JP2022532411A - ヒト多能性幹細胞から眼野前駆細胞を得るための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法に関し、その眼野前駆細胞は、例えば、網膜色素上皮細胞および／または神経網膜細胞へのさらなる分化に適している。プロトコルは、対象となる細胞の収率が高い単純な方法を提供し、ＧＭＰ準拠への変換を促進する。

Description

本発明は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）から眼野前駆細胞（ｅｙｅ ｆｉｅｌｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を効率的に得るための方法に関し、該眼野前駆細胞は、眼の状態の治療のための分化した細胞をさらに提供するのに有用である。本発明はまた、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団、および眼の状態の治療におけるそれらの使用に関する。このプロトコルは、単純かつ効率的な方法を提供すると同時に、ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ）準拠への変換も促進する。

配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

世界保健機関によると、世界中で３億１，４００万人の人々が視力障害を有し、そのうち２億６，９００万人が低視力を有し、４，５００万人が失明していると推定される（Ｒｅｓｎｉｋｏｆｆ Ｓ．，２００８）。これらの眼科学的障害の一部は、白内障、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、緑内障、角膜失明、および網膜色素変性（ＲＰ）である。

ＡＭＤは、網膜の黄斑部に影響を及ぼし、進行性の中心視力の低下を引き起こす疾患である。ＡＭＤの正確な病因は完全には解明されていないかもしれないが、網膜色素上皮の萎縮が起こり、その後に神経網膜細胞などの必須の網膜構造の変性が続き、それによって重度の視力障害を引き起こすことは、十分に確立されているように思われる。現在、利用可能な治療法は限られており、それらの治療法のうち、失われた網膜細胞を再生し、視力を修復するものはない。

例えば、置換療法のための健康な網膜色素上皮および神経網膜細胞の細胞移植は、例えば、網膜変性を遅延または抑制し、変性網膜を再生し、網膜機能を強化することによって失明を予防し、さらに不完全な視力を回復するためのＡＭＤの治療の実行可能な方法であると考えられる。

幹細胞は、そのような細胞移植のための有用な細胞療法を提供する有望な候補である。多能性幹細胞の可塑性は、ＡＭＤおよびＲＰが挙げられるがこれらに限定されない、異なるタイプの網膜症に適用するために、ヒトの眼の発達および再生を研究するための新たな可能性を提供する。しかしながら、置換療法のための網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および神経網膜（ＮＲ）細胞などの細胞を得ることは、依然として課題のままである。ここ数年にわたって、ｈＰＳＣの分化のための多くのプロトコルが開発されており、これらは、完全な眼杯形態形成を反復するか、または特定の網膜細胞サブタイプの生成の最大化を目的とする。ＲＰＥ細胞を含む異なる細胞サブタイプ、ならびに光受容体（ＰＲ）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）などの特定のＮＲ細胞サブタイプに対するプロトコルについて述べられてきた。後期眼前駆細胞に向かう発達は一般的であり、分化における中間細胞型は、眼杯前駆細胞と称され得る。利用可能なプロトコルのほとんどは、長い分化期間を必要とし、これは部分的には、眼杯前駆細胞に到達することになる。より広範な前駆細胞は、本明細書において初期眼野前駆細胞と称され、これは、ＰＲおよびＲＧＣなどのＮＲ細胞、ＲＰＥ細胞、水晶体細胞、ならびに角膜輪部幹細胞などの角膜細胞が挙げられるがこれらに限定されない、異なるタイプの眼細胞を生成する能力を有する細胞を含む。多くの場合、分化プロトコルはまた、成長因子などの複数の構成要素に依存しており、これは高価であり、かつ／またはＧＭＰに準拠させることが困難である場合がある。さらに、プロトコルの多くは、限られた細胞仕様および再現性に悩まされる。

本発明の目的は、これらの課題のいくつかを克服すること、特に、様々な後期のより成熟した眼前駆細胞へとさらに分化する能力を伴い、二次元設定で初期眼野前駆細胞を得るためのより短く、より効率的で、かつ堅牢なプロトコルを提供することである。本発明の別の目的は、ＧＭＰ準拠への変換を促進し得る単純なプロトコルを提供することである。

前述の目的は、本発明の態様によって達成される。さらに、本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかになるさらなる問題も解決し得る。

本発明の態様は、ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための改善された方法に関し、方法は、ｈＰＳＣを培養するステップと、ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞を、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路の阻害剤と接触させるステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップとを含み、分化細胞は、眼野前駆細胞に分化することが可能になる。

この改善された方法は、後期眼前駆細胞へのさらなる分化に適した多数の細胞を促進する。したがって、本発明の別の態様は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、高い割合の眼野前駆細胞が、本発明の方法に従って得ることが可能なＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２およびＭＩＴＦからなる群のうちの少なくとも１つを共発現する。

本発明者らは、幹細胞における骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路を活性化することが、様々なより成熟した眼前駆細胞へとさらに分化する可能性を伴い、分化細胞を初期眼野前駆細胞へと効果的に成熟させることを示している。特に、本発明者らは、ＢＭＰ５でＢＭＰシグナル伝達経路を活性化することが、細胞を分化するのに非常に有効であることを発見した。眼野前駆細胞がより成熟した細胞へとさらに分化され得る、こうした眼野前駆細胞の例としては、ＲＰＥ、ＰＲおよびＲＧＣなどのＮＲ細胞、水晶体細胞、ならびに角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）などの角膜細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一態様では、眼野前駆細胞は、ＲＰＥ前駆細胞である。したがって、本発明の態様はまた、ｈＰＳＣからＲＰＥ前駆細胞を得るための改善された方法に関し、方法は、ｈＰＳＣを培養するステップと、ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、分化細胞をＧＳＫ３の阻害剤と接触させるステップとを含み、分化細胞は、ＲＰＥ前駆細胞に分化することが可能になる。

本発明の一態様では、眼野前駆細胞は、神経網膜（ＮＲ）前駆細胞である。したがって、本発明の態様はまた、ｈＰＳＣからＮＲ前駆細胞を得るための改善された方法に関し、方法は、ｈＰＳＣを培養するステップと、ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップとを含み、分化細胞は、ＲＰＥ前駆細胞に分化することが可能になる。

発明者らはさらに、本発明によるプロトコルが、二次元設定において短期間で初期眼野前駆細胞を得るための堅牢かつ効率的な方法を提供することを示している。プロトコルは、高収率の対象となる細胞を提供し、方法は、ＧＭＰ準拠への変換を促進する。

図１は、１２時間後のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の初期付着に対する異なるラミニンの効果を示す。明視野写真は、ＬＮ－５２１上で成長し維持されたｈＥＳＣが、ＬＮ－１１１とは対照的に、ＬＮ－３３２への優れた付着をどのように示すかを示す。ＬＮ－３３２ラミニンは、単一細胞播種後のｈＥＳＣ付着に対するプラスの効果を示す。ＬＮ－３３２は、さらなる分化に使用され得る。 図２Ａおよび２Ｂは、ＶＳＸ２およびＭＩＴＦ陽性細胞へのｈＥＳＣの分化に対する、ヒトＢＭＰ５およびアクチビンＡの効果を示す。ＢＭＰ５またはアクチビンＡを含まず、ＭＩＴＦまたはＶＳＸ２のレベルが低い条件１および２を示す免疫蛍光。対照的に、１２日目からのＢＭＰ５の添加（条件３および４）は、ＭＩＴＦおよびＶＳＸ２に対して陽性の細胞数を増加させる。ＢＭＰ５と組み合わせた、１５日目からのアクチビンＡの添加は、明確なさらなる効果を有しない。対照的に、１２日目からのアクチビンＡの単独の使用、または１５日目からのＢＭＰ５との組み合わせ（条件５および６）は、ＭＩＴＦおよびＶＳＸ２に対して陽性のより少ない数の細胞を生成する。要約すると、ＢＭＰ５のみが、ＭＩＴＦ／ＶＳＸ２陽性細胞を生成する強力なプラスの効果を示す。ＩＨＨ（インディアンヘッジホッグ）およびＤＫＫ２（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤２）の組み合わせは、ＭＩＴＦ／ＶＳＸ２陽性細胞の生成に役立ち得る。 図２Ａ参照。 図３は、ＢＭＰ５が二重ＰＡＸ６／ＯＴＸ２陽性細胞の生成を誘導することを示す。小分子ＧＷ７８８３８８、ＮＯＧＧＩＮ、およびＥｎｄｏ ＩＷＲ１を用いた１２日間の初期治療、続くＢＭＰ５、ＩＨＨ、およびＤＫＫ２を用いた治療は、免疫蛍光によってアドレス指定される多数のＰＡＸ６／ＯＴＸ２二重陽性細胞を生成する。ＤＡＰＩは、すべての細胞の核染色に使用される。 図４は、ＢＭＰ５、およびＧＳＫ３阻害剤とのＢＭＰ５の組み合わせを示す。ＢＭＰ５の使用は、免疫蛍光によってアドレス指定されるＭＩＴＦおよびＶＳＸ２陽性細胞の生成（２段目）を誘導し、神経網膜前駆細胞の生成を示す。対照的に、ＧＳＫ３阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１の添加（下段）は、ＶＳＸ２の発現を劇的に遮断し、ＭＩＴＦの発現および敷石状形態を有するＭＩＴＦ陽性細胞の生成を強化する。これは、ＲＰＥ前駆細胞を示す。１段目、ＢＭＰ５なしの対照。ＤＡＰＩは、すべての細胞の核染色に使用される。 図５は、ＲＮＡ発現分析を示す。グラフは、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）からのサイクル閾値（ＣＴ）の値を示す。ＢＭＰ５を有する分化した細胞は、２１日目に採取され、ＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに変換され、ＲＮＡ発現分析が実施される。ｈＥＳＣは、比較として使用され、ＣＴ値は、ｍＲＮＡレベルに反比例する。ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、およびＶＳＸ２の発現は、ｈＥＳＣと比較してＢＭＰ５分化した細胞で上方制御される。 図６は、ＢＭＰ５分化した細胞とＢＭＰ５／ＣＨＩＲ９９０２１との間の細胞核の比較を示す。ＢＭＰ５／ＣＨＩＲ９９０２１処置細胞の異なる核組織化に注目し、上皮形態、およびＲＰＥ前駆細胞を示す典型的な敷石状形態を示す。ＤＡＰＩは、すべての細胞の核染色に使用される。 図７は、ＢＭＰ５／ＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせが、多数のＭＩＴＦ陽性細胞を生成することを示す。この図は、ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１の両方が組み合わせて使用される場合の、多数のＭＩＴＦ陽性細胞および高純度（８０％超、免疫蛍光）を示す。左側には、ＲＰＥ前駆細胞を示す敷石状形態を有するＭＩＴＦ陽性細胞の高純度および均質性が示される。 図８は、ＮＯＧＧＩＮと組み合わせてＳＭＡＤ阻害剤ＲｅｐＳＯＸを使用し、その後にＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１を用いて処置して、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルが、ＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞を生成することを示す。これは、ＯＴＸ２およびＰＡＸ６陽性細胞の免疫蛍光とともに、ＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＭＩＴＦの遺伝子発現の増加によって示される。 図９は、フローサイトメトリーによる、ＧＷ７８８３８８、ＣＨＩＲ９９０２１、およびＢＭＰ５で誘導されたｈＥＳＣ由来ＲＰＥ前駆細胞のタンパク質発現の分析を示す。細胞の４０％超が、マーカーＰＡＸ６／ＭＩＴＦの共発現を示す。 図１０は、フローサイトメトリーによる、ＧＷ７８８３８８およびＢＭＰ５で誘導されたｈＥＳＣ由来神経網膜前駆細胞のタンパク質発現の分析を示す。細胞の５０％超が、マーカーＰＡＸ６／ＶＳＸ２の共発現を示す。 図１１は、単一細胞ＲＮＡシークエンシングによって分析された、示されたマーカー遺伝子を発現するＲＰＥ前駆細胞同一性を有するｈＥＳＣ由来眼野前駆細胞の割合（表）を示す。この表には、ＲＰＥおよび眼杯を示す遺伝子の導入が見られるが、細胞は、他の胚葉（内胚葉および中胚葉）のマーカーを発現しない。各ベン図は、ＲＰＥ前駆細胞、ＰＡＸ６／ＭＩＴＦ／ＰＭＥＬおよびＰＡＸ６／ＰＭＥＬ／ＳＥＲＰＩＮＦ１遺伝子に特徴的な遺伝子を共発現する細胞の発現パターンを示す。 図１２は、角膜およびＬＳＣのマーカーを発現する細胞数を有するベン図を示す。ＴＰ６３／ＴＦＡＰ２Ｂ／Ｓ１００Ａ１４の三重陽性細胞の割合は、０．８％である。 図１３は、１２～２１日目のＣＨＩＲ９９０２１とともに、分化の７～２１日目のＢＭＰ５処置の異なる濃度（０、０．１、２００、および１０００ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。ＲＰＥ前駆細胞関連遺伝子のＲＮＡ発現を定量化した。２００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ５処置が、ＲＰＥ前駆遺伝子の発現を促進することに留意されたい。 図１４は、７～２１日目のＢＭＰ５処置の異なる濃度（０、０．１、２００、および１０００ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。神経網膜前駆遺伝子のＲＮＡ発現を定量化した。２００ｎｇ／ｍｌおよび１０００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ５処置は、神経網膜前駆細胞遺伝子の発現を促進する。 図１５は、ＲＰＥ前駆細胞遺伝子発現上の異なるＢＭＰアイソフォームの比較を示す。ＢＭＰ５の効果は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ４／７ヘテロ二量体の効果と比較される。ＢＭＰ５は、棒グラフに示されるＲＰＥ前駆遺伝子を誘導することが他のＢＭＰよりも優れている。

