JP6780216B2 - ヒト多能性幹細胞由来肝細胞様細胞の成熟 - Google Patents
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Description
[発明の詳細な説明]
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記ヒト肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。
肝細胞様細胞を得るための分化条件下でヒト肝前駆細胞を培養するステップ、及び
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記ヒト肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。
肝細胞様細胞を得るために、分化条件下でのヒト肝前駆細胞を培養するステップ、及び
レチノイン酸応答性受容体活性化剤に前記肝細胞様細胞を曝露するステップ
を含むものとして記載される場合がある。
前記ヒト肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露するステップであって、該ステップは、任意にCDK阻害剤、GSK3阻害剤又はWntシグナル伝達活性化剤との組み合わせに対して曝露し、さらに必要に応じて哺乳動物の細胞外マトリクスの1種以上の成分いずれかでの細胞のオーバーレイ(マトリクスオーバーレイ)への曝露との組み合わせで曝露するステップ、
を含むものとして説明される場合がある。
肝細胞様細胞を得るために、分化条件下でのヒト肝前駆細胞を培養するステップ、及び
前記肝細胞様細胞をレチノイン酸応答性受容体活性化剤に曝露するステップであって、任意に、CDK阻害剤、GSK3阻害剤又はWntシグナル伝達活性化剤への曝露と組み合わせて、さらに必要に応じて、哺乳動物細胞外マトリクスの特徴を有する1種以上の成分を有する細胞のオーバーレイ(マトリクスオーバーレイ)への曝露との組み合わせで曝露するステップ、
を含むものとして説明される場合がある。
各ECM成分はまた、約0.5〜約20μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約15μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約10μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約7.5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約2.5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約1.5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約0.5〜約1μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約1〜約20μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約1〜約15μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約1〜約12.5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約1〜約10μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約1〜約5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約1〜約2.5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約2〜約20μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約2〜約15μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約2〜約12.5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約2〜約10μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約2〜約5μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約5〜約25μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各ECM成分はまた、約5〜約20μgECM成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各タンパク質成分はまた、約5〜約15μgタンパク質成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各タンパク質成分はまた、約5〜約10μgタンパク質成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。各タンパク質成分はまた、約5〜約7.5μgタンパク質成分/cm2の濃度でマトリクスオーバーレイに存在する場合がある。
本明細書で用いられるところの、「多能性の」又は「多能性」とは、三胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)のすべてのタイプの特殊化した細胞を形成する能力をいい、子孫を生じることが可能な完全な胚を形成する能力である「全能性の」又は「全能性」とは区別されるべきである。
