CN111727239B - 一种制备功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种功能性肝(前体)细胞或功能性小肠上皮(前体)细胞的制备方法，其包括在抗生素存在下培养包含肝(前体)细胞或者小肠上皮(前体)细胞的分离细胞群的步骤。另外，本发明还提供一种包含功能性肝前体细胞的实质上均匀的分离细胞群，其中，CYP3A4在所述功能性肝前体细胞中的表达水平与其在HepaRG(注册商标)细胞株中的表达水平相比至少增大5倍。

Description

一种制备功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前 体细胞或小肠上皮细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种制备功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的方法、以及由该方法得到的功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞，以及使用它们的再生医疗或药物的毒性评价。
背景技术
作为肝硬化等肝病的根治疗法，一直以来都在进行肝移植，目前肝移植也仍然是主流的治疗方法。然而，为了使肝移植作为常用医疗普及却存在诸如器官捐献者不足、费用高昂、组织相容性等诸多问题。因此，建立使用肝细胞或肝前体细胞的肝再生医疗方法成为当务之急。
另外，在制药研究领域，药剂的毒性试验中多使用实验动物。然而，可能由于人与动物的物种差异而导致体内的药代动力学不同，在使用实验动物的试验中不能充分评价药物的安全性，导致在临床试验阶段才报道肝毒性，进而导致药剂开发中止的情况屡见不鲜。因此，非常期待建立一种使用人肝细胞的体外药物毒性评价系统，以用于在制药研究的初期阶段预测人体内的药代动力学。
迄今为止已经建立了多个人肝细胞株，但其中大部分的药物代谢活性非常低，不具有充分的肝功能。HepaRG(注册商标)细胞(非专利文献1)能维持肝功能，但它来自肝癌，具有致瘤性，因此不适合用于肝再生医疗。另外，由于它是来自一个特定个体的细胞株，因此无法针对药物代谢及毒性的个体差异进行评价。另一方面，作为人原代培养肝细胞的稳定供应极为困难，其原因在于，原本作为原料的人肝脏的获取受限，加之传代培养会导致药物代谢活性丧失，并且仅能够在极短时间内维持肝功能。此外，还存在批次间差异非常大的问题。
因此，近年来，从ES细胞或iPS细胞分化诱导功能性肝细胞的方式备受关注，至今为止也报道了多种分化诱导方法(非专利文献2、非专利文献3)。然而，目前所报道的分化诱导方法均分化效率低，无法高收率且高重现性地制备具有充分肝功能的肝细胞。因此，仍然需要一种能够高效且稳定地制备具有充分药物代谢能力的肝细胞的方法、以及通过这种方法得到的功能性肝细胞。
另外，小肠上皮细胞也与肝细胞同样地表达药物转运蛋白及药物代谢酶，并对药物代谢起到重要作用。特别是，为了预测口服制剂的生物利用度并评价安全性，需要使用功能性小肠上皮细胞。然而，目前尚未建立一种能够高效且稳定地制备具有充分药物代谢能力的小肠上皮细胞的方法、以及通过这种方法得到的功能性小肠上皮细胞。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Aninat,C.et al.,Drug Metab.Dispos.,2006；34(1):75-83
非专利文献2：Soudais,C.et al.,Development,1995；121(11):3877-88
非专利文献3：Abe,K.et al.,Exp Cell Res.,1996；229(1):27-34
发明内容
发明想要解决的课题
本发明的目的在于，克服现有技术的诸多问题，提供一种高效且稳定地制备具有充分药物代谢能力的功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的方法。
用于解决课题的手段
本发明人等经过潜心研究发现：通过在抗生素存在下培养包含肝(前体)细胞或小肠上皮(前体)细胞的细胞群，能够制备具有充分药物代谢能力的肝(前体)细胞或小肠上皮(前体)细胞。
即，基于一种实施方式，本发明提供一种制备功能性肝前体细胞或功能性肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞的方法，其包括如下培养步骤：在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群(分离的细胞群)。
优选地，所述分离细胞群是来自肝组织或小肠上皮组织的原代培养物。
优选地，所述分离细胞群是从干细胞分化诱导而成的。
优选地，所述干细胞是胚胎干(ES)细胞。
优选地，所述干细胞是人工多能性干细胞(induced pluripotentstem cell：iPS细胞、诱导多能干细胞)。
优选地，所述iPS细胞来自健康个体。
优选地，所述iPS细胞来自药物性肝损害患者或药物性小肠损害患者。
优选地，所述抗生素选自由嘌呤霉素、杀稻瘟菌素S、G418、潮霉素、腐草霉素以及腐草霉素D1所构成的组。
优选地，所述抗生素是0.1μg/ml～100μg/ml的嘌呤霉素。
优选地，所述培养步骤在肝分化诱导因子的存在下进行。
优选地，所述肝分化诱导因子选自由细胞因子、细胞生长因子、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、ALK抑制剂以及细胞外基质所构成的组。
优选地，上述方法还包括在氨的存在下培养所述分离细胞群的步骤。
另外，基于一种实施方式，本发明提供基于上述方法所获得的功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞。
另外，基于一种实施方式，本发明提供包含功能性肝前体细胞的实质上均匀的分离细胞群，其中，所述功能性肝前体细胞中的CYP3A4的表达水平(表达量)与其在HepaRG(注册商标)细胞株的表达水平相比至少增大5倍。
优选地，所述功能性肝前体细胞以高于所述HepaRG(注册商标)细胞株的水平来表达选自由甲胎蛋白、白蛋白、CYP1A2以及CYP2B6所构成的组中的至少一种。
优选地，所述功能性肝前体细胞是CD44阳性和/或EpCAM阳性。
优选地，所述实质上均匀的分离细胞群被永生化。