別段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者に既知の従来の化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の方法を用いる。

すべての見出しおよび小見出しが、本明細書では便宜上使用されているだけであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。

本明細書に提供されるありとあらゆる例および例示的な用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより良く理解するよう意図されており、特許請求の範囲に別途記載されない限り、本発明の範囲に制限を課さない。本明細書中のいずれの語句も、特許の範囲にない任意の要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。

本出願全体を通して、細胞を分化するためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。

本発明の細胞、化合物、または薬剤の量、用量、温度などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された量の５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動を包含するよう意図される。

本明細書で使用される場合、プロトコルに関する「日」という用語は、ある特定のステップを実施するための特定の時間を指す。概して、かつ別段の記載がない限り、「０日目」は、プロトコルの開始を指し、これは例えば、幹細胞をプレーティングすること、または幹細胞をインキュベーターに移すこと、または幹細胞の移植前に、現在の細胞培養培地中の幹細胞を化合物と接触させることよるが、これらに限定されない。典型的には、プロトコルの開始は、未分化幹細胞を異なる細胞培養培地および／または容器に移すことにより、例えば、限定されないが、播種もしくはインキュベートすること、および／または未分化幹細胞を、分化プロセスが開始されるような方法で未分化幹細胞に影響を及ぼす化合物と最初に接触させることによる。

１日目、２日目などの「Ｘ日目」に言及する場合、これは、０日目のプロトコル開始に関連するものである。当業者は、別段の指定がない限り、ステップを実施するための正確な時刻が変動し得ることを認識するであろう。したがって、「Ｘ日目」は、±１０時間、±８時間、±６時間、±４時間、±２時間、または±１時間などの時間範囲を包含するよう意図される。

本明細書で使用される場合、「約Ｘ日目～約Ｙ日目」という語句は、事象が開始する日を指す。この語句は、その事象が開始し得る日の間隔を提供する。例えば、「細胞が約３日目～約５日目に分化因子と接触する」場合、これは、すべての選択肢：「細胞が約３日目から分化因子と接触する」、「細胞が約４日目から分化因子と接触する」、および「細胞が約５日目から分化因子と接触する」を包含するものとして解釈される。したがって、この語句は、３日目～５日目の間にのみ起こる事象として解釈されるべきではない。これは、「約Ｘ日目～約Ｙ日目」という語句に準用する。

以下、本発明による方法は、非限定的な実施形態および実施例によってより詳細に記載される。眼野前駆細胞を得るための方法が提供され、得られた細胞は、成熟ＲＰＥ細胞、ＮＲ細胞、水晶体細胞、および角膜細胞などの細胞へのさらなる分化において、ｈＰＳＣからの中間体とみなされ、これはまた、白内障、ＡＭＤ、角膜失明、緑内障、およびＲＰなどの眼の状態の治療の提供に有用であると考えられている。

本発明によると、方法は、幹細胞の使用において相殺する。

幹細胞
「幹細胞」は、分化能および増殖能（特に自己再生能力）を有するが、分化能を維持する未分化細胞として理解されるべきである。幹細胞は、分化能に従って、全能性幹細胞、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、単能性幹細胞などの亜集団を含む。幹細胞は、発生能によって次に分類される：（１）全能性（すべての胚および胚体外細胞型を生じさせることができることを意味する）、（２）多能性（すべての胚細胞型を生じさせることができることを意味する）、（３）多分化能性（細胞系統のサブセットを生じさせることができるが、すべて特定の組織、臓器、または生理系内であることを意味する（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血液細胞制限少能性前駆細胞、ならびに血液の正常な構成成分であるすべての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる））、（４）少能性（多分化能性幹細胞よりも細胞系統のより制限されたサブセットを生じさせることができることを意味する）、ならびに（５）単能性（単一細胞系統を生じさせることができることを意味する（例えば、精子形成幹細胞））。多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織中の幹細胞、体細胞などから誘導され得る。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞（胚性生殖細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。文献中、「胚盤胞由来幹細胞」は、胚性幹細胞、より具体的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と称されることが多い。したがって、本発明で使用される多能性幹細胞は、例えば、ＷＯ０３／０５５９９２およびＷＯ２００７／０４２２２５に記載されているように、胚盤胞から調製される胚性幹細胞、または市販の細胞もしくは細胞株であり得る。ＥＳ細胞株はまた、子宮外胚を破壊することなく、かつ臨床転帰に影響を及ぼすことなく、単一割球から得られ得る（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）およびＫｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２００６））。しかしながら、例えば、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）に開示されるようなＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬＩＮ２８などであるがこれらに限定されない、ある特定の転写因子で成体細胞を処置することによって、多能性細胞に再プログラム化される分化成体細胞を含む、任意のｈＰＳＣが本発明で使用され得ることがさらに想定される。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得られるミューズ細胞（多系統分化ストレス耐性細胞）、および生殖細胞（例えば、精巣）から生成されるＧＳ細胞も、多能性幹細胞に包含される。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても既知）は、成体細胞から直接生成され得る多能性幹細胞の一種である。多能性関連遺伝子の特定のセットの産物の導入によって、成体細胞は、多能性幹細胞に変換され得る。胚性幹細胞は、胚の破壊なしに得られる内部細胞塊を培養することによって生成され得る。胚性幹細胞は、所与の組織から入手可能であり、市販もされている。

本発明の最も一般的な態様では、ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法が提供され、方法は、ｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップとを含み、分化細胞は、眼野前駆細胞に分化することが可能になる。より具体的な態様は、ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法に関し、方法は、ｈＰＳＣを培養するステップと、ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップとを含み、分化細胞は、眼野前駆細胞に分化することが可能になる。

本発明者らは、この態様による方法によって得られる細胞の品質および収率が高いこと、ならびにプロトコルが、ＧＭＰ準拠に容易に変換する化合物に基づき得ることを発見した。

分化
本明細書で使用される場合、「分化する」または「分化」または「分化すること」は、細胞が未分化状態から分化状態に、未成熟状態からあまり未成熟ではない状態に、または未成熟状態から成熟状態に進行するプロセスを指す。

眼野前駆細胞
後期眼前駆細胞に向かう発生は一般的であり、分化における中間細胞型は、眼野前駆細胞と称され得る。本明細書で使用される場合、「眼野前駆細胞」という一般用語は、発生初期の前駆細胞の中間および一時的な群を指し、これは、以下が挙げられるがこれらに限定されない、眼の異なる細胞系統の複数の前駆細胞を含む。

ａ）ＲＰＥ前駆細胞およびＮＲ前駆細胞を含む眼杯前駆細胞、
ｂ）水晶体前駆細胞、ならびに
ｃ）角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）を含む角膜前駆細胞
眼野前駆細胞は、ＲＰＥ細胞、ＮＲのすべての異なる細胞型、水晶体のすべての異なる細胞型、および角膜のすべての異なる細胞型が挙げられるがこれらに限定されない、複数の眼細胞に分化する可能性を有する。眼野前駆細胞は、各細胞系統により特異的な他のマーカーとともに、ＯＴＸ２およびＰＡＸ６の時間的発現によって定義される。

本明細書で使用される場合、「眼杯前駆細胞」は、ＮＲ細胞およびＲＰＥにさらに分化するように指定される前駆細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「角膜前駆細胞」は、３つの細胞層（上皮、間質、および内皮）ならびにＬＳＣにさらに分化するように指定される前駆細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「水晶体前駆細胞」は、ヒト水晶体を形成する任意の細胞型にさらに分化するように指定される前駆細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）」は、角膜上皮全体を再生する能力を有する幹細胞を指す。ＬＳＣは、角膜上皮幹細胞としても知られている。

本明細書で使用される場合、「神経網膜前駆細胞」は、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、ならびにＶＳＸ２およびＭＩＴＦの時間的発現によって定義される。ＮＲ前駆細胞におけるＭＩＴＦの発現は、分化プロセスの非常に初期の段階に限定される。

本明細書で使用される場合、「網膜色素上皮（ＲＰＥ）前駆細胞」は、ＯＴＸ２、ＰＡＸ６、およびＭＩＴＦの時間的発現、敷石状形態、ならびにＶＳＸ２の非存在によって定義される。

本明細書で使用される場合、「ＯＴＸ２」は、オルソデンティクルホメオボックス２遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、眼野前駆細胞を含む胚発生中の前脳構造のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＰＡＸ６」は、「ペアードボックス６」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、眼野前駆細胞を含む胚発生中の前脳構造のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＳＩＸ３」は、「ＳＩＸホメオボックス３」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、眼野前駆細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＳＩＸ６」は、「ＳＩＸホメオボックス６」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、眼野前駆細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＭＩＴＦ」は、「メラノサイト誘導転写因子」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＲＰＥ前駆細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＰＭＥＬ１７」または「ＰＭＥＬ」は、「プレメラノソームタンパク質」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＲＰＥ前駆細胞およびＲＰＥ成熟細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＳＥＲＰＩＮＦ１」は、「セルピンファミリーＦメンバー１」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＲＰＥ前駆細胞およびＲＰＥ成熟細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＴＹＲ」は、「チロシナーゼ」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＲＰＥ前駆細胞およびＲＰＥ成熟細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＶＳＸ２」は、ＣＨＸ１０としても既知の「ビジュアルシステムホメオボックス２」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、神経網膜前駆細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＴＰ６３」は、「腫瘍タンパク質６３」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＬＳＣのマーカーである。

本明細書で使用される場合、「Ｓ１００Ａ１４」は、「Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１４」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＬＳＣのマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＴＦＡＰ２Ｂ」は、「転写因子ＡＰ－２ベータ」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＬＳＣのマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＡＢＣＧ２」は、「ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー２」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、ＬＳＣのマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＮＡＮＯＧ」は、「Ｎａｎｏｇホメオボックス」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、多能性細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＰＯＵ５Ｆ１」は、「ＰＯＵクラス５ホメオボックス１」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、多能性細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＺＳＣＡＮ１０」は、「ジンクフィンガーおよびＳＣＡＮドメイン含有１０」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、多能性細胞のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＥＯＭＥＳ」は、「エオメソダーミン」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、中胚葉系統のマーカーである。