(図2)レチノイン酸処理の様々な長さで曝露したhESC由来肝細胞の多くのCYP酵素の機能発現
(図3)レチノイン酸処理の様々な長さで曝露したhESC由来肝細胞のCYP酵素、核内受容体CAR及びPXR並びにα−フェトプロテインの遺伝子発現
(図4)ケンパウロンとマトリクスオーバーレイとを組み合わせてレチノイン酸に曝露したhESC及びhiPS由来肝細胞のCYP酵素の機能発現
(図5)レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイに曝露された(基本プロトコールBで誘導した)hESC由来肝細胞様細胞の第1相酵素、第2相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の遺伝子発現
(図6)レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイに曝露された(基本プロトコールC及びDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞様細胞の第1相酵素、第2相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の遺伝子発現
(図7)マトリクスオーバーレイ(プロトコールB)で処理された(基本プロトコールBで誘導した)hESC由来肝細胞の形態と寿命
(図8)レチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイに曝露された(基本プロトコールC及びDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞の形態と寿命
(図9)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での(基本プロトコールCとDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞様細胞の第1相酵素、第2相酵素、薬物輸送体及び核内受容体の遺伝子発現
(図10)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での(基本プロトコールCとDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞様細胞のCYP酵素の機能発現
(図11)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での(基本プロトコールCとDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞様細胞の形態と寿命
(図12)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理あり及びなし、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露あり及びなしでの(基本プロトコールCとDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞様細胞におけるCYP酵素の機能発現の比較
(図13)前内胚葉期間(プロトコールの第0〜7日目)に、5−アザ−デオキシシチジン処理あり及びなしでの(基本プロトコールCとDで誘導した)hESC及びhiPSC由来胚体内胚葉細胞の特徴付け
(図14)前内胚葉期間(プロトコールの第0〜7日目)に、5−アザ−デオキシシチジン処理した(それぞれ基本プロトコールCとDで誘導した)27種類の異なるhESC及びhiPSC細胞株由来の胚体内胚葉細胞の特徴付け
(図15)前内胚葉期間(プロトコールの第0〜7日目)に、5−アザ−デオキシシチジン又は5−アザシチジン処理あり又はなしでの(それぞれ基本プロトコールCとDで誘導した)3種類のhESC及びhiPSC細胞株由来の胚体内胚葉細胞との特徴付け
(図16)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での、凍結保存したヒト初代肝細胞と、(基本プロトコールCとDで誘導した)hESC及びhiPSC由来肝細胞様細胞とにおけるCYP酵素発現の比較
(図17)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びに1種以上のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での(基本プロトコールCとDで誘導した)hiPSC由来肝細胞様細胞におけるCYP酵素の機能発現
(図18)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びに1種以上のレチノイン酸応答性受容体活性化剤、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの後期曝露での(基本プロトコールCとDで誘導した)hiPSC由来肝細胞様細胞におけるCYP酵素及び核内受容体PXRの遺伝子発現
(図19)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにレチノイン酸、ケンパウロン及び1種以上の複合体のマトリクスオーバーレイへの後期曝露された(基本プロトコールCとDで誘導した)hiPSC由来肝細胞様細胞におけるCYP酵素の機能発現
