、任意に、ＧＳＫ３シグナル伝達系の阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露、及び／又は哺乳動物細胞外マトリクスの１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞の重層（マトリクスオーバーレイ）との組み合わせで、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることにより、前記ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法を提供する。

したがって、前記ヒト肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することを含む前記ヒト肝細胞様細の成熟を促進する方法が提供される。

ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進する方法は、ヒト肝前駆細胞を前記肝細胞様細胞を取得するための分化条件下で培養することをさらに含む場合がある。

本発明は、第二の態様において、ヒト肝前駆細胞を肝細胞様細胞を得るための分化条件下で培養され、得られた肝細胞様細胞が、任意に、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露、及び／又は哺乳動物細胞外マトリクス（マトリクスオーバーレイ）の１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞のオーバーレイとの組み合わせで、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることにより、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法が提供される。

したがって、肝細胞様細胞を得るための分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養すること、及び、前記肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することを含むヒト肝細胞様細胞を産生する方法が提供される。

本発明者らは、驚くべきことに、例えば、レチノイン酸、レチノイン酸応答性受容体活性化剤の肝細胞様細胞の曝露が、成熟肝細胞の多数のマーカー、特に成人アイソフォームの、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＡＲ、ＧＳＴＡ１−１、及びＮＴＣＰの遺伝子及びタンパク質の発現を改善すること、したがって、初代肝細胞に顕著に似た表現型である肝細胞様細胞をもたらすことを見出した。さらに、レチノイン酸応答性受容体活性剤の曝露に対して、ＧＳＫ３阻害剤及び哺乳動物細胞外マトリクスの１種以上の特徴的な成分のオーバーレイは、肝細胞様細胞のヒト初代肝細胞により近似する表現型を作製するという驚くべき相乗効果が見出された。肝遺伝子と機能の改善された発現に加えて、例えば細胞−細胞接触が強化され、肝細胞様細胞の形態が改善され、肝細胞様細胞の寿命は７〜１０日に延長される（図８）。

レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤が、肝細胞様細胞への肝前駆細胞の分化、及び得られた肝細胞様細胞のさらなる成熟（「分化と成熟」）の間で、最大で３５日間の場合がある全体に亘って存在してもよい。このように、分化し成熟する肝細胞は、分化と成熟の間に連続的／長期的に曝露される場合がある。代替的に、例えば、５、２４又は４８時間などの連続的な期間で、４時間よりは長く７２時間を超えない連続的な期間で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に肝細胞様細胞を曝露する場合がある。肝細胞様細胞はまた、少なくとも３回、少なくとも４回又は少なくとも５回などの少なくとも２回の、４時間よりも長く７２時間を超えないの継続期間で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露する場合がある。少なくとも２回の連続的な期間は、通常、レチノイン酸応答性受容体活性化剤と前記の非曝露の期間によって分離される。このような非曝露の期間は、１２時間〜２４時間又は１日間〜２日間などの期間を有する場合がある。これに関連して、レチノイン酸応答性受容体活性化剤は、肝細胞様細胞の成熟中の任意の時点で培地に添加される場合がある。肝細胞様細胞は、肝細胞様細胞への肝前駆細胞の分化の開始後ｔ≧７日の時間でレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。したがって、肝細胞様細胞は、肝細胞様細胞への肝前駆細胞の分化の開始後７、９又は１２日目において、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。

本発明の方法は、分化条件下ｈＰＳ細胞を培養することにより、肝前駆細胞の初期世代（また、「初期肝分化」として以下に記載する）を含むことができる。そこで、ｈＰＳ細胞は、前記肝前駆細胞に最初に分化する。この初期培養又は分化は、胚体内胚葉（ＤＥ細胞）を得るための分化条件下でｈＰＳ細胞の培養（前内胚葉ステップ）を含む場合があり、さらに、培養した肝前駆細胞を得るための培養条件下で得られたＤＥ細胞をさらに培養すること（前肝ステップ）を含む場合がある。したがって、ｈＰＳ細胞は、このように最初に胚体内胚葉に分化し、次に、胚体内胚葉が肝前駆細胞へさらに分化する場合がある。

また、内胚葉及び／又は肝前駆細胞へのｈＰＳ細胞の初期分化の間、ゲノムのセクションの脱メチル化及び遺伝子の転写活性を許容するために、分化期のｈＰＳ細胞を５−アザ−２−デオキシシチジン又は５−アザシチジンなどのＤＮＡ脱メチル化剤に曝露する場合がある。前記ＤＮＡ脱メチル化剤への曝露は、ＤＥ細胞へｈＰＳ細胞の分化の間に、すなわち前内胚葉ステップの間に行う場合がある。そして、細胞は、肝前駆ステージに到達するまで培養される。すなわち、肝前駆細胞が得られるまで、ＧＳＫ−３阻害又はＷｎｔシグナル伝達活性化及び／又はマトリクスのオーバーレイとの組み合わせで、その時点で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露を含む、肝細胞様細胞のさらなる分化及び成熟が実施される。

ｈＰＳ細胞分化へのＤＮＡ脱メチル化剤の処理は、驚くべきことに、ＤＥ細胞の改善された形態及び収率をもたらすことが見出された。また、脱メチル化剤への曝露は、現在利用可能な技術の方法の状態と比較して、Ｏｃｔ４のような幹細胞マーカーの低い発現を伴って、より純粋で均一なＤＥ集団を提供する（図１３Ａ〜Ｄを参照のこと）。また、このようなｓｏｘ１７、ｃｘｃｒ４及びｈｈｅｘなどの胚体内胚葉に特徴的な多数のマーカーの遺伝子発現の増加（図１３のＤを参照のこと）が、これらの内胚葉細胞に対して観察される。このような効果は、ゲノムレベルでのメチル化の広範な欠損によって向上させ、胚体内胚葉に向かってのｈＰＳ細胞の分化に関与する、ＤＮＡの脱メチル化及び成長因子の適用が示されるのは初めてと考えられる。さらに、レチノイン酸応答性受容体活性化剤をＧＳＫ３阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイに対して単独で又はその組み合わせで、得られた肝前駆細胞に曝露する前で初期の内胚葉の発達中にＤＮＡの脱メチル化剤で細胞を処理するときに、肝細胞様細胞の成熟に対する強力な相乗効果が観察される。

本発明による方法の結果として、初代肝細胞に、より近似する表現型を有する肝細胞様細胞が得られる。成熟期以降の細胞の解析は、特に、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＡＲ、ＧＳＴＡ１の成人のアイソフォーム、及びＮＴＣＰに限定されるものではないが、成熟肝細胞のための特定のマーカーの発現レベルの明確な増加を示す（例えば図１Ｂ、４Ｂ＋Ｃ、６、９、１０、１２を参照のこと）。また、初代肝細胞とは対照的に、早期脱メチル化処理、並びに、レチノイン酸応答性受容体活性化剤及びＧＳＫ３阻害剤（又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤）及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露によって得られる肝細胞様細胞は、安定で増加したＣＹＰなど肝遺伝子の発現を培養時間と共に示す。初代培養肝細胞において、本発明の肝細胞様細胞で観察されるのと反対に、ＣＹＰ活性及びｍＲＮＡ発現は時間と共に急激に減少する（図１６を参照のこと）。別の広く使用される肝細胞のタイプは、本発明の肝細胞様細胞よりもはるかに低いＣＹＰ活性を示すＨｅｐＧ２細胞である。

本発明は、肝細胞様細胞が、任意にＣＤＫ阻害剤及び／又は哺乳動物細胞外マトリクス（マトリクスオーバーレイ）の１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞オーバーレイと組み合わせて、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することにより、前記ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法を提供する。

そこで、ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法は、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記ヒト肝細胞様細胞を曝露することを含み、提供される。

ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進する方法は、ヒト肝前駆細胞の前記肝細胞様細胞を取得するための分化条件下で培養することをさらに含む。

さらに、本発明は、ヒト肝臓前駆細胞が、肝細胞様細胞を得るための分化条件下で培養され、得られた肝細胞様細胞は、任意にＣＤＫ阻害剤及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクス（マトリクスオーバーレイ）の１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞のオーバーレイとの組み合わせで、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることによる、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法を提供する。

したがって、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法は、肝細胞様細胞を得るために、分化条件下でのヒト肝前駆細胞を培養すること、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記肝細胞様細胞を曝露することを含む方法が提供される。

上述したように、本発明者らは、驚くべきことに、特に成人、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤への肝細胞様細胞の曝露は、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＡＲ、ＧＳＴＡ１−１、及びＮＴＣＰのアイソフォームの多数の成熟肝細胞のマーカーの遺伝子及びタンパク質の発現を改善することを見出し、そして、初代肝細胞により近似した表現型を有する肝細胞様細胞をもたらす。さらに、レチノイン酸応答性受容体活性化剤の曝露に対して、ＣＤＫ阻害剤及び哺乳動物細胞外マトリクスの特徴を有する１種以上の成分のオーバーレイへの曝露が、ヒト初代肝細胞以上に近似する肝細胞様細胞の表現型を産生するという驚くべき相乗効果が見出された。肝遺伝子及び機能の発現の改善に加えて、例えば細胞−細胞接触が強化され、肝細胞様細胞の寿命は７〜１０日（図８）によって延長され、肝細胞様細胞の形態が改善される（図８）。

また、このようなレチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤は、肝細胞様細胞への肝前駆細胞の分化及び取得される肝細胞様細胞のさらなる成熟（「分化と成熟」）にわたって存在する場合があり、これは最大３５日かかる場合がある。このように、分化し成熟する肝細胞は、分化と成熟の間にレチノイン酸応答性受容体活性化剤に連続的／長期的に曝露される場合がある。代替的に、例えば、５、２４又は４８時間などの４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間で、肝細胞様細胞が前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、少なくとも3回、少なくとも４回又は少なくとも５回などの少なくとも２回の、４時間よりも長く、７２時間を超えない連続的な期間、前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。このような５、２４時間又は４８時間の連続的な期間の時間、時間の少なくとも２連続的な期間は、通常、前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤の非曝露の期間によって分離される。そのような非曝露の期間は、１２〜２４時間などの数時間、又は数日１〜２日などの１〜１０日間、持続時間を有する場合がある。これに関連して、レチノイン酸応答性受容体活性化剤は、肝細胞様細胞の成熟中の任意の時点で培地に添加される場合がある。肝細胞様細胞は、肝前駆細胞の肝細胞様細胞への分化の開始後のｔ≧７日の期間で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。したがって、肝細胞様細胞は、肝前駆細胞の肝細胞様細胞への分化の開始後７、９又は１２日目において、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。

本発明の方法は、（また、「初期肝分化」として以下に記載される）分化条件下、ｈＰＳ細胞を培養することにより、肝前駆細胞の初期世代を含む場合がある。したがって、ｈＰＳ細胞は、最初に前記肝前駆細胞に分化される。この初期培養又は分化は、胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）を得るための分化条件下で、ｈＰＳ細胞の培養を含む場合があり（前内胚葉ステップ）、さらに、得られたＤＥ細胞を肝前駆細胞を得るための分化条件下で培養することを含む場合がある（前肝ステップ）。したがって、ｈＰＳ細胞は、最初に胚体内胚葉に分化され、次に、胚体内胚葉の肝前駆細胞へのさらなる分化が続く場合がある。

また、内胚葉及び／又は肝前駆細胞へのｈＰＳ細胞の初期分化の間、分化ｈＰＳ細胞を、ゲノムのセクションを脱メチル化し遺伝子の転写活性化を許容するために、５−アザ−２−デオキシシチジン又は５−アザシチジンなどのＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。前記ＤＮＡ脱メチル化剤への曝露は、ＤＥ細胞へのｈＰＳ細胞の分化の間、すなわち前胚葉ステージの間に行われる場合がある。そして細胞は、内胚葉ステージから肝前駆ステージが到達されるまで、すなわち、肝前駆細胞が得られるまでさらに培養され、その時点で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤の単独又はＣＤＫ阻害及び／又はマトリクスのオーバーレイとの組み合わせでの曝露を含む肝細胞様細胞のさらなる分化及び成熟が、実施される。

ＤＮＡ脱メチル化剤でのｈＰＳ細胞の分化の処理が、驚くべきことに、改善された形態及びＤＥ細胞の収率をもたらすことが見出された。また、脱メチル化剤への曝露は、現在利用可能な技術的方法の状態と比較して、Ｏｃｔ４のような幹細胞マーカーの低い発現で、より純粋で均一なＤＥ集団を提供する（図１３Ａ〜Ｄを参照のこと）。また、このようなｓｏｘ１７、ｃｘｃｒ４及びｈｈｅｘなどの多数の胚体内胚葉に特徴的なマーカーの遺伝子発現の増加が、これらの内胚葉細胞に対して観察される（図１３Ｄを参照のこと）。このような効果は、ゲノムレベルでのメチル化の広範な欠損によって遺伝子レベルの活性が上昇される、ｈＰＳ細胞の胚体内胚葉に向かった分化に関与するＤＮＡ脱メチル化及び成長因子の適用のための効果が示されるのは初めてと考えられる。得られた肝前駆細胞にレチノイン酸応答性受容体活性化剤を曝露する前で、初期の内胚葉の発達中に、ＤＮＡ脱メチル化剤単独で又はＣＤＫ阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイと組み合わせて細胞を処理するときに、肝細胞様細胞の成熟に対する強力な相乗効果が観察される。

本発明による方法の結果として、初代肝細胞により近似する表現型を有する肝細胞様細胞が得られる。成熟期以降の細胞の解析は、ＨＮＦ４ａ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＡＲ、ＧＳＴＡ１及びＮＴＣＰの成人のアイソフォームに顕著であって、これらに限定されるものではなく、成熟肝細胞に対する特定のマーカーの発現レベルの明確な増加を示す（例えば図１Ｂ、４Ｂ＋Ｃ、６、９、１０、１２を参照のこと）。また、初代肝細胞とは対照的に、早期脱メチル化処理、及びレチノイン酸応答性受容体活性化剤、ＣＤＫ阻害剤及びマトリクスオーバーレイの後期曝露によって得られる肝細胞様細胞は、培養時間に伴ってＣＹＰｓのような肝臓の遺伝子の安定した又は増加した発現を示す。本発明の肝細胞様細胞で観察されるのとは反対に、初代培養肝細胞において、ＣＹＰ活性及びｍＲＮＡの発現は時間と共に急激に減少する（図１６を参照のこと）。もう一つの広く使用されている肝細胞のタイプは、本発明の肝細胞様細胞よりもはるかに低いＣＹＰ活性を示すＨｅｐＧ２細胞である。

したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる肝細胞様細胞、該肝細胞用細胞を含む又はから構成される細胞組成物に関する。

別の態様において、本発明は、医薬における、特に、再生医療における肝細胞様細胞又は本発明の細胞組成物のさらなる使用に関する。換言すれば、本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物の医薬に対する使用、特に、再生医療に対する使用である。特に、本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物は、組織の変性により惹起される病態及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するためのものである。本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物は、肝障害の予防及び／又は治療に使用するためでもある。本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物は、代謝性の病態及び／又は疾患の予防及び／又は治療に使用するためでもある。本発明のこのような肝細胞様細胞又は細胞組成物は、特に、組織変性によって惹起される病態及び／又は障害の予防及び／又は治療のために、代替組織又は細胞の注射の形態などの、医薬又は医薬製品の製造に使用される場合がある。本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物はまた、医薬又は医薬製品の製造、又は肝障害の予防及び／又は治療のために使用される場合がある。本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物は、代謝性の病態及び／又は疾患の予防及び／又は治療のための医薬又は医薬製品の製造のために使用される場合がある。また、本明細書に記載の病態及び／又は障害の治療のための方法は、本発明の細胞又は細胞組成物を必要とする被験体に有効量を投与することを含む態様が含まれる。

他の態様において、本発明は、創薬プロセス又は毒性試験；薬物トランスポーターや薬物代謝酵素を研究するため、肝再生を研究するためのｉｎｖｉｔｒｏモデルとして、ヒト肝再生障害を研究するため；などの薬学的及び毒物学的スクリーニングにおいて、本発明の肝細胞様細胞又は細胞組成物のさらなる用途を提供する。

さらなる態様において、本発明は、ヒト肝細胞様細胞の成熟のためのレチノイン酸応答性受容体活性化剤の使用に関する。また、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤及び／又はヒト肝細胞様細胞の成熟のためのマトリクスオーバーレイと組み合わせて、レチノイン酸応答性受容体活性化剤の使用が、この態様に含まれる。さらに、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤及び／又はヒト肝細胞様細胞を成熟させるためのマトリクスオーバーレイと組み合わせて、レチノイン酸応答性受容体活性化剤の使用が本発明の態様に含まれる。また、ＣＤＫ阻害剤及び／又はヒト肝細胞様細胞を成熟させるためのマトリクスオーバーレイとの組み合わせで、レチノイン酸応答性受容体活性化剤の使用が、本発明の態様に含まれる。

さらなる態様において、本発明は、本発明の方法を実施するのに有用なキットに関する。この態様に含まれる少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、並びにＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤、ＣＤＫ阻害剤及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物から選択される少なくとも１種を含むキットである。これは、本発明の方法において使用される成分に関して本明細書で与えられる詳細は、本発明のキットに含まれる成分に適用されることが理解される。

さらなる態様において、本発明は、組成物に関する。このような組成物は、本発明によるヒト肝細胞様細胞の成熟のために特に有用である。少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、並びにＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤及びＣＤＫ阻害剤から選択される少なくとも１種を含む組成物が、この態様に含まれる。これは、本発明の方法において使用される成分に関して本明細書で与えられた詳細は、本発明の組成物に含まれる成分に適用されることが理解される。

発明の詳細な説明

本発明は、レチノイン酸受容体活性化剤単独の細胞への曝露、又はＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露、及び／又は哺乳動物細胞外マトリクス（マトリクスオーバーレイ）の１種又は複数種の構成成分を有する細胞のオーバーレイとの組み合わせで、ヒト肝細胞様細胞を成熟させるための方法を提供する。本方法は、肝細胞様細胞を取得するために、細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露単独又はＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤とＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスの一種以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）との組み合わせで、ヒト肝前駆細胞の補助的な培養と分化培地での培養をさらに含む場合がある。

また、本発明は、レチノイン酸受容体活性化剤単独の細胞への曝露、又はＣＤＫ阻害剤への曝露、及び／又は哺乳動物細胞外マトリクス（マトリクスオーバーレイ）の１種又は複数種の構成成分を有する細胞のオーバーレイとの組み合わせで、ヒト肝細胞様細胞を成熟させるための方法も提供する。本方法は、肝細胞様細胞を取得するために、細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露単独又はＣＤＫ阻害剤への曝露及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスの一種以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）との組み合わせで、ヒト肝前駆細胞の補助的な培養と分化培地での培養をさらに含む場合がある。

本発明の出発材料は、内胚葉の段階を超えて任意の段階に発達される、胎児肝細胞及び肝前駆細胞などに限定されない、肝細胞への運命を有する任意の細胞の場合がある。

上記に概説したように、本発明は、肝細胞様細胞は、例えば、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることにより、任意に、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤とＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露及び／又は哺乳動物細胞外マトリクスの１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）との組み合わせで、前記ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法を提供する。

したがって、ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進する方法は以下のステップ、
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記ヒト肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。

ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法は、肝細胞様細胞を取得する分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養する工程をさらに含む場合がある。

本発明はまた、ヒト肝前駆細胞が肝細胞様細胞を得るための分化条件下で培養され、そして得られた肝細胞様細胞は、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることにより、任意に、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスの１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）との組み合わせで、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法を提供する。

したがって、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法は、以下のステップ
肝細胞様細胞を得るための分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養するステップ、及び
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。

本発明は、任意に、ＣＤＫ阻害剤への曝露及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスの１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）を組み合わせて、肝細胞様細胞をレチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することにより、前記ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法もまた提供される。

ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進する方法は、以下のステップ
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記ヒト肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。

ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法は、前記肝細胞様細胞を取得するための分化条件下で、ヒト肝前駆細胞を培養するステップをさらに含む場合がある。

本発明はまた、肝細胞様細胞を得るための分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養し、そして得られた肝細胞様細胞は、任意にＣＤＫ阻害剤への曝露及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスの１種以上の特徴的な構成成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）と組み合わせて、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることにより、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法を提供する。

したがって、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法は、以下のステップ、
肝細胞様細胞を得るために、分化条件下でのヒト肝前駆細胞を培養するステップ、及び
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。

したがって、ヒト肝前駆細胞が、本発明の出発材料として使用される場合がある。出発材料の肝前駆細胞は、例えば、肝前駆細胞の樹立細胞株であってもよく、又はｈＰＳ細胞又は内胚葉細胞などから新たに調製されてもよい。

肝細胞様細胞の分化及び成熟は、２つの段階に分ける場合がある。すなわち、肝前駆細胞が肝細胞様細胞（「肝前駆期」）に分化する第一段階、及び得られた肝細胞様細胞がさらに成熟する第二段階（成熟期段階）に分けることができる。成熟期段階の間、得られた肝細胞様細胞は、肝細胞に特徴的なマーカーの増大した遺伝子及びタンパク質の発現を示す。

ｈＥＳ細胞から肝細胞様細胞への肝前駆細胞へ分化させるための適切な条件（Hayら、2007；Hayら、2008；Brolenら、2010；Funakoshiら、2011）と、ｈｉＰＳ細胞から肝細胞様細胞への肝前駆細胞へ分化させるための適切な条件（US8148151B；Songら、2009；Sullivanら、2010；のＳｉ−のTayebら、2010；Chenら、2012）が知られている。WO2009/013254A1は、例えば、肝前駆細胞からの肝細胞様細胞（実施例１〜４）を得るのに適した基本的なプロトコールを記載する。

一般的に、肝前駆細胞は、ＨＧＦなどの１種以上の成長因子、及び／又は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デキサメタゾン（ＤｅｘＭ）、オメプラゾール、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、リファンピシン、デスオキシフェノバルビタール（プリミドン）、エタノール、イソニアジドなどの１種以上の分化誘導剤を含む分化培地で培養される。ＨＧＦなどの1種以上の成長因子の濃度は、通常、約２０〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約１５０ｎｇの／ｍＬ若しくは約５０〜約１００ｎｇ／ｍＬであり；又は約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ若しくは約３００ｎｇ／ｍＬなどの約１０〜約３００ｎｇ／ｍＬの範囲である。１種以上の分化誘導剤の濃度は、使用される特定の化合物に依存して変化する場合がある。ＤＭＳＯの濃度は、例えば、通常、約０．１５〜約１．５％ｖ／ｖ、約０．１５〜約１％ｖ／ｖ、約０．２５〜約１％ｖ／ｖ、１５、約０．２５〜約０．７５％ｖ／ｖ、約０．５〜約１、５％ｖ／ｖ、約０．５〜約１％（ｖ／ｖ）などの約０．１〜約２％ｖ／ｖの範囲である。ＯＳＭの濃度は、例えば、通常、約１〜約１５ｎｇ／ｍＬ、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬ、又は約７．５〜１２．５ｎｇ／ｍＬなどの約１〜約２０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＤｅｘＭの濃度は、例えば、通常、約０．０５〜約０．５μΜ、約０．０５〜約０．２μΜ、約０．０５〜約０．１μΜ、又は約０．１から約０．５μΜなどの０．０５〜約１μΜの範囲である。

分化培地は、ＦＢＳ又はＦＣＳなどの血清、及び／又は骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、及び／又は骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）などの１種以上の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む場合がある。血清濃度は、存在する場合、通常、約０．１〜約０．５％、０．２〜３％ｖ／ｖ、約０．５〜約２．５％ｖ／ｖ又は約０．５〜約１％ｖ／ｖなどの約０．１〜約５％ｖ／ｖの範囲である。１種以上のＢＭＰ濃度は、存在する場合、通常、約５０〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１００〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約１５０〜約２５０ｎｇ／ｍＬ、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ又は約１５０ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬなどの約５０〜約３００ｎｇ／ｍＬの範囲である。