本明細書で使用される場合、「ＳＯＸ１７」は、「ＳＲＹボックス転写因子１７」遺伝子、転写物、またはタンパク質を指し、これは、内胚葉系統のマーカーである。

当業者は、細胞がこれらのマーカーのうちの１つ以上をさらに分化するにつれて、例えば、上方制御または下方制御されることなどであるがこれに限定されず、変化し得ることを認識するであろう。当業者はまた、対象となっている細胞が、前述のマーカーのみの発現に限定されず、眼野前駆細胞に共通する他のマーカーも発現し得ることを認識するであろう。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも８０％が、ＰＡＸ６を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の約９０％が、ＰＡＸ６を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の約９５％が、ＰＡＸ６を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも４０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも４０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦのうちの少なくとも１つを共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％が、ＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦをさらに共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５０％が、ＰＡＸ６およびＶＳＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、眼野前駆細胞の少なくとも２０％が、ＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦをさらに共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５６％が、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＳＩＸ３を共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の少なくとも２９％が、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ、およびＳＥＲＰＩＮＦを共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の約６９％が、ＰＭＥＬおよびＳＥＲＰＩＮＦを共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の約７３％が、ＰＭＥＬを発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、眼野前駆細胞の約６９％が、ＳＥＲＰＩＮＦを発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該眼野前駆細胞の少なくとも０，８％が、ＴＰ６３、Ｓ１００Ａ１４、およびＴＦＡＰ２Ｂを共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも８０％が、ＰＡＸ６を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の約９０％が、ＰＡＸ６を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の約９５％が、ＰＡＸ６を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも４０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも４０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦのうちの少なくとも１つを共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％が、ＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦをさらに共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５０％が、ＰＡＸ６およびＶＳＸ２を共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、眼野前駆細胞の少なくとも２０％が、ＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦをさらに共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも５６％が、ＳＩＸ３を発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の約７３％が、ＰＭＥＬを発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の約６９％が、ＳＥＲＰＩＮＦを発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、該眼野前駆細胞の少なくとも０．８％が、ＴＰ６３、Ｓ１００Ａ１４、およびＴＦＡＰ２Ｂを共発現する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該細胞は、ＲＰＥ前駆細胞、ＮＲ細胞、または角膜細胞である。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該細胞は、ＲＰＥ前駆細胞である。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該細胞は、神経網膜細胞である。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該細胞は、角膜細胞である。

本明細書で使用される「遺伝子の時間的発現」という用語は、発生または分化中の特定の時点における特定の組織または細胞内の遺伝子の活性化を指す。

方法は、一連のステップによって定義される。本明細書で使用される場合、方法に関する「ステップ」という用語は、何かが取り組んでいる、および／または動作が実施される段階として理解されるべきである。実施されるステップおよび／または取り組んでいるステップが、同時および／または順次および／または連続的である場合が、当業者によって理解されるであろう。

ｈＥＳＣを培養するステップにおいて、細胞は、上記で言及された任意の好適な供給源から得られてもよい。方法に従ってマトリックスでコーティングされた基質上にｈＰＳＣを播種するステップは、提供されたｈＰＳＣを移すことを伴う。「播種」という用語は、好適な槽に分布されているｈＰＳＣとして理解されるべきである。「プレーティング」という用語は、基質を有する好適な槽上に細胞を分布させることを意味する。当業者は、未分化細胞を基質上に移すための適切な技術を知っているであろう。本発明の一実施形態では、ｈＰＳＣは、ｃｍ^２当たり約１０，０００個の細胞～ｃｍ^２当たり約１００，０００個の細胞、好ましくはｃｍ^２当たり約２０，０００個の細胞～ｃｍ^２当たり約８０，０００個の細胞、より好ましくはｃｍ^２当たり約３０，０００個の細胞～ｃｍ^２当たり約５０，０００個の細胞、さらにより好ましくはｃｍ^２当たり約４０，０００個の細胞の濃度でプレーティングされる。

基質
本明細書で使用される場合、「基質」という用語は、コーティングが提供され得る表面として理解されるべきである。これは、ウェルプレートおよびビーズであってもよいが、これらに限定されない。典型的な基質としては、細胞培養処理済みマルチウェルプレート、例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｎｕｎｃ（商標）細胞培養処理済みマルチウェルプレートが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、細胞を培養するための好適な基質を容易に認識するであろう。本発明によると、提供されるｈＰＳＣは、マトリックスでコーティングされた基質上にプレーティングされる。

「マトリックス」という用語は、細胞表面受容体との相互作用に関与する細胞外分子を意味し、したがって、接着、増殖、遊走、および分化などの細胞挙動を調節するか、または機械的支持の機能を果たす。一実施形態では、コーティングされたプレート上のコーティングは、ラミニンおよび／またはフィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンおよび／またはコラーゲンを含む。

本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「ラミニン」または「ＬＮ」という用語は、アルファ鎖、ベータ鎖、およびガンマ鎖と呼ばれる３つのサブユニットからなるヘテロ三量体分子を指す。本明細書では、ヒトラミニンへの言及が行われる。５種類の鎖（アルファ１～アルファ５）、３種類のベータ鎖（ベータ１～ベータ３）、および３種類のガンマ鎖（ガンマ１～ガンマ３）が既知であり、これらの鎖の様々な組み合わせは、少なくとも１２種類のラミニンアイソフォームを生じさせる。例えば、「ラミニンアルファ５ベータ１ガンマ１」は、本明細書において「ラミニン－５１１」または「ＬＮ－５１１」と称される。同じことが他のアイソフォームにも適用される。ラミニンを指す場合の「その断片」は、無傷のラミニンの一部を意味する。例えば、ラミニン－５１１のＥ８断片は、ヒト胚性幹細胞に強く接着することがわかっている。ラミニンおよびその断片は、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ ＡＢまたはＮｉｐｐｉ Ｉｎｃ．などの企業から市販されている。ラミニンの非限定的な例としては、ＬＮ－１１１、ＬＮ－４２３、ＬＮ－５２３、ＬＮ－５１１、ＬＮ－５２１、およびＬＮ－３３２、またはそれらの断片が挙げられる。

一実施形態では、本発明の方法で使用されるマトリックスは、ＬＮ－１１１、ＬＮ－４２３、ＬＮ－５２３、ＬＮ－５１１、ＬＮ－５２１、およびＬＮ－３３２からなる群から選択されるラミニンまたはその断片である。

一実施形態では、本発明の方法で使用されるマトリックスは、ＬＮ－４２３またはその断片である。

一実施形態では、本発明の方法で使用されるマトリックスは、ＬＮ－５１１またはその断片である。

一実施形態では、本発明の方法で使用されるマトリックスは、ＬＮ－５２１またはその断片である。

一実施形態では、本発明の方法で使用されるマトリックスは、ＬＮ－３３２またはその断片である。

本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「フィブロネクチン」という用語は、インテグリンと呼ばれる膜貫通受容体タンパク質に結合する細胞外マトリックスの高分子量（約４４０ｋＤａ）糖タンパク質を指す。インテグリンと同様に、フィブロネクチンは、コラーゲン、フィブリン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカン（例えば、シンデカン）などの細胞外マトリックス構成成分に結合する。本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「ビトロネクチン」という用語は、血清、細胞外マトリックス、および骨に豊富に見られるヘモペキシンファミリーの糖タンパク質を指す。本明細書で使用される場合、プレート上のコーティングに関する「コラーゲン」という用語は、動物体の様々な結合組織内の細胞外空間における構造タンパク質を指す。結合組織の主要構成成分として、これは、哺乳動物において最も豊富なタンパク質であり、全身タンパク質含量の２５％～３５％を占める。コラーゲンは、一緒に巻かれて三重らせんを形成して、細長いフィブリルを形成するアミノ酸からなる。

好ましい実施形態では、基質上にコーティングされたマトリックスは、ラミニンまたはその断片を含み、好ましくは、ラミニン－５１１およびラミニン－３３２からなる群から選択される。

別の実施形態では、ラミニンまたはその断片は、ラミニン－５１１およびラミニン－３３２の組み合わせである。

一実施形態では、マトリックスは、ラミニン－５１１および／またはラミニン－３３２、ならびに１つ以上のさらなるラミニンを含む。

別の実施形態では、ラミニンまたはその断片は、ラミニン－３３２である。一実施形態では、ラミニンは、無傷のラミニンタンパク質である。

別の実施形態では、ラミニンは、無傷のラミニンタンパク質の断片である。さらなる実施形態では、ラミニンの濃度は、約０．０１μｇ／ｃｍ^２～約５０μｇ／ｃｍ^２、好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～約２５μｇ／ｃｍ^２、より好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～１０μｇ／ｃｍ^２、より好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～約５、より好ましくは約０．２５μｇ／ｃｍ^２～約１μｇ／ｃｍ^２、さらにより好ましくは約０．５μｇ／ｃｍ^２である。

培養ステップは、幹細胞が、制御された条件下で、概して、その自然環境外で成長するプロセスとして理解されるべきである。「培養」という用語は、連続的手順として理解されるべきであり、これは、細胞の様々な段階での生存率を維持するために、方法全体を通して用いられる。対象となる細胞が、例えば、限定されないが、生体組織または胚から単離された後、それらは続いて、注意深く制御された条件下で維持される。これらの条件は、各細胞型によって異なるが、概して、必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、成長因子、ホルモン、およびガス（ＣＯ_２、Ｏ_２）を供給し、物理化学的環境（ｐＨ緩衝液、浸透圧、温度）を調節する基質または培地を有する適切な槽からなる。

一実施形態では、播種および培養のステップは同時に起こり、すなわち、ｈＰＳＣは、細胞培養培地を含む基質上にプレーティングされる。一実施形態では、分化プロセスは、播種および培養で直ちに開始される。培養ステップ単独が、分化細胞を培養するステップとして解釈されるものではないが、単に幹細胞を培養することは、分化細胞を得るためのさらなるステップの前提条件である。それにもかかわらず、培養されたｈＰＳＣは、ここで分化細胞と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「分化細胞」という用語は、細胞が、１つの細胞型（例えば、多分化能性、全能性、または多能性の分化可能な細胞）から、標的分化した細胞などの別の細胞型に分化するプロセスを受けるか、または受けている細胞を指し、これは、本発明によると、眼野前駆細胞である。細胞が分類され得る細胞型に発達した可能性があっても、「分化細胞」という用語は、依然として使用され得る。

一実施形態では、培養ステップにおける細胞培養培地は、第１の細胞培養培地であり、細胞培養培地の少なくとも一部は、その後、第２の細胞培養培地で置き換えられる。したがって、一実施形態では、０日目の細胞培養培地は、第１の細胞培養培地であり、細胞培養培地の少なくとも一部は、約１日目から第２の細胞培養培地で置き換えられる。好ましい実施形態では、０日目の播種ステップにおける細胞培養培地は、第１の細胞培養培地であり、第１の細胞培養培地は、約１日目から第２の細胞培養培地で実質的に置き換えられる。

ＲＯＣＫ阻害剤
Ｒｈｏ関連コイル状コイル含有キナーゼ（ＲＯＣＫ）は、ＲｈｏＡ小ＧＴＰａｓｅのエフェクターであり、セリン／スレオニンキナーゼのＡＧＣファミリーに属する。ＲＯＣＫキナーゼは、細胞の収縮、遊走、アポトーシス、生存、および増殖を含む多くの機能を有する。ＩＲｈｏ関連、コイル状コイル含有プロテインキナーゼＲＯＣＫ阻害剤は、ｒｈｏキナーゼを標的とし阻害する一連の化合物である。本明細書で使用される場合、「Ｙ－２７６３２」は、ＣＡＳ番号１２９８３０－３８－２を有するトランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩を指す。

一実施形態では、第１の細胞培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含む。一実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２またはＴｉｇｅｒである。