(図20)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びにケンパウロン、9シス−レチノイン酸又は9シス−レチノイン酸の類似体への後期曝露された(基本プロトコールDで誘導した)hiPSC由来肝細胞様細胞におけるCYP2C9酵素の機能発現
(図21)5−アザ−デオキシシチジンでの初期処理、並びに9シス−レチノイン酸、ケンパウロン又はケンパウロンの類似体への後期曝露された(基本プロトコールC及びDで誘導した)hiPSC及びhESC由来肝細胞様細胞におけるCYP2C9及び3A酵素の機能発現
(上記で定義したような)全てのhPS細胞は、本発明の出発材料として用いられる。以下の実施例に対して、特に、肝細胞様細胞は、mEFフィーダー細胞(Heinsら、2004年)で確立され、フィーダーなしの条件下で維持された未分化ヒト胚性幹細胞(hESC)からin vitroで誘導された。本実験に用いた細胞株は、hES細胞株SA167、SA181、SA461(セラーティスAB、イェーテボリ、スウェーデン)の場合があるが、これらに限定されず、細胞株は、Heinsら、2004年によって記載されるように増殖される。これらの細胞株は、NIHの幹細胞バンク、英国細胞バンク及び欧州hESCバンクに列挙され、要求により利用可能である。
肝細胞様細胞は、以下の例示的な基本プロトコールA、B、C及びDを使用することによってhPS細胞から誘導される場合がある。
未分化hPS細胞は分離され、新たに調製した0日目の培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、0、1、2、3、4、5、7日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に2日又は3日毎に添加された。
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 100ng/mL
NaB 1mM
ROCK阻害剤 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 100ng/mL
NaB 1mM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 100ng/mL
NaB 0.5mM
VitroHES
1%DMSO
WME +SQ(−GA1000)+1%グルタマックス+0.1%PEST
DexM 0.1μΜ
OsM 10ng/mL
HGF 20ng/mL
0.5%DMSO
(2’Z,3’£)−6−ブロモインジルビン−3’−オキシム(BIO) 1.4μM
未分化hPS細胞は分離され、新たに調製した0日目培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、0、1、2、3、4、5、7日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に2日又は3日毎に添加された。
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 100ng/mL
NaB 1mM
ROCK阻害剤 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 100ng/mL
NaB 1mM
CHIR99021 3μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 100ng/mL
NaB 0.5mM
未分化hPS細胞は分離され、新たに調製した0日目培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、第0、1、2、3、4、5、7日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に2日又は3日毎に添加された。前処理培地はセレクティスAB(Arvid Wallgrens Backe 20、41346イェーテボリ、スウェーデン)から入手可能である。
前処理培地
CHIR99021 3μM
ROCK阻害剤 5μM
前処理培地
CHIR99021 3μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 50ng/mL
CHIR99021 3μM
LY294002 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 50ng/mL
LY294002 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 50ng/mL
未分化hPS細胞は分離され、新たに調製した0日目培地に直接播種される。異なる培地が新たに調製され、0、1、2、3、4、5、7日目及びその後、前肝細胞期、並びに分化及び成熟期に2日又は3日毎に添加された。前処理培地はセレクティスAB(Arvid Wallgrens Backe 20、41346イェーテボリ、スウェーデン)から入手可能である。
前処理培地
CHIR99021 3μM
ROCK阻害剤 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 50ng/mL
CHIR99021 3μM
LY294002 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 50ng/mL
LY294002 5μM
RPMI 1640(+0.1%PEST、+1%グルタマックス)
B27(1×)
アクチビンA 50ng/mL
手順