另外，基于一种实施方式，本发明提供功能性肝前体细胞，其以保藏编号BP-02591和/或BP-02592保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心。
另外，基于一种实施方式，本发明提供治疗患有肝功能损害的对象的方法，其包括：将上述实质上均匀的分离细胞群给药于所述对象的步骤。
另外，基于一种实施方式，本发明还提供一种用于治疗肝功能损害的药物组合物，其包含上述实质上均匀的分离细胞群而成。
另外，基于一种实施方式，本发明提供一种供试化合物的毒性评价方法，其包括：(1)使通过将上述实质上均匀的分离细胞群或上述保藏的功能性肝前体细胞进行分化诱导而获得的功能性肝细胞与供试化合物接触的步骤；以及(2)分析所述功能性肝细胞的损害的程度的步骤。
发明效果
基于本发明的方法，仅仅通过在抗生素存在下培养包含肝(前体)细胞或小肠上皮(前体)细胞的分离细胞群，则能够容易且廉价并具有高重现性地制备具有充分药物代谢能力的功能性肝(前体)细胞或功能性小肠上皮(前体)细胞。另外，通过本发明的方法所得到的功能性肝(前体)细胞或功能性小肠上皮(前体)细胞对于再生医疗、药物毒性评价是有用的。
附图说明
图1是示出来自暴发性肝炎患者的iPS细胞(iPSC-K细胞)的相差显微镜图像的图；
图2是示出针对通过分化诱导iPSC-K细胞而获得的肝前体细胞进行(a)嘌呤霉素处理前以及(b)嘌呤霉素处理后的相差显微镜图像的图；
图3是示出通过分化诱导HepaSM细胞而获得的细胞的显微镜图像(苏木素-伊红染色)的图；
图4是示出通过分化诱导HepaSM细胞而获得的细胞的显微镜图像(右：明场；左：免疫染色(CYP3A4))的图；
图5是示出利用免疫细胞化学确认到的通过分化诱导HepaSM细胞而获得的细胞中的肝细胞标志物的表达的荧光显微镜图像的图；
图6是示出利用qRT-PCR针对通过分化诱导HepaSM细胞而获得的细胞中的肝细胞标志物的表达进行分析而得到的结果的图表；
图7是示出利用qRT-PCR针对通过分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞(puromycin(+))、HepaRG(注册商标)细胞(RG)、永生化后的成熟肝细胞(MN)、以及不利用嘌呤霉素进行选择即分化诱导而得到的肝细胞(YK)中的肝细胞标志物的表达进行分析而得到的结果的图表；
图8是示出利用qRT-PCR针对通过分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞进行利福平(rifampicin)处理或不进行利福平处理时的肝细胞标志物的表达进行分析而得到的结果的图表；
图9是示出利用免疫细胞化学针对通过分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞中的增殖细胞标志物的表达进行确认而得到的显微镜图像的图；
图10是示出利用各种抗生素针对通过分化诱导iPSC-K细胞而获得的肝前体细胞进行处理后的相差显微镜图像的图；
图11是示出利用各种抗生素针对通过分化诱导SEES5细胞而获得的肝前体细胞进行处理后的相差显微镜图像的图；
图12是示出针对通过分化诱导iPSC-O细胞或SEES5细胞而获得的肝前体细胞进行嘌呤霉素处理后再进行氨处理后的相差显微镜图像的图；
图13是示出利用qRT-PCR针对通过分化诱导iPSC-O细胞而获得的肝前体细胞进行嘌呤霉素处理及氨处理而获得的细胞中的代谢酶的表达所得到的结果的图表；
图14是示出针对通过分化诱导Edom-iPS细胞而获得的肠类器官进行嘌呤霉素处理前的相差显微镜图像的图；
图15是示出针对通过分化诱导Edom-iPS细胞而获得的肠类器官进行嘌呤霉素处理后的相差显微镜图像的图。
具体实施方式
下面，将对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于本说明书中所说明的实施方式。
基于第一实施方式，本发明是一种制备功能性肝前体细胞或功能性肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞的方法，其包括如下培养步骤：在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群。
在本实施方式中，“功能性肝前体细胞”表示具备分化为具有与体内的肝细胞同样的药物代谢能力的肝细胞的分化能力的细胞。另外，在本实施方式中，“功能性肝细胞”表示具有与体内的肝细胞同样的药物代谢能力的肝细胞。另外，在本实施方式中，“功能性小肠上皮前体细胞”表示具备分化为具有与体内的小肠上皮细胞同样的药物代谢能力的小肠上皮细胞的分化能力的细胞。另外，在本实施方式中，“功能性小肠上皮细胞”表示具有与体内的小肠上皮细胞同样的药物代谢能力的小肠上皮细胞。在此，细胞“具有药物代谢能力”表示细胞以足以显示药物代谢活性的量表达作为药物代谢酶的细胞色素P450，该细胞色素P450具体而言是选自由CYP3A4、CYP1A2以及CYP2B6所构成的组中的至少一种。需要指出的是，“肝细胞”可以同时包含成熟肝细胞及未成熟肝细胞。
在本实施方式中，“分离细胞群”表示从体内的细胞环境(例如组织等)中分离并通过在体外培养所得到的由多个细胞构成的群。
本实施方式中的分离细胞群可以是来自肝组织或小肠上皮组织的原代培养物。作为能够用于本实施方式的肝组织或小肠上皮组织可以来自任意脊椎动物，优选来自小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、山羊、猴、人等哺乳动物，特别优选来自人。另外，肝组织或小肠上皮组织可以是胎儿组织或成人组织中的任意一种。已经充分建立了来自肝组织的原代培养物的制备方法，能够按照本领域中公知的方法来制备(Cole,K.E.et al.,Cancer Res.,1986；46(3):1290-6；Adams R.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(美国国家科学院院刊),1992；89(19):8981-5)。来自小肠上皮组织的原代培养物也能够按照本领域中公知的方法来制备(Wang et al.,Nature(自然).,2015；522:173-178)。