一実施形態では、第１の細胞培養培地は、０．１～３０μＭの濃度範囲の該Ｒｏｃｋ阻害剤を含む。

一実施形態では、第１の細胞培養培地は、１～２０μＭの濃度範囲の該Ｒｏｃｋ阻害剤を含む。

一実施形態では、第１の細胞培養培地は、約１０μＭの濃度の該Ｒｏｃｋ阻害剤を含む。

培養培地
典型的には、幹細胞は、その現在の発生状態での生存能力に適した細胞培養培地で提供される。培養のための幹細胞を提供することは、典型的には、幹細胞を、新しい基質上に播種すること、またはインキュベーター中に懸濁することなどによって、異なる環境へと移すことを暗示する。当業者は、幹細胞がそのような移動に対して脆弱であり、手順が注意を必要とすること、および幹細胞を元の細胞培養培地中で維持することが、細胞培養培地を分化プロセスにより適した別の細胞培養培地で置き換える前に、細胞のより持続可能な移動を促進し得ることを認識するであろう。方法の一実施形態では、０日目の播種ステップにおける細胞培養培地は、第１の細胞培養培地であり、細胞培養培地の少なくとも一部は、１日目から第２の細胞培養培地で置き換えられる。本明細書で使用される場合、細胞培養培地、第１の細胞培養培地、および第２の細胞培養培地に関する「置き換え」という用語は、手順を意味し、細胞培養培地の量は、好適な手段によって取り出され、任意選択で、実質的に等しい量の細胞培養培地は、細胞培養培地の全体積が実質的に同じままであるように添加される。「第１の細胞培養培地を除去すること」とは、第１の除去および第２の細胞培養培地の添加の後として理解され、次いで、任意の後続の置き換えは、第１および第２の細胞培養培地の混合物の置き換えであり、混合物は、除去および添加される量に対応する比率である。したがって、順次除去では、第１の細胞培養培地は、第２の細胞培養培地によって連続的に希釈され、この手順を繰り返すことによって、細胞培養培地は最終的に、第１の細胞培養培地を実質的に含まないことになる。好ましい実施形態では、第１の細胞培養培地は、約１日目に第２の細胞培養培地で実質的に置き換えられる。

さらなる実施形態では、第１の細胞培養培地は、化学的に定義され、かつ異種由来成分を含まない。本明細書で使用される場合、細胞培養培地に関する「化学的に定義される」という用語は、化学構成成分のすべてが既知であるヒトまたは動物細胞のインビトロ細胞培養に適した成長培地を意味する。化学的に定義された培地は、構成成分のすべてが特定され、それらの正確な濃度が既知でなければならないことを必要とする。本明細書で使用される場合、「異種由来成分を含まない」および「動物由来成分を含まない」という用語は、互換的に、かつ本発明に従って使用されてもよく、任意の動物由来の構成成分を好ましくは完全に欠いていることを意味する。好ましい実施形態では、細胞培養培地はまた、フィーダーを含まない。「フィーダーを含まない」および「フィーダー細胞を含まない」という用語は、互換的に使用されてもよく、そうでなければ培養された幹細胞に栄養を与える目的で存在し得るヒトおよび動物細胞を欠いている培養系を指し、すなわち、フィーダー細胞は、それらが支持する幹細胞に代謝物を供給するが、成長または分裂を意図する細胞ではない。

本発明者らは、化学的に定義された「異種由来成分を含まない」および「フィーダー細胞を含まない」細胞培養環境を好むが、規制機関は、そのような基準に完全に準拠することなく、本発明による方法に基づいた医薬品および治療を承認し得る。本発明者らは、ＧＭＰおよび適ｇｏｏｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＴＰ）の最高基準を順守するよう努める。しかしながら、本発明は、そのような基準に限定されるものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明がそのような高い基準を順守することなく実施され得ることを容易に認識するであろう。

一実施形態では、第１の細胞培養培地は、基質への移動時に幹細胞の生存能力を支持する任意の好適な細胞培養培地であってもよい。そのような細胞培養培地は市販されており、例えば、ｉＰＳおよびＥＳ幹細胞用のＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地などのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）であり得る。したがって、一実施形態では、ｉＰＳおよびＥＳ幹細胞用のＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地などのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）。

一実施形態では、第２の細胞培養培地は、化学的に定義され、かつ異種由来成分を含まない。さらなる実施形態では、第２の細胞培養培地はまた、フィーダーを含まない。一実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＧＭＥＭ（グラスゴー改変必須培地）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地／ハムＦ－１２培地）を含む。類似の培地は、同等に良好に機能し、容易に購入可能である。さらなる実施形態では、ＧＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２は、Ｎ２および／またはＢ２７で補充される。一実施形態では、Ｂ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）～約２．５％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約２％（ｖ／ｖ）である。一実施形態では、Ｎ２の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）～約５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）～約２．５％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約１％（ｖ／ｖ）である。

一実施形態では、分化細胞は、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する。

本明細書で使用される場合、細胞を培養することに関する「接触」という用語は、特定の化合物を、それが細胞に触れて「接触した」細胞を生成することを可能にする場所に配置することによって、細胞を、例えば、特定の化合物に曝露することを意味する。接触は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。接触の非限定的な例は、化合物を細胞の細胞培養培地に添加することによる。細胞の接触は、細胞および特定の化合物が近接している限り、例えば、化合物が細胞培養培地中に好適な濃度で存在する限り、起こるものと想定される。

本明細書で使用される場合、シグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路の阻害に関する「阻害剤」という用語は、処置された細胞または組織を阻害しない化合物で処置された細胞と比較して、結果として生じる標的分子または標的化合物または標的プロセス、例えば、特定の分化結果に干渉する（すなわち、低減または排除または抑制する）（例えば、デフォルト細胞型分化を促進する活性シグナル伝達経路を抑制し、それによって非デフォルトの細胞型への分化を誘導する）化合物を指す。

Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路の阻害剤
本明細書で使用される場合、「Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路の阻害剤」は、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路を特異的に阻害する化合物を指す。Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤の例は、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＮＯＧＧＩＮ、ＲｅｐＳＯＸ、ＳＢ４３１５４２、およびＴＥＷ－７１９７を含む群から選択されてもよい。

本明細書で使用される場合、「ＧＷ７８８３８８」は、小分子化学名Ｎ－（オキサン－４－イル）－４－［４－（５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－２－イル］ベンズアミド、およびＣＡＳ番号４５２３４２－６７－５を示す。

本明細書で使用される場合、「ＬＤＮ－１９３１８９」は、ＩＵＰＡＣ名４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン、およびＣＡＳ番号１０６２３６８－２４－４を有する化合物を示す。

本明細書で使用される場合、「ＬＹ２１５７２９９」は、小分子を示し、これは、代替名ガルニセルチブ、および化学名４－［２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル］キノリン－６－カルボキサミド、ならびにＣＡＳ番号７００８７４－７２－２を有する強力なＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）阻害剤である小分子を示す。

本明細書で使用される場合、「ＬＹ３６４９４７」は、ＩＵＰＡＣ名４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、およびＣＡＳ番号３９６１２９－５３－６を有する化合物を示す。

本明細書で使用される場合、「ＮＯＧＧＩＮ」は、骨形成タンパク質－４（Ｂ ＭＰ ４）などのシグナル伝達タンパク質の形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）スーパーファミリーのメンバーに結合し、それを不活性化する、分泌されたホモ二量体糖タンパク質を示す。ＮＯＧＧＩＮは典型的には、グリコシル化、ジスルフィド結合二量体としてヒト細胞内で発現される６５ｋＤａのタンパク質である。

本明細書で使用される場合、「ＲｅｐＳＯＸ」は、代替名Ｅ－６１６４５２、ＳＪＮ ２５１１、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、および化学名２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、ならびにＣＡＳ番号４４６８５９－３３－２を有するＴＧＦ－βＲＩの強力かつ選択的な阻害剤である小分子である。

本明細書で使用される場合、「ＳＢ４３１５４２」は、化学名４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド、およびＣＡＳ番号３０１８３６－４１－９を有する化合物を示す。

本明細書で使用される場合、「ＴＥＷ－７１９７」は、代替名バクトセルチブおよび化学名２－フルオロ－Ｎ－［［５－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］アニリン、ならびにＣＡＳ番号１３５２６０８－８２－２を有する小分子を示す。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該方法は、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤を含む。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該方法は、２つのＳＭＡＤ阻害剤を含む。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該方法は、単一のＳＭＡＤ阻害剤を含む。

一実施形態では、分化細胞は、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＮＯＧＧＩＮ、ＲｅｐＳＯＸ、ＳＢ４３１５４２、およびＴＥＷ－７１９７からなる群から選択されるＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する。

別の実施形態では、分化細胞は、ＧＷ７８８３８８および／またはＲｅｐＳＯＸからなる群から選択されるＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該方法は、ＧＷ７８８３８８および／またはＲｅｐＳＯＸを含む。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該方法は、ＧＷ７８８３８８を含む。

一実施形態では、本発明は、眼野前駆細胞を得るための方法に関し、該方法は、ＲｅｐＳＯＸを含む。

本発明者らは、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達のこれらの阻害剤を、眼野前駆細胞への分化の有効かつ堅牢な開始を提供するものとして特定した。小分子はさらに、ＧＭＰ準拠への変換を促進する。

一実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤は、ＧＷ７８８３８８である。

そのさらなる実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤は、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬ～約１，０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＧＷ７８８３８８である。一実施形態では、濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬである。

一実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤は、ＲｅｐＳＯＸである。

別の実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤は、約０．２５μＭ～約２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１５０μＭ、より好ましくは約１５μＭ～約１００μＭ、さらにより好ましくは約２０μＭ～約７５μＭの濃度のＲｅｐＳＯＸである。

一実施形態では、分化細胞は、０日目からＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する。その結果、そのような実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達経路の阻害剤は、第１の細胞培養培地に添加されることになる。

好ましい実施形態では、分化細胞は、０日目～１５日目、１４日目、１３日目、１２日目、１１日目、または１０日目、好ましくは０日目～１２日目にＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する。その結果、そのような実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達経路の阻害剤は、第２の細胞培養培地にも添加されることになる。

一実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤は、１つの化合物のみを含む。

一実施形態では、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤は、前述のＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤の組み合わせなどであるがこれに限定されない、２つ以上の化合物を含む。当業者は、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の個々の阻害剤の濃度が、個々の阻害剤と類似の効果を得るためにそれに応じて調節される必要があり得ることを認識するであろう。

本発明者らは、ｈＰＳＣが、細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の１つの阻害剤のみに曝露するプロトコルを用いて、眼野前駆細胞に分化され得ることを発見した。

一実施形態では、分化細胞は、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の１つの阻害剤のみと接触する。これは、分化プロトコルを単純化し、コストを削減し、ＧＭＰ準拠への変換をさらに促進する。

分化細胞は、ＢＭＰ５またはその類似体と接触する。本明細書で使用される場合、「類似体」および「バリアント」という用語は、互換的に使用されてもよく、１つ以上のアミノ酸変化によって天然または参照のペプチドまたはタンパク質とは異なるペプチドまたはタンパク質を定義するために使用される。

ＢＭＰ５
本明細書で使用される場合、「ＢＭＰ５」は、ヒト骨形成タンパク質５またはその類似体を指す。ＢＭＰ５は、ＢＭＰシグナル伝達経路の活性化因子であり、ヒトにおいてＢＭＰ５遺伝子によってコードされ、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質である。ヒトＢＭＰ５（骨形成タンパク質５）アイソフォーム１のプレプロタンパク質は、配列番号１によって特定される。当業者は、この配列のバリアントが、例えば、限定されないが、タンパク質合成および成熟の様々な段階で存在し得ること、ならびにまたそのようなバリアントが、配列番号１によって特定されるＢＭＰ５と同等に良好に機能し得ることを容易に認識するであろう。

一実施形態では、ＢＭＰ５は、配列番号１によって特定される。

一実施形態では、分化細胞は、ＢＭＰ５（配列番号１）またはその類似体と接触し、その類似体は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の有効な活性化因子である。本発明者らは、ＢＭＰ５が、眼野前駆細胞への迅速かつ有効な分化を可能にする、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の有効な活性化因子であることを発見した。