分化培地は、さらに、ＰＥＳＴ及び／又はＧｌｕｔａＭＡＸなどの他の補助剤を含んでもよい。ＰＥＳＴの濃度は、通常、約０．１〜約０．２５％ｖ／ｖなどの約０．１〜約０．５の範囲である。ＧｌｕｔａＭＡＸの濃度は、通常、例えば、約１％ｖ／ｖ、約０．７５〜約１％（ｖ／ｖ）などの、約０．５〜約１．５％（ｖ／ｖ）の範囲である。

分化培地の基礎を形成する培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０、又はアドヴァンスト培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨＣＭ培地、ＨＢＭ培地、ウェイマウス培地又はウィリアムＥ基礎培地などのヒト肝前駆細胞の培養に適したいかなる培地であってもよい。したがって、分化培地は、上記の成分を含む又は補充したＲＰＭＩ１６４０又はアドヴァンスト培地の場合がある。代替的に、分化培地は、上記の成分を含む又は補充したＭＥＭであってもよい。さらなる代替として、分化培地は、このように上記の成分を含む又は補充したＨＣＭ又はＨＢＭ培地の場合がある。さらなる代替として、分化培地は、上記成分を含む又は上記成分を補充したウェイマウス培地又はウィリアムＥ基礎培地であってもよい。

ヒト肝前駆細胞の分化、及び得られた肝細胞様細胞のさらなる成熟（「分化及び成熟」）は、通常、最大で３５日を要する。したがって、肝細胞様細胞を得るために、ヒト肝前駆細胞を、最大３５日間、分化培地で培養する。例えば、ヒト肝前駆細胞は、約７〜約３５日の間のいずれかの期間に分化培地中で培養される場合がある。したがって、これらはまた、約１０〜約３０日間培養される場合がある。また、約１０〜約２５日間培養される場合がある。代替的に、それらは、約１０〜約２０日間、又は約１０〜約１５日間培養される場合がある。また、約１５〜約３５日間培養される場合がある。したがって、それらはまた、約１５〜約３０日間培養される場合がある。代替的に、それらは、約１５〜約２５日間培養される場合がある。また、約１５〜約２０日間培養される場合がある。培養の間に、分化培地は、通常２日又は３日ごとに新鮮な培地に交換される。

上記の条件の下で、肝細胞様細胞は、培養７日又はその後に肝前駆細胞から得られる。したがって、分化及び肝細胞様細胞の成熟は、肝前駆細胞は肝細胞様細胞に分化する７日の肝前駆段階に分けられる場合があり、それによって得られた肝細胞様細胞をさらに成熟させる全培養期間の終了時まで（例えば、３５日目まで）、熟成段階が持続する場合がある。

本発明の方法に用いられるレチノイン酸応答性受容体活性化剤は、例えば、ヒトレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）及び／又はヒトレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に結合し、活性化可能ないかなる化合物、例えば、ＲＡＲとＲＸＲの両方に結合し活性化することができる化合物であってもよい。

本発明での使用のためのレチノイン酸応答性受容体の適切な活性化剤は、９−シス−レチノイン酸及び１３−シス−レチノイン酸、又は、７−シスレチノイン及び１１−シス−レチノイン酸を含む他のレチノイン異性体、又は、例えば、ＴＴＮＰＢ、ＡＭ５８０、レチロイン酸(retilloic acid)又はＣＢＳ−２１１Ａなどのレチロイン酸類似体、又はレチノイドである。

これにより、９−シス−レチノイン酸が、本発明に従ったレチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。代替的に、又は付加的に、１３−シス−レチノイン酸が、本発明に従ったレチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。１３−シスレチノイン酸もまた、本発明に従ったレチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。

９−シス−レチノイン酸が、例えば、ＲＸＲとＲＡＲの両方に結合し、活性化するレチノイン酸の立体異性体であると報告されている（Allenbyら；Idresら）。しかし、別の報告書はまた、１１−シス−レチノイン酸、１３−シス−レチノイン酸及び全トランスレチノイン酸はＲＸＲに結合するが、９−シス−レチノイン酸よりもはるかに低い親和性であると主張する（Heymanら）。まとめると、これらの報告は、９−シス−レチノイン酸は、他のＲＡ異性体と比較して、主要なＲＸＲ活性化剤であることを示唆する。したがって、本発明で使用するためのレチノイン酸応答性受容体活性化剤は、レチノイン酸、レチノイン酸類似体又はＲＡＲ及びＲＸＲの両方に結合、活性化することができる、例えば、９−シスレチノイン酸若しくはその類似体などのレチノイドである場合がある。

さらに、全トランスレチノイン酸、７−シス−レチノイン酸、１１−シス−レチノイン酸又は１３−シス−レチノイン酸が、レチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。これらの異性体は、選択的にＲＡＲに結合し、ＲＸＲに結合しない（Allenbyら；Idresら）、又は９−シス−レチノイン酸よりもＲＸＲに対してかなり低い親和性を有すること（Heymanら）が示されている。したがって、本発明で使用するためのレチノイン酸応答性受容体活性化剤は、例えば、全トランスレチノイン酸若しくは全トランスレチノイン酸類似体又は７−シス−レチノイン酸又は７−シス−レチノイン酸の類似体、又は１１−シス−レチノイン酸若しくは１１−シス−レチノイン酸の類似体、又は１３−シスレチノイン酸又は１３−シスレチノイン酸の類似体などのＲＡＲに結合し活性化することができ、ＲＸＲに対してそのような活性がない若しくは弱い、レチノイン酸、レチノイン酸類似体又はレチノイドの場合がある。

本発明における使用のためのレチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、例えば、ベキサロテン（ＬＧＤ１０６９）、ＬＧ１００２６８又はＳＲ１１２３７などの、ＰＡＲのみに結合し活性化させることができ、ＲＸＲに対してそうではない、レチノイドの場合がある。

上述のように、例えば、ＴＴＮＰＢ、ＡＭ５８０、レチロイン酸又はＣＢＳ−２１１Ａなどのレチノイン酸類似体もまた、レチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。したがって、レチノイン酸類似体ＴＴＮＰＢはレチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。代替的に、レチノイン酸類似体ＡＭ５８０が、レチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合がある。

また、レチノイン酸応答性受容体活性化剤として、ヒトレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）及び／又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に結合し活性化させる小分子、脂質、ポリペプチド又はタンパク質の使用がまた想定される。このような化合物の非限定的な例としては、すべてがＲＡＲ又はＲＸＲのアゴニストとして知られるＣｈ５５、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＣＤ１５３０、ＣＤ４３７、ＣＤ３２５４、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、ＢＭＳ９６１、アダパレン、タザロテン、ドコサヘキサエン酸及びフルオロベキサロテンである。

代替的に、肝細胞様細胞は、一つ以上の更なるレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。したがって、肝細胞様細胞は、１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されるだけではなく、また、上述の中の、２種、３種の組み合わせなどの１種以上の更なるレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、例えば、９−シス−レチノイン酸及び１３−シス−レチノイン酸の両方に曝露される場合がある。

本発明の一態様では、分化及び成熟している肝細胞が、肝細胞様細胞の分化及び成熟中にレチノイン酸応答性受容体活性化剤に連続的／長期的に曝露される。したがって、レチノイン酸応答性受容体活性化剤は、分化及び成熟期間にわたって分化培地中に存在する場合がある。

分化及び成熟肝細胞は、例えば、最大約３５日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。これらは、例えば、約１０日〜約３０日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１０日〜約２５日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１０日〜約２０日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１０日〜約１５日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１５日〜約３５日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１５日〜約３０日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１５日〜約２５日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。また、約１５日〜約２０日間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。

本発明の別の態様では、肝細胞様細胞は、４時間よりも長く７２時間を超えない時間の連続的な期間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される。したがって、分化及び成熟期間中に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間に、分化培地中で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤が添加される場合があり、したがって存在する。

曝露時間の連続的な期間は、約５〜約１０時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約５〜約１２時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約５〜約１８時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約５〜約２４時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約５〜約４８時間の場合がある。したがって、曝露時間の連続的な期間は約５時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１２〜約１８時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１２〜約２４時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１２〜約４８時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１２〜約７２時間の場合がある。したがって、曝露時間の連続的な期間は約１２時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１８〜約２４時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１８〜約４８時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約１８〜約７２時間の場合がある。したがって、曝露時間の連続的な期間は約１８時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約２４〜約４８時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約２４〜約７２時間の場合がある。したがって、曝露時間の連続的な期間は約２４時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間はまた、約４８〜７２時間の場合がある。したがって、曝露時間の連続的な期間は約４８時間又は約７２時間の場合がある。

曝露時間の連続的な期間は、例えば、約５、約１０、約１２、約１８、約２４、約４８又は約７２時間の場合がある。曝露時間の連続的な期間は、約５時間の場合がある。それはまた約２４時間の場合がある。また別の方法として、代替的に、曝露時間の連続的な期間は約４８時間の場合がある。

例えば、実施例４（図２）に示されるように、例えば、５、２４及び４８時間、ここで、９−シス−レチノイン酸であるレチノイン酸応答性受容体活性化剤への肝細胞様細胞の曝露は、非処理の細胞と比較してＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａ活性の増加をもたらす。また、５時間又は２４時間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に肝細胞様細胞を曝露すると、成人の肝臓遺伝子ＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現の増加と胎児の肝臓遺伝子ＣＹＰ３Ａ７の強い減少が直ちに観察される（実施例５、図３を参照のこと）。

肝細胞様細胞は、４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間に、１回、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合があるだけではなく、また、例えば、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回などの少なくとも２回、５、２４時間又は４８時間の連続的な期間などの４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。したがって、肝細胞様細胞は、例えば、４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間の２回で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、４時間より長く７２時間を超えない連続的な期間の３回で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、４時間より長く７２時間を超えない連続的な期間の４回で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、４時間より長く７２時間を超えない連続的な期間の５回で、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。

実施例４に示されるように、レチノイン酸応答性受容体活性化剤への反復曝露は、一回の曝露よりも、例えば、ＣＹＰ１Ａ及びＣＹＰ２Ｃ９の強い増加効果を有する。

曝露時間のこの連続的な期間の後、分化培地は、レチノイン酸応答性受容体活性化剤を欠いたものに交換し、分化細胞の培養が継続される。したがって、肝細胞様細胞が、曝露時の少なくとも２つの連続した期間でレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される上記で定義されたプロトコールでは、少なくとも２つの連続した期間又は曝露が、レチノイン酸応答性受容体活性化剤に非曝露の期間によって分離される。非曝露期間は、１２〜２４時間又は１〜１０日間などの、数時間〜数日間の持続時間を有する場合がある。非曝露期間は１〜２日間の期間を有する場合がある。非曝露期間はまた、１〜５日間の期間を有する場合がある。非曝露期間はまた、２〜５日間の持続時間を有する場合がある。非曝露期間は、例えば、１日の持続時間を有する場合がある。非曝露期間も２日間の持続期間を有できる。非曝露の期間は、例えば、５日間の期間を有する場合がある。

肝細胞様細胞が得られた後、本発明によれば、例えば、培養７、９、１、１３、１５、２０、２５及び／又は３０日後などの任意の時点でレチノイン酸応答性受容体活性化剤が分化培地に添加される場合がある。

したがって、レチノイン酸応答性受容体活性化剤は、例えば、分化及び成熟の７日目と１５日目の間などの、７日目及び３０日目の間の４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間に、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤は、分化及び成熟の７日目と９日目の間の４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。

したがって、レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の７日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間に、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の９日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の１１日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の１３日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の１５日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の２０日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の２５日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。レチノイン酸応答性受容体活性化剤はまた、分化及び成熟の３０日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。

レチノイン酸応答性受容体活性化剤は分化及び成熟の７及び９日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。分化及び成熟の７、９及び１１日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。分化及び成熟の１、６、９及び１６日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。分化及び成熟の７、９、１１及び１６日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。分化及び成熟の７、９、１１、１３及び１６日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。分化及び成熟の１、７、９、１１及び１６日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。分化及び成熟の１、３、７、９、１１及び１６日目に４時間よりも長く７２時間を超えない連続的な期間、分化培地に添加される場合がある。

肝細胞様細胞は、例えば、約０．５〜約１．５μΜなどの約０．１〜約５μΜの濃度範囲内のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に一般的に曝露される。

したがって、肝細胞様細胞は、約０．１〜約２．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約０．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約０．３μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２〜約５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２〜約２．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２〜約１．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約３μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約３μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１．２５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約１．５μΜの濃度範囲のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞は、約０．１μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１．２５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１．５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１．７５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約２μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約２．５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約３μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約３．５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約４μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約５μΜの濃度のレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合がある。

同様の濃度は、例えば、９−シス−レチノイン酸は、本発明のレチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用されるケースで使用される場合があり、肝細胞様細胞に、例えば約０．２μΜの濃度などの、例えば約０．１〜約０．５μΜの濃度範囲内などの、約０．１〜約２．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞は、９−シス−レチノイン酸が約０．１〜約２μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．１〜約１．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．１〜約１μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．１〜約０．７５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．１〜約０．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．１〜約０．３μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．２〜約２．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．２〜約１．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．５〜約２．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．５〜約２μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．５〜約１．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．５〜約１μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．７５〜約２．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．７５〜約２μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．７５〜約１．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．７５〜約１．２５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１〜約２．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１〜約２μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１〜約１．５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞は、９−シス−レチノイン酸が約０．１μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．２μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．５μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約０．７５μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１．２５μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１．５μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約１．７５μΜの濃度で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９−シス−レチノイン酸が約２μΜの濃度で曝露される場合がある。

例えば、１３−シス−レチノイン酸が本発明のレチノイン酸応答性受容体活性化剤として使用される場合に、同様の濃度が使用される場合がある。

レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることに加えて、肝細胞様細胞は、任意に、ＧＳＫ−３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスに特徴的な１種以上の成分のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）にも曝露される場合がある。したがって、レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露は、ＧＳＫ−３阻害剤への曝露又はマトリクスオーバーレイ、又はその両方への曝露と組み合わされる。レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露はまた、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤又はマトリクスオーバーレイ、又はその両方への曝露とも組み合わせる場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤及び／又はマトリクスオーバーレイへの分化肝前駆細胞のさらなる曝露は、さらに、肝細胞様細胞の成熟及び機能的特徴の改善が示された（図４）。

本発明の方法で使用されるＧＳＫ−３阻害剤は、ＧＳＫ−３シグナル伝達を阻害することができるいずれかの化合物の場合がある。本発明で使用するのに適したＧＳＫ−３阻害剤はまた、ケンパウロン又はＮＳＣ６６４７０４としても知られる９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン；１−アザ−ケンパウロン（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−ピリド［３’，２’：２，３］アゼピノ［４，５−ｂ］インドール−６（５Ｈ）−オン）；アルスターパウロン（９−ニトロ−７，１２−ジヒドロインドロ−［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５）−オン）；また、ＡＴ−７５１９としても知られる４−（２，６−ジクロロベンズアミド）−Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド；また、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）としても知られるＮ−（５−（（５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル）メチルチオ）チアゾール−２−イル）ピペリジン−４−カルボキサミド；またＡＺＤ５４３８としても知られる４−（１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−Ｎ−（４−（メチルスルホニル）フェニル）ピリミジン−２−アミン；また、ＢＩＯ（ＧＳＫ３阻害剤ＩＸ）としても知られる（２’Ｚ，３£）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；ＢＩＯ−アセトキシム（ＧＳＫ３阻害剤Ｘ）として知られる（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム；（５−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミン（ＧＳＫ３−阻害剤ＸＩＩＩ）；ピリドカルバゾール−シクロペナジエニルルテニウム錯体（ＧＳＫ３阻害剤ＸＶ）；ＴＤＺＤ−８４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（ＧＳＫ３β阻害剤Ｉ）；２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（1−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩ）；ＯＴＤＺＴ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（ＧＳＫ３ベータ阻害剤ＩＩＩ）；α−４−ジブロモアセトフェノン（ＧＳＫ３β阻害剤ＶＩＩ）；また、ＡＲ−ＡＯ１４４１８（ＧＳＫ−３ベータ阻害剤ＶＩＩＩ）としても知られるＮ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素；３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオン（ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩ）；ＴＷＳＩ１９ピロロピリミジン化合物（ＧＳＫ３β阻害剤ＸＩＩ）；Ｌ８０３Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２又はミリストイルエステル体（ＧＳＫ３β阻害剤ＸＩＩＩ）；２−クロロ−１−（４，５−ジブロモ−チオフェン−２−イル）−エタノン（ＧＳＫ３β阻害剤ＶＩ）；アミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１；また、ＳＢ２１６７６３としても知られる３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；そしてインジルビン−３’−オキシムである。ＧＳＫ−３阻害剤は、上記の群から選択される場合がある。

本発明の方法において使用される場合がある他の適切なＧＳＫ−３阻害剤は、３Ｆ８（５−エチル−７，８−ジメトキシ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｃ］イソキノリン−１，３−（２Ｈ）−ジオン）、Ａ１０７０７２２、ベリリウム、銅、リチウム、水銀、タングステン（ウォルフラム）及び亜鉛などの無機イオン、ＡＲ−０１４４１８、ＡＺＤ２８５８、アキシンＧＩＤ−２５残基（ペプチド）、ビスインドリルマレイミド類、ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＴ９８０１４）、ＣＨＩＲ９８０２３（ＣＴ９８０２３）、ＦＲＡＴｉｄｅ−３９残基（ペプチド）、ハロメチルケトン誘導体、例えば、ＨＭＫ−３２、ＫＴ５７２０、Ｌ８０３−ｍｔｓ（ペプチド）及び変異体、ＬＹ２０９００３１４、ＮＰ−１２（Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＮＰ０３１１１２）、ＮＰ００１１１、ＮＰ０３１１１５、ポリ酸素ビス−７−アザインドリル−マレイミド類、ＲＯ３１−８２２０、ＳＢ４１５２８６（マレイミド）、ＴＣ−Ｇ２４、ＴＣＳ２００２、ＴＣＳ２１３１１、ＴＤＺＤ−８、ＴＯＳ１１９及びＴＷＳ１１９（ジフルオロアセテート）である。ＧＳＫ−３阻害剤は、上記の群から選択される場合がある。

ＧＳＫ−３阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、アミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１及びインジルビン−３’−オキシムから選ばれる場合がある。

本発明の方法で使用されるＧＳＫ−３阻害剤は、ケンパウロン９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、1−アザケンパウロン−１の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、アルスターパウロンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＡＴ−７５１９の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＡＺＤ５４３８の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＢＩＯ（２’Ｚ，３’£）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシムの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＢＩＯ−アセトキシム（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシムの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、（５−メチルビス−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）（２−フェニルキナゾリン−４−イル）アミンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ピリドカルバゾール−シクロペナジエニルルテニウム錯体の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＴＤＺＤ−８４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、２−チオ（３−ヨードベンジル）−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾールの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＯＴＤＺＴ２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、α−４−ジブロモアセトフェノンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＡＲ−ＡＯ１４４１８Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）尿素の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、３−（１−（３−ヒドロキシプロピル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル］−４−ピラジン−２−イル−ピロール−２，５−ジオンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＴＷＳＩ１９ピロロピリミジン化合物の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、Ｌ８０３Ｈ−ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２又はミリストイルエステル体の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、２−クロロ−１−（４，５−ジブロモチオフェン−２−イル）−エタノンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、アミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１の場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、ＳＢ２１６７６３、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンの場合がある。ＧＳＫ−３阻害剤はまた、インジルビン−３’−オキシムの場合がある。

肝細胞様細胞は、１種のＧＳＫ−３阻害剤に曝露されるだけではなく、また、上記のそれらの２種、３種又は４種の組み合わせなどの１種以上のさらなるＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞は、一般に、約０．０１〜約１０μΜの濃度範囲で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞は、約０．０５〜約５μΜの濃度範囲のＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、したがって、約０．０５〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、したがって、約０．０５〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約２μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約１．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約１μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約０．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、約０．０５〜約５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、したがって、約０．１〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約０．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約１．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約１μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約０．７５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約０．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．０μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約４μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約３μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約１．５μΜの濃度範囲内で、ＧＳＫ−３阻害剤に曝露される場合がある。

例えば、ケンパウロンはＧＳＫ３阻害剤として使用される場合には、例えば、約０．５〜約１．５μΜなどの濃度範囲の、約０．０５〜約５μΜの濃度範囲で曝露される場合がある。

肝細胞様細胞は、約０．０５〜約２μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約１．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約１μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約０．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約０．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約２．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約１．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約１μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約０．７５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約０．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．０μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約１．５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露される場合がある。

同様の濃度が、例えば、１−アザ−ケンパウロン又はアルスターパウロンが、本発明のＧＳＫ−３阻害剤として使用され場合に使用される場合がある。

ＧＳＫ３の阻害に加えて、本発明にしたがって使用されるＧＳＫ−３阻害剤はさらに、ＣＤＫ２などのサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に対する阻害活性を示す場合がある。このような二重阻害剤の例は、ケンパウロン、ＡＴ−７５１９ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）及びＡＺＤ５４３８である。このような二重阻害剤のさらなる例は、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロンとインジルビン−３’−オキシムである。さらに、このような二重阻害剤のさらなる例は、２−ブロモ−９−ニトロパウロン、２−ブロモ−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ブロモパウロン、２−ヨード−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ヨードパウロン、２−フェニル−４−（２−チエニル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、２−［２−（１−ヒドロキシシクロヘキシル）−エチニル］−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシ−９−ニトロパウロン、２，３−ジメトキシ−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシパウロン、２−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、２，９−ジブロモパウロン、３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−プロピオニトリル、４−メトキシパウロン、４−（４−クロロフェニル）−２−（２−ナフチル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、５−ベンジル−９−ブロモパウロン、５−ヨード−インジルビン−３−モノオキシム、５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、６−ブロモインジルビン、８，１０−ジクロロパウロン、９−ブロモ−２，３−ジヒドロキシパウロン、９−ブロモ−２，３−ジメトキシパウロン、９−ブロモ−４−ヒドロキシパウロン、９−ブロモ−４−メトキシパウロン、９−ブロモ−５−エチルパウロン、９−ブロモ−５−（メチルオキシカルボニルメチル）パウロン、９−ブロモ−５−メチルパウロン、９−ブロモ−５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、９−ブロモ−５，７−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，７−１２−トリ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，１２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−（ヒドロキシアミノ）−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−メチルチオ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−チオン、９−ブロモ−１２−（２−ヒドロキシエチル）−パウロン、９−ブロモ−１２−（２−プロペニル）−パウロン、９−ブロモ−１２−エチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルオキシカルボニル−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−クロロパウロン、９−シアノパウロン、９−シアノ−２，３−ジメトキシパウロン、９−フルオロパウロン、９−メトキシパウロン、９−メチルパウロン、９−オキソ−チアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリン−２−カルボニトリル誘導体、９−トリフルオロメチルパウロン、１０−ブロモパウロン、１１−ブロモパウロン、１１−クロロパウロン、１１−エチルパウロン、１１−メチルパウロン、アロイシン類（＝６−フェニル［５Ｈ］ピロロ［２，３−６］ピラジン類）；例えばアロイシンＡ、ＡＺＤ１０８０、ビス−インドールインジルビン、デブロモヒメニアルジシン、ジブロモカンタレリン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリル酸メチルエステル、（Ｅ）−２−（３−オキソ−１−ブテニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリロニトリル、インジルビン、ヒメニジン、ヒメニアルジシン、マンザミン類、例えばマンザミンＡ、メリジアミン類、パウロン、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体、ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン誘導体及びチアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリノ−９−オン誘導体である。

ＧＳＫ３阻害剤の代わりに、肝細胞様細胞は、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。本発明の方法に用いられるＷｎｔシグナル伝達活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化するいかなる化合物であってもよい。