基本プロトコールAに続いて、ゼラチンを利用したコーティング上で培養されたhES細胞由来の肝細胞様細胞は、そのプロトコールの23日目(すなわち分化及び成熟の9日目)に1又は2μMの9−シス−レチノイン酸で5、24若しくは48時間、又は14日目(すなわち分化及び成熟期の開始1日目)からの長期間及びそれ以降で処理され、曝露後すぐに(図1A、B、C)又は7日後(図C)に解析された。3つの異なるHNF4α−TaqManアッセイは、HNF4αの発現解析のために使用され、1つは、全部で9つのHNF4αアイソフォームを同定するアッセイであり、1つは、(成体のアイソフォーム1及び2を含む)アイソフォーム1〜3を同定するアッセイであり、1つは、(胎児のアイソフォーム7及び8を含む)アイソフォーム4〜9を同定するアッセイである。アイソフォーム3、4、5、6及び9は、in vivoで全く発現していないか、非常に低レベルであり、したがって完全に無視することができる。
A)5時間のRA曝露は、成体HNF4α1〜3のアイソフォームの発現を強く増加するだけでなく、胎児HNF4α4〜9のアイソフォームの発現も強く増加する。24、48時間曝露及び連続的なRA処理は、成体HNF4α1〜3のアイソフォームを僅かに増加し、胎児HNF4α4〜9のアイソフォームを僅かに低下し、hp hepにさらに似る1〜3アイソフォーム/4〜9アイソフォームの割合となる(図1Bを参照のこと)。
B)ヒト初代肝細胞(hp hep)は、胎児4〜9アイソフォームに対して成体HNF4αアイソフォーム1〜3の割合が高い一方、HepG2は割合が低い。24時間及び48時間のRA曝露と、長期間/連続的な処理とは、hp hepの場合と類似のレベルまでhESC由来肝細胞の1〜3/4〜9割合を増加する。また、4〜9アイソフォームの発現が増加するため、5時間の曝露は1〜3/4〜9割合を増加しない(図1Aを参照のこと)。hp hepは新たに単離したhp hepの7バッチ分の平均である。HepG2は2バッチ分の平均である。
C)1μMのRAでの5時間曝露は、曝露直後にHNF4αアイソフォーム1〜3の発現を増加するが(またAを参照のこと)、7日後、アイソフォーム1〜3の発現は、非処理対照細胞よりもRA処理細胞では僅かに低い。アイソフォーム4〜9の発現が、曝露直後の対照よりもRA処理細胞では僅かに低い。7日後、胎児アイソフォームの発現が対照値を超えて惹起される。
手順
基本的なプロトコールAに続いて、ゼラチンを利用したコーティング上で培養した、分化期のhES細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコール(すなわち、分化及び成熟期の7、8又は9日目;図2A、B、D)の21、22又は23日目に5、24又は48時間曝露、プロトコール(すなわち、前肝細胞期の4日目と、分化及び成熟期の2、9、11及び16日目;図2C)の11、16、23、25及び30日目に繰り返しの5時間曝露、又は、14日目とそれ以降の長期/連続的な処理(すなわち、分化及び成熟期の開始1日目;図2D)にて、1μMの9−シスレチノイン酸で処理された。
A)プロトコールの21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)の5及び24時間のRA曝露後、hESC由来肝細胞でのCYP1A及び3A活性の即時増加が観察される。CYP1A活性は48時間培養した初代肝細胞と同一レベルである一方、CYP3A活性は48時間培養した初代肝細胞のおよそ25%である。HepG2は、hESC由来肝細胞よりもはるかに低いCYP1A及び3A活性を有する。プロトコールの23日目に、CYP2C9活性はhESC由来肝細胞で全く検出されなかった。
B)プロトコールの23日目(すなわち、分化及び成熟期の9日目)の1回の5時間のRA曝露7日後、まだ、hESC由来肝細胞は、非処理細胞と比較してCYP1A、2C9及び3A活性が増加した。しかし、CYP1A及び2C9活性の増加は5回繰り返した5時間曝露後、より高かった(図2Cを参照のこと)。
C)プロトコールの11、16、23、25及び30日目(すなわち、肝細胞前駆細胞段階の4日目及び成熟期段階の2、9、11及び16日目)の5回繰り返した5時間RAパルスは、プロトコールの31日目にCYP1A、2C9及び3A活性の顕著な増加をもたらした。しかし、プロトコールの24日目に、CYP3A活性ではなく、CYP1A活性の増加を観察することができた(プロトコールの24日目にCYP2C9活性は全く検出できない)。したがって、繰り返しの5時間のRA曝露は、1回の5時間のRA曝露よりもCYP1A及び2C9活性でより強い増加効果を有する(図2Bと比較せよ)。
D)5、24、48時間の曝露と連続的な処理との比較は、CYP3A活性の最も強い増加は5、24及び48時間のRA曝露と比較して連続的なRA処理で得られる一方、CYP1A活性の最も強い増加は24時間曝露後に観察されることを示す。
手順
基本プロトコールAに続いて、ゼラチンを利用したコーティング上で培養したhES細胞由来肝細胞様細胞は、プロトコールの21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)に5時間、又はプロトコールの22〜23日目(すなわち、分化及び成熟期の8〜9日目)に24時間、1μMの9−シス−レチノイン酸で処理された。
細胞はプロトコールの21又は23日目(すなわち、分化及び成熟期の7又は9日目)に採取され、遺伝子発現がqRT−PCRを用いて解析され、ハウスキーピング遺伝子CREBBPにて正規化され、そしてその結果が較正物質にて正規化された相対定量として提示された(図3)。