一実施形態では、分化細胞は、ＢＭＰ５（配列番号１）またはその類似体と接触し、類似体は、配列番号１によって特定されるＢＭＰ５と少なくとも５０％の同一性を有する。

一実施形態では、ＢＭＰ５の類似体は、配列番号１によって特定されるＢＭＰ５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。

好ましい実施形態では、分化細胞は、有効量のＢＭＰ５（配列番号１）またはその類似体と接触する。「有効量」という用語は、分化細胞をある濃度のＢＭＰ５またはその類似体と接触させることを意味し、ＢＭＰ５またはその類似体の活性は、分化細胞の眼野前駆細胞運命に向かうさらなる分化を促進するのに十分高い。当業者は、ＢＭＰ５およびその類似体の活性が変化し得ることを認識するであろう。これは、異なるベンダーによって提供される一見したところ同一の製品についてさえ事実であり得る。したがって、一実施形態では、ＢＭＰ５の活性（ＥＤ_５０）は、約０．１μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１５μｇ／ｍＬ～約１．５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．２μｇ／ｍＬ～約１．３μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは約０．２１μｇ／ｍＬ～約１．２μｇ／ｍＬである。一実施形態では、この活性は、ＢＭＰ５の濃度と相関し得る。言及される活性は、“Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｉｔｓ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ＡＴＤＣ５ ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５０：３５１に記載されるように測定され得る。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、少なくとも約０，１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、または２５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌである。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１０００、９００、８００、７００、６００、または５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは約４５０ｎｇ／ｍｌ未満である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約０，１ｎｇ／ｍｌ～約２０００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約０，１ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約２００ｎｇ／ｍｌである。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１０００ｎｇ／ｍｌである。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約２００ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌ～約１１００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、約１５０ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの範囲内である。

一実施形態では、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップにおいて、ＢＭＰ５の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ～約５５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌである。

さらなる実施形態では、ＢＭＰ５の濃度は、３５０ｎｇ／ｍｌ～約４５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３６０ｎｇ／ｍｌ～約４４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３７０ｎｇ／ｍｌ～約４３０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３８０ｎｇ／ｍｌ～約４２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３９０ｎｇ／ｍｌ～約４１０ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約４００ｎｇ／ｍｌである。

一実施形態では、分化細胞は、約５日目～約１４日目、好ましくは約６日目～約１３日目、より好ましくは約６日目～約１２日目、より好ましくは約６日目～約１１日目、より好ましくは約６日目～約１０日目、より好ましくは約６日目～約９日目、より好ましくは約６日目～約８日目、さらにより好ましくは約７日目にＢＭＰ５と接触する。

一実施形態では、分化細胞は、ＢＭＰ５と接触し、分化細胞は、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９日目まで、好ましくは約２０日目～２２日目まで、さらにより好ましくは約２１日目までに眼野前駆細胞に分化することが可能になる。

一実施形態では、分化細胞は、約５日目～約３０日目、約５日目～約２９日目、約５日目～約２８日目、約５日目～約２７日目、好ましくは約６日目～約２６日目、より好ましくは約６日目～約２５日目、より好ましくは約６日目～約２４日目、より好ましくは約６日目～約２３日目、より好ましくは約６日目～約２２日目、より好ましくは約６日目～約２１日目、さらにより好ましくは約７日目～約２１日目にＢＭＰ５と接触する。

分化細胞が分化することを可能にすることは、実施される別個の最終ステップとして解釈されるべきではない。当業者は、本明細書で使用される場合、「分化する」および「分化」という用語が、細胞が未分化状態から分化状態に、未成熟状態からあまり未成熟ではない状態に、または未成熟状態から成熟状態に進行するプロセス（方法が実施される際に連続的に起こる）を指すことを容易に理解するであろう。これは、例えば、眼野前駆細胞に分化するｈＰＳＣであるがこれに限定されない。細胞相互作用および成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うまたは分化した細胞のマーカーを得るときに生じる。単一マーカーの損失または獲得は、細胞が「成熟または完全に分化」されたことを示し得る。

当業者は、分化細胞がいつ特定のマーカーに基づいて眼野前駆細胞に成熟したかを決定することができる。したがって、いくつかの実施形態では、分化細胞は、０日目から開始して約１７日間～４０日間、好ましくは約１８日間～３０日間、より好ましくは約１９日間～２５日間、より好ましくは約１９日間～２３日間、より好ましくは約２０日間～２２日間、さらにより好ましくは約２１日間、眼野前駆細胞に分化することが可能になる。

一実施形態では、分化細胞は、約０日目～約１２日目にＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触し、分化細胞は、約７日目からＢＭＰ５と接触し、分化細胞は、約２１日目までに眼野前駆細胞に分化することが可能になる。

分化細胞は、眼野前駆細胞に完全に分化されたものとみなされ得るが、さらなる分化は、ＲＰＥ細胞およびＮＲ細胞などであるがこれらに限定されない、さらなる特定の、または成熟した前駆細胞に向かって進行してもよく、追加の因子および／または条件が用いられてもよい。特に、例えば、眼の状態の治療で使用するための、より成熟した前駆細胞または完全に成熟した細胞にさらに分化され得る細胞を提供することが、本発明の目的である。

ｈＰＳＣは、眼野前駆細胞に分化することが可能になる。一実施形態では、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２およびＭＩＴＦのうちの１つ以上を共発現する。さらなる実施形態では、眼野前駆細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％が、ＶＳＸ２およびＭＩＴＦのうちの１つ以上をさらに共発現する。

一実施形態では、方法は、分化細胞がＷＮＴ／β－カテニン経路の阻害剤と接触する、さらなるステップを含む。本明細書で使用される場合、「ＷＮＴ／βカテニン経路」という用語は、細胞表面受容体を通してシグナルを細胞内に入れるタンパク質で始まるシグナル伝達経路の群を指す。Ｗｎｔは、「Ｗｉｎｇｌｅｓｓ／Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ」を表す遺伝子学の分野での頭字語である。

一実施形態では、分化細胞は、約２日目～約１５日目、好ましくは約３日目～約１４日目、より好ましくは約３日目～約１３日目、さらにより好ましくは約３日目～約１２日目に、ＷＮＴ／β－カテニン経路の阻害剤と接触する。一実施形態では、ＷＮＴ／β－カテニン経路の阻害剤は、Ｅｎｄｏ ＩＷＲ １である。さらなる実施形態では、Ｅｎｄｏ ＩＷＲ １の濃度は、約０．１μＭ～約１０μＭ、好ましくは約０．５μＭ～約５μＭ、さらにより好ましくは約１μＭ～約３μＭである。本明細書で使用される場合、「Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１」は、化学名［（３ａＲ＊，４Ｓ＊，７Ｒ＊，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ヘキサヒドロ－１，３－ジオキソ－４，７－メタノ－２Ｈ－イソインドール－２－イル］－Ｎ－８－キノリニルベンズアミド、およびＣＡＳ番号１１２７４４２－８２－３を有する小分子を示す。

本発明のさらなる態様は、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２およびＭＩＴＦのうちの１つ以上を共発現する。その結果、特定の実施形態では、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団は、本発明の第１の態様による方法によって得られることになる。「インビトロ細胞集団」は、例えば、好適な槽に含有されるなど、ヒト身体の外の細胞集団を意味する。特定の実施形態では、眼野前駆細胞は、非天然である。「非天然」という用語は、ヒトまたは動物の体など、自然界では存在しない細胞として理解されるべきである。一般に、ヒトの体内の細胞と同一または同一に近い細胞に到達することが幹細胞療法の目的であるが、細胞を分化し成熟させるための現在の方法は、これらと完全に同一である細胞産物を提供しない。

一実施形態では、眼野前駆細胞は、神経網膜前駆細胞に分化される。したがって、本発明の別の態様は、ｈＰＳＣから神経網膜前駆細胞を得るための方法に関する。この態様による方法は、眼野前駆細胞を得るためのプロトコルに直接関連する。したがって、眼野前駆細胞を得るための方法に関連する実施形態は、この態様に等しく適用され得る。この態様の一実施形態は、神経網膜前駆細胞を得るための方法に関し、方法は、ｈＰＳＣを培養するステップと、ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップとを含み、分化細胞は、神経網膜前駆細胞に分化することが可能になる。

別の実施形態では、眼野前駆細胞は、ＲＰＥ前駆細胞に分化される。

したがって、本発明の別の態様は、ＲＰＥ細胞を得るための方法にも関連する。この態様による方法は、眼野前駆細胞を得るためのプロトコルに直接関連する。したがって、眼野前駆細胞を得るための方法に関連する実施形態は、この態様に等しく適用され得る。この態様の一実施形態は、ｈＰＳＣからＲＰＥ前駆細胞を得るための方法に関し、方法は、ｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、分化細胞をＧＳＫ３の阻害剤と接触させるステップを含み、分化細胞は、ＲＰＥ前駆細胞に分化することが可能になる。より具体的な実施形態では、ｈＰＳＣからＲＰＥ前駆細胞を得るための方法は、ｈＰＳＣを培養するステップと、ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、分化細胞をＧＳＫ３の阻害剤と接触させるステップとを含み、分化細胞は、ＲＰＥ前駆細胞に分化することが可能になる。

ＧＳＫ３
本明細書で使用される場合、「ＧＳＫ３」は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３を意味する。ＧＳＫ３は、胚性脳発生中の神経前駆細胞の増殖および細胞極性などの細胞機能を制御する多くのシグナル伝達経路に関与するセリンスレオニンキナーゼである。ＧＳＫ３は、ＷＮＴへの細胞応答、成長因子、インスリン、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ヘッジホッグ経路、およびＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を含む、多数のシグナル伝達経路の下流制御スイッチとして作用する。ＧＳＫ３阻害剤の非限定的な例は、ＣＨＩＲ９９０２１またはＣＨＩＲ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲＡ０１４４１８、１－アザケンパウロン、およびビス－７－インドリルマレイミドである。

本明細書で使用される場合、「ＣＨＩＲ９９０２１」および「ＣＴ９９０２１」は、互換的に使用されてもよく、ＣＡＳ番号２５２９１７－０６－９を有する６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリルを指す。

一実施形態では、ＧＳＫ３の阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。

一実施形態では、分化細胞は、約５日目～約４０日目、好ましくは約５日目～約２５日目、より好ましくは約６日目～約２６日目、より好ましくは約６日目～約２５日目、より好ましくは約６日目～約２４日目、より好ましくは約６日目～約２３日目、より好ましくは約６日目～約２２日目、より好ましくは約６日目～約２１日目、さらにより好ましくは約７日目～約２１日目にＧＳＫ３の阻害剤と接触する。

一実施形態では、分化細胞は、分化細胞をＢＭＰ５またはその類似体と接触させた約２日後、好ましくは３日後、より好ましくは４日後、さらにより好ましくは５日後から、ＧＳＫ３の阻害剤と接触する。

一実施形態では、分化細胞は、約０．２５μＭ～約５μＭ、好ましくは約１μＭ～約４μＭ、より好ましくは約２μＭ～約３μＭの濃度で、ＧＳＫ３の阻害剤と接触する。

本発明者らは、ＧＳＫ３の阻害剤が、ＲＰＥ細胞に向かう分化の有効かつ堅牢な開始をもたらすことを特定した。小分子ＣＨＩＲ９９０２１はさらに、ＧＭＰ準拠への変換を促進する。

本発明者らは、ＧＳＫ３阻害剤を使用する代替手段として、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、およびＷＮＴ１６などのＷＮＴリガンドが使用され得ることを企図する。一実施形態では、ＷＮＴリガンドは、ＷＮＴ３Ａである。