另外，本实施方式中的分离细胞群可以从干细胞分化诱导而来。在本实施方式中，“干细胞”表示具有自我复制能力及分化能力的细胞。干细胞根据其分化能力分类为多能干细胞(多潜能干细胞)、单能性干细胞等，作为能够用于本实施方式的干细胞，只要是至少具有分化为肝细胞或小肠上皮细胞的分化能力的任意干细胞，均能够用于本实施方式的方法。另外，即使是原本会分化为脂肪细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞等，但不会分化为肝细胞或小肠上皮细胞的干细胞，若其能够通过后述的分化诱导步骤来获得分化为肝细胞或小肠上皮细胞的能力，则也能够用于本实施方式的方法。
作为能够用于本实施方式的方法的干细胞可以来自任意脊椎动物，优选来自小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、山羊、猴、人等哺乳动物，特别优选来自人。另外，作为能够用于本实施方式的干细胞可以由胚泡、胎儿组织、成人组织或脐带血中任意一种制备。用于制备干细胞的组织也不作特别限定，例如，能够从骨髓、肌肉、大脑、胰腺、肝脏、肾脏等制备干细胞。能够用于本实施方式的干细胞可以是胚胎干(ES)细胞、成体干细胞或人工多能性干(iPS)细胞中的任意一种，优选为ES细胞或iPS细胞。另外，iPS细胞可以来自健康个体，也可以来自药物性肝损害患者或药物性小肠损害患者。
ES细胞及iPS细胞的制备方法已经得到充分建立，并能够按照本领域中公知的方法来制备(Takahashi,K.et al.,Cell 2007；131(5):861-72,doi:10.1016/j.cell.2007.11.019)。或者，也可以从例如理研生物资源中心(RIKEN BRC)、ATCC(American Type Culture Collection：美国菌种保藏中心)等获得已经建立的ES细胞株或iPS细胞株。
作为用于使干细胞分化诱导为肝(前体)细胞或小肠上皮(前体)细胞的各种培养条件是公知的，可以通过适当选择这些条件来制备包含所需的分化度或成熟度的肝(前体)细胞或小肠上皮(前体)细胞的分离细胞群。例如，由干细胞形成类胚体，由此能够使干细胞分化诱导为肝(前体)细胞或小肠上皮(前体)细胞。作为形成类胚体的培养条件已经得到充分建立，例如，在不含分化抑制因子的培养基中悬浮培养干细胞1天～2周，由此能够形成类胚体。或者，例如，通过在添加有激活素A、FGF、BMP等体液因子(humoral factor)的分化诱导培养基中培养干细胞，由此能够使干细胞分化诱导为肝(前体)细胞。另外，例如，在添加有调节蛋白β1(Heregulinβ1)、IGF、bFGF等体液因子的分化诱导培养基中培养干细胞，由此能够使干细胞朝向小肠上皮(前体)细胞分化诱导。另外，也可以不使用体液因子，而是在细胞粘附区域和细胞非粘附区域被图案化的基材上接种干细胞，从而使其朝向肠类器官(肠道细胞器)分化诱导(日本特开2017-184749)。
作为用于使干细胞朝向肝(前体)细胞分化诱导的试剂盒在市面上有出售，可以使用这样的市售品。作为优选的市售品，例如，可列举Cellartis(注册商标)iPS细胞向肝细胞分化系统(iPS Cell to Hepatocyte Differentiation System)(Cellartis，Y30055)。
在本实施方式的方法中，在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群。其中，在本实施方式中，“抗生素”表示抑制细胞的存活及增殖(生长)的全部细胞毒性化合物。在本实施方式的方法中，在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群，由此使不能代谢抗生素的细胞死亡，从而能够仅选择能代谢抗生素的功能性肝前体细胞或功能性肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞。
作为本实施方式中的抗生素，能够使用除了细胞壁合成抑制剂以外的任意的抗生素，例如，能够使用细胞膜功能抑制剂、蛋白质合成抑制剂、核酸合成抑制剂、叶酸合成抑制剂等，可使用选自它们中的单独一种或者两种以上的组合。优选地，作为本实施方式中的抗生素，可使用通常为了选择具有外源基因的稳定转化体而采用的抗生素(所谓的“选择用抗生素”)。作为选择用抗生素，例如，可列举但不限定于这些：嘌呤霉素、杀稻瘟菌素S、G418(也称为Geneticin(商标))、潮霉素，以及博来霉素(bleomycin)、腐草霉素、以及腐草霉素D1(也称为Zeocin(商标))等来自博来霉素家族的抗生素等。能够用于本实施方式的方法的抗生素优选为嘌呤霉素。
在本实施方式的方法中，将包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群在添加有抗生素的培养基中培养一定时间。抗生素的浓度根据细胞的种类和/或抗生素的种类而有所不同，例如，能够设为0.1～5000μg/ml的范围。另外，培养时间根据抗生素的种类而有所不同，例如，能够培养1～10天。例如，在使以嘌呤霉素作为抗生素的情况下，优选在0.1μg/ml～100μg/ml的浓度下培养1～10天，特别优选在0.5～50μg/ml的浓度下培养1～5天。另外，优选地，例如，在使用腐草霉素作为抗生素的情况下，在20～100μg/ml的浓度下培养1～10天；在使用潮霉素作为抗生素的情况下，在20～2000μg/ml的浓度下培养1～10天；在使用杀稻瘟菌素S作为抗生素的情况下，在1～100μg/ml的浓度下培养1～10天；在使用腐草霉素D1作为抗生素的情况下，在20～2000μg/ml的浓度下培养1～10天；在使用G418作为抗生素的情况下，在50～5000μg/ml的浓度下培养1～10天。
作为能够用于本实施方式的方法中的培养基，例如，可列举DMEM、RPMI1640等基础培养基，能够使用选自其中的单独一种或混合使用两种以上。另外，在本实施方式的方法中，优选在1×106～1×108细胞(cells)/ml的浓度范围内接种包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群。