A)成体肝遺伝子CYP3A4のmRNA発現の増加が、21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)と同様に、2及び7日後(プロトコールの23及び30日目それぞれ)の5時間のRA曝露後すぐに観察される。また、プロトコールの22〜23日目(すなわち、分化及び成熟期の8〜9日目)の24時間のRA曝露は、23日目(すなわち、分化及び成熟期の9日目)の成体CYP3A4発現の即時の上向き調節をもたらす。
B)21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)の5時間曝露は、胎児肝遺伝子CYP3A7の発現を21日目の曝露直後に僅かに減少させ、2日後のプロトコールの23日目(すなわち、分化及び成熟期の9日目)に強く減少させる。同様に、プロトコールの22〜23日目(すなわち、分化及び成熟期の8〜9日目)の24時間のRA曝露は、プロトコール23日目(すなわち、分化及び成熟期の9日目)の曝露直後に、胎児肝遺伝子CYP3A7の発現を強く減少させる。
C)21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)の5時間曝露は、23日目(すなわち、分化及び成熟期の9日目)の成体肝遺伝子PXRのmRNA発現を増加させるが、21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)の5時間曝露直後には増加させない。
また、プロトコールの22〜23日目(すなわち、分化及び成熟期の8〜9日目)の24時間のRA曝露は、成体肝遺伝子PXRのmRNA発現を増加させる。
D,E)連続的/長期RA処理は、22日目及び21〜22日目の5時間及び24時間曝露それぞれ(分化及び成熟期の8日目及び7〜8日目それぞれ)よりも、成体肝遺伝子CAR(D)のmRNA発現のより高い増加と、胎児肝遺伝子α−フェトプロテイン(AFP,E)のより強い下方調節とをもたらす。
手順
基本プロトコールBに続いて、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養された、分化期のhES細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの14日目(すなわち、分化及び成熟期の1日目)に開始する0.2μMの9−シス−レチノイン酸及び0.5μMのケンパウロン(K)での連続的な/長期処理で処理され、プロトコールの14及び16日目(すなわち、分化及び成熟期の1及び3日目)に薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイで培養され、23、30、37日目など(すなわち、分化及び成熟期の9、16、23日目など)、その後、週に一度、新しくされる。薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイ、RA及びケンパウロンのこの組合せは、これ以降、「RA+マトリクスオーバーレイ+ケンパウロン」と呼ばれる。
本発明者らは、RA単独の使用に加えて、薄層フィブロネクチン−コラーゲン−オーバーレイ、0.5μMのケンパウロン及び0.2μMのRA(以下、「RA+マトリクスオーバーレイ+ケンパウロン」)での連続的な/長期処理の組合せ(14日目に開始し、それ以降、すなわち、分化及び成熟期の1日目に開始する)はhESC由来肝細胞(図4A、B)及びhiPSC由来肝細胞(図4C)におけるCYP活性を再現性良く増加し、したがって、(ヒト初代肝細胞により類似する)成体肝細胞により類似する表現型を誘導することを見出した。
B,C)(14日目に開始し、それ以降)薄層フィブロネクチン−コラーゲンオーバーレイ、0.5μMケンパウロン及び0.2μMのRAでの連続的な/長期間処理の組合せは、hESC由来及びhiPSC由来肝細胞においてCYP1A、2C9及び3A活性を再現性良く増加する。
手順
基本プロトコールB(図5)、C(図6のhESC由来肝細胞)又はD(図6のhiPSC由来肝細胞)に続いて、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養した、分化期のhES細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの14日目(すなわち、分化及び成熟期の1日目)に開始する0.2μMの9シス−RA及び0.5μMケンパウロンでの連続的な/長期処理で処理され、プロトコールの14及び16日目(すなわち、分化及び成熟期の1及び3日目)に薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイで培養され、23、30、37日目など(すなわち、分化及び成熟期の9、16、23日目など)、その後、週に一度、新しくされる。
手順
基本プロトコールC(hESC由来肝細胞)又はD(hiPSC由来肝細胞)に続いて、前内胚葉期の分化期のhES及びhiPSは、プロトコールの2又は3日目に10nMのDNA脱メチル化剤5−アザ−2−デオキシシチジンで24時間処理された。
手順
基本プロトコールC(hESC由来肝細胞)又はD(hiPSC由来肝細胞)に続いて、DE段階の細胞は、プロトコールの2〜3日目に10nMのDNA脱メチル化剤5−アザ−2−デオキシシチジンで24時間処理された。プロトコールの後期に、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養したhPS細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの14日目(すなわち、分化及び成熟期の1日目)に開始する0.2μMの9シス−RA及び0.5μMケンパウロンでの連続的な/長期処理で処理され、プロトコールの14及び16日目(すなわち、分化及び成熟期の1及び3日目)に薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイで培養され、23、30、37日目など(すなわち、分化及び成熟期の9、16、23日目など)、その後、週に一度、新しくされる。