本発明で使用するためのＷｎｔシグナル伝達の適切な活性化剤は、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ／１３、Ｗｎｔ３Ａの、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６などのＷｎｔタンパク質であり、実際は、組換え型の場合がある。

したがって、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤は、上記のＷｎｔタンパク質の群から選択される場合がある。Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤は、例えば、Ｗｎｔ３Ａの場合がある。Ｗｎｔシグナル伝達の性化剤はまた、Ｗｎｔ５Ａの場合がある。

肝細胞様細胞は、一般に、約０．０５〜約１０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞は、約０．０５〜約５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約２〜約５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２．５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２．５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１．５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２．５ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。

そのような場合、例えば、Ｗｎｔ３ＡがＷｎｔシグナル伝達活性化剤として使用され、肝細胞様細胞は、例えば、約０．５〜約２．５μＭなどの約０．０５〜約１０ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内で、Ｗｎｔ３Ａに曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞で約０．０５〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約２〜約５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２．５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度でＷｎｔ３Ａに曝露される場合がある。

肝細胞様細胞は、１種のＷｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露されるだけではなく、また、上記のものの２、３又は４種の組み合わせなどの１種以上のＷｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される場合がある。

レチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露されることに加えて、肝細胞様細胞は、任意に、ＣＤＫ阻害剤及び／又は哺乳動物の細胞外マトリクスの特徴の１種以上の成分のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。したがって、レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露は、ＣＤＫ阻害剤への曝露又はマトリクスオーバーレイ、又はその両方への曝露と組み合わされる場合がある。ＣＤＫ阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイへの分化肝前駆細胞の追加の曝露は、さらに、肝細胞様細胞のための成熟した及び機能的な特徴を改善することが示された（図４）。

本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の機能（例えば、活性）を阻害するいかなる化合物であってもよい。本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９の１種以上の阻害剤の場合がある。本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）阻害剤の場合がある。本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、例えば、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の阻害剤の場合がある。本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、例えば、ＣＤＫ２及びＣＤＫ５の阻害剤の場合がある。本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、例えば、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２及びＣＤＫ５の阻害剤の場合がある。

本発明で使用するのに適したＣＤＫ阻害剤は、ケンパウロン又はＮＳＣ６６４７０４としても知られる９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［３，２−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−オン；ロスコビチンとしても知られる（Ｒ）−２−（６−（ベンジルアミノ）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−２−イルアミノ）ブタン−１−オール；フラボピリドールとしても知られる２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン−４−イル）−４Ｈ−クロメン−４−オン；ＡＴ−７５１９としても知られる４−（２，６−ジクロロベンズアミド）−Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド；ＰＤ０３３２９９１塩酸塩としても知られる塩酸６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イルアミノ）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン；ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）としても知られるＮ−（５−（（５−ｔｅｒｔ−ブチルブリルオキサゾール−２−イル）メチルチオ）チアゾール−２−イル）ピペリジン−４−カルボキサミド；ＪＮＪ−７７０６６２１；ＰＨＡ−７９３８８７としても知られるＮ−（６，６−ジメチル−５−（１−メチルピペリジン−４−カルボニル）−１，４，５，６−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］ピラゾール−３−イル）−３−メチルブタンアミド；ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）；ＢＭＳ−２６５２４６としても知られる（４−ブトキシ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−イル）（２，６−ジフルオロ−４−メチルフェニル）メタノン；ＰＨＡ−８４８１２５としても知られるＮ，１，４，４−テトラメチル−８−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）フェニルアミノ）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｈ］キナゾリン−３−カルボキサミド；ＰＨＡ−７６７４９１としても知られる２−（ピリジン−４−イル）−６，７−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジン−４（５Ｈ）−オン；ＳＣＨ９００７７６；塩酸フラボピリドールとしても知られる塩酸２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−（（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン−４−イル）−４Ｈ−クロメン−４−オン；Ｒ５４７としても知られる（４−アミノ−２−（１−（メチルスルホニル）ピペリジン−４−イルアミノ）ピリミジン−５−イル）（２，３−ジフルオロ−６−メトキシフェニル）メタノン；Ａ−６７４５６３としても知られる（２Ｓ）−１−（５−（３−メチル−１Ｈ−インダゾール−５−イル）ピリジン−３−イルオキシ）−３−フェニルプロパン−２−アミン；ＡＺＤ５４３８としても知られる４−（１−イソプロピル−２−メチル−１Ｈ−イミダゾール−５−イル）−Ｎ−（４−（メチルスルホニル）フェニル）ピリミジン−２−アミン；塩酸ＢＳ−１８１としても知られるＮ５−（６−アミノヘキシル）−Ｎ７−ベンジル−３−イソプロピルプラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５，７−ジアミン塩酸塩；ＣＹ−２０２；ＡＧ−０２４３２２；Ｐ２７６−００；ＺＫ３０４７０９；ＧＰＣ−２８６１９９；及びＢＡＹ８０−３０００である。ＣＤＫ阻害剤は、上記の群から選択できる。

本発明の方法において使用され得る他の適切なＣＤＫ阻害剤は、２−ヒドロキシボヘミン、Ａ６７４５６３、アミノプルバノロール、ＢＡＹ１０００３９４、ＢＭＳ−２６５２４６、ＢＳ−１８１、ブチロラクトンＩ、ＣＲ８Ｓ−異性体、ジアシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）、ＪＮＪ−７７０６６２１、Ｎ９−イソプロピル−オロモウシン、ＮＵ６１４０、ＮＵ６１０２、オロモウシンＩＩ、オキシインドールＩ、Ｐ２７６−００、ＰＤ３３２９９１、ＰＨＡ−７９３８８７、ＰＨＡ−７６７４９１、ＰＨＡ−８４８１２５、ＰＮＵ１１２４５５Ａ、プルバノロールＡ及びＢ、Ｒ５４７、（Ｒ）−ＤＲＦ０５３及びＳＣＨ９００７７６（ＭＫ−８７７６）である。ＣＤＫ阻害剤が、上記の群から選択される場合がある。

本発明の方法において用いられるＣＤＫ阻害剤は、例えば、ケンパウロンの場合がある。ケンパウロンは、ＣＤＫ２の阻害剤であることが知られている。ＣＤＫ阻害剤はまた、ロスコビチンの場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、フラボピリドールの場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＡＴ−７５１９の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＰＤ０３３２９９１塩酸塩の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＪＮＪ−７７０６６２１の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＰＨＡ−７９３８８７の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ジナシクリブ（ＳＣＨ７２７９６５）の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＢＭＳ−２６５２４６の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＰＨＡ−８４８１２５の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＰＨＡ−７６７４９１の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＳＣＨ９００７７６の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、塩酸フラボピリドールの場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、Ｒ５４７の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、Ａ−６７４５６３の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＡＺＤ５４３８の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、塩酸ＢＳ−１８１の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＣＹ−２０２の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＡＧ−０２４３２２の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、Ｐ２７６−００の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＺＫ３０４７０９の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＧＰＣ−２８６１９９の場合がある。ＣＤＫ阻害剤はまた、ＢＡＹ８０−３０００の場合がある。

ＣＤＫ阻害剤は、ケンパウロン、ＳＮＳ−２００３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ−７５１９及びＡＺＤ５４３８からなる群から選択される場合がある。

ＣＤＫ阻害剤は、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、インジルビン−３’−オキシム、アルスターパウロン、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ−７５１９及びＡＺＤ５４３８からなる群から選択される場合がある。

肝細胞様細胞は、１種類のＣＤＫ阻害剤に曝露されるだけではなく、上記の中の２、３又は４種の組み合わせなどの１種類以上のさらなるＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞は、一般に、約０．０１〜約１０μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。

したがって、肝細胞様細胞は、約０．０５〜約５μΜの範囲の濃度で、ＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、したがって、約０．０５〜約２．５μΜの濃度範囲内で曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約２μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約１．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約１μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．０５〜約０．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、約０．１〜約５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、したがって、約０．１〜約２．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約２μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約１μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．１〜約０．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約２．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約１．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約１μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約０．７５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．２５〜約０．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約２μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．５〜約１μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約２．０μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約０．７５〜約１μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約４μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約３μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約２μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、約１〜約１．５μΜの濃度範囲のＣＤＫ阻害剤に曝露される場合がある。

例えば、ケンパウロンがＣＤＫ阻害剤として使用される場合には、肝細胞様細胞は、の範囲で、例えば、約０．５〜約１．５μΜなどの約０．０５〜約５μΜの範囲の濃度でケンパウロンに曝露されることができる。

ＣＤＫの阻害に加えて、本発明にしたがって、使用されるＣＤＫ阻害剤はさらに、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）、特にＧＳＫ−３βに対して、阻害活性を示す場合がある。このような二重阻害剤の例としては、ＣＤＫ２及びＧＳＫ３の両方を阻害するケンパウロン、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ−７５１９及びＡＺＤ５４３８である。このような二重阻害剤のさらなる例は、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン及びインジルビン−３’−オキシムである。このような二重阻害剤のさらなる例は、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロンとインジルビン−３’−オキシムである。さらに、このような二重阻害剤のさらなる例は、２−ブロモ−９−ニトロパウロン、２−ブロモ−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ブロモパウロン、２−ヨード−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ヨードパウロン、２−フェニル−４−（２−チエニル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、２−［２−（１−ヒドロキシシクロヘキシル）−エチニル］−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシ−９−ニトロパウロン、２，３−ジメトキシ−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシパウロン、２−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、２，９−ジブロモパウロン、３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−プロピオニトリル、４−メトキシパウロン、４−（４−クロロフェニル）−２−（２−ナフチル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、５−ベンジル−９−ブロモパウロン、５−ヨード−インジルビン−３−オキシム、５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、６−ブロモインジルビン、８，１０−ジクロロパウロン、９−ブロモ−２，３−ジヒドロキシパウロン、９−ブロモ−２，３−ジメトキシパウロン、９−ブロモ−４−ヒドロキシパウロン、９−ブロモ−４−メトキシパウロン、９−ブロモ−５−エチルパウロン、９−ブロモ−５−（メチルオキシカルボニルメチル）パウロン、９−ブロモ−５−メチルパウロン、９−ブロモ−５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、９−ブロモ−５，７−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，７，１２−トリ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，１２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−（ヒドロキシアミノ）−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−メチルチオ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−チオン、９−ブロモ−１２−（２−ヒドロキシエチル）−パウロン、９−ブロモ−１２−（２−プロペニル）−パウロン、９−ブロモ−１２−エチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルオキシ−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−クロロパウロン、９−シアノパウロン、９−シアノ−２，３−ジメトキシパウロン、９−フルオロパウロン、９−メトキシパウロン、９−メチルパウロン、９オキソ−チアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリン−２−カルボニトリル誘導体、９−トリフルオロメチルパウロン、１０−ブロモパウロン、１１−ブロモパウロン、１１−クロロパウロン、１１−エチルパウロン、１１−メチルパウロン、アロイシン類（＝６−フェニル［５Ｈ］ピロロ［２，３−６］ピラジン類）、例えばアロイシンＡ；ＡＺＤ１０８０、ビス−インドールインジルビン、デブロモヒメニアルジシン、ジブロモカンタレリン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリル酸メチルエステル、（Ｅ）−２−（３−オキソ−１−ブテニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリロニトリル、インジルビン、ヒメニジン、ヒメニアルジシン、マンザミン類、例えばマンザミンＡ、メリジアミン類、パウロン、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体、ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン誘導体及びチアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリノ−９−オン誘導体である。

また、ＧＳＫ３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露される肝細胞様細胞は、さらに、ＣＤＫ阻害剤に曝露されることが本発明によって企図される。使用されるＧＳＫ阻害剤が、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に対する阻害活性を示さない場合に特に関心がある。

同様に、ＣＤＫ阻害剤に曝露される肝細胞様細胞が、さらに、ＧＳＫ３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤に曝露されることが本発明によって企図される。使用されるＣＤＫ阻害剤が、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）に対する阻害活性を示さない場合、特に関心がある。

したがって、本発明は、ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進する方法をさらに提供し、これによって、前記肝細胞様細胞は、任意に、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤及びＣＤＫ阻害剤への曝露との組み合わせで、さらに必要に応じて哺乳動物細胞外マトリクスの特徴的な１種以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）との組み合わせで、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される。

したがって、ヒト肝細胞様細胞の成熟を促進する方法は、下記のステップ、
前記ヒト肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露するステップであって、該ステップは、任意にＣＤＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤との組み合わせに対して曝露し、さらに必要に応じて哺乳動物の細胞外マトリクスの１種以上の成分いずれかでの細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）への曝露との組み合わせで曝露するステップ、
を含むものとして説明される場合がある。

また、本発明は、肝細胞様細胞を得るために、ヒト肝前駆細胞が分化条件下で培養され、得られた肝細胞様細胞を、例えば、レチノイン酸などのレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露され、任意に、ＧＳＫ３シグナル伝達阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤及びＣＤＫ阻害剤への曝露との組み合わせで、さらに必要に応じて、哺乳動物細胞外マトリクスの特徴的な１種以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）と組み合わせて、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法を提供する。

したがって、ヒト肝細胞様細胞を産生するための方法は、以下のステップ、
肝細胞様細胞を得るために、分化条件下でのヒト肝前駆細胞を培養するステップ、及び
前記肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露するステップであって、任意に、ＣＤＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤への曝露と組み合わせて、さらに必要に応じて、哺乳動物細胞外マトリクスの特徴を有する１種以上の成分を有する細胞のオーバーレイ（マトリクスオーバーレイ）への曝露との組み合わせで曝露するステップ、
を含むものとして説明される場合がある。

一例として、肝細胞様細胞がＧＳＫ３阻害剤及びＣＤＫ阻害剤との組み合わせでレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露される場合、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１の場合があり、ＣＤＫ阻害剤はロスコビチン又はフラボピリドールの場合がある。しかし、特に本明細書に具体的に記載される、いずれかの他のＣＤＫ阻害剤が、代わりに使用される場合があることが理解される。

コラーゲンＩ又はマトリゲル（エンゲル−ホルム−スワームマウス肉腫から抽出された基底膜ミックス）からなるマトリクスオーバーレイが、数十年の間、初代肝細胞を培養するために使用されている（例えば、Dunnら、1991；Pageら、2007）。なぜならば、初代肝細胞は、細胞下の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）との細胞層の頂部上の１つのＥＣＭ層を伴ういわゆるサンドイッチ構造で、より良い機能性を維持し、長期間生きることが見出された。古典的には、コラーゲンＩ及びマトリゲルオーバーレイは、例えば、１２５μｇのマトリゲル／ｃｍ^２又は５０μｇのコラーゲンＩ／ｃｍ^２を含む厚さである。しかし、これは、肝臓のＥＣＭの生理学的組成や厚さを反映していない（Turnerら、2011；Wangら、2011を比較のこと）。

本発明の方法において用いられるマトリクスオーバーレイは新規であり、成人の肝臓のＥＣＭ中に存在する成分のより生理的な組み合わせであり、１種以上のＥＣＭ成分から構成され、正常な哺乳動物の細胞外マトリクス環境の一部を形成する。本発明におけるマトリクスオーバーレイとして使用するのに適したＥＣＭの成分は、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩなどのコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパリンプロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、例えばグリピカン、シンデカン又はペルレカン類、グリコサミノグリカン類、ニドジェン／エンタクチン、ラミニン類、ビグリカン、テネイシン、ヒアルロナン、又は他のＥＣＭ成分又は例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、プロテオグリカン類、及びグリコサミノグリカン類を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物である。

したがって、肝細胞様細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０又は最大２０種の１種以上の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。したがって、肝細胞様細胞は、２種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、３種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、４種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、５種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、６種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、７種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、８種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、９種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、１０種の上述のＥＣＭ成分を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。

例えば、肝細胞様細胞は、コラーゲンＩ及びフィブロネクチン（コラーゲンＩ−フィブロネクチンマトリクスオーバーレイ）を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイなどの、コラーゲン及びフィブロネクチン（コラーゲン−フィブロネクチン−マトリクスオーバーレイ）を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、コラーゲンＩなどのコラーゲン及びラミニン（コラーゲン−ラミニン−マトリクスオーバーレイ）を含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイに曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ニドジェン及びラミニンを含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイ（コラーゲン−ラミニン−ニドゲンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、コラーゲンＩなどのコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンを含む又はから成るマトリクスオーバーレイ（コラーゲン−フィブロネクチン−ラミニンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。肝細胞様細胞は、フィブロネクチン及びラミニンを含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイ（フィブロネクチン−ラミニンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、フィブロネクチン、ラミニン及びナイドジェンを含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイ（フィブロネクチン−ラミニン−ニドジェンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞はまた、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ニドジェン、バイグリカン及びラミニンを含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイ（フィブロネクチン−コラーゲンＩ、ＩＶ、ＶＩ−ニドジェン−バイグリカン−ラミニン−マトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞はまた、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ニドジェン、バイグリカン及びラミニンを含む又はから構成されるマトリクスオーバーレイ（フィブロネクチン−コラーゲンＩ、ＩＶ−ニドジェン−バイグリカンラミニンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞はまた、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンを含むマトリクスオーバーレイ（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。肝細胞様細胞はまた、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びプロテオグリカンを含むマトリクスオーバーレイ（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン及びプロテオグリカンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。

肝細胞様細胞はまた、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エラスチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンを含むマトリクスオーバーレイ（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エラスチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンマトリクスオーバーレイ）に曝露される場合がある。

本発明の方法において用いられるマトリクスオーバーレイは、これまで使用されている厚いマトリクスに比較して薄い。マトリクスオーバーレイの厚さは、したがって、使用されるＥＣＭ成分の濃度に相関する。現在のマトリクスオーバーレイの適切な濃度は、０．０１〜２０μｇなどの、例えば、０．０１〜３０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２である。

したがって、それぞれのＥＣＭ成分は、約０．１〜約２０μｇのＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．１〜約１５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．１〜約１２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．１〜約１０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．１〜約５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．１〜約２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．２〜約２０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．２〜約１５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．２〜約１２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．２〜約１０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．２〜約５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約２５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。
各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約２０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約１５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約１０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約７．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約１．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約０．５〜約１μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約１〜約２０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約１〜約１５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約１〜約１２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約１〜約１０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約１〜約５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約１〜約２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約２〜約２０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約２〜約１５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約２〜約１２．５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約２〜約１０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約２〜約５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約５〜約２５μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ＥＣＭ成分はまた、約５〜約２０μｇＥＣＭ成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各タンパク質成分はまた、約５〜約１５μｇタンパク質成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各タンパク質成分はまた、約５〜約１０μｇタンパク質成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各タンパク質成分はまた、約５〜約７．５μｇタンパク質成分／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

コラーゲンＩは、例えば、約５〜約１５μｇ／ｃｍ^２などの約２〜約２０μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

コラーゲンＩＶは、例えば、約０．０５〜約１０μｇ／ｃｍ^２などの約０．０１〜１０μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

コラーゲンＶＩは、例えば、約０．０１〜約１０μｇ／ｃｍ^２又は約０．１〜約１５μｇ／ｃｍ^２などの約０．０１〜約１５μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

フィブロネクチンは、例えば、約２〜約２０μｇ／ｃｍ^２などの約２〜約３０μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

ニドジェンは、例えば、約０．０５〜約１０μｇ／ｃｍ^２などの約０．０１〜約１０μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

ラミニンは、例えば、約０．０５〜約１０μｇ／ｃｍなどの約０．０１〜約１０μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

バイグリカンは、例えば、約０．１〜約１０μｇ／ｃｍ^２などの約０．０１〜約１０μｇ／ｃｍ^２の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。

「μｇ／ｃｍ^２」での上記濃度は、乾燥状態のそれぞれの成分に対しするものであることが理解されるべきある。

一般的に、細胞が培養容器の表面を覆う成長補助としてコーティング上に培養される場合がある。ゼラチン又はフィブロネクチンベースのコーティングは、広く成長補助として使用されている。したがって、細胞、特に、肝前駆細胞及び肝細胞様細胞が、ゼラチン又はフィブロネクチンベースのコーティングで培養される場合がある。しかし、細胞は、上記で定義されるマトリクスオーバーレイと類似又は同一の組成を有するコーティングで培養される場合がある。例えば、マトリクスオーバーレイを使用する場合、細胞が用いられるマトリクスオーバーレイと同一組成を有するコーティングで培養される場合がある。したがって、いわゆる「サンドイッチ」型の培養環境が提供される。

任意の予備ステップとして、本発明の方法において使用される肝前駆細胞は、最初に、ヒト胚性幹細胞（ヒトＥＳ細胞）又はヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）などのヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞から誘導される場合がある。本発明の方法は、したがって、最初のステップとして前記肝前駆細胞を取得するための分化条件下でｈＰＳ細胞の培養をさらに含む場合がある。したがって、ｈＰＳ細胞は、前記肝前駆細胞に最初に分化される。このステップは、初期肝分化と呼ぶ。

上記に示したように、また内胚葉及び／又は肝前駆細胞を得るための出発材料として使用することができるヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞の場合がある。そのようなｈＥＳ細胞を得るための様々な技術が当業者に知られている。しかしながら、好ましくは、本発明の使用のためのｈＥＳ細胞は、例えば、Chungら（2008年）さらにMercaderらのエッセンシャル幹細胞法（第１版、2009年）に記載の、単一割球の除去技術を使用することによって、ヒト胚を破壊することなく誘導（又は取得）されたものである。使用するのに適したヒトＥＳ細胞株は、例えば、ＮＩＨ、英国幹細胞バンク及び欧州ｈＥＳＣに登録されている細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ４６１（セラーティスＡＢ、イェーテボリ、スウェーデン）が、リクエストに応じて利用できる。使用するのに適した他の細胞株は、それらのKlimanskayaら（2006年）によって確立された細胞株ＭＡ０１及びＭＡ０９などの、及びChungら（2008年）、すべてが国際幹細胞に登録（アドヴァンスト・セル・テクノロジー社、ウスター、マサチューセッツ州、米国に譲渡）されている細胞株ＭＡ１２６、ＭＡ１２７、ＭＡ１２８及びＭＡ１２９である。

代替的に、内胚葉及び／又は肝前駆細胞を得るための出発材料として使用することができるヒト多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞の場合がある。このようなｈｉＰＳ細胞を得るための様々な技術は、科学文献に記載され、したがって、当業者に知られている（例えば、Takahashiら（2007年）；Zhouら（2009年）；You及びThomson「エッセンシャル幹細胞生物学第２版」）。

また、内胚葉及び／又は肝前駆細胞はまた、成体幹細胞、癌幹細胞、又は、胚、胎児、幼若又は成体が供給源の他の多能性幹細胞から誘導される場合があることが想定される。

適切なｈＰＳ細胞を分化させるための条件が知られている（例えば、Hay 2008年、Brolen 2010年及びDuan 2010年を参照のこと）。例えば、WO2009/013254A1は、適切な肝前駆細胞を得るためのプロトコールを記載する（実施態様１〜４）。

ｈＰＳ細胞は、肝前駆細胞を得るために、通常は、適切な分化培地中で最大１４日間培養される。例えば、ｈＰＳ細胞は、約１１〜約１４日間などの約１０〜１４日間、適切な分化培地で培養される場合がある。

初期肝分化は、前内胚葉段階、すなわち、胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）を得るための分化条件下でｈＰＳ細胞の培養すること、そして、それに続く前肝臓段階、すなわち、得られたＤＥ細胞を肝前駆細胞を得るための分化条件下で培養すること、を含むことによって定義される場合がある。したがって、ｈＰＳ細胞は最初に胚体内胚葉に分化され、その後、胚体内胚葉の肝前駆細胞へのさらなる分化が続く。