在通过本实施方式的方法制备功能性肝前体细胞或功能性肝细胞的情况下，优选适当向培养基中添加肝分化诱导因子。作为肝分化诱导因子，能够使用选自由细胞因子、细胞生长因子、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、ALK抑制剂以及细胞外基质所构成的组中的单独一种或者组合使用两种以上。作为细胞因子及细胞生长因子，例如，能够使用抑癌素M(2～200ng/ml左右)、肝细胞生长因子(HGF)(5～500ng/ml左右)、Wnt(10～1000ng/ml左右)、上皮细胞生长因子(EGF)(10～1000ng/ml左右)、R-脊椎蛋白1(10～1000ng/ml左右)、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)(50～5000ng/ml左右)、烟酰胺(1～100mM左右)、氢化可的松(40～4000ng/ml左右)等，但不限定于此。作为ROCK抑制剂，例如，可使用Y-27632(1～100μmol/ml左右)等。作为MAPK抑制剂，例如，可使用SB202190(0.5～50μM左右)等。作为ALK抑制剂，例如，可使用A81-01(10～1000ng/ml左右)等。
在通过本实施方式的方法制备功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞的情况下，优选适当向培养基中添加小肠上皮分化诱导因子。作为小肠上皮分化诱导因子，能够使用选自由细胞因子、细胞生长因子、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、ALK抑制剂以及细胞外基质所构成的组中的单独一种或者组合使用两种以上。作为细胞因子及细胞生长因子，例如，能够使用抑癌素M(2～200ng/ml左右)、Wnt(10～1000ng/ml左右)、上皮细胞生长因子(EGF)(10～1000ng/ml左右)、R-脊椎蛋白1(10～1000ng/ml左右)、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)(50～5000ng/ml左右)、烟酰胺(1～100mM左右)、氢化可的松(40～4000ng/ml左右)等，但不限定于此。作为ROCK抑制剂，例如，可使用Y-27632(1～100μmol/ml左右)等。作为MAPK抑制剂，例如，可使用SB202190(0.5～50μM左右)等。作为ALK抑制剂，例如，可使用A81-01(10～1000ng/ml左右)等。
本实施方式的方法中的培养可以通过粘附培养法进行，也可以通过悬浮培养法进行，优选通过粘附培养法进行。优选地，粘附培养中能够使用由层粘连蛋白、胶原、明胶、纤连蛋白、基质胶等细胞外基质或者由小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)等饲养细胞所包覆的板等。本实施方式的方法中的培养条件能够根据所用干细胞种类来适当设置，例如，若是来自哺乳动物的干细胞，则优选在37℃、5％CO2条件下培养。
本实施方式的方法可以进一步包括在氨存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群的步骤。具体而言，在添加有抗生素的培养基中培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群一定时间即可。氨的浓度例如可以在5～15mg/ml的范围。另外，培养时间例如为1～10天，优选培养1～5天。
需要指出的是，在本实施方式的方法中，在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群的步骤与在氨存在下培养相同分离细胞群的步骤能够依次或同时进行。例如，可以在抗生素存在下培养分离细胞群一定时间之后，更换为添加有氨的培养基培养一定时间；也可以在氨存在下培养分离细胞群一定时间之后，更换为添加抗生素有的培养基培养一定时间；还可以在添加有抗生素及氨两者的培养基中培养一定时间。
基于本实施方式的方法，仅仅通过在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群，则可以制备具有充分药物代谢能力的功能性肝细胞或功能性小肠上皮细胞或者它们的前体细胞。
基于第二实施方式，本发明是一种通过上述方法获得的功能性肝前体细胞或功能性肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞。
本实施方式中的“功能性肝前体细胞”、“功能性肝细胞”、“功能性小肠上皮前体细胞”以及“功能性小肠上皮细胞”与第一实施方式中定义的细胞相同。因此，能够通过选自由CYP3A4、CYP1A2以及CYP2B6所构成的组中的至少一种细胞色素P450的表达来确认通过上述方法获得的细胞是否是功能性肝前体细胞或功能性肝细胞、或者是功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞，特别是能够通过CYP3A4的显著表达来确认。
即，基于第三实施方式，本发明是一种包含功能性肝前体细胞的实质上均匀的分离细胞群，其中，CYP3A4在所述功能性肝前体细胞中的表达水平与其在HepaRG(注册商标)细胞株中的表达水平相比至少增大5倍。
本实施方式中的“功能性肝前体细胞”以及“分离细胞群”与第一实施方式中定义的相同。
在本实施方式中，分离细胞群“实质上均匀”表示分离细胞群处于至少以90％的比例包含目标细胞的状态。因此，本实施方式的分离细胞群至少以90％、优选95％以上、特别优选99％以上的比例包含功能性肝前体细胞。下面，在本说明书中，将包含功能性肝前体细胞的实质上均匀的分离细胞群记作“功能性肝前体细胞群”。
对于本实施方式的功能性肝前体细胞群中所含的肝前体细胞是否是功能性肝前体细胞，能够以CYP3A4的显著表达为标准来判断。本实施方式的功能性肝前体细胞群中的CYP3A4的表达水平与其在HepaRG(注册商标)细胞株中的表达水平相比增大至少5倍、优选20倍以上、特别优选100倍以上。CYP3A4及以下记载的标志物的表达水平能够通过定量RT-PCR或免疫印迹等公知的方式来定量分析。