本発明者らは、後期RA+マトリクスオーバーレイ+ケンパウロンと組み合わせた初期DNA脱メチル化処理の長期間の効果をさらに調べるために、肝細胞表現型及び肝細胞マーカーの発現が培養で長期間維持されるかどうかを決定する。
手順
(hESC及びhiPSC由来肝細胞両方の)基本プロトコールCに続いて、細胞は、前内胚葉期において、異なる時点で、異なる期間、例えば、プロトコールの2〜3、2〜4、3〜4及び4〜6日目に10nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで処理された(hESC-DE: 5azadCなし;n=4、5azadC d2〜3;n=4、d3〜4;n=1、d2〜4;n=1、d4〜6;n=1 ; hiPSC-DE:5azadCなし;n=5、5azadC d2〜3;n=5、d3〜4;n=2、d2〜4;n=1、d4〜6 n=1 ; nは個別実験の数である)。
図13A
2〜3日目に10nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで処理されたhESC由来DE(図13A2)は、非処理対照DE(図13A1)と比較して、より均一であり、より顕著な細胞同士の接触を有する。対照DE(図13Dとの比較)でのOct4及びNanogのmRNAの発現のより高発現と一致している対照DE(図13A1)において未分化細胞の存在に留意せよ。2〜4、3〜4及び4〜6日目に100nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで細胞を処理するとき、同様の結果が得られた。1nMの5−アザ−2−デオキシシチジンは効果が少なかった(データは示されない)。
2〜3日目に10nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで処理されたhiPSC由来DE(図13B2)は、対照DE(図13A1)よりも、より密集し、より顕著な細胞同士の接触を有する(図13B1)。2〜4、3〜4及び4〜6日目に100nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで細胞を処理するとき、同様の結果が得られた。1nMの5−アザ−2−デオキシシチジンは効果が少なかった(データは示されない)。
2〜3日目に10nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで処理されたhiPSC由来DEは、非処理対照と比較して、7日目にOct4免疫陽性細胞が非常に少なく、すなわち、より少ない未分化細胞が残され、DEは、脱メチル化剤での処理後により均一である。
幹細胞マーカーOct4の発現は、非処理対照でよりも、2〜3、3〜4、2〜4及び4〜6日目に10nMの5azadCで処理されたhESC及びhiPSC由来のDEでは非常に低い(図13D1)。5azadCで処理されたhESC由来DEでは、幹細胞マーカーNanogのmRNA発現は強く低下した一方、hiPSC由来DEでは、ほとんど影響がないままである(図13D1)。DEマーカーSox17、Cxcr4、FoxA2及びhHexの発現は、非処理対照と比較して5azadCで処理されたhESC及びhiPSC由来DEで上向き調節されるが、その効果は、hiPSC由来DEよりもhESC由来DEでより強い(図13D3〜6)。胚体外マーカーSox7の発現は、Sox7のmRNAレベルが増加する2〜4及び4〜6日目の5azadC処理を除いて、対照と、5azadCで処理されたhESC及びhiPSC由来DEとの両方で非常に低かった。
手順
基本プロトコールC又はDに続いて、27種のhPSC細胞株から誘導された細胞は、前内胚葉期の2〜3日目に10nMの5−アザ−2−デオキシシチジンで処理された(プロトコールC:ChiPSC14、ChiPSC19、ChiPSC22、P11015、SA167、SA181、SA461及びVal9;プロトコールD:ChiPSC4、ChiPSC6b、ChiPSC7、ChiPSC8、ChiPSC9、ChiPSC10、ChiPSC11、ChiPSC13、ChiPSC15、ChiPSC17、ChiPSC18、ChiPSC19、ChiPSC20、ChiPSC21、ChiPSC23、ChiPSC24、P11012、P11021、P11025及びSA121)。
図14A〜D
前内胚葉期の2〜3日目でのDNA脱メチル化処理を含む基本プロトコールC又はDを用いて、27種の異なるhPSC細胞株由来の未分化細胞株は非常に均一なDEに分化させることができ、未分化hESC(SA181)及びhiPSC(ChiPSC4)と比較して、幹細胞マーカーOct−4及びNanogの低いmRNA発現レベル(図14A、B)と、DEマーカーSox17及びCxcr4の高いレベル(図14C、D)とを示す。
手順
基本プロトコールC(P11032、SA181)又はD(P11012)に続いて、3種の異なるhPSC細胞株から誘導した細胞は、前内胚葉期の2〜3日目に10nMの5−アザ−2−デオキシシチジン及び1μMの5−アザシチジンのいずれかで処理された。
図15