一般的に、内胚葉細胞を得るためには、ｈＰＳ細胞が、例えば、アクチビンＡ又はＢなどのアクチビンを含む分化培地で培養される。分化培地は、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、フェニルブチレート（ＰＢ）、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、エンチノスタット又はパノビンスタットなどのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤をｓらに含む場合がある。分化培地は、さらに、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４、及び／又はＦＢＳ又はＦＣＳなどの血清などの１種以上の成長因子を含む場合がある。分化培地は、例えばＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３阻害剤、又はＷｎｔ３ＡなどのＷｎｔシグナル伝達活性化剤を含む場合がある。分化培地は、さらに、ＬＹ２９４００２などのＰＩ３Ｋ（ＰＩ３キナーゼ）阻害剤を含む場合がある。

アクチビンの濃度は、約８０〜約１２０ｎｇ／ｍＬなどの約５０〜約１５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。アクチビンは、例えば、約５０ｎｇ／ｍＬ又は約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在してもよい。ＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、約０．５〜約２ｍＭの範囲である。ＨＤＡＣ阻害剤は、通常は、約０．５ｍＭ又は約１ｍＭの濃度で分化培地中に存在してもよい。一種以上の成長因子の濃度は、使用される特定の化合物に依存して変化する場合がある。ＦＧＦ２の濃度は、通常は、約２〜約１０ｎｇ／ｍＬなどの約２〜約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＦＧＦ２は、例えば、約４又は約５ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在してもよい。ＦＧＦ１の濃度は、例えば、約８０〜約１２０ｎｇ／ｍＬなどの約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬの範囲の場合がある。ＦＧＦ１は、例えば、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在する場合がある。ＦＧＦ４の濃度は、通常、例えば、約２０〜約４０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＦＧＦ４は、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在してもよい。血清の濃度は、存在する場合、通常、約０．１〜約０．５％、約０．２〜約１．５％ｖ／ｖ、約０．２〜約１％ｖ／ｖの、約０．５〜１％ｖ／ｖ、又は約０．５〜約１、５％（ｖ／ｖ）などの約０．１〜約２％Ｖ／ｖの範囲である。、である。血清は、例えば、約０．２％ｖ／ｖの、約０．５％ｖ／ｖの、又は約１％ｖ／ｖの濃度で分化培地中に存在してもよい。ＧＳＫ３阻害剤の濃度は、存在する場合、通常、約０．０５〜約５μΜなどの約０．１〜約１０μΜの範囲である。Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤の濃度は、存在する場合、通常、約０．５〜約５μΜなどの約０．０５〜約１０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＰＩ３Ｋ阻害剤の濃度は、通常、約１〜５μΜなどの約０．１〜１０μΜの範囲である。

分化培地は、さらに、ＰＥＳＴ及び／又はグルタマックスなどの他の補助剤を含む場合がある。分化培地はまた、ＲＯＣＫ阻害剤を含む場合がある。ＰＥＳＴの濃度は、通常、約０．１〜約０．２５％ｖ／ｖなどの約０．１〜約０．５％ｖ／ｖの範囲である。グルタマックスの濃度は、通常、例えば約１％（ｖ／ｖ）の約０．７５〜１％（ｖ／ｖ）などの約０．５〜１．５％（ｖ／ｖ）の範囲である。分化培地はまた、ＲＯＣＫ阻害剤を含む場合がある。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、例えば、通常約５μΜの約２．５〜約７．５μΜなどの約１〜約１０μΜの範囲である。

分化培地の基礎を形成する培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０又はアドヴァンスト培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨＣＭ培地、ＨＢＭ培地又はウィリアムＥ基礎培地などのｈＰＳ細胞を培養するのに適したいずれかの培地の場合がある。したがって、分化培地は、上記の成分を補充した、ＲＰＭＩ１６４０又はアドヴァンスト培地の場合がある。代替的に、分化培地は、上述の各成分を含む又は補充したＤＭＥＭの場合がある。分化培地は、上述の各成分を含む又は補充したＨＣＭ培地の場合がある。分化培地は、したがってまた、上述の各成分を含む又は補充したＨＢＭ培地の場合がある。分化培地は、したがってまた、分化培地は、上述の各成分を含む又は補充したウィリアムＥ基礎培地の場合がある。

内胚葉分化のために、ｈＰＳ細胞は、上記のようにアクチビンを含む分化培地で最大１０日間通常培養される。前記ｈＰＳ細胞はまた、例えば、約７〜約９日などの約４〜約１０日間分化培地で培養される場合がある。

その後、得られたＤＥ細胞は、肝前駆細胞を得るためにＤＭＳＯを含有する分化培地中でさらに培養される。代替的に、得られたＤＥ細胞は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２及びＦＧＦ４などの１種以上の増殖因子、ならびにＢＭＰ２及びＢＭＰ４などの１種以上の骨形成タンパク質を含む分化培地で培養される場合がある。分化培地は、さらに、ＨＧＦ、ＥＧＦ及び／又は血清を含む場合がある。

ＤＭＳＯの濃度は、通常、約０．５％〜約１．５％ｖ／ｖなどの約０．１％〜約２％ｖ／ｖの範囲である。ＤＭＳＯは、例えば、約１％の濃度で分化培地中に存在する場合がある。一種以上の成長因子の濃度は、使用される特定の化合物に依存して変化する場合がある。ＦＧＦ２の濃度は、例えば、通常、約２〜約１０ｎｇ／ｍＬなどの約２〜約５０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＦＧＦ２は、例えば、４又は５ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在する場合がある。ＦＧＦ１の濃度は、例えば、通常、約８０〜約１２０ｎｇ／ｍＬなどの約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＦＧＦ１は、例えば、通常、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在する場合がある。ＦＧＦ４の濃度は、例えば、通常、約２０〜約４０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＦＧＦ４は、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在する場合がある。ＨＧＦの濃度は、存在する場合、通常、約１０〜約３０ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＨＧＦは、例えば、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在してもよい。ＥＧＦの濃度は、存在する場合、通常、約５〜約１５ｎｇ／ｍＬの範囲である。ＥＧＦは、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で分化培地中に存在する場合がある。血清の濃度は、存在する場合、通常、約０．１〜約０．５％ｖ／ｖ、約０．２〜１．５％ｖ／ｖ、約０．２〜約１％ｖ／ｖ、約０．５〜１％ｖ／ｖ、約０．５〜約１．５％ｖ／ｖなどの約０．１〜約２％ｖ／ｖである。血清は、例えば、約０．２％ｖ／ｖ、約０．５％ｖ／ｖ、又は約１％ｖ／ｖの濃度で分化培地中に存在する場合がある。

分化培地は、さらに、ＰＥＳＴ及び／又はグルタマックスなどの他の補助剤を含んでもよい。ＰＥＳＴの濃度は、通常、約０．１〜約０．２５％ｖ／ｖなどの約０．１〜約０．５％ｖ／ｖの範囲である。グルタマックスの濃度は、通常、約１％（ｖ／ｖ）の約０．７５〜１．２５％ｖ／ｖなどの約０．５〜約１．５％ｖ／ｖの範囲である。

分化培地の基礎を形成する培養培地は、ＲＰＭＩ１６４０若しくはアドヴァンスト培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨＣＭ培地、ＨＢＭ培地又はウィリアムＥ基礎培地などのヒト内胚葉細胞を培養するのに適したいずれかの培地の場合がある。したがって、分化培地は、上記の成分を含むか又は補充したＲＰＭＩ１６４０又はアドヴァンスト培地の場合がある。代替的に、分化培地は、上記の成分を含むか又は補充したＤＭＥＭの場合がある。分化培地は、したがって、また、上記の成分を含むか又は補充したＨＣＭ培地の場合がある。分化培地は、したがってまた、上記の成分を含むか又は補充したＨＢＭ培地の場合がある。分化培地は、したがってまた、上記の成分を含むか又は補充したウィリアムＥ基礎培地の場合がある。

上述したように、肝前駆細胞への分化のために、ＤＥ細胞は通常分化培地で最大７日間培養される。ＤＥ細胞は、例えば、約４〜約７日間分化培地で培養される場合がある。

ＤＥ細胞、肝前駆細胞及び肝細胞様細胞を得るための基本的な、非限定的な培養条件は、本明細書の実施例２で提供される。

分化期のｈＰＳ細胞はまた、ＤＮＡ脱メチル化剤に曝露される場合がある。細胞は、多能性幹細胞段階及び胚体内胚葉細胞段階の間のいかなる段階で前記薬剤に曝露（又は処理）される場合がある。したがって、前記ＤＮＡ脱メチル化剤への曝露は、ｈＰＳ細胞のＤＥ細胞への分化の間に、すなわち中胚葉の前の段階で行うことができる。内胚葉段階をとおして、肝前駆段階に達するまで、すなわち、肝前駆細胞が得られるまで、細胞は培養される。このポイントでは、レチノイン酸応答性受容体活性化剤単独、又はＧＳＫ−３阻害若しくはＷｎｔシグナル伝達活性化及び／又はＣＤＫ阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイとの組み合わせのいずれかの曝露を含む、肝細胞様細胞へのさらなる分化及び成熟が実施される。

本発明の方法において用いられるＤＮＡの脱メチル化剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の活性を妨害するいずれかの化合物の場合がある。適切なＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）などのヌクレオシド類似体型の１つ、又は、ゼブラリン、プロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、コーヒー酸、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、塩酸ヒドララジン、プロカインアミド塩酸塩又はサマプリンＡなどの非ヌクレオシド型のものである。

したがって、本発明の方法において使用するＤＮＡ脱メチル化剤は、ヌクレオシド類似体型の１種の場合がある。あるいは、本発明の方法において用いられるＤＮＡの脱メチル化剤は、非ヌクレオシド型のものの場合がある。

したがって、本発明の方法において使用するＤＮＡ脱メチル化剤としては、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）、又はシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドなどのシチジン類似体の場合がある。

本発明の方法において用いられるＤＮＡの脱メチル化剤は、このように５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン及び２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）からなる群から選択されるシチジン類似体の場合がある。

したがって、本発明の方法において用いられるＤＮＡの脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び５−アザシチジン（アザシチジン）からなる群から選択されるシチジン類似体の場合がある。あるいは、本発明の方法中に使用されるＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）又は５−アザシチジン（アザシチジン）ではないシチジン類似体の場合がある。

したがって、本発明の方法において使用するＤＮＡ脱メチル化剤は、５−アザ−２−デオキシシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、５−アザシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、ゼブラリンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、プソイドイソシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、５−フルオロ−２−デオキシシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、６−アザシチジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）の場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドの場合がある。前記ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、プロカインの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、ＲＧ１０８の場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステインの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、コーヒー酸の場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、クロロゲン酸の場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、没食子酸エピガロカテキンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、塩酸ヒドララジンの場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、プロカインアミド塩酸塩の場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、サマプリンＡの場合がある。

分化期のｈＰＳ分化細胞は、ＤＮＡ脱メチル化剤のみに曝露するのではなく、また、上記のものの２種、３種、又は４種の組み合わせなどの１種以上のさらなるＤＮＡ脱メチル化剤に曝露してもよい。

分化期のｈＰＳ細胞は、一般に、約１ｎＭ〜約５μΜの範囲などの、約１ｎＭ〜約１０μΜの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露されてもよい。

したがって、分化期のｈＰＳ細胞は、約１ｎＭ〜約１μΜの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、このように約１ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、したがって、約１ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、したがって、約１ｎＭ〜約２５ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、したがって、約１ｎＭ〜約１５ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、したがって、約５ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約２５ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１０ｎＭの範囲などの約５ｎＭ〜約１５ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約２５０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約５０ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約２５ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約１２．５ｎＭの範囲の濃度で、ＤＮＡの脱メチル化剤に曝露される場合がある。

例えば、５−アザ−２−デオキシシチジンをＤＮＡ脱メチル化剤として使用する場合には、分化期のｈＰＳ細胞は、１ｎＭ〜約１μΜの範囲の濃度で曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、このように約１ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約２５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約２５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、このように、約１ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、このように、約１ｎＭ〜約２５ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、このように、約１ｎＭ〜約１５ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１ｎＭ〜約１０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞は、このように、約５ｎＭ〜約２５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約５ｎＭ〜約２５ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約１０ｎＭの範囲などの約５ｎＭ〜約１５ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約２５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約２５ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。分化期のｈＰＳ細胞はまた、約７．５ｎＭ〜約１２．５ｎＭの濃度範囲の５−アザ−２−デオキシシチジンに曝露される場合がある。

同様の濃度は、５−アザシチジン又はゼブラリンがＤＮＡ脱メチル化剤として使用される場合に使用してもよい。同様の濃度は、例えば、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）、又はシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド、特に５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン又は２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）などの他のシチジン類似体の場合にも使用される場合がある。

分化期のｈＰＳ細胞は通常、分化２日目及び７日目の間などの細胞倍加時間によって証明された最大の増殖能力を示すときに、ヌクレオシド類似体型のＤＮＡの脱メチル化剤（例えば５−アザ−２−デオキシシチジン、５−アザシチジン、ゼブラリン）に曝露される。したがって、ＤＮＡの脱メチル化剤は、分化２日目に分化培地に添加される場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、分化３日目に分化培地に添加される場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、分化４日目に分化培地に添加される場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、分化５日目に分化培地に添加される場合がある。ＤＮＡ脱メチル化剤はまた、分化６日目に分化培地に添加される場合がある。非ヌクレオシド型のＤＮＡ脱メチル化剤（例えばプロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）は、それらの効果に細胞増殖を必要としないので、分化プロトコールのいずれかの時点で添加できる。

本明細書の図１３（実施例１０）に示されるように、分化期のｈＰＳ細胞のＤＮＡ脱メチル化剤に対する処理は、驚くべきことに、ＤＥ細胞の改善された形態及び収率をもたらす。また、ＤＮＡ脱メチル化剤での処理はまた、驚くべきことに、ＤＥ細胞における幹細胞マーカーＯｃｔ４の発現の有意なダウンレギュレーション（図１３Ｃ及びＤ）及びＤＥ特異的マーカーＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４及びＨＨＥＸの改善された発現をもたらした（図１３Ｄ）。本発明のこの態様は、ＤＮＡ脱メチル化と、ゲノムレベルでの作用が広範囲のメチル化の非存在によって増強され得る特定の成長因子の適用との間で、特異的な相乗効果が示されたのは初めてであると考えられる。得られた肝前駆細胞にレチノイン酸応答性受容体活性化剤、ＧＳＫ３阻害剤／Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤又はＣＤＫ阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイを曝露する前の初期の内胚葉発達中に、ＤＮＡ脱メチル化剤で細胞を処理する場合に、さらに、肝細胞様細胞の成熟に強い相乗効果が見られる（実施例８；図９、１０及び１２）。

また、本発明の肝細胞様細胞は、異種非含有条件下で得られる場合がある。このように、本発明の方法において用いられる出発材料は、したがって、動物フリーの条件で得られた又は確立された異種非含有ｈＰＳ細胞若しくは細胞系、又は異種非含有の肝前駆細胞若しくは細胞株などの、異種非含有の場合がある。また、本発明の細胞の方法を通じて真に異種非含有の肝細胞様細胞を生じさせる異種非含有条件下で完全に培養できる。このような細胞又は細胞株は、治療又は再生医療用途により適しており、非ヒトシアル酸のＮｅｕ５Ｇｃ又は他の非ヒトマーカーの異種非含有でない細胞での存在によって、異種非含有組成物と区別することができる（Martinら、2005年）。

本発明の方法の結果として、肝細胞様細胞は、当技術分野の方法の現在利用可能な状態と比較して、より成熟した機能的特徴を取得する。

本発明の方法を使用して得られる肝細胞様細胞は、例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ５、ＭＲＰ２、ＣＡＲ、ＮＴＣＰ、ＧＳＴＡ−１、ＰＸＲ及び成人のＨＮＦ４ａアイソフォームなどの肝細胞関連遺伝子の発現の上昇を示した。それらはさらに、パラセタモール及びジクロフェナクなどの薬物を代謝するためのＣＹＰ１Ａ１／２、２Ｃ９及び３Ａ４／５／７などのＣＹＰ酵素、又は、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ９及びＵＧＴ２Ｂ７などのＵＧＴ酵素（ＵＤＰ−グルクロニルトランスフェラーゼ）の活性の増加によって証明されるように、代謝活性を増加させた。本発明の肝細胞様細胞はまた、非処理の対照細胞と比較して、長期の寿命を示す。本発明の方法を使用して得られた肝細胞様細胞はまた、例えば、５−アザ−デオキシシチジン、レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイが使用されない場合と比較して、例えば２倍などの少なくとも１．５倍の変化倍率を超えるシトクロムＰ４５０の活性を示す。

さらに、取得された肝細胞様細胞の集団又は細胞組成物は、技術方法において現在利用可能な状態によって得られるものと比較して、より純粋で均質である。

本発明の細胞組成物は、さらに、例えば、７５％、８０％、９０％又は９５％などの少なくとも７０％の細胞が本発明の肝細胞様細胞であることを特徴とすることができる。

本発明で使用される方法と、本発明で提示される本発明と原理を使用して得られた肝細胞様細胞は、創薬プロセス、毒性試験、薬物輸送体や薬物代謝酵素を研究するためを含む、例えば、ヒトの肝再生疾患を研究するための、ｉｎｖｉｔｒｏでの肝毒性試験のための、早期肝再生などの肝再生を研究するための、ｉｎｖｉｔｒｏモデルとして多くの目的に使用できる。

さらに、本発明の方法を使用して得られた肝細胞様細胞は、薬剤において、疾患の治療のための、肝組織の変性などの組織変性によって引き起こされる病理及び／又は疾患の予防及び／又は治療のための薬剤又は医薬品の製造のために使用できる。本発明の肝細胞様細胞はまた、肝疾患の治療のための薬剤又は医薬品の製造のために使用できる。肝臓障害は、例えば、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫疾患；脂質異常症などの代謝性疾患；例えばアルコール乱用によって引き起こされる肝障害；例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、及びＡ型肝炎などのウイルスによって引き起こされる疾患；例えば、医薬品に対する急性毒性反応によって引き起こされる肝臓の壊死、及び例えば肝細胞癌に罹患している患者における腫瘍除去である。

代替的に、本発明の方法を使用して得られた肝細胞様細胞は、代謝性病態及び／又は疾患の治療及び／又は予防のための薬剤又は医薬品の製造のために使用できる。

薬剤又は医薬品は、例えば、置換組織の形態又は細胞の注射剤の場合がある。

本発明の肝細胞様細胞の分化及び成熟は、肝細胞様細胞に対する成熟の研究、又は、肝細胞機能を調整する能力に対して化合物をスクリーニングするために、代謝的に改善された肝細胞様細胞を得るために有用である場合がある。そして、この本発明の肝細胞様細胞の分化及び成熟は、インビトロで得られた誘導肝細胞様細胞を本明細書に提供される指示にしたがって化合物に曝露するステップ、化合物との接触から生じる細胞内の任意の表現型又は代謝変化を決定するステップ、及び肝細胞の機能を調整する能力変化を関連付けるステップを含む場合がある。

本発明はまた、キットを提供する。このようなキットは、本発明によるヒト肝細胞様細胞の成熟のために、例えば、本発明の方法の実施に対して特に有用である。本発明のキットは、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、並びに、ＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤、ＣＤＫ阻害剤及び細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物から選択される少なくとも１種を含む。

したがって、本発明のキットは、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、及び、少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤、並びに、場合により少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットはまた、レチノイン酸応答性受容体の少なくとも１種の活性剤、及び少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性化剤、並びに、任意に少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットはまた、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、及び少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤、並びに、場合により少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットはまた、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性剤、少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤、及び少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤又はＷｎｔシグナル伝達活性化剤、並びに、任意に少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットはまた、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、及び少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

上述したように、本発明の方法において使用される成分に関して本明細書で与えられる詳細は、本発明のキットに含まれる成分に適用することが理解される。

したがって、本発明のキットに含まれる少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性剤は、例えば、９−シス−レチノイン酸などのレチノイン酸の場合がある。

本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＧＳＫ−３阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、アミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１及びインジルビン−３’−オキシムから選択される場合がある。

本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＧＳＫ−３阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３’−オキシム、２−ブロモ−９−ニトロパウロン、２−ブロモ−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ブロモパウロン、２−ヨード−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ヨードパウロン、２−フェニル−４−（２−チエニル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、２−［２−（１−ヒドロキシシクロヘキシル）−エチニル］−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシ−９−ニトロパウロン、２，３−ジメトキシ−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシパウロン、２−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、２，９−ジブロモパウロン、３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−プロピオニトリル、４−メトキシパウロン、４−（４−クロロフェニル）−２−（２−ナフチル）−５Ｈ−ピリド［２±３-ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、５−ベンジル−９−ブロモパウロン、５−ヨードインジルビン−３−オキシム、５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、６−ブロモインジルビン、８，１０−ジクロロパウロン、９−ブロモ−２，３−ジヒドロキシパウロン、９−ブロモ−２，３−ジメトキシパウロン、９−ブロモ−４−ヒドロキシパウロン、９−ブロモ−４−メトキシパウロン、９−ブロモ−５−エチルパウロン、９−ブロモ−５−（メチルオキシカルボニルメチル）パウロン、９−ブロモ−５−メチルパウロン、９−ブロモ−５，６，７，１２−テトラヒドロベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、９−ブロモ−５，７−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，７，１２−トリ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，１２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−（ヒドロキシアミノ）−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−メチルチオ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−チオン、９−ブロモ−１２−（２−ヒドロキシエチル）−パウロン、９−ブロモ−１２−（２−プロペニル）−パウロン、９−ブロモ−１２−エチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルオキシカルボニル−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−クロロパウロン、９−シアノパウロン、９−シアノ−２，３−ジメトキシパウロン、９−フルオロパウロン、９−メトキシパウロン、９−メチルパウロン、９−オキソ−チアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリン−２−カルボニトリル誘導体、９−トリフルオロメチルパウロン、１０−ブロモパウロン、１１−ブロモパウロン、１１−クロロパウロン、１１−エチルパウロン、１１−メチルパウロン、アロイシン類（＝６−フェニル［５Ｈ］ピロロ［２，３−６］ピラジン類）、例えばアロイシンＡ、ＡＺＤ１０８０、ビス−インドールインジルビン、デブロモヒメニアルジシン、ジブロモカンタレリン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリル酸メチルエステル、（Ｅ）−２−（３−オキソ−１−ブテニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリロニトリル、インジルビン、ヒメニジン、ヒメニアルジシン、マンザミン類、例えばマンザミンＡ、メリジアミン類、パウロン、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体、ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン誘導体及びチアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリノ−９−オン誘導体から選択されるものの場合がある。

本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性剤は、例えば、上記のＷｎｔタンパク質の群から選択されたものの場合がある。これは、例えば、Ｗｎｔ３Ａ又はＷｎｔ５Ａの場合がある。

本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３’−オキシム、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ−７５１９及びＡＺＤ５４３８から選択される場合がある。

本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３’−オキシム、２−ブロモ−９−ニトロパウロン、２−ブロモ−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ブロモパウロン、２−ヨード−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ヨードパウロン、２−フェニル−４−（２−チエニル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、２−［２−（１−ヒドロキシシクロヘキシル）−エチニル］−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシ−９−ニトロパウロン、２，３−ジメトキシ−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシパウロン、２−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、２，９−ジブロモパウロン、３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−プロピオニトリル、４−メトキシパウロン、４−（４−クロロフェニル）−２−（２−ナフチル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、５−ベンジル−９−ブロモパウロン、５−ヨード−インジルビン−３−オキシム、５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、６−ブロモインジルビン、８，１０−ジクロロパウロン、９−ブロモ−２，３−ジヒドロキシパウロン、９−ブロモ−２，３−ジメトキシパウロン、９−ブロモ−４−ヒドロキシパウロン、９−ブロモ−４−メトキシパウロン、９−ブロモ−５−エチルパウロン、９−ブロモ−５−（メチルオキシカルボニルメチル）パウロン、９−ブロモ−５−メチルパウロン、９−ブロモ−５，６，７，１２−テトラヒドロベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、９−ブロモ−５，７−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，７，１２−トリ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，１２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−（ヒドロキシアミノ）−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−メチルチオ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−チオン、９−ブロモ−１２−（２−ヒドロキシエチル）−パウロン、９−ブロモ−１２−（２−プロペニル）−パウロン、９−ブロモ−１２−エチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルオキシカルボニル−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−クロロパウロン、９−シアノパウロン、９−シアノ−２，３−ジメトキシパウロン、９−フルオロパウロン、９−メトキシパウロン、９−メチルパウロン、９−オキソ−チアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリン−２−カルボニトリル誘導体、９−トリフルオロメチルパウロン、１０−ブロモパウロン、１１−ブロモパウロン、１１−クロロパウロン、１１−エチルパウロン、１１メチルパウロン、アロイシン類（＝６−フェニル［５Ｈ］ピロロ［２，３−６］ピラジン類）、例えば、アロイシンＡ、ＡＺＤ１０８０、ビス−インドールインジルビン、デブロモヒメニアルジシン、ジブロモカンタレリン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリル酸メチルエステル、（Ｅ）−２−（３−オキソ−１−ブテニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリロニトリル、インジルビン、ヒメニジン、ヒメニアルジシン、マンザミン類、例えばマンザミンＡ、メリジアミン類、パウロン、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体、ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン誘導体及びチアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリノ−９−オン誘導体から選択される場合がある。