优选地，本实施方式的功能性肝前体细胞群中的功能性肝前体细胞以比HepaRG(注册商标)细胞株更高的水平表达CYP3A4、以及选自由作为肝前体细胞/未熟肝细胞标志物的甲胎蛋白、作为未熟肝细胞/成熟肝细胞标志物的白蛋白、CYP1A2以及CYP2B6所构成的组中的至少一种。而且，本实施方式的功能性肝前体细胞群中的功能性肝前体细胞以比HepaRG(注册商标)细胞株更高的水平表达鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)和/或氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)，其中，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)是构成代谢氨的尿素循环的酶。更优选地，针对作为肝前体细胞/未熟肝细胞标志物的CD44及EpCAM(CD326)的任一者或两者，本实施方式的功能性肝前体细胞群中所含的功能性肝前体细胞还可以是阳性。
本实施方式的功能性肝前体细胞群可通过第一实施方式中的方法来制备。此外，作为本实施方式的功能性肝前体细胞群，为了进一步提高其中所含的功能性肝前体细胞的比例，可以从通过第一实施方式的方法得到的细胞群中采集表达肝前体细胞/未熟肝细胞的细胞表面标志物的细胞。作为优选的肝前体细胞/未熟肝细胞的细胞表面标志物，例如，可列举：CD44、EpCAM(CD326)、羧肽酶M(CPM)、CD133、CD13等。上述标志物阳性细胞的采集能够通过荧光活性细胞分离(FACS)或磁性细胞分离(MACS)等公知的方式来进行。
本实施方式的功能性肝前体细胞群可以任选被永生化。其中，细胞“被永生化”表示细胞在重复一定次数分裂后仍保持可增殖状态，即，细胞具有无限增殖能力。目前已经建立了使细胞永生化的方法，能够采用公知的方式。例如，将端粒酶逆转录酶(TERT)基因等永生化基因通过逆转录病毒载体导入细胞中，由此能够使细胞永生化。
如上所述那样得到的功能性肝前体细胞被命名为HepaSM及HepaNS，并以保藏编号BP-02591及BP-02592保藏于作为国际保藏机构的(日本)独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(旧称：(日本)独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(保藏日期为2017年12月6日，受理号为AP-02591及AP-02592)。
第二实施方式中的功能性肝前体细胞及功能性肝细胞、以及第三实施方式中的功能性肝前体细胞群对于肝病的治疗、药物代谢毒性试验是有用的。
基于第四实施方式，本发明是一种治疗患有肝功能损害的对象的方法，其包括：将上述功能性肝前体细胞群给药于所述对象的步骤。
在本实施方式中，“治疗”不仅包含完全治愈对象的肝功能损害，还包含缓解肝功能损害的症状、减轻病症或者延迟或停止病情恶化。
本实施方式中的“对象”可以是任意脊椎动物，优选为小鼠、大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、山羊、猴、人等哺乳动物，特别优选人。对象可以是任意年龄，包括婴幼儿、少年、青年、成人及老人对象。
作为本实施方式中的“肝功能损害”，例如，可列举但不限定于这些：肝炎、肝硬化、肝癌、先天性代谢异常、急性肝衰竭(暴发性肝炎)、慢性肝衰竭等。
本实施方式的方法能够通过向患有肝功能损害的对象给药上述功能性肝前体细胞群来进行。其中，给药的功能性肝前体细胞群可以与对象异源、同源或者来自其本身。另外，在本实施方式中，功能性肝前体细胞群可以是任选被基因重组的细胞群。例如，能够从先天性代谢异常的患者中制备iPS细胞，向分化诱导该iPS细胞而获得的功能性肝前体细胞群中导入与引发疾患的异常基因相对应的正常基因，并向所述患者给药。
在本实施方式中，能够通过例如注射、注入、移植等适当的方法给药功能性肝前体细胞群。优选地，功能性肝前体细胞群能够注入对象的门静脉内。在将功能性肝前体细胞群注入门静脉内的情况下，将例如使用磷酸盐缓冲生理盐水等制备的细胞悬浮液(1×106细胞/ml)以约2ml/分钟的速度注入门静脉内即可。其中，功能性肝前体细胞群的给药量可以根据对象的年龄、体重、肝功能损害的严重程度等而有所不同，例如，可以是1×105～1×1010细胞/kg(体重)，优选为1×106～1×108细胞/kg(体重)。另外，所述给药量可以一次给药，也可以分多次给药。
基于第五实施方式，本发明是一种用于治疗肝功能损害的药物组合物，其包含上述功能性肝前体细胞群而成。
本实施方式中的“肝功能损害”以及“治疗”与第四实施方式中定义的相同。
本实施方式的药物组合物含有上述功能性肝前体细胞群作为有效成分。本实施方式的药物组合物可以仅由有效成分构成，但还可以包含药学上可接受的公知的载体、缓冲剂以及其它成分(例如肝细胞生长因子)等作为任选成分。例如，使用能够保持作为有效成分的细胞存活的磷酸盐缓冲生理盐水等载体，作为注射剂型而制备本实施方式的药物组合物。本实施方式的药物组合物的给药方法及给药量与第四实施方式中的记载相同。
第四实施方式中的方法以及第五实施方式中的药物组合物对于肝功能损害的根治性治疗是有用的。
基于第六实施方式，本发明是一种供试化合物的毒性评价方法，其包括：(1)使通过分化诱导上述功能性肝前体细胞群或保藏的功能性肝前体细胞所获得的功能性肝细胞与供试化合物进行接触步骤；以及(2)分析所述功能性肝细胞的损害的程度的步骤。
本实施方式的毒性评价方法使用通过分化诱导上述功能性肝前体细胞群或保藏的功能性肝前体细胞所获得的功能性肝细胞。如第一实施方式中所述，用于使肝前体细胞分化诱导为肝细胞的培养条件是公知的，可通过适当的培养条件得到所需分化度/成熟度的功能性肝细胞。
在本实施方式的毒性评价方法中，使功能性肝细胞与供试化合物接触。对于供试化合物不作特别限定，例如，可列举：药物等合成化合物、细胞提取物等天然化合物等。另外，这些供试化合物可以是新型物质，也可以是公知物质。
作为功能性肝细胞与供试化合物的接触，例如，能够通过向培养功能性肝细胞的培养基或磷酸盐缓冲生理盐水、Tris-HCl缓冲液等缓冲液中添加供试化合物，并在其中孵育细胞一定时间来进行。所添加的供试化合物的浓度根据化合物的种类而有所不同，例如，能够在20nM～500μM的范围内适当选择。孵育时间可以优选为24～48小时。
接着，分析所述功能性肝细胞的损害的程度。例如，可通过测定功能性肝细胞的存活率、以及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等肝损害标志物向细胞外的漏出量等来分析功能性肝细胞的损害的程度。当细胞的存活率与接触供试化合物之前相比显著降低或者当肝损害标志物向细胞外的漏出量显著增加的情况下，可以评价该供试化合物具有肝毒性，不能用作药物。另一方面，当细胞的存活率与接触供试化合物之前相比相同程度或更高，或者当肝损害标志物向细胞外的漏出量相同程度或更低的情况下，可以评价该供试化合物不具有肝毒性，有望用作药物。