本明細書で使用される場合、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、およびＷＮＴ１６は、３５０～４００個のアミノ酸長である分泌脂質修飾シグナル伝達糖タンパク質の多様なファミリーに含まれる。これらのタンパク質上で起こる脂質修飾のタイプは、セリン残基の保存されたパターンにおけるセリンのパルミトレオイル化である。パルミトレオイル化は、それが分泌のためにＷｎｔタンパク質の原形質膜への標的化を開始し、脂肪酸の共有結合によりＷｎｔタンパク質がその受容体を結合することを可能にするため、必要である。Ｗｎｔタンパク質はまた、適切な分泌を確保するために炭水化物に付着するグリコシル化も受ける。Ｗｎｔシグナル伝達では、これらのタンパク質は、リガンドとして作用して、パラクリン経路およびオートクリン経路を介して異なるＷｎｔ経路を活性化する。

本発明の別の態様は、本発明の第１の実施形態による方法によって得られる、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団に関する。

一実施形態では、本発明の眼野前駆細胞は、非天然である。

一実施形態では、ＲＰＥ前駆細胞、眼杯前駆細胞、角膜前駆細胞、およびＮＲ前駆細胞を含む眼野前駆細胞は、非天然である。

本発明の別の態様は、ＮＲ前駆細胞、初期眼前駆細胞、および／またはＲＰＥ細胞を得るための眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団の使用に関する。

本発明の別の態様は、ＲＰＥ前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、ＲＰＥ前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＭＩＴＦを共発現する。

本発明の別の態様は、神経網膜前駆細胞のインビトロ細胞集団に関し、神経網膜前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＶＳＸ２を共発現する。

特定の実施形態
本発明の態様がここで、以下の非限定的な実施形態によってさらに説明される。
１．ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法であって、
－ｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、
－分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、を含み、
分化細胞が、眼野前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
２．ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法であって、
－ｈＰＳＣを培養するステップと、
－細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、
－分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、を含み、
分化細胞が、眼野前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
３．ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法であって、
－ｈＰＳＣを培養するステップと、
－細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、
－分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、
－分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、を含み、
分化細胞が、眼野前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
４．ｈＰＳＣから眼野前駆細胞を得るための方法であって、
－ｈＰＳＣを培養するステップと、
－ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、
－細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、
－分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、
－分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、を含み、
分化細胞が、眼野前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
５．分化細胞が、ＢＭＰ５またはその類似体と接触し、その類似体が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の有効な活性化因子である、実施形態４に記載の方法。
６．分化細胞が、ＢＭＰ５（配列番号１）と接触し、類似体が、配列番号１によって特定されるＢＭＰ５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し、類似体が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路の有効な活性化因子である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．分化細胞が、有効量のＢＭＰ５またはその類似体と接触する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．分化細胞が、ＢＭＰ５（配列番号１）と接触する、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．ＢＭＰ５の濃度が、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも約１５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１８０ｎｇ／ｍｌである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ＢＭＰ５の濃度が、約１０００、９００、８００、７００、６００、または５００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは約４５０ｎｇ／ｍｌ未満である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．ＢＭＰ５の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ～約５５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．ＢＭＰ５の濃度が、約３５０ｎｇ／ｍｌ～約４５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３６０ｎｇ／ｍｌ～約４４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３７０ｎｇ／ｍｌ～約４３０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３８０ｎｇ／ｍｌ～約４２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３９０ｎｇ／ｍｌ～約４１０ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約４００ｎｇ／ｍｌである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＢＭＰ５の活性（ＥＤ_５０）が、約０．１μｇ／ｍｌ～約２μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１５μｇ／ｍｌ～約１，５μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．２μｇ／ｍｌ～約１．３μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約０．２１μｇ／ｍｌ～約１．２μｇ／ｍｌである、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．分化細胞が、約５日目～約１４日目、好ましくは約６日目～約１３日目、より好ましくは約６日目～約１２日目、より好ましくは約６日目～約１１日目、より好ましくは約６日目～約１０日目、より好ましくは約６日目～約９日目、より好ましくは約６日目～約８日目、さらにより好ましくは約７日目からＢＭＰ５と接触する、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．分化細胞が、ＢＭＰ５またはその類似体と接触し、分化細胞が、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９日目まで、好ましくは約２０日目～２２日目まで、さらにより好ましくは約２１日目までに眼野前駆細胞に分化することが可能になる、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．分化細胞が、約５日目～約３０日目、約５日目～約２９日目、約５日目～約２８日目、約５日目～約２７日目、好ましくは約６日目～約２６日目、より好ましくは約６日目～約２５日目、より好ましくは約６日目～約２４日目、より好ましくは約６日目～約２３日目、より好ましくは約６日目～約２２日目、より好ましくは約６日目～約２１日目、さらにより好ましくは約７日目～約２１日目にＢＭＰ５と接触する、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．分化細胞が、０日目から開始して約１５日間～４０日間、好ましくは約１７日間～２５日間、好ましくは約１８日間～２４日間、より好ましくは約１９日間～２３日間、より好ましくは約１９日間～２３日間、より好ましくは約２０日間～２２日間、さらにより好ましくは約２１日間、眼野前駆細胞に分化することが可能になる、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．
－分化細胞をＷＮＴ／β－カテニン経路と接触させるステップをさらに含む、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．細胞が、約２日目～約１５日目、好ましくは約３日目～約１４日目、より好ましくは約３日目～約１３日目、さらにより好ましくは約３日目～約１２日目に、ＷＮＴ／β－カテニン経路の阻害剤と接触する、実施形態１８に記載の方法。
２０．ＷＮＴ／β－カテニン経路の阻害剤が、Ｅｎｄｏ ＩＷＲ １である、実施形態１８または１９に記載の方法。
２１．Ｅｎｄｏ ＩＷＲ １の濃度が、約０．１μＭ～約１０μＭ、好ましくは約０．５μＭ～約５μＭ、さらにより好ましくは約１μＭ～約３μＭである、実施形態２０に記載の方法。
２２．マトリックスが、ラミニンまたはその断片を含む、実施形態４～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．ラミニンまたはその断片が、ラミニン－５１１およびラミニン－３３２からなる群から選択される、実施形態２２に記載の方法。
２４．ラミニンまたはその断片が、ラミニン－５１１およびラミニン－３３２の組み合わせである、実施形態２２に記載の方法。
２５．ラミニンまたはその断片が、ラミニン－３３２である、実施形態２３に記載の方法。
２６．ラミニンが、無傷のラミニンタンパク質である、実施形態２２～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．ラミニンが、無傷のラミニンタンパク質の断片である、実施形態２２～２５のいずれか１つに記載の方法。
２８．ラミニンの濃度が、約０．０１μｇ／ｃｍ^２～約５０μｇ／ｃｍ^２、好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～約２５μｇ／ｃｍ^２、より好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～１０μｇ／ｃｍ２、より好ましくは約０．１μｇ／ｃｍ^２～約５、より好ましくは約０．２５μｇ／ｃｍ^２～約１μｇ／ｃｍ^２、さらにより好ましくは約０．５μｇ／ｃｍ^２である、実施形態２２～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．分化細胞が、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＮＯＧＧＩＮ、ＲｅｐＳＯＸ、ＳＢ４３１５４２、およびＴＥＷ－７１９７からなる群から選択されるＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する、実施形態３～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．分化細胞が、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤の組み合わせと接触し、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤のうちの少なくとも１つが、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＮＯＧＧＩＮ、ＲｅｐＳＯＸ、ＳＢ４３１５４２、およびＴＥＷ－７１９７からなる群から選択される、実施形態２９に記載の方法。
３１．分化細胞が、ＧＷ７８８３８８および／またはＲｅｐＳＯＸからなる群から選択されるＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する、実施形態３～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤が、ＧＷ７８８３８８である、実施形態２９または３１に記載の方法。
３３．ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤が、０．１ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約５ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＷ７８８３８８である、実施形態３２に記載の方法。
３４．ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤が、ＲｅｐＳＯＸである、実施形態２９または３１に記載の方法。
３５．ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤が、０．２５μＭ～２００μＭ、好ましくは約１０μＭ～約１５０μＭ、より好ましくは約１５μＭ～約１００μＭ、さらにより好ましくは約２０μＭ～約７５μＭの濃度のＲｅｐＳＯＸである、実施形態３４に記載の方法。
３６．分化細胞が、ＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の１つの阻害剤のみと接触する、実施形態３～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．分化細胞が、約０日目からＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達と接触する、実施形態３～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．分化細胞が、ＢＭＰ５またはその類似体と接触し、分化細胞が、約４０日目またはそれ以上まで、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９日目まで、好ましくは約２０日目～２２日目まで、さらにより好ましくは約２１日目までに眼野前駆細胞に分化することが可能になる、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．分化細胞が、約０日目～約１５日目、好ましくは約１４日目まで、より好ましくは約１３日目まで、さらにより好ましくは約１２日目までにＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触する、実施形態３～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．分化細胞が、約０日目～約１２日目にＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触し、分化細胞が、約７日目からＢＭＰ５と接触し、分化細胞が、約２１日目までに眼野前駆細胞に分化することが可能になる、実施形態３～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．眼野前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２およびＭＩＴＦのうちの１つ以上を共発現する、実施形態１～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．眼野前駆細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％が、ＶＳＸ２およびＭＩＴＦのうちの１つ以上をさらに共発現する、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．細胞培養培地が、化学的に定義され、かつ異種由来成分を含まない、実施形態２～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．細胞培養培地が、フィーダー細胞を含まない、実施形態２～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．ｈＰＳＣが、ｃｍ^２当たり約１０，０００個の細胞～ｃｍ^２当たり約１００，０００個の細胞、好ましくはｃｍ^２当たり約２０，０００個の細胞～ｃｍ^２当たり約８０，０００個の細胞、より好ましくはｃｍ^２当たり約３０，０００個の細胞～ｃｍ^２当たり約５０，０００個の細胞、さらにより好ましくはｃｍ^２当たり約４０，０００個の細胞の濃度でプレーティングされる、実施形態２～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．０日目の細胞培養培地が、第１の細胞培養培地であり、細胞培養培地の少なくとも一部が、約１日目から第２の細胞培養培地で置き換えられる、実施形態２～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．０日目の細胞培養培地が、第１の細胞培養培地であり、第１の細胞培養培地が、約１日目から第２の細胞培養培地で実質的に置き換えられる、実施形態２～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．第１の細胞培養培地が、ｉＰＳおよびＥＳ幹細胞用のＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ｈＰＳＣ ＸＦ培地などのＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）である、実施形態４６または４７に記載の方法。
４９．第１の細胞培養培地が、ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含み、好ましくは、ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．第２の細胞培養培地が、Ｎ２およびＢ２７で補充されたＧＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．眼野前駆細胞が、ＮＲ細胞にさらに分化される、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．眼野前駆細胞が、ＲＰＥ細胞に分化される、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．眼野前駆細胞が、ＲＰＥ前駆細胞であり、該方法が、分化細胞をＧＳＫ３の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．ＧＳＫ３の阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、実施形態５３に記載の方法。
５５．ＣＨＩＲ９９０２１の濃度が、約０．２５μＭ～約５μＭ、好ましくは約１μＭ～約４μＭ、より好ましくは約２μＭ～約３μＭである、実施形態５４に記載の方法。
５６．分化細胞が、約５日目～約４０日目、好ましくは約５日目～約２５日目、より好ましくは約６日目～約２６日目、より好ましくは約６日目～約２５日目、より好ましくは約６日目～約２４日目、より好ましくは約６日目～約２３日目、より好ましくは約６日目～約２２日目、より好ましくは約６日目～約２１日目、さらにより好ましくは約７日目～約２１日目にＧＳＫ３の阻害剤と接触する、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．分化細胞が、約７日目～約１５日目、好ましくは約１２日目からＧＳＫ３の阻害剤と接触する、実施形態５３～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．分化細胞が、分化細胞をＢＭＰ５と接触させた約２日後、好ましくは３日後、より好ましくは４日後、さらにより好ましくは５日後から、ＧＳＫ３の阻害剤と接触する、実施形態５３～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団であって、眼野前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２およびＭＩＴＦのうちの１つ以上を共発現する、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団。
６０．眼野前駆細胞が、非天然である、実施形態５９に記載の眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団。
６１．眼野前駆細胞が、ＲＰＥ前駆細胞である、実施形態５９または６０に記載のインビトロ細胞集団。
６２．眼野前駆細胞が、ＮＲ前駆細胞である、実施形態５９または６０に記載のインビトロ細胞集団。
６３．実施形態１～５８のいずれか１つに記載の方法によって得られる、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団。
６４．ＮＲ前駆細胞、初期眼前駆細胞、および／またはＲＰＥ前駆細胞を得るための、実施形態５９～６３のいずれか１つに記載の眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団の使用。
６５．加齢黄斑変性、白内障、角膜失明、緑内障，およびＲＰなどの眼の状態の治療のための、実施形態６４に記載の使用。
６６．ｈＰＳＣからＲＰＥ前駆細胞を得るための方法であって、
－ｈＰＳＣを培養するステップと、
－ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、
－細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、
－分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、
－分化細胞をＢＭＰ５またはその類似体と接触させるステップと、
－分化細胞をＧＳＫ３の阻害剤と接触させるステップとを含み、
分化細胞が、ＲＰＥ前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
６７．ＲＰＥ前駆細胞のインビトロ細胞集団であって、ＲＰＥ前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＭＩＴＦを共発現する、ＲＰＥ前駆細胞のインビトロ細胞集団。
６８．ＲＰＥ前駆細胞が、非天然である、実施形態６７に記載のＲＰＥ前駆細胞のインビトロ細胞集団。
６９．ｈＰＳＣから神経網膜前駆細胞を得るための方法であって、
－ｈＰＳＣを培養するステップと、
－ｈＰＳＣを、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、
－細胞培養培地中でｈＰＳＣを培養して、分化細胞を得るステップと、
－分化細胞をＳＭＡＤタンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、
－分化細胞をＢＭＰ５と接触させるステップと、を含み、
分化細胞が、神経網膜前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
７０．神経網膜前駆細胞のインビトロ細胞集団であって、神経網膜前駆細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＶＳＸ２を共発現する、神経網膜前駆細胞のインビトロ細胞集団。
７１．神経網膜前駆細胞が、非天然である、実施形態７０に記載の神経網膜前駆細胞のインビトロ細胞集団。