本発明のキットに含まれる少なくとも１種のＥＣＭ成分は、例えば、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩなどのコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパリンプロテオグリカン、グリピカン類、シンデカン類又はペルレカン類などのヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ニドジェン／エンタクチン、ラミニン類、ビグリカン、テネイシン、及びヒアルロナン類から選択される場合がある。

本発明のキットは、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種若しくは１０種又は最大２０種から含む又は構成される、本明細書に記載のＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。したがって、本発明のキットは、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの２種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの３種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの４種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの５種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの６種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの７種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの８種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの９種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットはまた、本明細書で言及されるＥＣＭ成分のうちの１０種を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

例えば、本発明のキットは、コラーゲンＩ及びフィブロネクチンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物などのコラーゲン及びフィブロネクチンを含む又はから構成される細胞外マトリクス成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットは、コラーゲンＩなどのコラーゲン及びラミニンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットは、コラーゲンＩなどのコラーゲン、並びにニドジェン及びラミニンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットは、コラーゲンＩなどのコラーゲン並びにフィブロネクチン及びラミニンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がる。本発明のキットは、フィブロネクチン及びラミニンを含む又はから構成される細胞外マトリクス成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットは、フィブロネクチン、ニドジェン及びラミニンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩ、ニドジェン、ビグリカン及びラミニンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットは、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ニドジェン、ビグリカン及びラミニンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットは、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカン類を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。本発明のキットは、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、及びプロテオグリカンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットは、コラーゲンＩなどのコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エラスチン、プロテオグリカン類及びグリコサミノグリカン類を含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

したがって、本発明のキットは、９−シス−レチノイン酸及びケンパウロンを含む場合がある。このようなキットはさらに、コラーゲンＩ及びフィブロネクチンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物を含む、コラーゲン及びフィブロネクチンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物などの上記で開示されたＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットは、９−シス−レチノイン酸及びインジルビン−３’−オキシムを含む場合がある。このようなキットはさらに、コラーゲンＩ及びフィブロネクチンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物などのコラーゲン及びフィブロネクチンを含む又はから構成されるＥＣＭ成分の混合物などの、上記で開示されたＥＣＭ成分の混合物を含む場合がある。

本発明のキットはさらに、少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤を含む場合がある。ＤＮＡの脱メチル化剤は、本発明のキットに含まれる場合には、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５−フルオロ−２−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、２’−デオキシ−５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、６−アザシチジン、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン）、又はシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシドなどのシチジン類似体の場合がある。

少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤は、例えば、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）の場合がある。少なくとも１種のＤＮＡ脱メチル化剤はまた、５−アザシチジン（アザシチジン）の場合がある。

本発明のキットは、ヒト多能性幹細胞を含む場合がある。したがって、本発明のキットは、ヒト胚性幹細胞又はヒト誘導多能性幹細胞を含む場合がある。ヒト多能性幹細胞は、適切に細胞懸濁液として提供される場合があり、凍結状態で提供される場合がある。

本発明のキットはさらに、胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）を含む場合がある。ＤＥ細胞は、適切に細胞懸濁液として提供される場合があり、凍結状態で提供される場合がある。

本発明のキットの構成成分は、同一又は別々の容器で提供される場合がある。例えば、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性剤、並びに、少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤、少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性化剤又は少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤が、同じ容器で提供される場合がある。少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物がまた、キットに含まれている場合、そのようなＥＣＭ成分又はＥＣＭ成分の混合物は、一般に、別個の容器で提供される場合がある。したがって、レチノイン酸応答性受容体並びに少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤、少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性化剤又は少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤は、同じ容器で提供される場合があり、少なくとも１種の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分又はＥＣＭ成分の混合物は、異なる容器で提供される。

ヒト多能性幹細胞又は胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）がキットに含まれている場合は同様に、ヒト多能性幹細胞又はＤＥ細胞は、一般的に他の成分を含む容器とは異なる容器で提供される。

本発明はまた、組成物を提供する。このような組成物は、本発明によるヒト肝細胞様細胞の成熟に対して特に有用である。本発明の組成物は、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、並びにＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達活性剤及びＣＤＫ阻害剤から選択される少なくとも１種を含む。

したがって、本発明の組成物は、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性剤、及び少なくとも１種のＧＳＫ−３阻害剤、並びに場合により少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤を含む場合がある。

本発明の組成物は、少なくとも１種のレチノイン酸受容体応答活性化剤、及び、少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性化剤、並びに場合により少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤を含む場合がある。

本発明の組成物は、少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性剤及び少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤、並びに場合により少なくとも１種のＧＳＫ３阻害剤又は少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性剤を含む場合がある。

上述したように、本発明の方法において使用される成分に関して本明細書で与えられた詳細は、本発明の組成物に含まれる成分に適用されることが理解される。

したがって、本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のレチノイン酸応答性受容体活性剤は、例えば、９−シス−レチノイン酸などのレチノイン酸の場合がある。

本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＧＳＫ−３阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、アミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１及びインジルビン−３’−オキシムから選択される場合がある。

本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＧＳＫ−３阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３’−オキシム、２−ブロモ−９−ニトロパウロン、２−ブロモ−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ブロモパウロン、２−ヨード−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ヨードパウロン、２−フェニル−４−（２−チエニル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、２−［２−（１−ヒドロキシシクロヘキシル）−エチニル］−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシ−９−ニトロパウロン、２，３−ジメトキシ−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシパウロン、２−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、２，９−ジブロモパウロン、３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−プロピオニトリル、４−メトキシパウロン、４−（４−クロロフェニル）−２−（２−ナフチル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、５−ベンジル−９−ブロモパウロン、５−ヨード−インジルビン−３−オキシム、５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、６−ブロモインジルビン、８，１０−ジクロロパウロン、９−ブロモ−２，３−ジヒドロキシパウロン、９−ブロモ−２，３−ジメトキシパウロン、９−ブロモ−４−ヒドロキシパウロン、９−ブロモ−４−メトキシパウロン、９−ブロモ−５−エチルパウロン、９−ブロモ−５−（メチルオキシカルボニルメチル）パウロン、９−ブロモ−５−メチルパウロン、９−ブロモ５，６，７，１２−テトラヒドロベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、９−ブロモ−５，７−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，７，１２−トリ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，１２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−（ヒドロキシアミノ）−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−メチルチオ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−チオン、９−ブロモ−１２−（２−ヒドロキシエチル）−パウロン、９−ブロモ−１２−（２−プロペニル）−パウロン、９−ブロモ−１２−エチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルオキシカルボニル−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−クロロパウロン、９−シアノパウロン、９−シアノ−２，３−ジメトキシパウロン、９−フルオロパウロン、９−メトキシパウロン、９−メチルパウロン、９−オキソ−チアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリン−２−カルボニトリル誘導体、９−トリフルオロメチルパウロン、１０−ブロモパウロン、１１−ブロモパウロン、１１−クロロパウロン、１１−エチルパウロン、１１−メチルパウロン、アロイシン類（＝６−フェニル［５Ｈ］ピロロ［２，３−６］ピラジン類）；例えばアロイシンＡ、ＡＺＤ１０８０、ビス−インドールインジルビン、デブロモヒメニアルジシン、ジブロモカンタレリン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリル酸メチルエステル、（Ｅ）−２−（３−オキソ−１−ブテニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリロニトリル、インジルビン、ヒメニジン、ヒメニアルジシン、マンザミン類、例えばマンザミンＡ、メリジアミン類、パウロン、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体、ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン誘導体及びチアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリノ−９−オン誘導体から選ばれる場合がある。

本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＷｎｔシグナル伝達活性剤は、例えば、上記で開示されたＷｎｔタンパク質の群から選択されるものの場合がある。これは、例えば、たＷｎｔ３Ａ又はＷｎｔ５Ａの場合がある。

本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３’−オキシム、ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ−３８７０３２）、ＡＴ−７５１９及びＡＺＤ５４３８から選択される場合がある。

本発明の組成物に含まれる少なくとも１種のＣＤＫ阻害剤は、例えば、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、インジルビン−３’−オキシム、２−ブロモ−９−ニトロパウロン、２−ブロモ−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ブロモパウロン、２−ヨード−９−トリフルオロメチルパウロン、２−ヨード−パウロン、２−フェニル−４−（２−チエニル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、２−［２−（１−ヒドロキシシクロヘキシル）−エチニル］−９−トリフルオロメチル−パウロン、２，３−ジメトキシ−９−ニトロパウロン、２，３−ジメトキシ−９−トリフルオロメチルパウロン、２，３−ジメトキシパウロン、２−（３−ヒドロキシ−１−プロピニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、２，９−ジブロモパウロン、３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−プロピオニトリル、４−メトキシパウロン、４−（４−クロロフェニル）−２−（２−ナフチル）−５Ｈ−ピリド［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（７Ｈ）−チオン、５−ベンジル−９−ブロモパウロン、５−ヨード−インジルビン−３−オキシム、５，６，７，１２−テトラヒドロ−ベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、６−ブロモ−インジルビン、８，１０−ジクロロパウロン、９−ブロモ−２，３−ジヒドロキシパウロン、９−ブロモ−２，３−ジメトキシパウロン、９−ブロモ−４−ヒドロキシパウロン、９−ブロモ−４−メトキシパウロン、９−ブロモ−５−エチルパウロン、９−ブロモ−５−（メチルオキシカルボニルメチル）パウロン、９−ブロモ−５−メチルパウロン、９−ブロモ−５，６，７，１２−テトラヒドロベンゾ［６±７］シクロヘプタ［１，２−ｂ］インドール、９−ブロモ−５，７−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，７，１２−トリ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−５，１２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−（ヒドロキシアミノ）−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−６−メチルチオ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン、９−ブロモ−７，１２−ジヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−６（５Ｈ）−チオン、９−ブロモ−１２−（２−ヒドロキシエチル）−パウロン、９−ブロモ−１２−（２−プロペニル）−パウロン、９−ブロモ−１２−エチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−メチルオキシカルボニル−メチルパウロン、９−ブロモ−１２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−パウロン、９−クロロパウロン、９−シアノパウロン、９−シアノ−２，３−ジメトキシパウロン、９−フルオロパウロン、９−メトキシパウロン、９−メチルパウロン、９−オキソ−チアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリン−２−カルボニトリル誘導体、９−トリフルオロメチルパウロン、１０−ブロモパウロン、１１−ブロモパウロン、１１−クロロパウロン、１１−エチルパウロン、１１−メチルパウロン、アロイシン類（＝６−フェニル［５Ｈ］ピロロ［２，３，６］ピラジン類）；例えばアロイシンＡ、ＡＺＤ１０８０、ビス−インドールインジルビン、デブロモヒメニアルジシン、ジブロモカンタレリン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリル酸メチルエステル、（Ｅ）−２−（３−オキソ−１−ブテニル）−９−トリフルオロメチルパウロン、（Ｅ）−３−（６−オキソ−９−トリフルオロメチル−５，６，７，１２−テトラヒドロ−インドロ［２±３−ｄ］［１］ベンゾアゼピン−２−イル）−アクリロニトリル、インジルビン、ヒメニジン、ヒメニアルジシン、マンザミン類、例えばマンザミンＡ、メリジアミン類、パウロン、ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン誘導体、ピラゾロ［３，４−ｂ］キノキサリン誘導体及びチアゾロ［５，４−ｆ］キナゾリノ−９−オン誘導体から選択される場合がある。

したがって、本発明の組成物は、９−シス−レチノイン酸及びケンパウロンを含む場合がある。

本発明の組成物は、９−シス−レチノイン酸及びインジルビン−３’−オキシムを含む場合がある。

本発明の組成物は、１３−シス−レチノイン酸及びケンパウロンを含む場合がある。

本発明の組成物は、１３−シス−レチノイン酸及びインジルビン−３’−オキシムを含む場合がある。

定義
本明細書で用いられるところの、「多能性の」又は「多能性」とは、三胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のすべてのタイプの特殊化した細胞を形成する能力をいい、子孫を生じることが可能な完全な胚を形成する能力である「全能性の」又は「全能性」とは区別されるべきである。

本明細書で用いられるところの、「ヒト多能性幹細胞」（ＨＰＳＣ）は、適切な条件下で自己複製する能力と、三胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のいずれかのタイプの特殊化した細胞を形成する能力とを有するヒト細胞をいう。ｈＰＳ細胞は、８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスでテラトーマを形成する能力及び／又は組織培養で全ての三胚葉の同定可能な細胞を形成する能力を有する場合がある。ヒト多能性幹細胞の定義に含まれるものは、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（例えば、Thomsonら(1998年)、Heinsら(2004年)）、及び、人工多能性幹細胞［例えば、Takahashiら(2007年); Zhouら(2009年); Yu and Thomson in Essentials of Stem Cell Biology (第２版)］を含む様々なタイプの胚性細胞である。本明細書に記載される様々な方法は、様々な供給源由来のｈＰＳ細胞を利用してもよい。例えば、使用するのに適したｈＰＳ細胞は、例えば、Chungら(2008年)に記載され、さらにMercaderらによってEssential Stem Cell Methods（第１版，2009年）に記載された単一割球の除去技術を使用することなどの、非破壊技術を使用することによって発生中の胚から得られる場合がある。追加的又は代替的に、適切なｈＰＳ細胞は、確立された細胞株から得られる場合、又は、成体幹細胞の場合がある。

本明細書で用いられるところの、「ｈｉＰＳ細胞」とは、ヒト人工多能性幹細胞をいう。ｈｉＰＳ細胞は、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８などの多能性に関連する遺伝子の発現による、典型的には成体体細胞由来の非多能性細胞から誘導される多能性幹細胞の一種である。

本明細書で用いられるところの、「胚体内胚葉（ＤＥ）」及び「胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）」は、タンパク質及び／又は遺伝子の発現を示している細胞、並びに胚体内胚葉の細胞に典型的な形態、又は、胚体内胚葉の細胞に似ているかなりの数の細胞を含む組成物をいう。胚体内胚葉は、腸、膵臓、肝臓及び肺の細胞を生じる生殖細胞層である。ＤＥ細胞は、一般的に、内胚葉マーカーＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６の遺伝子及びタンパク質の陽性発現によって特徴付けられ、ひいては同定される場合がある。２つのマーカーＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４はＤＥに特異的であり、ｈＰＳＣ、肝前駆細胞又は肝細胞で同定されない。最後に、ＤＥ細胞は、未分化細胞マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１の遺伝子及びタンパク質発現を示さないが、Ｎａｎｏｇの低発現を示す。

本明細書で用いられるところの、「肝前駆細胞(hepatic progenitors)」又は「肝前駆細胞(hepatic progenito cells)」は、肝細胞系譜に入り、肝細胞を生じる細胞をいう。「肝前駆細胞」は、このように、それらが腸、膵臓及び肺の細胞に発達する可能性を失っているという点で、「内胚葉細胞」と区別される。「肝前駆細胞」は、一般的に、初期肝マーカーのＥｐＣＡＭ、ｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）、ＡＦＰ、ＣＫ１９、ＨＮＦ６、Ｃ／ＥＢＰα及びβの遺伝子及びタンパク質の陽性発現によって特徴付けられ、ひいては同定される場合がある。それらは、ＤＥ−マーカーＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７の遺伝子及びタンパク質の発現を示さない。最後に、「肝前駆細胞」は、未分化細胞マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１も、成熟肝マーカーＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ１９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６及びＰＸＲのいずれの遺伝子及びタンパク質の発現も示さない。

本明細書で用いられる、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、完全に分化した肝細胞をいう。「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、一般的に、成熟肝マーカー、とりわけ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｂ６、ＧＳＴＡ１−１、ＯＡＴＰ−２、ＮＴＣＰ、アルブミン、ＰＸＲ、ＣＡＲ及びＨＮＦ４ａ（アイソフォーム１＋２）の遺伝子及びタンパク質の陽性発現によって特徴付けられ、ひいては同定される場合がある。さらに、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、未分化細胞マーカーＯｃｔ４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１の遺伝子及びタンパク質発現を示さない。ＤＥ細胞と比較して、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、ＤＥ細胞マーカーＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４の遺伝子及びタンパク質発現を示さない。「肝前駆細胞」と比較して、「肝細胞」又は「肝細胞様細胞」は、肝前駆細胞マーカーのサイトケラチン１９及びＡＦＰの遺伝子及びタンパク質発現を示さない。

本明細書で意味するように、かかる遺伝子又はタンパク質の発現レベルを測定する実験で、決定した発現レベルが、測定の標準偏差の３倍よりも高い場合には、遺伝子又はタンパク質が「発現」されると解釈されるべきであり、前記発現レベル及び標準偏差は、発現レベルの１０回の個別の測定で決定される。前記１０回の個別の測定における発現レベルの決定は、好ましくは、バックグラウンドシグナルに対して補正される。

本明細書で用いられるところの、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸ナトリウム（「ＮａＢ」）、フェニルブチレート（「ＰＢ」）、トリコスタチンＡ及びバルプロ酸（「ＶＡ」）などのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤をいう。

本明細書で用いられるところの、「ＧＳＫ阻害剤」は、ＧＳＫ（特に、ＧＳＫ３アルファ又はＧＳＫ３ベータを含むＧＳＫ３）を阻害する化合物をいう。

本明細書で用いるところの、「Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤」は、Ｗｎｔシグナル伝達を活性化する化合物をいう。

本明細書で用いられるところの、ＤＮＡ脱メチル化剤は、シチジン類似体、特に５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）及び５−アザシチジン（アザシチジン）のようなヌクレオシド類似体、及び、ＲＧ１０８、Ｓ−５アデノシル−Ｌ−ホモシステイン及びプロカインなどの非ヌクレオシドタイプなどの、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の活性を妨げる化合物を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、「ＣＹＰ」は、シトクロムＰ、より具体的にはシトクロムＰ４５０で、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６／２Ａ７／２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７及びＣＹＰ７Ａ１などの多くの異なるアイソザイムからなる肝臓の主要な第１相の代謝酵素を意味することを意図する。

本明細書で用いるところの、用語「ＧＳＴ」は、グルタチオントランスフェラーゼを意味することを意図し、そして、そのサブタイプの例はＧＳＴＡ１−１、ＧＳＴＭ１−１及びＧＳＴＰ１−１である。

本明細書で用いるところの、用語「ＵＧＴ」は、ウリジンジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを意味することを意図し、グルクロン酸化活性を触媒する一群の肝臓酵素である。

本明細書で用いるところの、用語「ＮＴＣＰ」は、Ｎａ−タウロコール酸共輸送ポリペプチド、ＳＬＣ１０Ａ１遺伝子によってエンコードされるナトリウム／胆汁酸共輸送体を意味するものである。

本明細書で用いるところの、用語「ＣＡＲ」は、構成的アンドロスタン受容体を意味するものである。

用語「機能薬物代謝酵素」は、生体異物及び薬物の化学修飾、いわゆる薬物又は生体異物代謝を行う第１相及び第２相酵素に属する機能酵素を意味することを意図する。

本明細書で用いるところの、用語「機能活性」は、一般的に初代ヒト肝細胞で検出される、薬物輸送体に対しての薬物の測定可能な輸送、及び、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰｓ）酵素に対しての測定可能な代謝などの、有効な測定可能な肝細胞機能を意味する。

本明細書で用いられるところの、用語「胚体外内胚葉（ＥＸＥ）」は、胚体内胚葉の反対に関して、卵黄嚢のように、ヒトの発生で胚の外側の区画を構成する分化した内胚葉細胞を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＡＡＴ」は、肝臓マーカーのアルファ抗トリプシンを意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＡＦＰ」は、肝臓マーカーのアルファフェトプロテインを意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＢＳＥＰ」は、胆汁酸輸送体の胆汁酸塩排出ポンプ（the bile transporter bile salt export pump）を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＣＫ」は、サイトケラチン１８（ＣＫ１８／ＫＲＴ１８）、サイトケラチン１９（ＣＫ１９／ＫＲＴ１９）、サイトケラチン８（ＣＫ８）及びサイトケラチン７（ＣＫ７）などの異なるサブタイプを有する（互換的に用いられる）肝臓マーカーのサイトケラチンを意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＦＧＦ」は、好ましくは、ヒト及び／又は組換体起源の線維芽細胞成長因子を意味し、それに属するサブタイプは、例えば、（時にはＦＧＦ２とも呼ばれる、塩基性線維芽細胞成長因子を意味する）「ｂＦＧＦ」及びＦＧＦ４である。「ａＦＧＦ」は、酸性線維芽細胞成長因子（時にはＦＧＦ１とも呼ばれる）を意味する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＢＭＰ」は、好ましくは、ヒト及び／又は組換体起源の骨形成タンパク質を意味し、それに属するサブタイプは、例えば、ＢＭＰ４及びＢＭＰ２である。

本明細書で用いられるところの、用語「ＨＧＦ」は、好ましくは、ヒト及び／又は組換体起源の肝細胞成長因子を意味する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＥＧＦ」は、好ましくは、ヒト及び／又は組換体起源の上皮成長因子を意味する。

本明細書で用いられるところの、互換的に用いられる「ＨＮＦ４アルファ」又は「ＨＮＦ４ａ」は、内胚葉由来組織、例えば、肝臓、膵島及び脂肪細胞で遺伝子発現を調節する転写因子の、ＮＲ２Ａ１（核内受容体サブファミリー２、グループＡ、メンバー１）としても知られている肝細胞核因子４を意味することを意図する。エンコードされたタンパク質は、肝細胞核因子１アルファを含む多くの遺伝子の発現を制御する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＭＤＲ」は、多剤耐性輸送体を意味することを意図する。ＭＤＲ１及び３は輸送体のＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）ファミリーのメンバーであり、両方とも薬物排出輸送体である。ＭＤＲ１は、体内への薬物、ペプチド及び生体異物の出入りを調節し、生体異物傷害及び薬物毒性から身体を保護するのに重要である一方、ＭＤＲ３は、胆汁へのリン脂質分泌に必要不可欠である。

本明細書で用いられるところの、用語「アクチビン」は、「アクチビンＡ」又は「アクチビンＢ」などの細胞増殖及び分化の調節を含む広い範囲の生物活性を示すＴＧＦ−βファミリーのメンバーを意味することを意図する。アクチビンは、リガンドの共通のＴＧＦ−ベータスーパーファミリーに属する。

本明細書で用いられるところの、用語「レチノイン酸応答性受容体活性化剤」は、ヒトレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）及び／又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲｓ）に結合し、活性化することができる化合物を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「レチノイン酸受容体」又は「ＲＡＲ」は、レチノイン酸受容体のファミリーのメンバー、特に、ＲＡＲ−アルファ、ＲＡＲ−ベータ及びＲＡＲ−ガンマを意味することを意図し、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ遺伝子それぞれによってエンコードされる。各受容体アイソフォームは、多くのスプライスバリアントがあり、アルファには２つ、ベータには４つ、そしてガンマには２つある。また、これらのアイソフォームは「レチノイン酸受容体」の定義に含まれる。