A,B)脱メチル化剤での処理なしで、3種のhPSC細胞株、P11032、SA181及びP11012は、幹細胞マーカーOct4及びNanogの相対的に高いmRNA発現をともなう不均一なDEを産生した。DNA脱メチル化剤である5−アザ−2−デオキシシチジン(5azadC)及び5−アザシチジン(5azaC)での処理は、Oct4及びNanogのmRNAを顕著に減少させ(図15A、B)、したがって3種のhPSC細胞株から均一なDE集団の誘導を可能にした。
C,D)DEマーカーSox17及びCxcr4のmRNA発現の顕著な変化は、10nMの5−アザ−2−デオキシシチジン又は1μMの5−アザシチジンでの処理において全く観察することができなかった(図15C、D)。
手順
基本プロトコールD(hiPSC由来肝細胞)に続いて、前内胚葉期の分化中のhPS細胞は、プロトコールの2又は3日目に10nMのDNA脱メチル化剤5−アザ−2−デオキシシチジンで24時間処理された。プロトコールの後期に、フィブロネクチンを利用したコーティング上で培養したhPS細胞由来の肝前駆細胞及び肝細胞様細胞は、プロトコールの14日目(すなわち、分化及び成熟期の1日目)に開始する0.2μMの9シス−RA及び0.5μMのケンパウロンでの連続的な/長期処理で処理され、プロトコールの14及び16日目(すなわち、分化及び成熟期の1及び3日目)に薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイで培養され、23、30、37日目など(すなわち、分化及び成熟期の9、16、23日目など)、その後に週に一度、新しくされる。1つのグループは、記載した処理に加えて、プロトコールの21日目(すなわち、分化及び成熟期の7日目)に開始する0.2μMの13シス−RAが添加された。
本発明者らは、さらに肝細胞の成熟を改善するかどうかを決定するために、初期DNA脱メチル化処理に加えてレチノイン酸応答性受容体の追加の活性化剤での処理と、後期RA+マトリクスオーバーレイ+ケンパウロン処理とを伴う処理の効果をさらに調べた。
初期内胚葉発生期間におけるDNA脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期における9シスRA、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたhiPSC由来肝細胞様細胞は、13シスRAでの処理においてCYP1A、CYP2B6、CYP2C9、CYP2D6及びCYP3A活性のさらなる増加を示した。
初期内胚葉発生期間におけるDNA脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期におけるレチノイン酸応答性受容体の追加の活性化剤13シスRAとともに9シスRA、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたhiPSC由来肝細胞様細胞は、CYP2C9、CYP3A4、CYP3A5及びPXRの最も高いmRNA発現レベルを示した。
手順
基本プロトコールC(hESC由来肝細胞)及びD(hiPSC由来肝細胞)に続いて、前内胚葉期の細胞は、プロトコールの2〜3日目に10nMのDNA脱メチル化剤5−アザ−2−デオキシシチジンで24時間処理された。プロトコールの後期に、hPS細胞由来の肝前駆細胞及びhPS細胞由来の肝細胞様細胞は、プロトコールの14日目(すなわち、分化及び成熟期の1日目)に開始する0.2μMの9シス−RA及び0.5μMのケンパウロンでの連続的な/長期処理で処理され、プロトコールの14及び16日目(すなわち、分化及び成熟期の1及び3日目)に薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイで培養され、23、30、37日目など(すなわち、分化及び成熟期の9、16、23日目など)、その後、週に一度、新しくされる。
本発明者らは、標準的なフィブロネクチンを利用したコーティング及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイと比較して、さらに肝細胞の成熟を改善するかどうかを決定するために、初期DNA脱メチル化処理、並びに後期レチノイン酸及びケンパウロン処理に加えて、より複雑なECM様コーティング及びオーバーレイでの処理の効果をさらに調べた。
コーティング及びオーバーレイの両方が、対照群の標準的なフィブロネクチンを利用したコーティング及び薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイと比較して、より複雑で、かつECM様であったとき、初期内胚葉発生期におけるDNA脱メチル化剤での処理と、分化及び成熟期におけるレチノイン酸、ケンパウロン及びマトリクスオーバーレイへの曝露とによって得られたHESC及びhiPSC由来肝細胞は、より高いCYP2C9及びCYP3A活性を示した。
手順
基本プロトコールDに続いて、前内胚葉期の細胞は、該プロトコールの2〜3日目に10nMのDNA脱メチル化剤5−アザ−2−デオキシシチジンで24時間処理された。
本発明者は、9シスRA以外に他のRXR及びRARアゴニストが、hiPSC由来肝細胞の改善された機能を誘導することができるかどうかを調査した。
13シスRAでの処理は、9シスRA の処理と類似のレベルにCYP2C9活性を増加させる一方、SR11237、ATRA、AM580、LGD1069及びLG100268での処理は、わずかにより小さい増加をもたらす(図20)。
手順