以下は、本発明を実施するためのプロトコルの非限定的な例である。

［一般的な調製方法］
［ｈＥＳＣの培養］
内部で生成されたｈＥＳＣ株を、５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中のヒト組換えラミニン（ｈｒＬＮ）コーティングプレート（Ｂｉｏｌａｍｉｎｉｎ ５２１ ＬＮ、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）上に維持し、３～５日毎に１：１０～１：２０の比率で酵素的に継代した。継代のために、コンフルエント培養物を、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、酵素を慎重に除去し、細胞を、穏やかにピペットで移すことによって新鮮なＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地中に採取して、単一細胞懸濁液を得て、必要な体積を新鮮なｈｒＬＮ－５２１コーティングされた皿上にプレーティングした。継代後、培地を、新鮮な予熱したＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地で置き換え、毎日交換した。

［ｈＥＳＣの眼野前駆細胞への分化］
ｈＥＳＣ－ＲＰＥ単層分化 ｈＥＳＣを、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ｈＰＳＣ ＸＦ培地を使用して、１０μｇ／ｍｌでｈｒＬＮ－３３２ラミニンがコーティングされた皿（Ｂｉｏｌａｍｉｎｉｎ ３３２ ＬＮ、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）上に、５．５×１０^４細胞／ｃｍ２の細胞密度でプレーティングした。１０μＭの濃度のＲｈｏ－キナーゼ阻害剤（Ｙ－２７６３２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を最初の２４時間の間に添加する一方で、細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２で維持した。２４時間後、培養培地を、実施例に従って分化培地で置き換えた。以下の実施例における分化培地「ＧＭＥＭ」は常に、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液（２０単位／ｍｌ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ベータ－メルカプトエタノール（０．５ｍＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、非必須アミノ酸（１Ｘ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で補充される。

濃度
表１に提示される以下の濃度は、実施例１～１１に提供されるプロトコルで使用され得る。これらの濃度を、図１～１５で実施および参照される実験でも使用した。

［実施例１］
［ＢＭＰ５と組み合わせた二重ＳＭＡＤ阻害およびＷＮＴ阻害を使用して、眼野前駆細胞を得るためのプロトコル］
ｈＥＳＣを眼前駆細胞に分化するために、発生合図を模倣する小分子および組換えタンパク質と組み合わせた異なる条件下で、ＢＭＰ５の効果を試験した。我々の分化プロトコルについて、眼の発生に関連し、ＢＭＰ５によるＢＭＰ経路の活性化と組み合わせた、共通の発生経路の順次活性化および／または抑制に依存した。細胞解離後、ＬＮ－５２１上で増殖したｈＥＳＣ株を単一細胞に解離させ、分化のためにＬＮ－３３２上に播種した。これらの細胞は、このラミニンによく適合した。ＬＮ－５２１、ＬＮ－１１１、およびＬＮ－３３２の間の１２時間後の細胞接着の比較が、図１に示される。

ここで、図２に示される分化について試験した異なる６つの条件を要約する。

条件１：ＢＭＰ５を含まない二重ＳＭＡＤ阻害、ＷＮＴ阻害を使用した対照条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）
条件２：ＢＭＰ５を含まない二重ＳＭＡＤ阻害、順次ＷＮＴ阻害を使用した条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２
条件３：ＢＭＰ５を含む二重ＳＭＡＤ阻害、順次ＷＮＴ阻害を使用した条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２＋ＢＭＰ５
条件４：ＢＭＰ５およびアクチビンＡを含む二重ＳＭＡＤ阻害、順次ＷＮＴ阻害を使用した条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
１２～１４日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２＋ＢＭＰ５
１５～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２＋ＢＭＰ５＋アクチビンＡ
条件５：アクチビンＡを含み、ＢＭＰ５を含まない二重ＳＭＡＤ阻害、順次ＷＮＴ阻害を使用した条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２＋アクチビンＡ
条件６：ＢＭＰ５を含まない二重ＳＭＡＤ阻害、順次ＷＮＴ阻害を使用した対称条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
１２～１４日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２
１５～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＩＨＨ＋ＤＫＫ２＋アクチビンＡ

図２ＡおよびＢに示されるように、条件３におけるＢＭＰ５の使用は、ＭＩＴＦおよびＶＳＸ２陽性細胞を生成した。ＩＨＨによるヘッジホッグ経路の刺激およびＷＮＴ阻害剤ＤＫＫ２の使用は、対照（条件１）と類似のパターンを示す条件２に示されるように、ＭＩＴＦまたはＶＳＸ２陽性細胞を生成するには不十分であった。アクチビンＡをＢＭＰ５と併用した処置は、条件４に示されるように、ＭＩＴＦまたはＶＳＸ２のレベルを高めなかった。対照的に、アクチビンＡによるＢＭＰ５の置き換え、またはアクチビンＡによる初期処置後のＢＭＰ５を用いた処置は、条件５および６に示されるように、ＭＩＴＦおよびＶＳＸ２陽性細胞の生成にマイナスの影響を与えた。図３に示されるように、これらの細胞は、前脳同一性を示し、ＰＡＸ６マーカーおよびＯＴＸ２マーカーに対して陽性であり、眼野前駆細胞同一性に適合する。

これらの結果は、ＢＭＰ５が、ＲＰＥ前駆細胞マーカーＭＩＴＦおよびＮＲ前駆細胞マーカーＶＳＸ２に対して陽性の眼野前駆細胞を強力に生成することを示す。ＩＨＨ、ＤＫＫ２、およびアクチビンＡの添加は、これらのマーカーの発現に対するＢＭＰ５を用いた処置へのいかなる相加効果も示さなかった（図２ＡおよびＢ）。

［実施例２］
［ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせた二重ＳＭＡＤ阻害を使用して、眼野前駆細胞を得るためのプロトコル］
ＧＳＫ３阻害が、標準（ベータ－カテニン依存性）ＷＮＴシグナル伝達を活性化する可能性があるため、ＢＭＰ５と組み合わせた小分子ＣＨＩＲ９９０２１を用いたＧＳＫ３阻害を調査し、ＷＮＴ阻害剤Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１をプロトコルから除去することを決定した。ＢＭＰ５が、ＭＩＴＦおよびＶＳＸ２陽性細胞の生成にプラスの効果を示したため、７日目に開始してＢＭＰ５処置のより早い時点を試験した。

ここで、試験され図４に示され、かつ図５、６、および７で捕捉される、異なる３つの条件を要約する。

条件２：ＢＭＰ５を含まない二重ＳＭＡＤ阻害を使用した対照条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）
条件２：ＢＭＰ５を含む二重ＳＭＡＤ阻害を使用した条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５
条件３：ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１を含む二重ＳＭＡＤ阻害を使用した条件
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１

図４、条件２に示されるように、ＢＭＰ５は、ＭＩＴＦおよびＶＳＸ２陽性細胞を強力に生成した。ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、およびＶＳＸ２のｍＲＮＡレベルも、ＣＴ値が有意に減少するにつれて、ｈＥＳＣと比較して増加した（図５）。ＢＭＰ５をＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせたとき、ＶＳＸ２陽性細胞の数が劇的に低減した（条件３、図４）。驚くべきことに、ＢＭＰ５／ＣＨＩＲ９９０２１処置を受けるＭＩＴＦ陽性細胞は、ＢＭＰ５のみの条件と比較して、ＲＰＥ前駆細胞に特徴的なよく組織化された敷石状形態を採用した（図６）。

ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせは、図７に示されるように、２１日後にＭＩＴＦ陽性細胞の非常に均質な細胞集団を生成した。

要約すると、我々の順次のＢＭＰ５ベースのプロトコルは、ｈＥＳＣを眼野前駆細胞（ＭＩＴＦ／ＶＳＸ２）に分化し、ＣＨＩＲ９９０２１の添加は、これらの細胞をさらなるＲＰＥ前駆細胞同一性に向け直し、敷石状形態を有してＭＩＴＦに対して陽性、かつＶＳＸ２に対して陰性である。

［実施例３］
［ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１を含む二重ＳＭＡＤ阻害剤としてＲｅｐＳＯＸおよびＮＯＧＧＩＮを使用して、眼前駆細胞を得るためのプロトコル］
ＮＯＧＧＩＮと組み合わせた別のＳＭＡＤ阻害剤、ＲｅｐＳＯＸの効果を調査し、ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせて、ＭＩＴＦに対して陽性ＲＰＥ前駆細胞を得ることを決定した。これは、異なるＳＭＡＤ阻害剤を、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルで使用することができたかを示す。

ここで、図８に示されるように試験した条件を要約する。

条件ＲｅｐＳＯＸ：ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１を含む二重ＳＭＡＤ阻害
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＲｅｐＳＯＸ＋ＮＯＧＧＩＮ＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＲｅｐＳＯＸ＋ＮＯＧＧＩＮ
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＲｅｐＳＯＸ＋ＮＯＧＧＩＮ
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＲｅｐＳＯＸ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１

図８に示されるように、２１日後のＰＡＸ６、ＳＩＸ３、およびＭＩＴＦ遺伝子発現の明らかな誘導があり、ＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞の生成を示す。タンパク質レベルでは、ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせたＲｅｐＳＯＸはまた、眼野前駆細胞のマーカーである、免疫染色によって評価されたＯＴＸ２およびＰＡＸ６陽性細胞を生成した。

結論として、これらの結果は、異なるＳＭＡＤ阻害剤が、眼野前駆細胞を生成するために、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルで使用され得ることを示す。

［実施例４］
［単一ＳＭＡＤ阻害およびＢＭＰ５またはＣＨＩＲ９９０２１を含むＢＭＰ５を使用して、眼野前駆細胞を得るためのプロトコル］
我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルを用いて生成された細胞の定量的データを提供するために、フローサイトメトリーによって、ＮＲ前駆細胞についてはＢＭＰ５、またはＲＰＥ前駆細胞についてはＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１での処置を受けて生成された眼野前駆細胞を分析した。さらに、ＮＯＧＧＩＮをプロトコルから除去することによって、単一ＳＭＡＤ阻害を試験した。