本明細書で用いられるところの、用語「レチノイドＸ受容体」は、レチノイドＸ受容体ファミリーのメンバー、特に、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ遺伝子それぞれによってエンコードされるＲＸＲ−アルファ、ＲＸＲ−ベータ及びＲＸＲ−ガンマを意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「レチノイン酸」は、全トランスレチノイン酸、７−シス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、１１−シス−レチノイン酸及び１３−シス−レチノインを含むが、これらに限定されないレチノイン酸異性体を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「サイクリン依存性キナーゼの阻害剤」又は「ＣＤＫ阻害剤」は、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）などのサイクリン依存性キナーゼの機能（例えば、活性）を阻害することができる化合物を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「ＲＯＣＫ阻害剤」は、ＲＯＣＫＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ活性阻害剤を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「マトリクス」は、単離したか、又は組み合わせの、いずれかの成分をいうことを意図し、正常な哺乳類細胞外マトリクス環境の一部を形成する。かかるマトリクス成分は、コラーゲン、フィブロネクチン及びラミニンを含むが、これらに限定されず、天然又は合成の供給源由来の場合がある。

本明細書で用いられるところの、用語「オーバーレイ」は、例えば、細胞外マトリクス成分の層をいうことを意図し、培養細胞の上に適用される。

本明細書で用いられるところの、用語「コーティング」は、例えば、細胞外マトリクス成分の層をいうことを意図し、培養容器の表面を被覆し、その上に細胞が培養される。

本明細書で用いられるところの、用語「異種非含有（xeno-free）」は、非ヒト動物成分への直接又は間接曝露の完全な回避を意味することを意図する。

本明細書で用いられるところの、用語「肝細胞毒性」は、壊死毒性、アポトーシス、ミトコンドリア毒性、リン脂質症、脂肪症及び胆汁酸輸送などの細胞応答を示す。

異なるＲＡ処理あり及びなしでのｄ２３のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＨＮＦ４ａのｍＲＮＡ発現異なるＲＡ処理あり及びなしでのｄ２３のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＨＮＦ４ａ４〜９アイソフォームに対するＨＮＦ４ａ１〜３アイソフォームの発現率ｄ２３の５時間ＲＡパルスの直後、及び、７日後のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＨＮＦ４ａのｍＲＮＡ発現ｄ２１での５又は２４時間ＲＡパルス後のｄ２３のｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ１Ａ活性及びＣＹＰ３Ａ活性ｄ２３での５時間ＲＡパルスあり及びなしでのｄ３０のｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ１Ａ活性、ＣＹＰ３Ａ活性及びＣＹＰ２Ｃ９活性５時間ＲＡパルスの繰り返しあり又はなしでのｄ２４及びｄ３１のｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ１Ａ活性、ＣＹＰ３Ａ活性及びＣＹＰ２Ｃ９活性５、２４及び４８時間ＲＡパルス（ｄ２３、２２−２３及び２１−２３）又は長期曝露（ｄ１４−２３）あり又はなしでのｄ２３のｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ３Ａ活性及びＣＹＰ１Ａ活性ｄ２１及び２１−２３それぞれでの５及び２４時間ＲＡパルスあり及びなしでのｄ２１、２３及び３０のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現ｄ２１での５時間ＲＡパルスあり及びなしでのｄ２１及び２３のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ７のｍＲＮＡ発現ｄ２１での５時間ＲＡパルスあり及びなしでのｄ２１及び２３のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＰＸＲのｍＲＮＡ発現異なるＲＡ処理あり及びなしでのｄ２２のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＣＡＲのｍＲＮＡ発現異なるＲＡ処理あり及びなしでのｄ２２のｈＥＳＣ由来肝細胞におけるＡＦＰのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び／又は薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでのｄ３６のｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞のＣＹＰ活性ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでのｄ３７のｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞のＣＹＰ活性ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでのｄ３７のｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞のＣＹＰ活性ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの３種の異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞におけるｄ２３、３０及び３７でのＮＴＣＰのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの３種の異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞におけるｄ２３、３０及び３７でのＧＳＴＡ１−１のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの３種の異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞におけるｄ２３、３０及び３７でのＣＡＲのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの３種の異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞におけるｄ２３、３０及び３７でのＣＹＰ２Ｂ６のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの３種の異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞におけるｄ２３、３０及び３７でのＣＹＰ２Ｃ９のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの３種の異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞におけるｄ２３、３０及び３７でのＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ３０及び３６のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ２Ｂ６のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの、ｄ３０及び３６のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現、及び、ｄ２９及び３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの、ｄ３０及び３６のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ３Ａ５のｍＲＮＡ発現、及び、ｄ２９及び３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ３Ａ５のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの、ｄ３０及び３６のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＡＲのｍＲＮＡ発現、及び、ｄ２９及び３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＡＲのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの、ｄ３０及び３６のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＧＳＴＡ１−１のｍＲＮＡ発現、及び、ｄ２９及び３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＧＳＴＡ１−１のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの、ｄ３０及び３６のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＮＴＣＰのｍＲＮＡ発現、及び、ｄ２９及び３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＮＴＣＰのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ２９及び３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡ発現薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ２８のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ３５のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ４３のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ３０のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ３５のｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ２８のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでのｄ３６のｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＣＹＰ２Ｂ６発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＣＹＰ３Ａ４発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＣＹＰ３Ａ５発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＣＡＲ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＧＳＴＡ１−１発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＮＴＣＰ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるｄ２９及び３６でのＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞のｄ３７でのＣＹＰ活性ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞のｄ３７でのＣＹＰ活性ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞のｄ２８での形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞のｄ３５での形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来の肝細胞様細胞のｄ４２での形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞のｄ２８での形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞のｄ３５での形態ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり及びなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞のｄ４２での形態５ａｚａ−ｄＣ処理、ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでのｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞のｄ３７でのＣＹＰ活性５ａｚａ−ｄＣ処理、ケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加あり又はなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞のｄ３７でのＣＹＰ活性前内胚葉期間（プロトコールの第０−７日目）に、５−アザ−デオキシシチジン処理あり及びなしでの（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ由来胚体内胚葉細胞前内胚葉期間（プロトコールの第０−７日目）に、５−アザ−デオキシシチジン処理あり及びなしでの（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈｉＰＳＣ由来胚体内胚葉細胞Ｏｃｔ４免疫染色及びＤＡＰＩ核染色Ｏｃｔ４のｍＲＮＡ発現ＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現Ｓｏｘ１７のｍＲＮＡ発現ＣＸＣＲ４のｍＲＮＡ発現ＦｏｘＡ２のｍＲＮＡ発現ｈＨＥＸのｍＲＮＡ発現Ｓｏｘ７のｍＲＮＡ発現未分化ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおける発現と比較しての、２７種のｈＰＳＣ細胞株由来の５ａｚａｄＣで処理されたＤＥにおけるＯＣＴ−４のｍＲＮＡ発現未分化ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおける発現と比較しての、２７種のｈＰＳＣ細胞株由来の５ａｚａｄＣで処理されたＤＥにおけるＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現未分化ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおける発現と比較しての、２７種のｈＰＳＣ細胞株由来の５ａｚａｄＣで処理されたＤＥにおけるＳｏｘ１７のｍＲＮＡ発現未分化ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおける発現と比較しての、２７種のｈＰＳＣ細胞株由来の５ａｚａｄＣで処理されたＤＥにおけるＣｘｃｒ４のｍＲＮＡ発現ＤＮＡメチル化阻害剤での処理あり又はなしでのＤＥ細胞におけるＯＣＴ−４のｍＲＮＡ発現ＤＮＡメチル化阻害剤での処理あり又はなしでのＤＥ細胞におけるＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現ＤＮＡメチル化阻害剤での処理あり又はなしでのＤＥ細胞におけるＳｏｘ１７のｍＲＮＡ発現ＤＮＡメチル化阻害剤での処理あり又はなしでのＤＥ細胞におけるＣｘｃｒ４のｍＲＮＡ発現９６時間にわたる培養でのｈｐｈｅｐにおけるＣＹＰ１Ａ活性２週間にわたってケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加ありでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ１Ａ活性９６時間にわたる培養でのｈｐｈｅｐにおけるＣＹＰ２Ｃ９活性２週間にわたってケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加ありでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９活性９６時間にわたる培養でのｈｐｈｅｐにおけるＣＹＰ３Ａ活性２週間にわたってケンパウロン、ＲＡ及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイの添加ありでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞におけるＣＹＰ３Ａ活性培養期間中にわたる５ａｚａ−ｄＣ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ、ケンパウロン及びＲＡで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ１Ａ、２Ｂ６、２Ｃ９及び３Ａ４のｍＲＮＡ発現培養期間中にわたる５ａｚａ−ｄＣ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ、ケンパウロン及びＲＡで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ３Ａ５のｍＲＮＡ発現培養期間中にわたるｈｐｈｅｐにおけるＣＹＰ１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ９及び３Ａ４のｍＲＮＡ発現培養期間中にわたるｈｐｈｅｐにおけるＣＹＰ３Ａ５のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞のｄ３６でのＣＹＰ１Ａ活性ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞のｄ３６でのＣＹＰ２Ｂ６活性ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞のｄ３６でのＣＹＰ２Ｃ９活性ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞のｄ３６でのＣＹＰ２Ｄ６活性ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞のｄ３６でのＣＹＰ３Ａ活性ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり又はなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ２ＢのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり又はなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり又はなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり又はなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ５のｍＲＮＡ発現ケンパウロン、９シスＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ及び１３シスＲＡでの処理あり又はなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるＰＸＲのｍＲＮＡ発現ケンパウロン、ＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ、薄層肝マトリクス様オーバーレイ、又は、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−基底板−オーバーレイの添加あり及びなしでのｈＥＳＣ由来肝細胞におけるｄ３６でのＣＹＰ２Ｃ９活性ケンパウロン、ＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ、薄層肝マトリクス様オーバーレイ、又は、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−基底板−オーバーレイの添加あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるｄ３６でのＣＹＰ２Ｃ９活性ケンパウロン、ＲＡ、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ、薄層肝マトリクス様オーバーレイ、又は、薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−基底板−オーバーレイの添加あり及びなしでのｈｉＰＳＣ由来肝細胞におけるｄ３６でのＣＹＰ３Ａ活性マトリクスオーバーレイ、ケンパウロン及び９シスＲＡ又は９シスＲＡの類似体での処理あり又はなしでの５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来幹細胞の３６日目でのＣＹＰ２Ｃ９活性マトリクスオーバーレイ、９シスＲＡ及びケンパウロン又はケンパウロンの類似体で処理した又は処理されていない５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来幹細胞の２９日目でのＣＹＰ２Ｃ９活性マトリクスオーバーレイ、９シスＲＡ及びケンパウロン又はケンパウロンの類似体で処理した又は処理されていない５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈｉＰＳＣ由来幹細胞の２９日目でのＣＹＰ３Ａ活性マトリクスオーバーレイ、９シスＲＡ及びケンパウロン又はケンパウロンの類似体で処理した又は処理されていない５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来幹細胞の２９日目でのＣＹＰ２Ｃ９活性マトリクスオーバーレイ、９シスＲＡ及びケンパウロン又はケンパウロンの類似体で処理した又は処理されていない５ａｚａ−ｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来幹細胞の２９日目でのＣＹＰ３Ａ活性

（図１）レチノイン酸処理の様々な長さで曝露したｈＥＳＣ由来肝細胞のＨＮＦ４ａの発現
（図２）レチノイン酸処理の様々な長さで曝露したｈＥＳＣ由来肝細胞の多くのＣＹＰ酵素の機能発現
（図３）レチノイン酸処理の様々な長さで曝露したｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ酵素、核内受容体ＣＡＲ及びＰＸＲ並びにα−フェトプロテインの遺伝子発現
（図４）ケンパウロンとマトリクスオーバーレイとを組み合わせてレチノイン酸に曝露したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳ由来肝細胞のＣＹＰ酵素の機能発現
（図５）レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイに曝露された（基本プロトコールＢで誘導した）ｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞の第１相酵素、第２相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の遺伝子発現
（図６）レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイに曝露された（基本プロトコールＣ及びＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞の第１相酵素、第２相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の遺伝子発現
（図７）マトリクスオーバーレイ（プロトコールＢ）で処理された（基本プロトコールＢで誘導した）ｈＥＳＣ由来肝細胞の形態と寿命
（図８）レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイに曝露された（基本プロトコールＣ及びＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞の形態と寿命
（図９）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞の第１相酵素、第２相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の遺伝子発現
（図１０）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞のＣＹＰ酵素の機能発現
（図１１）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞の形態と寿命
（図１２）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理あり及びなし、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露あり及びなしでの（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ酵素の機能発現の比較
（図１３）前内胚葉期間（プロトコールの第０〜７日目）に、５−アザ−デオキシシチジン処理あり及びなしでの（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来胚体内胚葉細胞の特徴付け
（図１４）前内胚葉期間（プロトコールの第０〜７日目）に、５−アザ−デオキシシチジン処理した（それぞれ基本プロトコールＣとＤで誘導した）２７種類の異なるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ細胞株由来の胚体内胚葉細胞の特徴付け
（図１５）前内胚葉期間（プロトコールの第０〜７日目）に、５−アザ−デオキシシチジン又は５−アザシチジン処理あり又はなしでの（それぞれ基本プロトコールＣとＤで誘導した）３種類のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ細胞株由来の胚体内胚葉細胞との特徴付け
（図１６）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での、凍結保存したヒト初代肝細胞と、（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞とにおけるＣＹＰ酵素発現の比較
（図１７）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びに１種以上のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ酵素の機能発現
（図１８）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びに１種以上のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ酵素及び核内受容体ＰＸＲの遺伝子発現
（図１９）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及び１種以上の複合体のマトリクスオーバーレイへの後期曝露された（基本プロトコールＣとＤで誘導した）ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ酵素の機能発現
（図２０）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにケンパウロン、９シス−レチノイン酸又は９シス−レチノイン酸の類似体への後期曝露された（基本プロトコールＤで誘導した）ｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９酵素の機能発現
（図２１）５−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びに９シス−レチノイン酸、ケンパウロン又はケンパウロンの類似体への後期曝露された（基本プロトコールＣ及びＤで誘導した）ｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞におけるＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａ酵素の機能発現

一般的な培養及び継代技術の例は、WO2004/099394、WO2003/055992、WO2007/042225、WO2007/140968及びWO2011116930の出願で開示されている。

以下の実施例で詳しく説明するように、出発材料は、いずれかの肝前駆細胞の細胞タイプ、特に、ヒト多能性幹細胞から胚体内又は胚体外系譜への初期分化を通じて誘導される細胞タイプを含む場合がある。また、出発材料は肝前駆細胞系譜のいずれかの細胞の場合がある。

実施例１：ｈＰＳ細胞タイプの維持
（上記で定義したような）全てのｈＰＳ細胞は、本発明の出発材料として用いられる。以下の実施例に対して、特に、肝細胞様細胞は、ｍＥＦフィーダー細胞（Heinsら、2004年）で確立され、フィーダーなしの条件下で維持された未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）からｉｎｖｉｔｒｏで誘導された。本実験に用いた細胞株は、ｈＥＳ細胞株ＳＡ１６７、ＳＡ１８１、ＳＡ４６１（セラーティスＡＢ、イェーテボリ、スウェーデン）の場合があるが、これらに限定されず、細胞株は、Heinsら、2004年によって記載されるように増殖される。これらの細胞株は、ＮＩＨの幹細胞バンク、英国細胞バンク及び欧州ｈＥＳＣバンクに列挙され、要求により利用可能である。

また、ｈＥＳＣから得たｈＰＳとともに、ｈｉＰＳ（ヒト人工多能性幹）細胞が、本発明の実施例の肝細胞を誘導するために用いられた。

本発明で用いたｈｉＰＳＣ細胞株は以下のように誘導された。ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＲＬ２４２９、ＡＴＣＣ）が、３７℃、５％Ｃ０_２飽和雰囲気で、１０％ウシ胎児血清、１×のグルタマックス、５Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで維持された。線維芽細胞は、マウスＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−ｍｙｃをエンコードする組換体レンチウイルスで形質導入され、５日間培養された。その後、形質導入した細胞は、トリプシンで分散され、マイトマイシンＣで処理されたヒト皮膚線維芽細胞フィーダー細胞上に、その通常増殖培地中に５×１０^３細胞／ｃｍ^２の密度で播種された。２４時間後、培地は、３７℃、５％Ｃ０_２飽和雰囲気で、２０％ノックアウト血清代替品、１×の非必須アミノ酸、１×のグルタマックス、５Ｕ／ｍＬのペニシリン、５μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの２−メルカプトエタノール及び３０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充したノックアウトＤＭＥＭで交換された。培地の体積の半分が毎日交換され、ｉＰＳ細胞のコロニーは約３０日後に出現した。ｉＰＳコロニーが採取され、ＤＥＦ−ＣＳ（商標）で拡大され、そして細胞バンクが調製された。その後、バンクで保存された細胞は、内因性Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃの発現、導入遺伝子のサイレンシング、ｉｎｖｉｔｒｏで全ての三胚葉を代表する細胞タイプに分化する可能性をチェックし、ＳＴＲプロファイリング及び親の線維芽細胞株（ＡＴＣＣ）との比較により、それらの信頼性を確認して特徴付けられた。レンチウイルスを用いる再プログラミングの代替として、ｈｉＰＳＣ細胞株はまた、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソームプラスミドベクター、タンパク質及びｍＲＮＡその他の技術を用いてリプログラムすることができる。使用に適切な他の細胞株は、ＭＡ１２６、ＭＡ１２７、ＭＡ１２８及びＭＡ１２９（アドヴァンスト・セル・テクノロジー社、ウスター、マサチューセッツ州、米国）などのChungら(2008年)によって確立された細胞株であり、全てが国際幹細胞バンクに登録される。これらの細胞株は、単一割球の除去技術を使用することによってヒト胚を破壊することなく誘導された（又は取得された）。

実施例２肝細胞様を作製するためのｈＰＳ細胞タイプの分化
肝細胞様細胞は、以下の例示的な基本プロトコールＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを使用することによってｈＰＳ細胞から誘導される場合がある。

プロトコールＡ
未分化ｈＰＳ細胞は分離され、新たに調製した０日目の培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、０、１、２、３、４、５、７日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に２日又は３日毎に添加された。

０日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬ
ＮａＢ１ｍＭ
ＲＯＣＫ阻害剤５μＭ

１日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬ
ＮａＢ１ｍＭ

２〜７日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬ
ＮａＢ０．５ｍＭ

７日目に細胞は継代される。細胞は３７℃でＴｒｙｐＬＥＳｅｌｅｃｔで３〜７分間インキュベーションされ、同量のＶｉｔｒｏＨＥＳが添加され、細胞懸濁液が２００〜３００ｇで５〜６分間遠心分離される。その後、細胞は、例えば100000〜300000細胞／ｃｍ^２、好ましくは150000細胞／ｃｍ^２などの50000〜350000細胞／ｃｍ^２の細胞密度でゼラチンを利用したコーティング上に再播種される。

７〜１４日目（プレ肝細胞）
ＶｉｔｒｏＨＥＳ
１％ＤＭＳＯ

１４〜４５日目（分化及び成熟）
ＷＭＥ＋ＳＱ（−ＧＡ１０００）＋１％グルタマックス＋０．１％ＰＥＳＴ
ＤｅｘＭ０．１μΜ
ＯｓＭ１０ｎｇ／ｍＬ
ＨＧＦ２０ｎｇ／ｍＬ
０．５％ＤＭＳＯ
（２’Ｚ，３’£）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）１．４μＭ

プロトコールＢ
未分化ｈＰＳ細胞は分離され、新たに調製した０日目培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、０、１、２、３、４、５、７日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に２日又は３日毎に添加された。

１日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬ
ＮａＢ１ｍＭ
ＣＨＩＲ９９０２１３μＭ

７日目に細胞は継代される。細胞は３７℃でTrypLE Selectで３〜７分間インキュベーションされ、同量のＶｉｔｒｏＨＥＳが添加され、細胞懸濁液が２００〜３００ｇで５〜６分間遠心分離される。その後、細胞は、例えば100000〜300000細胞／ｃｍ^２、好ましくは150000細胞／ｃｍ^２などの50000〜350000細胞／ｃｍ^２の細胞密度でフィブロネクチンを利用したコーティング上に再播種される。培地ｄ７〜１４（プレ肝細胞）及び１４〜４５（分化及び成熟）に対しては、プロトコールＡを参照のこと。

プロトコールＣ
未分化ｈＰＳ細胞は分離され、新たに調製した０日目培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、第０、１、２、３、４、５、７日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に２日又は３日毎に添加された。前処理培地はセレクティスＡＢ（Arvid Wallgrens Backe 20、41346イェーテボリ、スウェーデン）から入手可能である。

０日目
前処理培地
ＣＨＩＲ９９０２１３μＭ
ＲＯＣＫ阻害剤５μＭ

１日目
前処理培地
ＣＨＩＲ９９０２１３μＭ

２日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ
ＣＨＩＲ９９０２１３μＭ
ＬＹ２９４００２５μＭ

３日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ
ＬＹ２９４００２５μＭ

４〜７日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ

継代ｄ７に対しては、培地ｄ７〜１４（プレ肝細胞）及び１４〜４５（分化及び成熟）のプロトコールＢを参照せよ。

プロトコールＤ
未分化ｈＰＳ細胞は分離され、新たに調製した０日目培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、０、１、２、３、４、５、７日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に２日又は３日毎に添加された。前処理培地はセレクティスＡＢ（Arvid Wallgrens Backe 20、41346イェーテボリ、スウェーデン）から入手可能である。

１日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ
ＣＨＩＲ９９０２１３μＭ
ＬＹ２９４００２５μＭ

２日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ
ＬＹ２９４００２５μＭ

３〜７日目
ＲＰＭＩ１６４０（＋０．１％ＰＥＳＴ、＋１％グルタマックス）
Ｂ２７（１×）
アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ

実施例３異なるＨＮＦ４αアイソフォームの発現における９シス−レチノイン酸でのｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞の処理効果
手順
基本プロトコールＡに続いて、ゼラチンを利用したコーティング上で培養されたｈＥＳ細胞由来の肝細胞様細胞は、そのプロトコールの２３日目（すなわち分化及び成熟の９日目）に１又は２μＭの９−シス−レチノイン酸で５、２４若しくは４８時間、又は１４日目（すなわち分化及び成熟期の開始１日目）からの長期間及びそれ以降で処理され、曝露後すぐに（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）又は７日後（図Ｃ）に解析された。３つの異なるＨＮＦ４α−ＴａｑＭａｎアッセイは、ＨＮＦ４αの発現解析のために使用され、１つは、全部で９つのＨＮＦ４αアイソフォームを同定するアッセイであり、１つは、（成体のアイソフォーム１及び２を含む）アイソフォーム１〜３を同定するアッセイであり、１つは、（胎児のアイソフォーム７及び８を含む）アイソフォーム４〜９を同定するアッセイである。アイソフォーム３、４、５、６及び９は、ｉｎｖｉｖｏで全く発現していないか、非常に低レベルであり、したがって完全に無視することができる。

結果
Ａ）５時間のＲＡ曝露は、成体ＨＮＦ４α１〜３のアイソフォームの発現を強く増加するだけでなく、胎児ＨＮＦ４α４〜９のアイソフォームの発現も強く増加する。２４、４８時間曝露及び連続的なＲＡ処理は、成体ＨＮＦ４α１〜３のアイソフォームを僅かに増加し、胎児ＨＮＦ４α４〜９のアイソフォームを僅かに低下し、ｈｐｈｅｐにさらに似る１〜３アイソフォーム／４〜９アイソフォームの割合となる（図１Ｂを参照のこと）。
Ｂ）ヒト初代肝細胞（ｈｐｈｅｐ）は、胎児４〜９アイソフォームに対して成体ＨＮＦ４αアイソフォーム１〜３の割合が高い一方、ＨｅｐＧ２は割合が低い。２４時間及び４８時間のＲＡ曝露と、長期間／連続的な処理とは、ｈｐｈｅｐの場合と類似のレベルまでｈＥＳＣ由来肝細胞の１〜３／４〜９割合を増加する。また、４〜９アイソフォームの発現が増加するため、５時間の曝露は１〜３／４〜９割合を増加しない（図１Ａを参照のこと）。ｈｐｈｅｐは新たに単離したｈｐｈｅｐの７バッチ分の平均である。ＨｅｐＧ２は２バッチ分の平均である。
Ｃ）１μＭのＲＡでの５時間曝露は、曝露直後にＨＮＦ４αアイソフォーム１〜３の発現を増加するが（またＡを参照のこと）、７日後、アイソフォーム１〜３の発現は、非処理対照細胞よりもＲＡ処理細胞では僅かに低い。アイソフォーム４〜９の発現が、曝露直後の対照よりもＲＡ処理細胞では僅かに低い。７日後、胎児アイソフォームの発現が対照値を超えて惹起される。