基本プロトコールC(hESC由来肝細胞)及びD(hiPSC由来肝細胞)に続いて、前内胚葉期の細胞は、プロトコールの2〜3日目に10nMのDNA脱メチル化剤5−アザ−2−デオキシシチジンで24時間処理された。プロトコールの後期に、hPS細胞由来の肝前駆細胞及びhPS細胞由来の肝細胞様細胞は、プロトコールの14日目(すなわち、分化及び成熟期の1日目)に開始する0.2μMの9シス−RA及び0.5μMのケンパウロンでの連続的な/長期処理で処理され、プロトコールの14及び16日目(すなわち、分化及び成熟期の1及び3日目)に薄層フィブロネクチン−コラーゲンI−オーバーレイで培養され、23、30、37日目など(すなわち、分化及び成熟期の9、16、23日目など)、その後、週に一度、新しくされる。
インジルビン−3−オキシムでの処理は、hiPSC由来肝細胞(図21A1、A2)及びhESC由来肝細胞(図21B1、B2)の両方で、ケンパウロンでの処理と類似のレベルにCYP2C9及び3A活性を増加する(図21B1、B2)。
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Claims (18)
- 9−シス−レチノイン酸、13−シス−レチノイン酸及びSR11237からなる群から選択される少なくとも1つのレチノイン酸応答性受容体活性化剤、並びに、ケンパウロン、1−アザ-ケンパウロン、アルスターパウロン及びインジルビン−3'−オキシムからなる群から選択される少なくとも1つのGSK3阻害剤を含むことを特徴とする、組成物。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸、13−シス−レチノイン酸、又は、それらの組み合わせであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸であることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記GSK3阻害剤が、ケンパウロン、1−アザ−ケンパウロン、及びアルスターパウロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記GSK3阻害剤がケンパウロンであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が、9−シス−レチノイン酸、13−シス−レチノイン酸又はそれらの組み合わせであり、並びに、GSK3阻害剤が、ケンパウロン、1−アザ−ケンパウロン、及びアルスターパウロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸であり、並びに、GSK3阻害剤がケンパウロンであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 9−シス−レチノイン酸、13−シス−レチノイン酸及びSR11237からなる群から選択されるレチノイン酸応答性受容体の少なくとも1つの活性化剤、並びに、ケンパウロン、1−アザ-ケンパウロン、アルスターパウロン及びインジルビン−3'−オキシムからなる群から選択される少なくとも1つのGSK3阻害剤を含むことを特徴とする、キット。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸、13−シス−レチノイン酸、又は、それらの組み合わせであることを特徴とする、請求項8に記載のキット。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸であることを特徴とする、請求項8に記載のキット。
- 前記GSK3阻害剤が、ケンパウロン、1−アザ−ケンパウロン、及びアルスターパウロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項8〜10のいずれか一項に記載のキット。
- 前記GSK3阻害剤がケンパウロンであることを特徴とする、請求項8〜11のいずれか一項に記載のキット。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸、13−シス−レチノイン酸又はそれらの組み合わせであり、並びに、GSK3阻害剤が、ケンパウロン、1−アザ−ケンパウロン、及びアルスターパウロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項8に記載のキット。
- レチノイン酸応答性受容体活性化剤が9−シス−レチノイン酸であり、及び、GSK3阻害剤がケンパウロンであることを特徴とする、請求項8に記載のキット。
- 少なくとも1つの細胞外マトリックス(ECM)成分又はECM成分の混合物を含むことを特徴とする、請求項8〜14のいずれか一項に記載のキット。
- 少なくとも1つのECM成分が、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパリンプロテオグリカン、グリピカン、シンデカン又はペルレカンから選択されるヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ニドジェン/エンタクチン、ラミニン、ビグリカン、テネイシン、及びヒアルロナンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- 前記ECM成分の混合物がコラーゲン及びフィブロネクチンを含むことを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- ヒト肝細胞様細胞のin vitroでの成熟のための、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項8〜17のいずれか一項に記載のキットの使用。
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