本实施方式的方法对于药物的候选化合物的筛选是有用的。
实施例
下面，例举实施例进一步对本发明进行说明。需要指出的是，这些实施例对本发明没有任何限定。
<1.制作来自暴发性肝炎患者的iPS细胞>
通过下面的步骤由暴发性肝炎患者的成纤维细胞制作iPS细胞。通过活检从暴发性肝炎患者(0岁7个月的男性)获得皮肤并培养该皮肤，从而得到成纤维细胞。使用仙台病毒载体向得到的成纤维细胞中导入Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的人基因。然后，培养2周，确认出现穹顶状的细胞集落。分离所出现的细胞集落并将其转移至MEF饲养细胞上，在hiPS培养基(组成如下所述)中传代培养。
表1.hiPS培养基的组成
敲除DMEM 赛默飞世尔科技(公司) 10829-018 380ml
敲除SR 赛默飞世尔科技 10828-028 100ml
GlutaMAX Gibco 35050-061 5ml
Pen Strep Gibco 15140-122 5ml
MEM NEAA Gibco 11140-050 5ml
丙酮酸钠 Gibco 11360-070 5ml
2-巯基乙醇 Gibco 21985-023 500μl
bFGF Invitrogen PHG0023 500μl
将结果示于图1。确认通过传代培养形成了与人ES细胞及已建立的iPS细胞相同的轮廓清晰且扁平的细胞集落，这表明得到了来自暴发性肝炎患者的iPS细胞。下面，将该iPS细胞记作“iPSC-K细胞”。
另外，通过与上述相同的步骤由其它暴发性肝炎患者的成纤维细胞制作iPS细胞。下面，将该iPS细胞记作“iPSC-O细胞”。
<2.制备功能性肝前体细胞>
(2-1.形成类胚体(EB))
将上述iPSC-K细胞培养至其约80％融合。去除培养基并通过PBS清洗，然后，添加StemPro Accutase(赛默飞世尔科技：Thermo Fisher Scientific)，在10～20分钟、37℃、5％CO2条件下孵育。轻轻叩击培养皿剥下细胞集落之后，加入hiPS培养基使其悬浮。将得到的细胞悬浮液转移至被明胶所包覆的培养皿中，在15分钟、37℃、5％CO2条件下孵育，由此去除饲养细胞。离心分离上清，将所回收的iPSC-K细胞悬浮于EB培养基(组成如下所述)。以1×106细胞/孔的浓度向用于悬浮培养的96孔板(赛默飞世尔科技，174929)上接种iPSC-K细胞，并在37℃、5％CO2条件下培养10天，形成类胚体(下面，记作“EB”)。
表2.EB培养基的组成
敲除DMEM 赛默飞世尔科技 10829-018 380ml
敲除SR 赛默飞世尔科技 10828-028 100ml
GlutaMAX Gibco 35050-061 5ml
Pen Strep Gibco 15140-122 5ml
MEM NEAA Gibco 11140-050 5ml
丙酮酸钠 Gibco 11360-070 5ml
2-巯基乙醇 Gibco 21985-023 250μl
(2-2.从EB分化诱导为功能性肝前体细胞)
回收EB并将其悬浮于XF32培养基(Uchida,H.et al.,JCI Insight.,2017；2(1):e86492,doi:10.1172/jci.insight.86492)。以20EBs/孔的浓度将EB接种于胶原包覆的24孔板，在37℃、5％CO2下进行粘附培养35天，由此分化诱导为肝前体细胞。然后，使用添加有3μg/ml的嘌呤霉素(Wako，#160-23151)的改性SCM-6F8培养基(Wang,X.et al.,Nature,2015；522(7555):173-8.,doi:10.1038/nature14484.,Epub 2015Jun 3)继续培养2天。
表3.XF32培养基的组成
敲除DMEM 赛默飞世尔科技 10829-018 405ml
CTS敲除SR XenoFree 赛默飞世尔科技 10828-013 75ml
GlutaMAX Gibco 35050-061 5ml
Pen Strep Gibco 15140-122 5ml
MEM NEAA Gibco 11140-050 5ml
丙酮酸钠 Gibco 11360-070 5ml
bFGF Invitrogen PHG0023 1ml(10ng/ml)
IGF Sigma I1271 100μl(10μg/100μl)
Heleglinβ Wako 080-09001 50μl(5μg/50μl)
L-抗坏血酸 Sigma A4544 500μl(50μg/ml)
将结果示于图2。通过在嘌呤霉素存在下培养粘附培养EB而得到的细胞(图2(a))得到了细胞的集落(图2(b))。增殖培养被该嘌呤霉素选择后的集落而得到的功能性肝前体细胞命名为“HepaNS”，以保藏编号BP-02592保藏于作为国际保藏机构的(日本)独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(保藏日期为2017年12月6日，受理号为AP-02592)。
(2-3.功能性肝前体细胞永生化)
接下来，将人端粒酶逆转录酶(TERT)基因、突变人CDK4(CDK4R24C)基因、以及人细胞周期素D1基因导入上述得到的功能性肝前体细胞中使其永生化。分别使用慢病毒属载体CSII-CMV-hTERT、CSII-TRE-Tight-hCDK4R24C、以及CSII-TRE-Tight-cyclin D1，按照“PLoS One,2012；7(1):e29677.,doi:10.1371/journal.pone.0029677.,Epub 2012Jan19.”中记载的步骤来导入上述基因。对所得到的永生化功能性肝前体细胞命名为“HepaSM”，以保藏编号BP-02591保藏于作为国际保藏机构的(日本)独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(保藏日期为2017年12月6日，受理号为AP-02591)。