したがって、２３日目に胎児アイソフォームの最小限の増加又は減少を伴って、ＨＮＦ４αの成体アイソフォームの増加をもたらすための最適培養条件は、２３日目での１又は２μＭのＲＡの連続的な処理、又は２４時間若しくは４８時間曝露を含み、初代ヒト肝細胞（ｈｐｈｅｐ）の発現プロファイルに最も近い発現プロファイルに相当する。変わらない発現プロファイルを有する細胞を作製することを望む当業者は、その代わりに、ＲＡへの５時間曝露を選択する。

実施例４ＣＹＰ活性に対する９−シス−レチノイン酸（ＲＡ）でのｈＥＳＣ由来肝前駆細胞と肝細胞様細胞の処理効果
手順
基本的なプロトコールＡに続いて、ゼラチンを利用したコーティング上で培養した、分化期のｈＥＳ細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコール（すなわち、分化及び成熟期の７、８又は９日目；図２Ａ、Ｂ、Ｄ）の２１、２２又は２３日目に５、２４又は４８時間曝露、プロトコール（すなわち、前肝細胞期の４日目と、分化及び成熟期の２、９、１１及び１６日目；図２Ｃ）の１１、１６、２３、２５及び３０日目に繰り返しの５時間曝露、又は、１４日目とそれ以降の長期／連続的な処理（すなわち、分化及び成熟期の開始１日目；図２Ｄ）にて、１μＭの９−シスレチノイン酸で処理された。

ＲＡ処理の終了直後に、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供される。細胞がフェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅで２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２６μＭフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、９μＭジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）及び３μＭミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

結果
Ａ）プロトコールの２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）の５及び２４時間のＲＡ曝露後、ｈＥＳＣ由来肝細胞でのＣＹＰ１Ａ及び３Ａ活性の即時増加が観察される。ＣＹＰ１Ａ活性は４８時間培養した初代肝細胞と同一レベルである一方、ＣＹＰ３Ａ活性は４８時間培養した初代肝細胞のおよそ２５％である。ＨｅｐＧ２は、ｈＥＳＣ由来肝細胞よりもはるかに低いＣＹＰ１Ａ及び３Ａ活性を有する。プロトコールの２３日目に、ＣＹＰ２Ｃ９活性はｈＥＳＣ由来肝細胞で全く検出されなかった。
Ｂ）プロトコールの２３日目（すなわち、分化及び成熟期の９日目）の１回の５時間のＲＡ曝露７日後、まだ、ｈＥＳＣ由来肝細胞は、非処理細胞と比較してＣＹＰ１Ａ、２Ｃ９及び３Ａ活性が増加した。しかし、ＣＹＰ１Ａ及び２Ｃ９活性の増加は５回繰り返した５時間曝露後、より高かった（図２Ｃを参照のこと）。
Ｃ）プロトコールの１１、１６、２３、２５及び３０日目（すなわち、肝細胞前駆細胞段階の４日目及び成熟期段階の２、９、１１及び１６日目）の５回繰り返した５時間ＲＡパルスは、プロトコールの３１日目にＣＹＰ１Ａ、２Ｃ９及び３Ａ活性の顕著な増加をもたらした。しかし、プロトコールの２４日目に、ＣＹＰ３Ａ活性ではなく、ＣＹＰ１Ａ活性の増加を観察することができた（プロトコールの２４日目にＣＹＰ２Ｃ９活性は全く検出できない）。したがって、繰り返しの５時間のＲＡ曝露は、１回の５時間のＲＡ曝露よりもＣＹＰ１Ａ及び２Ｃ９活性でより強い増加効果を有する（図２Ｂと比較せよ）。
Ｄ）５、２４、４８時間の曝露と連続的な処理との比較は、ＣＹＰ３Ａ活性の最も強い増加は５、２４及び４８時間のＲＡ曝露と比較して連続的なＲＡ処理で得られる一方、ＣＹＰ１Ａ活性の最も強い増加は２４時間曝露後に観察されることを示す。

ＣＹＰ２Ｃ９の発現の最も強い増加は、ｄ２４（すなわち、分化及び成熟期の１２日目）に開始する繰り返しの５時間曝露で観察される。したがって、特定のＣＹＰ遺伝子の増加を達成することを望む当業者は、関心のある遺伝子に応じてそれらのパルス条件から選択する。

実施例５９−シス−レチノイン酸（ＲＡ）での処理は、ｈＥＳＣ由来肝細胞様細胞で、より成体の表現型を誘導する。
手順
基本プロトコールＡに続いて、ゼラチンを利用したコーティング上で培養したｈＥＳ細胞由来肝細胞様細胞は、プロトコールの２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）に５時間、又はプロトコールの２２〜２３日目（すなわち、分化及び成熟期の８〜９日目）に２４時間、１μＭの９−シス−レチノイン酸で処理された。
細胞はプロトコールの２１又は２３日目（すなわち、分化及び成熟期の７又は９日目）に採取され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された（図３）。

結果
Ａ）成体肝遺伝子ＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現の増加が、２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）と同様に、２及び７日後（プロトコールの２３及び３０日目それぞれ）の５時間のＲＡ曝露後すぐに観察される。また、プロトコールの２２〜２３日目（すなわち、分化及び成熟期の８〜９日目）の２４時間のＲＡ曝露は、２３日目（すなわち、分化及び成熟期の９日目）の成体ＣＹＰ３Ａ４発現の即時の上向き調節をもたらす。
Ｂ）２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）の５時間曝露は、胎児肝遺伝子ＣＹＰ３Ａ７の発現を２１日目の曝露直後に僅かに減少させ、２日後のプロトコールの２３日目（すなわち、分化及び成熟期の９日目）に強く減少させる。同様に、プロトコールの２２〜２３日目（すなわち、分化及び成熟期の８〜９日目）の２４時間のＲＡ曝露は、プロトコール２３日目（すなわち、分化及び成熟期の９日目）の曝露直後に、胎児肝遺伝子ＣＹＰ３Ａ７の発現を強く減少させる。
Ｃ）２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）の５時間曝露は、２３日目（すなわち、分化及び成熟期の９日目）の成体肝遺伝子ＰＸＲのｍＲＮＡ発現を増加させるが、２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）の５時間曝露直後には増加させない。
また、プロトコールの２２〜２３日目（すなわち、分化及び成熟期の８〜９日目）の２４時間のＲＡ曝露は、成体肝遺伝子ＰＸＲのｍＲＮＡ発現を増加させる。
Ｄ，Ｅ）連続的／長期ＲＡ処理は、２２日目及び２１〜２２日目の５時間及び２４時間曝露それぞれ（分化及び成熟期の８日目及び７〜８日目それぞれ）よりも、成体肝遺伝子ＣＡＲ（Ｄ）のｍＲＮＡ発現のより高い増加と、胎児肝遺伝子α−フェトプロテイン（ＡＦＰ，Ｅ）のより強い下方調節とをもたらす。

このケースでは、（肝前駆細胞期の終了時に）２１日目でのＲＡへの曝露は、成体遺伝子ＣＹＰ３Ａ４、ＣＡＲ及びＰＸＲの発現の増加と、胎児遺伝子ＡＦＰ及びＣＹＰ３Ａ７の減少とをもたらすことが分かり、したがって、より成熟かつ成体の表現型が達成されていることを示している。当業者が上方又は下方調節することを望むこのセット内からの１種の特定の遺伝子又は遺伝子群がある場合には、当業者は、５時間パルス、２４時間パルス又は連続処理を選択することによって本方法をさらに改善することができる。

実施例６ＣＹＰ活性における９−シス−レチノイン酸（ＲＡ）、ケンパウロン（Ｋ）及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイ（薄層ＦＣ−オーバーレイ）でのｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の処理効果
手順
基本プロトコールＢに続いて、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養された、分化期のｈＥＳ細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９−シス−レチノイン酸及び０．５μＭのケンパウロン（Ｋ）での連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイ、ＲＡ及びケンパウロンのこの組合せは、これ以降、「ＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ケンパウロン」と呼ばれる。

薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイは以下のように適用される。０．０２Ｍ酢酸でコラーゲンＩストックを希釈することによって３ｍｇ／ｍＬのラット尾部コラーゲンＩ溶液を調製する。室温に細胞培養培地を事前に温め、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液８μＬ（＝２５μｇのコラーゲンＩ／ｍＬ）及び培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液５０μＬ（＝５０μｇのフィブロネクチン／ｍＬ）を添加する。培養物から古い培地を除去し、１ｃｍ^２の培養表面あたり０．５ｍＬのコラーゲンＩ及びフィブロネクチン含有培地を添加する（＝１２．５μｇコラーゲンＩ／ｃｍ^２及び２５μｇフィブロネクチン／ｃｍ^２）。週に一度、オーバーレイを新しくするため、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液４μＬ（＝６．２５μｇ／ｍＬ）及び培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液１０μＬ（＝５μｇ／ｍＬ）を添加する。

ＣＹＰ酵素の機能発現を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供される。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２６μＭのフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、９μＭのジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）及び３μＭのミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

結果
本発明者らは、ＲＡ単独の使用に加えて、薄層フィブロネクチン−コラーゲン−オーバーレイ、０．５μＭのケンパウロン及び０．２μＭのＲＡ（以下、「ＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ケンパウロン」）での連続的な／長期処理の組合せ（１４日目に開始し、それ以降、すなわち、分化及び成熟期の１日目に開始する）はｈＥＳＣ由来肝細胞（図４Ａ、Ｂ）及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞（図４Ｃ）におけるＣＹＰ活性を再現性良く増加し、したがって、（ヒト初代肝細胞により類似する）成体肝細胞により類似する表現型を誘導することを見出した。

Ａ）（１４日目に開始し、それ以降）０．２μＭのＲＡ及び０．５μＭケンパウロンで処理されたｈＥＳＣ由来幹細胞の連続的な処理と、薄層−コラーゲンＩ−オーバーレイの適用との組合せが、プロトコールの３６日目（すなわち、分化及び成熟期の２２日目）において、増加したＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａ活性の両方を有するのは、たった１つの実験群のみである。しかし、いくつかの単一又は二重処理群は、またＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａ活性の増加を示したが、ＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａの両方の高活性を全く有していなかった。ＣＹＰ１Ａ活性は、オーバーレイ単独で最も高い。ＨｅｐＧ２のみがＣＹＰ１Ａ活性を示し、かつ２Ｃ９又は３Ａ活性を全く示さなかった。
Ｂ，Ｃ）（１４日目に開始し、それ以降）薄層フィブロネクチン−コラーゲンオーバーレイ、０．５μＭケンパウロン及び０．２μＭのＲＡでの連続的な／長期間処理の組合せは、ｈＥＳＣ由来及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞においてＣＹＰ１Ａ、２Ｃ９及び３Ａ活性を再現性良く増加する。

様々なＣＹＰ遺伝子及び成熟肝細胞の表現型と関連する他のマーカーの発現レベルは、以下の実施例においてさらに試験され、この３つの組合せを用いて成熟肝細胞の表現型を改善することを望むものに、より詳細なガイダンスを提供する。

実施例７肝細胞様細胞における肝細胞第Ｉ相及び第ＩＩ相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の発現増加
手順
基本プロトコールＢ（図５）、Ｃ（図６のｈＥＳＣ由来肝細胞）又はＤ（図６のｈｉＰＳＣ由来肝細胞）に続いて、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養した、分化期のｈＥＳ細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩオーバーレイは以下のように適用される。０．０２Ｍ酢酸でコラーゲンＩストックを希釈することによって３ｍｇ／ｍＬのラット尾部コラーゲンＩ溶液を調製する。室温に細胞培養培地を事前に温め、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液８μＬ（＝２５μｇのコラーゲンＩ／ｍＬ）及び培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液５０μＬ（＝５０μｇのフィブロネクチン／ｍＬ）を添加する。培養物から古い培地を除去し、１ｃｍ^２の培養表面あたり０．５ｍＬのコラーゲンＩ及びフィブロネクチン含有培地を添加する（＝１２．５μｇコラーゲンＩ／ｃｍ^２及び２５μｇフィブロネクチン／ｃｍ^２）。週に一度、オーバーレイを新しくするため、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液４μＬ（＝６．２５μｇ／ｍＬ）及び培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液１０μＬ（＝５μｇ／ｍＬ）を添加する。

細胞はプロトコールの２３、３０及び３６／３７日目（すなわち、分化及び成熟期の９、１６及び２２／２３日目）に採取され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された（図５及び６）。

図５及び６は、様々なｈＥＳＣ細胞株（図５）、又は様々な独立の細胞株からのｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ（図６）が肝細胞様細胞を作製するために用いられた様々な実験の結果を要約する。したがって、ＮＴＣＰ、ＧＳＴＡ１−１、ＣＡＲ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６を含む成熟肝細胞に関する多くのマーカーのｍＲＮＡ発現に対してＱＲＴ−ＰＣＲによってアッセイされる前に、レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイの組合せに曝露された。

図５Ａ〜Ｆ）ＲＡ、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイの組合せでの処理時に、（ＳＡ１８１、ＳＡ１６７及びＳＡ４６１；基本プロトコールを用いる）３つの異なるｈＥＳＣ細胞株由来の肝細胞様細胞は、プロトコールの２３、３０及び３７日目（すなわち、分化及び成熟期の９、１６及び２３日目）において、成体肝マーカーのＮＴＣＰ、ＧＳＴＡ１−１、ＣＡＲ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ４の増加したｍＲＮＡ発現の類似の傾向を示した。

図６Ａ〜Ｇ）ＲＡ、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイの組合せでの処理時に、（基本プロトコールＣ及びＤそれぞれを用いる）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の両方の肝細胞様細胞は、プロトコールの２９及び３６日目（すなわち、分化及び成熟期の１５及び２２日目）において、成体肝マーカーのＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＡＲ、ＧＳＴＡ１−１、ＮＴＣＰ及びＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡ発現の類似の増加を示した。

ケンパウロン、マトリクスオーバーレイ及びＲＡの組合せは、ＲＡ単独での曝露を超える相乗効果を示す（例えば、図３Ａ対図５ＦでのＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ発現、又は、図４ＡのＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａ活性を参照のこと）。この効果は、多くの遺伝子に対してｈＥＳＣ及びｈｉＰＳ由来肝細胞様細胞における遺伝子発現を比較する図６の一対のイメージで示されるように、多くの独立のｈＥＳＣ細胞株及びｈｉＰＳ細胞株にわたって一貫している。

したがって、当業者は、本発明を実施するための出発物質として、多能性幹細胞株の多くの供給源から選択するしてもよい。また、当業者が上向き調節を望むマーカーに応じて、処理（ＲＡ単独曝露、又はＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ＧＳＫ−３阻害剤又はＣＤＫ阻害剤）及び処理の特定の時点を選択することによって１つ以上の遺伝子マーカーを選択的に上向き調節するために、図３、５及び６で得られた結果を当業者は用いてもよい。

実施例８肝細胞様細胞における肝細胞第Ｉ相及び第ＩＩ相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の発現増加：ＤＮＡ脱メチル化剤への事前曝露
手順
基本プロトコールＣ（ｈＥＳＣ由来肝細胞）又はＤ（ｈｉＰＳＣ由来肝細胞）に続いて、前内胚葉期の分化期のｈＥＳ及びｈｉＰＳは、プロトコールの２又は３日目に１０ｎＭのＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで２４時間処理された。

プロトコールの後期に、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養されたｈＰＳ細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９−シス−ＲＡ及び０．５μＭのケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

ｍＲＮＡ発現解析のために（図９）、細胞はプロトコールの２９及び３６日目（すなわち、分化及び成熟期の１５及び２２日目）に採取され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された。

３６日目（すなわち、成熟段階の２２日目、図１０）のＣＹＰ酵素の機能発現を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供される。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２６μＭフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、９μＭジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）及び３μＭミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

図９Ａ〜Ｇ：前内胚葉期における脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジン、及び、分化及び成熟期におけるＲＡ、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイの組合せでの処理時に、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の両方の肝細胞様細胞は、プロトコールの２９及び３６日目（すなわち、分化及び成熟期の１５及び２２日目）において、成体肝マーカーのＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＡＲ、ＧＳＴＡ１−１、ＮＴＣＰ及びＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡ発現の類似の増加を示した。

図１０Ａ，Ｂ：分化及び成熟期のＲＡ、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイの組合せでの処理は、前内胚葉期における脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで処理されたｈＰＳ細胞から誘導されたｈＥＳＣ由来及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞においてＣＹＰ１Ａ、２Ｃ９及び３Ａ活性を再現性良く増加する。

図１１：分化期のｈＰＳ細胞は前内胚葉期にＤＮＡ脱メチル化剤で処理され、その後、得られた肝細胞様細胞はケンパウロン及びＲＡと組み合わせてマトリクスオーバーレイに曝露されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の細胞形態を示す図１１に細胞の対応する形態が示される。肝細胞の形態は、ケンパウロン及びＲＡと組み合わせてＤＮＡ脱メチル化剤、マトリクスオーバーレイでの細胞処理によって得られた肝細胞様細胞のｈＰＳ細胞分化の開始後４２日間までと、４２日間を超えて維持される一方、非処理対照細胞は次々と死に始めるか、脱分化し始めることを画像は示す。

図１２Ａ，Ｂ：ここで、プロトコールの２〜３日目にＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンでの処理あり又はなしで得られたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞と、分化及び成熟期に０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭケンパウロンでの連続的な処理あり又はなしで得られたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞とにおけるＣＹＰ活性の比較が提供される。ＣＹＰ１Ａ及び３Ａ活性に対して、最も高い値が５−アザ−２−デオキシシチジン、マトリクスオーバーレイ、ケンパウロン及びＲＡの４つの因子全てで処理された肝細胞様細胞に対して得られ、ＣＹＰ１Ａ及び３Ａ活性におけるそれらの４因子の相乗効果と、４因子全てでの組合せの処理によって最も成熟な肝細胞表現型の誘導とを示唆する。ＣＹＰ２Ｃ９活性の追加増加は、ＤＮＡ脱メチル化剤での処理の理由から全く観察できなかった。

ここに見られる一般的な傾向は、初めに小さな増加を生じ（ｄ２９）、ｄ３６までに大きな増加を生じる処理で、ｈｉＰＳ及びｈＥＳＣ由来の両方の肝細胞が成熟マーカーの発現増加を示すことである。例えば、後期ＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ケンパウロンと組み合わせたＤＮＡ脱メチル化処理の組合せは、ｈＥＳＣ及びｉＰＳ由来の両方の肝細胞様細胞においてＣＹＰ２Ｂ６の発現をもたらし、この増加がｄ２９よりもｄ３６でより顕著であることを図９は示す。初期のＤＮＡ脱メチル化処理と、後期ＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ケンパウロンとの組合せの相乗効果は、例えば、高い倍率のＮＴＣＰ発現がこの相乗効果の結果であるところのＮＴＣＰの発現（図５Ａ対図９Ｆを参照のこと）に例示される。再び、当業者は、処理した細胞の全般的な肝細胞表現型を改善するか、若しくは１つ以上の選択した遺伝子マーカーを上向き調節するために、図９及び１０に例示した結果を利用してもよい。

実施例９：脱メチル化剤、レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイで処理されるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞における安定なＣＹＰ発現
手順
基本プロトコールＣ（ｈＥＳＣ由来肝細胞）又はＤ（ｈｉＰＳＣ由来肝細胞）に続いて、ＤＥ段階の細胞は、プロトコールの２〜３日目に１０ｎＭのＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで２４時間処理された。プロトコールの後期に、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養したｈＰＳ細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

ｍＲＮＡ発現の解析のために（図９）、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞はプロトコールの２２、２９及び３６日目（すなわち、成熟期の８、１５及び２２日目）に採取され、播種後４及び４８時間のヒト初代肝細胞。遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された。

２２、２９及び３６日目（すなわち、成熟期の８、１５及び２２）のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞、及び、播種後４、２４、４８、７２及び９６時間のヒト初代肝細胞におけるＣＹＰ酵素活性を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供される。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２６μＭフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、９μＭジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）及び３μＭミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

結果
本発明者らは、後期ＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ケンパウロンと組み合わせた初期ＤＮＡ脱メチル化処理の長期間の効果をさらに調べるために、肝細胞表現型及び肝細胞マーカーの発現が培養で長期間維持されるかどうかを決定する。

図１６Ａ，Ｂ：初期内胚葉発生期におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期におけるレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたＨＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞は、典型的に直ちにＣＹＰ活性及びｍＲＮＡ発現を培養で消失するヒト初代肝細胞と比較して、ＣＹＰ１Ａ、２Ｃ９及び３Ａ活性の驚くほどに安定なレベル又は増加レベルを示し（図１６Ａ〜２）、同様に、多くのＣＹＰの安定なｍＲＮＡ発現又は増加ｍＲＮＡ発現を示す（図１６Ｂ）。ＨｅｐＧ２は多くの成体肝細胞遺伝子の発現が非常に低いか、又は全くない。したがって、当業者は本処理技術を用いてもよく、肝細胞表現型の長期維持が可能であることを確信し、さらに当業者は、もし当業者がたった１つ又はそれ以上の特定のマーカーの長期間発現を望むのであれば、本実施例及び以前の実施例を利用した処理プログラムを調整してもよい。

実施例１０：ＤＮＡ脱メチル化剤で処理されるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＤＥにおける改善された胚体内胚葉表現型の検証
手順
（ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞両方の）基本プロトコールＣに続いて、細胞は、前内胚葉期において、異なる時点で、異なる期間、例えば、プロトコールの２〜３、２〜４、３〜４及び４〜６日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理された（hESC-DE: 5azadCなし；n=4、5azadC d2〜3；n=4、d3〜4；n=1、d2〜4；n=1、d4〜6；n=1 ; hiPSC-DE:5azadCなし；n=5、5azadC d2〜3；n=5、d3〜4；n=2、d2〜4；n=1、d4〜6 n=1 ; nは個別実験の数である）。

ｍＲＮＡ発現の解析のために、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＤＥ細胞はプロトコールの７日目に採取され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された。

結果
図１３Ａ
２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理されたｈＥＳＣ由来ＤＥ（図１３Ａ２）は、非処理対照ＤＥ（図１３Ａ１）と比較して、より均一であり、より顕著な細胞同士の接触を有する。対照ＤＥ（図１３Ｄとの比較）でのＯｃｔ４及びＮａｎｏｇのｍＲＮＡの発現のより高発現と一致している対照ＤＥ（図１３Ａ１）において未分化細胞の存在に留意せよ。２〜４、３〜４及び４〜６日目に１００ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで細胞を処理するとき、同様の結果が得られた。１ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンは効果が少なかった（データは示されない）。

図１３Ｂ
２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理されたｈｉＰＳＣ由来ＤＥ（図１３Ｂ２）は、対照ＤＥ（図１３Ａ１）よりも、より密集し、より顕著な細胞同士の接触を有する（図１３Ｂ１）。２〜４、３〜４及び４〜６日目に１００ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで細胞を処理するとき、同様の結果が得られた。１ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンは効果が少なかった（データは示されない）。