ここで、試験され、図９および１０に示される２つの異なる条件を要約する。

ＲＰＥの条件（図９）：ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１を含む単一ＳＭＡＤ阻害
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１
ＮＲの条件（図１０）：単一ＳＭＡＤ阻害およびＢＭＰ５
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５

図９に示されるように、ＰＡＸ６陽性細胞は、分化した細胞の９０％超を表し、細胞がＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１に曝露された２１日後、ＰＡＸ６／ＭＩＴＦの両方に対して４０％超が陽性である。これは、眼野前駆細胞が、単一のＳＭＡＤ阻害剤（ＧＷ７８８３８８）に曝露され、その後にＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１で処置された後、ＲＰＥ前駆細胞同一性を採用したことを示す。細胞がＢＭＰ５単独に曝露された場合、図１０に示されるように、ＰＡＸ６陽性細胞の数は、９５％超であり、二重陽性細胞ＰＡＸ６／ＶＳＸ２は、５０％超であった。これは、ＢＭＰ５と組み合わせた単一ＳＭＡＤ阻害が、ＰＡＸ６およびＶＳＸ２に対して陽性である、ＮＲ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞を生成したことを示す。

結論として、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルにおける単一ＳＭＡＤ阻害は、ＮＲ前駆細胞同一性（ＰＡＸ６／ＶＳＸ２）を有する眼野前駆細胞の５０％超を生成し、ＣＨＩＲ９９０２１の添加は、これらの細胞をＲＰＥ前駆細胞（ＭＩＴＦ）同一性に向け直すことができる。驚くべきことに、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルにおける単一のＳＭＡＤ阻害剤（ＧＷ７８８３８８）の使用は、二重ＳＭＡＤ阻害の使用に取って代わることができる。

［実施例５］
［ＢＭＰ５およびＣＨＩＲ９９０２１を含む単一ＳＭＡＤ阻害を使用して、ＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞を得るためのプロトコルに対する、単一細胞ＲＮＡシーケンシング分析］
トランスクリプトームレベルでＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞の生成のためのＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせた、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルにおける単一ＳＭＡＤ阻害の効果を評価するために、以下のプロトコルで生成された細胞に対して、２１日目に単一細胞ＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を実施した。

ここで、図１１および１２の試験した条件を要約する。

条件：単一ＳＭＡＤ阻害およびＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１処置：
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１

図１１の表は、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析された、示された遺伝子を発現するｈＥＳＣ由来の眼野前駆細胞の割合を示す。表に示されるように、多能性（ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、およびＺＳＣＡＮ１０）のマーカーは、２１日間の分化後の細胞の１％未満を表し、三重ＮＡＮＯＧ／ＰＯＵ５Ｆ１／ＺＳＣＡＮ１０陽性細胞は検出されず、多能性細胞が存在しないことを示す。ＲＰＥ前駆細胞の特異的マーカーに対して陽性の細胞が検出され、ＭＩＴＦは２９％、ＰＭＥＬは７３％、ＳＥＲＰＩＮＦ１は６９％を表した。ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、およびＳＩＸ３などの眼杯マーカーに対して陽性の細胞も検出された（それぞれ、８６％、６４％、および５６％）。注目すべきことに、中胚葉系統および内胚葉系統などの他の生殖細胞系統に対して陽性の細胞は検出されなかった。各ベン図は、ＲＰＥ前駆細胞、ＰＡＸ６／ＭＩＴＦ／ＰＭＥＬおよびＰＡＸ６／ＰＭＥＬ／ＳＥＲＰＩＮＦ１遺伝子に特徴的な遺伝子を共発現する細胞の発現パターンを示す。

驚くべきことに、ＴＰ６３（８％）、Ｓ１００Ａ１４（４％）、ＴＦＡＰ２Ｂ（４％）、およびＡＢＣＧ２（１％）などのＬＳＣ（角膜幹細胞としても既知）マーカーに対して陽性の細胞の小さいクラスターを特定した。図１２中、細胞の０．８％を表す、ＬＳＣ（ＴＰ６３／ＴＦＡＰ２Ｂ／Ｓ１００Ａ１４）に対する三重陽性細胞を示すベン図を示す。

結論として、ＣＨＩＲ９９０２１および単一ＳＭＡＤ阻害と組み合わせた我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルは、ＲＰＥ前駆細胞同一性（ＭＩＴＦ／ＰＭＥＬ／ＳＥＲＰＩＮＦ１）を有する眼野前駆細胞を生成した。中胚葉系統または内胚葉系統からの未分化細胞（複数可）は、存在しなかった。驚くべきことに、我々のＢＭＰ５ベースのプロトコルはまた、ＬＳＣ（角膜幹細胞としても既知）同一性を有する眼野前駆細胞を生成することができる。

［実施例６］
［異なる濃度のＢＭＰ５を使用して、眼野前駆細胞を得るためのプロトコル］
眼野前駆細胞を生成するために、ＢＭＰ５のどの濃度範囲が最も有効であるかを判定するために、３つの異なる濃度（０．１、２００、および１０００ｎｇ／ｍｌ）を試験し、ＢＭＰ５を含まない対照条件と比較した。以下のプロトコルを用いて生成された細胞に対して、２１日目の遺伝子発現を分析した。

ここで、図１３および１４の試験した条件を要約する。

条件：単一ＳＭＡＤ阻害およびＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１処置（図１３）
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１
条件：単一ＳＭＡＤ阻害およびＢＭＰ５処置（図１４）
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５

図１３に示されるように、ＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞を誘導する最良の条件は、２００ｎｇ／ｍｌであった。図１４に示されるように、ＮＲ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞を生成するための最良の条件は、ＶＳＸ２（ＣＨＸ１０としても既知）遺伝子発現の誘導から明らかなように、ＮＲ前駆細胞についても２００ｎｇ／ｍｌであった。

結論として、試験した濃度のうち、２００ｎｇ／ｍｌが、眼野前駆細胞を生成するのに最良のＢＭＰ５濃度であるように思われ、１０００ｎｇ／ｍｌも、プラスではあるがより軽度の効果を示した。

［実施例７］
［異なるＢＭＰを比較する眼野前駆細胞を得るためのプロトコル］
ＢＭＰ５が、眼野前駆細胞を生成するＢＭＰファミリーの他のメンバーと比較して優れた効果を有するかを調査するために、ＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞を生成するためにＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせて、ＢＭＰ５をＢＭＰ４、ＢＭＰ７、およびＢＭＰ４－ＢＭＰ７によって形成されるＢＭＰヘテロ二量体と比較した。

ここで、図１５の試験した条件を要約する。

条件：ＣＨＩＲ９９０２１を含む単一ＳＭＡＤ阻害および異なるＢＭＰ
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋ＢＭＰ
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ＋ＣＨＩＲ９９０２１

図１５に示されるように、ＢＭＰ５は、ＲＰＥ前駆細胞同一性を有する眼野前駆細胞のマーカーの遺伝子発現を誘導する優れた効果を有した。ＢＭＰ４は、これらのマーカーを誘導する最小の能力を示し、ＢＭＰ７およびヘテロ二量体ＢＭＰ４－ＢＭＰ７は、ＢＭＰ４よりも良好であったが、ＢＭＰ５の効果は、ここに示されるすべてのマーカーに対して優れていた。

結論として、ＢＭＰ５は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、およびヘテロ二量体ＢＭＰ４－ＢＭＰ７などの他のＢＭＰファミリーメンバーと比較して、眼野前駆細胞の生成に対して優れた効果を有する。

［実施例８：二重ＳＭＡＤ阻害およびＷＮＴ経路の初期阻害を使用して、網膜色素上皮（ＲＰＥ）前駆細胞を得るためのプロトコル］
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１

［実施例９：単一ＳＭＡＤ阻害を使用し、ＷＮＴ経路の初期阻害を用いて、網膜色素上皮（ＲＰＥ）前駆細胞を得るためのプロトコル］
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５＋ＣＨＩＲ９９０２１

［実施例１０：二重ＳＭＡＤ阻害およびＷＮＴ経路の初期阻害を使用して、神経網膜前駆細胞を得るためのプロトコル］
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＮＯＧＧＩＮ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５

［実施例１１：単一ＳＭＡＤ阻害を使用し、ＷＮＴ経路の初期阻害を用いて、神経網膜前駆細胞を得るためのプロトコル］
０日目：１００％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋ＧＷ７８８３８８＋Ｙ－２７６３２
１日目：５０％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋５０％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
２日目：７５％ Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ＋２５％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８
３～６日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１
７～１１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＧＷ７８８３８８＋Ｅｎｄｏ ＩＷＲ１＋ＢＭＰ５
１２～２１日目：１００％（ＧＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）Ｎ２＋２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７）＋ＢＭＰ５

本発明のある特定の特徴が本明細書に例示および記載されているが、ここで、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるこうしたすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。

Claims (15)

1. ヒト多能性幹細胞から眼野前駆細胞を得るための方法であって、
   －前記ヒト多能性幹細胞を培養して、分化細胞を得るステップと、
   －前記分化細胞をＢＭＰ５（配列番号１）と接触させるステップであって、前記分化細胞が、前記眼野前駆細胞に分化することが可能になる、ステップと、を含む、方法。
2. 前記眼野前駆細胞が、ＲＰＥ前駆細胞およびＮＲ前駆細胞などの眼杯前駆細胞、水晶体前駆細胞、ならびに角膜前駆細胞を含むがこれらに限定されない、眼の異なる細胞系統の複数の前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
3. ヒト多能性幹細胞から眼野前駆細胞を得るための方法であって、
   －前記ヒト多能性幹細胞を、マトリックスでコーティングされた基質上に播種するステップと、
   －細胞培養培地中で前記ヒト多能性幹細胞を培養して、分化細胞を得るステップと、
   －前記分化細胞を、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させるステップと、
   －前記分化細胞をＢＭＰ５（配列番号１）と接触させるステップと、を含み、
   前記分化細胞が、前記眼野前駆細胞に分化することが可能になる、方法。
4. 前記分化細胞を、ＢＭＰ５（配列番号１）と接触させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＢＭＰ５の濃度が、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約２５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１５０ｎｇ／ｍｌ～約４５０ｎｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記分化細胞を、ＧＷ７８８３８８、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＮＯＧＧＩＮ、ＲｅｐＳＯＸ、ＳＢ４３１５４２、およびＴＥＷ－７１９７からなる群から選択されるＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤が、ＧＷ７８８３８８および／またはＲｅｐＳＯＸである、請求項６に記載の方法。
8. 前記マトリックスが、ラミニン－５１１、ラミニン－５２１、およびラミニン－３３２、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるラミニンまたはその断片である、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記分化細胞を、約５日目～約１５日目、好ましくは約６日目～約１２日目、より好ましくは約６日目～約８日目、さらにより好ましくは約７日目から、ＢＭＰ５（配列番号１）と接触させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記分化細胞を、約０日目～約１５日目、好ましくは約１４日目まで、より好ましくは約１３日目まで、さらにより好ましくは約１２日目までにＳｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記眼野前駆細胞が、ＲＰＥ前駆細胞であり、前記方法が、
    －前記分化細胞をＧＳＫ３の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記分化細胞を、約７日目～約１５日目、好ましくは約１２日目から前記ＧＳＫ３の阻害剤と接触させる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＧＳＫ３の阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団であって、前記眼野前駆細胞の少なくとも４０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２、ならびにＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦのうちの少なくとも１つを共発現する、眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団。
15. 前記眼野前駆細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ＰＡＸ６およびＯＴＸ２を共発現し、前記眼野前駆細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％が、ＶＳＸ２および／またはＭＩＴＦのうちの少なくとも１つをさらに共発現する、請求項１４に記載の眼野前駆細胞のインビトロ細胞集団。

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