使用改性SCM-6F8培养基，在37℃、5％CO2条件下培养HepaSM细胞7天，由此分化诱导为肝细胞。针对得到的肝细胞进行下面的分析。
<3.从功能性肝前体细胞分化诱导而来的肝细胞的分析>
针对通过分化诱导HepaSM细胞而获得的细胞进行苏木素-伊红染色以及利用肝细胞标志物的免疫染色。利用肝细胞标志物的免疫染色通过下面的步骤来进行。去除培养基，加入4％多聚甲醛溶液，在4℃下将细胞固定10分钟。去除溶液后，加入0.1％Triron-X(Nacalai Tesque)溶液，并在室温对细胞进行渗透处理10分钟。去除溶液后，加入即用型无血清蛋白质组件(Protein Block Serum-Free Ready-to-use)(Dako，X0909)，并在室温下进行封闭处理30分钟。作为一抗，使用抗CYP3A4抗体(C-17)(SANTACLUZ BIOTECHNOLOGY(圣克鲁斯生物技术)，sc-27639)(1/1000稀释)、抗白蛋白抗体(CEDARLANE公司，CLFAG2140)(1/50稀释)或抗甲胎蛋白(AFP)抗体(B&D SYSTEM，MAB1368)(1/100稀释)，在4℃下反应过夜。作为二抗，分别使用兔抗山羊IgG(H+L)交叉吸附二抗(Rabbit anti-Goat IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody)、Alexa Fluor 488(赛默飞世尔科技，A11078)、GFPTag Polyclonal Antibody、Alexa Fluor 488(赛默飞世尔科技，A21311)或山羊抗小鼠IgG1交叉吸附二抗(Goat anti-Mouse IgG1 Cross-Adsorbed Secondary Antibody)、Alexa Fluor 546(赛默飞世尔科技，A21123)(均1/1000稀释)，在室温下反应30分钟。
将结果示于图3～5。由苏木素-伊红染色的结果确认，分化诱导HepaSM细胞而获得的细胞呈现出肝细胞的形态(图3)。另外，由免疫染色的结果还确认到：通过分化诱导HepaSM细胞所获得的细胞表达了作为肝细胞标志物的CYP3A4、白蛋白(ALB)以及甲胎蛋白(AFP)(图4、5)。该结果表明，HepaSM细胞为肝前体细胞。
接着，通过定量RT-PCR(qRT-PCR)分析了通过分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞中的CYP3A4、白蛋白及甲胎蛋白的表达水平。使用RNeasy Micro Kit(Qiagen，74004)，按照试剂盒附带的规程(方案)，从分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞中提取总RNA(totalRNA)。使用RT-PCR用SuperScript III第一链合成系统(SuperScript III First-StrandSynthesis System for RT-PCR)(赛默飞世尔科技)，按照试剂盒附带的规程，逆转录1μg的总RNA，从而制备cDNA。将得到的cDNA保存在-20℃下。
将得到的cDNA作为模板，使用下述的引物组进行qRT-PCR。qRT-PCR反应使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(赛默飞世尔科技)并按照试剂盒附带的规程来进行。PCR反应条件如下：50℃下2分钟×1循环、95℃下2分钟×1循环、(95℃下15秒、60℃下30秒)×40循环、95℃下15秒×1循环、60℃下15秒×1循环、95℃下15秒×1循环、50℃下2分钟×1循环。通过Quant Studio 12K Flex(Applied Biosystems)进行测定，利用装置内置的分析软件进行自动分析，由此算出各个基因的Ct值，并通过作为内标基因的泛素的表达水平进行校正。另外，作为对照，使用不施行分化诱导及嘌呤霉素存在下的选择并经历相同程度期间的传代培养而获得的未分化iPSC-K细胞。
表4.qRT-PCR中使用的引物组(1)
基因 正向和反向引物(5'→3') 序列号
AFP AGCTTGGTGGTGGATGAAAC 1
CCCTCTTCAGCAAAGCAGAC 2
ALB TGGCACAATGAAGTGGGTAA 3
CTGAGCAAAGGCAATCAACA 4
CYP1A2 CAATCAGGTGGTGGTGTCAG 5
GCTCCTGGACTGTTTTCTGC 6
CYP2B6 TCCTTTCTGAGGTTCCGAGA 7
TCCCGAAGTCCCTCATAGTG 8
CYP3A4 CAAGACCCCTTTGTGGAAAA 9
CGAGGCGACTTTCTTTCATC 10
UBIQUITIN GGAGCCGAGTGACACCATTG 11
CAGGGTACGACCATCTTCCAG 12
将结果示于图6。确认在分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞(puromycin(+))中甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)及CYP3A4的表达水平均升高。上面的结果表明，HepaSM细胞能够分化为高水平表达CYP3A4的肝细胞，即HepaSM细胞是功能性肝前体细胞。
接着，将分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞中的肝细胞标志物的表达水平与HepaRG(注册商标)细胞(由Life Technologies公司获得)、与除未添加嘌呤霉素之外通过与上述2-2相同的步骤分化诱导而得到的肝细胞、以及永生化后的成熟肝细胞中的肝细胞标志物的表达水平进行比较。按照与上述相同的步骤，通过qRT-PCR对各个肝细胞中的甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4的表达水平进行定量。需要指出的是，通过与上述相同的步骤使按照“Alexandrova,K.,et al.；Large-Scale Isolation of HumanHepatocytes for Therapeutic Application,Cell Transplantation,2005；14(10):845-853”中记载的步骤分离及原代培养而成的肝细胞永生化，从而制作永生化的成熟肝细胞。