図１３Ｃ
２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理されたｈｉＰＳＣ由来ＤＥは、非処理対照と比較して、７日目にＯｃｔ４免疫陽性細胞が非常に少なく、すなわち、より少ない未分化細胞が残され、ＤＥは、脱メチル化剤での処理後により均一である。

図１３Ｄ
幹細胞マーカーＯｃｔ４の発現は、非処理対照でよりも、２〜３、３〜４、２〜４及び４〜６日目に１０ｎＭの５ａｚａｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来のＤＥでは非常に低い（図１３Ｄ１）。５ａｚａｄＣで処理されたｈＥＳＣ由来ＤＥでは、幹細胞マーカーＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現は強く低下した一方、ｈｉＰＳＣ由来ＤＥでは、ほとんど影響がないままである（図１３Ｄ１）。ＤＥマーカーＳｏｘ１７、Ｃｘｃｒ４、ＦｏｘＡ２及びｈＨｅｘの発現は、非処理対照と比較して５ａｚａｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＤＥで上向き調節されるが、その効果は、ｈｉＰＳＣ由来ＤＥよりもｈＥＳＣ由来ＤＥでより強い（図１３Ｄ３〜６）。胚体外マーカーＳｏｘ７の発現は、Ｓｏｘ７のｍＲＮＡレベルが増加する２〜４及び４〜６日目の５ａｚａｄＣ処理を除いて、対照と、５ａｚａｄＣで処理されたｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＤＥとの両方で非常に低かった。

まとめると、前内胚葉期におけるＤＮＡ脱メチル化剤での細胞処理は、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来細胞の両方で、改善されたＤＥ形態及びＤＥ細胞産物をもたらす（図１３Ａ〜Ｂ）。さらに、免疫細胞化学によって同定されるように、幹細胞マーカーＯｃｔ４のより強い減少をもたらし（図１３Ｃ）、よく明確にされているＤＥマーカーＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＨＥＸ、Ｆｏｘａ２の改善された発現をもたらし、同様に、胚体外内胚葉マーカーＳｏｘ７と、幹細胞マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇとの減少ももたらした（図１３Ｄ）。したがって、胚体内胚葉細胞のより均一な集団を作製することを望む当業者は、１種以上のＤＮＡ脱メチル化剤から選択することができ、例えば、多能性幹細胞タイプの分化期の２〜３又は３〜４日目でそれらを用いることができる。

実施例１１ＤＥ分化期におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理で２７種のｈＰＳＣ細胞株のパネルから誘導される非常に均一な胚体内胚葉
手順
基本プロトコールＣ又はＤに続いて、２７種のｈＰＳＣ細胞株から誘導された細胞は、前内胚葉期の２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジンで処理された（プロトコールＣ：ChiPSC14、ChiPSC19、ChiPSC22、P11015、SA167、SA181、SA461及びVal9;プロトコールＤ:ChiPSC4、ChiPSC6b、ChiPSC7、ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10、ChiPSC11、ChiPSC13、ChiPSC15、ChiPSC17、ChiPSC18、ChiPSC19、ChiPSC20、ChiPSC21、ChiPSC23、ChiPSC24、P11012、P11021、P11025及びSA121)。

２７種のｈＰＳＣ細胞株のうち２３種が、プロトコールＣ及びＤの両方で試験された。これら２３種の細胞株のうち、４種の細胞株（ChiPSC14、ChiPSC23、P11015及びP11032）のみが、２つのプロトコールのうち１つで分化のみすることができた。４種のｈＰＳＣ細胞株（ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10及びChiPSC11）のみが、プロトコールＤで試験された。

ｍＲＮＡ発現解析のために、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＤＥ細胞はプロトコールの７日目に採取され、遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された。

結果
図１４Ａ〜Ｄ
前内胚葉期の２〜３日目でのＤＮＡ脱メチル化処理を含む基本プロトコールＣ又はＤを用いて、２７種の異なるｈＰＳＣ細胞株由来の未分化細胞株は非常に均一なＤＥに分化させることができ、未分化ｈＥＳＣ（ＳＡ１８１）及びｈｉＰＳＣ（ＣｈｉＰＳＣ４）と比較して、幹細胞マーカーＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの低いｍＲＮＡ発現レベル（図１４Ａ、Ｂ）と、ＤＥマーカーＳｏｘ１７及びＣｘｃｒ４の高いレベル（図１４Ｃ、Ｄ）とを示す。

まとめると、ＤＮＡ脱メチル化剤での前内胚葉期における細胞処理は、試験した全てのｈＰＳＣ細胞株から、幹細胞マーカーの低発現レベルとＤＥマーカーの高発現レベルとを伴って均一なＤＥの誘導が可能である。均一なＤＥの誘導は、試験した全ての細胞株から得ることができる均一な肝細胞培養物の誘導に不可欠である（データは示されない）。

したがって、いかなる特定のｈＰＳＣ細胞株から、胚体内胚葉細胞（及び肝細胞）の均一な集団を作製することを望む当業者は、例えば前内胚葉期の２〜３日目におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理を含めることができる。

実施例１２ＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジン及び５−アザシチジンの両方は、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来ＤＥでの胚体内胚葉表現型を改善する。
手順
基本プロトコールＣ（Ｐ１１０３２、ＳＡ１８１）又はＤ（Ｐ１１０１２）に続いて、３種の異なるｈＰＳＣ細胞株から誘導した細胞は、前内胚葉期の２〜３日目に１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジン及び１μＭの５−アザシチジンのいずれかで処理された。

結果
図１５
Ａ，Ｂ）脱メチル化剤での処理なしで、３種のｈＰＳＣ細胞株、Ｐ１１０３２、ＳＡ１８１及びＰ１１０１２は、幹細胞マーカーＯｃｔ４及びＮａｎｏｇの相対的に高いｍＲＮＡ発現をともなう不均一なＤＥを産生した。ＤＮＡ脱メチル化剤である５−アザ−２−デオキシシチジン（５ａｚａｄＣ）及び５−アザシチジン（５ａｚａＣ）での処理は、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇのｍＲＮＡを顕著に減少させ（図１５Ａ、Ｂ）、したがって３種のｈＰＳＣ細胞株から均一なＤＥ集団の誘導を可能にした。
Ｃ，Ｄ）ＤＥマーカーＳｏｘ１７及びＣｘｃｒ４のｍＲＮＡ発現の顕著な変化は、１０ｎＭの５−アザ−２−デオキシシチジン又は１μＭの５−アザシチジンでの処理において全く観察することができなかった（図１５Ｃ、Ｄ）。

まとめると、ＤＮＡ脱メチル化剤である５−アザ−２−デオキシシチジン（５ａｚａｄＣ）及び５−アザシチジン（５ａｚａＣ）の両方での処理は、ｈＰＳＣ細胞株から均一なＤＥの誘導を可能にし、非処理の場合には、他の不均一なＤＥを提供する。

したがって、胚体内胚葉細胞の均一な集団を作製することを望む当業者は、１種以上のＤＮＡ脱メチル化剤から選択することができ、例えば、多能性幹細胞タイプの分化期の２〜３日目にそれらを用いることができる。

実施例１３脱メチル化剤、レチノイン酸応答性受容体活性化剤２種、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイで処理したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の機能のさらなる改善
手順
基本プロトコールＤ（ｈｉＰＳＣ由来肝細胞）に続いて、前内胚葉期の分化中のｈＰＳ細胞は、プロトコールの２又は３日目に１０ｎＭのＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで２４時間処理された。プロトコールの後期に、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養したｈＰＳ細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭのケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後に週に一度、新しくされる。１つのグループは、記載した処理に加えて、プロトコールの２１日目（すなわち、分化及び成熟期の７日目）に開始する０．２μＭの１３シス−ＲＡが添加された。

ｍＲＮＡ発現解析のために、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞はプロトコールの３６日目（すなわち、分化及び成熟期の２２日目）に採取され、播種後４８時間のヒト初代肝細胞。遺伝子発現がｑＲＴ−ＰＣＲを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子ＣＲＥＢＢＰにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された。

３６日目（すなわち、分化及び成熟期の２２日目）のｈｉＰＳＣ由来肝細胞、ＨｅｐＧ２及び播種後４８時間のヒト初代肝細胞に対してＣＹＰ酵素活性を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供される。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μＭフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、１０μＭのブプロピオン（ＣＹＰ２Ｂ６のモデル基質）、１０μＭのジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）、１０μＭのブフラロール（ＣＹＰ２Ｄ６のモデル基質）及び５μＭのミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｂ６によるＯＨ−ブプロピオン、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク、ＣＹＰ２Ｄ６によるＯＨ−ブフラロール及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

結果
本発明者らは、さらに肝細胞の成熟を改善するかどうかを決定するために、初期ＤＮＡ脱メチル化処理に加えてレチノイン酸応答性受容体の追加の活性化剤での処理と、後期ＲＡ＋マトリクスオーバーレイ＋ケンパウロン処理とを伴う処理の効果をさらに調べた。

図１７Ａ〜Ｅ
初期内胚葉発生期間におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期における９シスＲＡ、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞は、１３シスＲＡでの処理においてＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ活性のさらなる増加を示した。

図１８Ａ〜Ｅ
初期内胚葉発生期間におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期におけるレチノイン酸応答性受容体の追加の活性化剤１３シスＲＡとともに９シスＲＡ、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたｈｉＰＳＣ由来肝細胞様細胞は、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５及びＰＸＲの最も高いｍＲＮＡ発現レベルを示した。

ＣＹＰ２Ｂ６活性の増加（図１７Ｂ）と反対に、ＣＹＰ２Ｂ６のｍＲＮＡ発現の減少が１３シスＲＡ処理グループにおいて見ることができる（図１８Ａ）。

したがって、当業者は、最も成熟な特徴を有する肝細胞様細胞を得るために、１種より多くのレチノイン酸応答性受容体活性化剤、例えば、２種、３種、４種又はそれ以上の活性化剤で処理してもよい。

実施例１４脱メチル化剤、レチノイン酸、ケンパウロン及びより複雑なマトリクスオーバーレイで処理したｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞の機能のさらなる改善
手順
基本プロトコールＣ（ｈＥＳＣ由来肝細胞）及びＤ（ｈｉＰＳＣ由来肝細胞）に続いて、前内胚葉期の細胞は、プロトコールの２〜３日目に１０ｎＭのＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで２４時間処理された。プロトコールの後期に、ｈＰＳ細胞由来の肝前駆細胞及びｈＰＳ細胞由来の肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭのケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

１つの実験群は、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、ニドジェン／エンタクチン及びビグリカンからなる肝マトリクス様コーティング上で増殖され、フィブロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、ニドジェン／エンタクチン及びビグリカンからなる肝マトリクス様オーバーレイで培養された。

別の実験群は、フィブロネクチン、コラーゲンＩ及び（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エラスチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンを含む）ヒト細胞外マトリクス調製物からなるフィブロネクチン−コラーゲンＩ−基底板（basal lamina）混合コーティング上で培養され、フィブロネクチン、コラーゲンＩ及び（コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシン、エラスチン、プロテオグリカン及びグリコサミノグリカンを含む）ヒト細胞外マトリクス調製物からなる薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−基底板混合オーバーレイで培養された。

対照群は、標準的なフィブロネクチンを利用したコーティング上で増殖され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

薄層肝マトリクス様オーバーレイに対して、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液８μＬ（＝２５μｇのコラーゲンＩ／ｍＬ）、培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液５０μＬ（＝５０μｇのフィブロネクチン／ｍＬ）、培地１ｍＬあたり０．５ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶ溶液１．２μＬ（＝０．６μｇ／ｍＬ）、培地１ｍＬあたり１００μｇ／ｍＬのニドジェン／エンタクチン溶液６μＬ（＝０．６μｇ／ｍＬ）、培地１ｍＬあたり１００μｇ／ｍＬのラミニン１溶液６μＬ（＝０．６μｇ／ｍＬ）、及び、培地１ｍＬあたり２００μｇ／ｍＬのビグリカン溶液６μＬ（＝０．６μｇ／ｍＬ）を添加する。薄層フィブロネクチン−コラーゲン−基底板−オーバーレイに対して、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液８μＬ（＝２５μｇのコラーゲンＩ／ｍＬ）、培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液５０μＬ（＝５０μｇのフィブロネクチン／ｍＬ）、及び、培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのヒト細胞外マトリクス溶液６μＬ（＝６μｇ／ｍＬ）を添加する。安定なヒト細胞外マトリクス調製物の例は、Sigma-AldrichからのＭａｘＧｅｌ（商標）である。

３６日目（すなわち、分化及び成熟段階の２２日目）のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞、ＨｅｐＧ２及び播種後４８時間のヒト初代肝細胞に対してＣＹＰ酵素活性を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供される。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μＭのフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、１０μΜのブプロピオン（ＣＹＰ２Ｂ６のモデル基質）、１０μＭのジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）、１０μΜのブフラロール（ＣＹＰ２Ｄ６のモデル基質）及び５μＭのミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｂ６によるＯＨ−ブプロピオン、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク、ＣＹＰ２Ｄ６によるＯＨ−ブフラロール及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

結果
本発明者らは、標準的なフィブロネクチンを利用したコーティング及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイと比較して、さらに肝細胞の成熟を改善するかどうかを決定するために、初期ＤＮＡ脱メチル化処理、並びに後期レチノイン酸及びケンパウロン処理に加えて、より複雑なＥＣＭ様コーティング及びオーバーレイでの処理の効果をさらに調べた。

図１９Ａ〜Ｃ
コーティング及びオーバーレイの両方が、対照群の標準的なフィブロネクチンを利用したコーティング及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイと比較して、より複雑で、かつＥＣＭ様であったとき、初期内胚葉発生期におけるＤＮＡ脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期におけるレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたＨＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞は、より高いＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ３Ａ活性を示した。

したがって、当業者は、最も成熟した特徴を有する肝細胞様細胞を得るために、肝マトリクスに似ているより複雑なコーティング及びオーバーレイでの処理を実施してもよい。

実施例１５脱メチル化剤、ケンパウロンと、９−シス−レチノイン酸又は９−シス−レチノイン酸類似体とで処理されるｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞での機能の改善
手順
基本プロトコールＤに続いて、前内胚葉期の細胞は、該プロトコールの２〜３日目に１０ｎＭのＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで２４時間処理された。

プロトコールの後期に、ｈＰＳ細胞由来の肝前駆細胞及びｈＰＳ細胞由来の肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭのケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

いくつかの実験群は、０．２μＭの９シスＲＡの代わりに、０．５μＭの全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、５μＭのＭ５８０、０．２μＭの１３シスＲＡ、５μＭのＬＧＤ１０６９、５μＭのＬＧ１００２６８又は５μＭのＳＲ１１２３７で処理された。

薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイは以下のように適用される。０．０２Ｍの酢酸でコラーゲンＩストックを希釈することによって３ｍｇ／ｍＬのラット尾部コラーゲンＩ溶液を調製する。室温に細胞培養培地を事前に温め、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液８μＬ（＝２５μｇのコラーゲンＩ／ｍＬ）及び培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液５０μＬ（＝５０μｇのフィブロネクチン／ｍＬ）を添加する。培養物から古い培地を除去し、１ｃｍ^２の培養表面あたり０．５ｍＬのコラーゲンＩ及びフィブロネクチン含有培地を添加する（＝１２．５μｇコラーゲンＩ／ｃｍ^２及び２５μｇフィブロネクチン／ｃｍ^２）。週に一度、オーバーレイを新しくするため、培地１ｍＬあたり３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩ溶液４μＬ（＝６．２５μｇ／ｍＬ）及び培地１ｍＬあたり１ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液１０μＬ（＝５μｇ／ｍＬ）を添加する。

３６日目（すなわち、分化及び成熟段階の２２日目）のｈＥＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ酵素活性を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供された。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μＭのフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、１０μＭのブプロピオン（ＣＹＰ２Ｂ６のモデル基質）、１０μＭジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）、１０μＭのブフラロール（ＣＹＰ２Ｄ６のモデル基質）及び５μＭのミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｂ６によるＯＨ−ブプロピオン、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク、ＣＹＰ２Ｄ６によるＯＨ−ブフラロール及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

結果
本発明者は、９シスＲＡ以外に他のＲＸＲ及びＲＡＲアゴニストが、ｈｉＰＳＣ由来肝細胞の改善された機能を誘導することができるかどうかを調査した。

図２０
１３シスＲＡでの処理は、９シスＲＡでの処理と類似のレベルにＣＹＰ２Ｃ９活性を増加させる一方、ＳＲ１１２３７、ＡＴＲＡ、ＡＭ５８０、ＬＧＤ１０６９及びＬＧ１００２６８での処理は、ほんの少しの増加をもたらす（図２０）。

したがって、当業者は、より成熟した肝細胞様細胞を得るために、９シスＲＡ以外に他のＲＸＲ及びＲＡＲアゴニスト、例えば、１３シスＲＡ、ＡＴＲＡ、ＡＭ５８０、ＬＧＤ１０６９、ＬＧ１００２６８及びＳＲ１１２３７を用いてもよい。

実施例１６脱メチル化剤、９シスレチノインと、ケンパウロン又はケンパウロン類似体とで処理されるｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来の肝細胞様細胞での機能の改善
手順
基本プロトコールＣ（ｈＥＳＣ由来肝細胞）及びＤ（ｈｉＰＳＣ由来肝細胞）に続いて、前内胚葉期の細胞は、プロトコールの２〜３日目に１０ｎＭのＤＮＡ脱メチル化剤５−アザ−２−デオキシシチジンで２４時間処理された。プロトコールの後期に、ｈＰＳ細胞由来の肝前駆細胞及びｈＰＳ細胞由来の肝細胞様細胞は、プロトコールの１４日目（すなわち、分化及び成熟期の１日目）に開始する０．２μＭの９シス−ＲＡ及び０．５μＭのケンパウロンでの連続的な／長期処理で処理され、プロトコールの１４及び１６日目（すなわち、分化及び成熟期の１及び３日目）に薄層フィブロネクチン−コラーゲンＩ−オーバーレイで培養され、２３、３０、３７日目など（すなわち、分化及び成熟期の９、１６、２３日目など）、その後、週に一度、新しくされる。

１つの実験群は、０．５μＭのケンパウロンの代わりに、０．５μＭのインジルビン−３−オキシムで処理された。

３６日目（すなわち、分化及び成熟段階の２２日目）のｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ由来肝細胞のＣＹＰ酵素活性を解析するために、細胞培養物が以下のプロトコールに従ってＣＹＰ活性アッセイに供された。細胞は、フェノールレッドのない温かいウィリアム培地Ｅ（＋０．１％ＰＥＳＴ）で２回洗浄される。その後、フェノールレッド（＋０．１％ＰＥＳＴ）なしの温かいウィリアム培地Ｅ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μＭのフェナセチン（ＣＹＰ１Ａのモデル基質）、１０μＭのブプロピオン（ＣＹＰ２Ｂ６のモデル基質）、１０μＭのジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９のモデル基質）、１０μＭのブフラロール（ＣＹＰ２Ｄ６のモデル基質）及び５μＭのミダゾラム（ＣＹＰ３Ａのモデル基質）からなるＣＹＰ活性分析試料が細胞に添加され（例えば、２２０μＬ／２４ウェル）、３７℃で１６時間培養される。その後、上清が収集され、４℃で10.000 rcfで２０分間遠心分離される。その後、１２０μＬの上清が９６ウェルプレートに移され、密封テープで密封され、代謝物生成（ＣＹＰ１Ａによるアセトアミノフェン（パラセタモール）、ＣＹＰ２Ｂ６によるＯＨ−ブプロピオン、ＣＹＰ２Ｃ９によるＯＨ−ジクロフェナク、ＣＹＰ２Ｄ６によるＯＨ−ブフラロール、及びＣＹＰ３ＡによるＯＨ−ミダゾラム）のＬＣ／ＭＳ分析まで−２０又は−８０℃で保存される。

本発明者らは、ケンパウロン以外に他のＣＤＫ及びＧＳＫ３阻害剤がｈｉＰＳＣ由来肝細胞の改善された機能を誘導することができるかどうかを調べた。

図２１
インジルビン−３−オキシムでの処理は、ｈｉＰＳＣ由来肝細胞（図２１Ａ１、Ａ２）及びｈＥＳＣ由来肝細胞（図２１Ｂ１、Ｂ２）の両方で、ケンパウロンでの処理と類似のレベルにＣＹＰ２Ｃ９及び３Ａ活性を増加する（図２１Ｂ１、Ｂ２）。

したがって、当業者は、より成熟した肝細胞様細胞を得るために、ケンパウロン以外に他のＣＤＫ及びＧＳＫ３阻害剤を用いてもよい。

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Claims

インビトロで誘導されるヒト肝細胞様細胞の成熟を促進するための方法であって、
前記ヒト肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することを含み、前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤が、９−シス―レチノイン酸、１３−シスーレチノイン酸、ＳＲ１１２３７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、方法。
前記肝細胞様細胞を得るための分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養することをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
ヒト肝細胞様細胞をインビトロで産生するための方法であって、
肝細胞様細胞を得るための分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養すること、及び、
前記肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露することを含み、前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤が９−シス―レチノイン酸、１３−シスーレチノイン酸、ＳＲ１１２３７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、方法。
前記ヒト肝前駆細胞が、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳ）から誘導されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
前記肝前駆細胞を取得するための分化条件下でヒト多能性幹（ｈＰＳ）細胞を最初に培養することをさらに含むことを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
ｈＰＳ細胞の最初の培養は、胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）を得るための分化条件下でｈＰＳ細胞を培養して得られる細胞を、前記肝前駆細胞を得るための分化条件下でさらに培養することを含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
前記ｈＰＳ細胞が、胚体内胚葉細胞（ＤＥ細胞）へ分化中にＤＮＡ脱メチル化剤に曝露されることを特徴とする、請求項４又は５に記載の方法。
前記ヒト多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）であることを特徴とする、請求項４ないし７のいずれか１項に記載の方法。
レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露と同時に、ＧＳＫ阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイに前記肝細胞様細胞を曝露することをさらに含むことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露と同時に、Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤及び／又はマトリクスオーバーレイに前記肝細胞様細胞を曝露することをさらに含むことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
レチノイン酸応答性受容体活性化剤への曝露と同時に、ＣＤＫ阻害剤及び／又はマトリクスオーバーレイに前記肝細胞様細胞を曝露することをさらに含むことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤が、９−シス−レチノイン酸であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤が、１３−シス−レチノイン酸であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤が、ＳＲ１１２３７であることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞が、９−シス−レチノイン酸及び１３−シス−レチノイン酸の組合せに曝露されることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＧＳＫ−３阻害剤が、ＧＳＫ−３アルファ阻害剤又はＧＳＫ−３ベータ阻害剤であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記ＧＳＫ３阻害剤が、ケンパウロン、１−アザ−ケンパウロン、アルスターパウロン、アミノピリミジンＣＨＩＲ９９０２１及びインジルビン−３'−オキシムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記ＧＳＫ３阻害剤が、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）に対して阻害活性をさらに示すことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記ＧＳＫ３阻害剤が、ケンパウロンであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
前記Ｗｎｔシグナル伝達活性化剤が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ／１３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ９Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１及びＷｎｔ１６から選択されるＷｎｔタンパク質であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ３Ａであることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
前記ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ２の阻害剤であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
前記マトリクスオーバーレイが、フィブロネクチン−コラーゲンＩ−マトリクスオーバーレイであることを特徴とする、請求項９ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＤＮＡ脱メチル化剤が、５−アザ−２−デオキシシチジン（デシタビン）、５−アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プロカイン、ＲＧ１０８、Ｓ−５−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、コーヒー酸、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、塩酸ヒドララジン、塩酸プロカインアミド及びサマプリンＡからなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
インビトロで誘導される肝細胞様細胞を成熟させるためのレチノイン酸応答性受容体活性化剤の使用であって、前記レチノイン酸応答性受容体活性化剤が９−シス―レチノイン酸、１３−シスーレチノイン酸、ＳＲ１１２３７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、使用。