将结果示于图7。确认分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞(图中，记作“puromycin(+)”)表达甲胎蛋白(AFP)、CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4。特别是，与HepaRG(注册商标)细胞(图中，记作“RG”)、永生化的成熟肝细胞(图中，记作“MN”)或未通过嘌呤霉素进行选择即分化诱导而得到的肝细胞(图中，记作“YK”)相比，，分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞以显著较高的水平表达CYP3A4。该结果表明，HepaSM细胞为稳定的功能性肝前体细胞。
另外，针对通过分化诱导HepaNS细胞而获得的肝细胞，同样地定量肝细胞标志物的表达水平，结果确认，其与分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞相同，以显著较高的水平表达CYP3A4(数据省略)。该结果表明，HepaNS细胞也同样是稳定的功能性肝前体细胞。
<4.功能性肝前体细胞中的药物代谢酶诱导>
针对通过分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞，进行基于细胞色素P450的表达的药物代谢酶诱导试验(Khuu,D.N.et al.；In Vitro Differentiated Adult Human LiverProgenitor Cells Display Mature Hepatic Metabolic Functions:APotential Toolfor In Vitro Pharmacotoxicological Testing,Cell Transplantation.,2011；20(2):287-302)。将利福平(溶剂：DMSO)加入改性SCM-6F8培养基中，使其最终浓度为20μM，培养2天后，按照与上述3.部分相同的步骤，通过qRT-PCR对CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4的表达水平进行定量。另外，使用添加等量的DMSO来代替利福平的培养基并同样地操作，从而制备细胞(图中，记作“RFP(-)”)，并将该细胞作为对照。
将结果示于图8。在分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞(图中，记作“RFP(+)”)中，CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4的细胞色素P450的表达水平均因利福平处理而显著增加。特别是确认了相比于HepaRG(注册商标)细胞(图中，记作“RG”)、永生化的成熟肝细胞(图中，记作“MN”)或未通过嘌呤霉素进行选择即分化诱导而得到的肝细胞(图中，记作“YK”)，分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞诱导了显著较高的CYP3A4的表达。该结果表明，分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞能够用于药物的毒性试验，其中，该药物的毒性试验依据FDA的非临床药代动力学相互作用试验指南(Drug Interaction Studies-Study Design,DataAnalysis,Implications for Dosing,and Labeling Recommendations,2012)，并利用体外酶诱导。
另外，针对通过分化诱导HepaNS细胞而获得的肝细胞，同样地进行药物代谢酶诱导试验，结果确认，与分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞相同，其也诱导了显著较高的CYP3A4的表达(数据省略)。该结果表明，分化诱导HepaNS细胞而获得的肝细胞也同样能够用于药物的毒性试验，其中该药物的毒性试验依据FDA的非临床药代动力学相互作用试验指南，并利用体外酶诱导。
<5.分化诱导功能性肝前体细胞而获得的肝细胞的增殖能力评价>
基于增殖细胞标志物Ki67及PCNA的表达来评价分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞的增殖能力。通过石蜡包埋固定细胞之后，进行脱石蜡处理，并用PBS清洗。然后，加入2.5％山羊血清/PBS，在室温下进行30分钟封闭处理。作为一抗使用抗Ki67抗体(DAKO，PC10)或抗PCNA抗体(DAKO，MIB-1)(均1/200稀释)，在室温下反应1小时。二抗反应及DAB显色使用ImmPRESS抗小鼠IgG试剂盒(ImmPRESS Anti-Mouse IgG Kit)(Vector Labs公司)进行。用水清洗后，进行苏木素-伊红染色，利用显微镜观察所得到的标本。
将结果示于图9。表明分化诱导HepaSM细胞而获得的肝细胞表达了增殖细胞标志物PCNA(图9(a))及Ki67(图9(b))。另外，确认分化诱导HepaNS细胞而获得的肝细胞也同样表达了Ki67及PCNA的增殖细胞标志物(数据省略)。此外，还确认HepaSM细胞与HepaNS细胞均具有较高的增殖能力，能够培养超过6个月。
<6.利用各种抗生素进行的功能性肝前体细胞的制备(1)>
除了使用各种抗生素代替嘌呤霉素之外，通过与上述(2-1)及(2-2)相同的步骤由iPSC-K细胞制备功能性肝前体细胞。所使用的抗生素及其浓度、以及培养天数如下所示。
表5.抗生素及培养条件(由iPSC-K细胞制备功能性肝前体细胞)
抗生素 产品信息 浓度 培养时间
腐草霉素 InvivoGen,ant-ph-1 80μg/ml 3天
潮霉素 InvivoGen,ant-hg-1 20μg/ml 6天
杀稻瘟菌素S InvivoGen,ant-bl-1 1μg/ml 3天
Zeocin(商标) InvivoGen,ant-zn-1 600μg/ml 6天
G418 InvivoGen,ant-gn-1 300μg/ml 3天
将结果示于图10。在使用(a)腐草霉素、(b)潮霉素、(c)杀稻瘟菌素S、(d)Zeocin(商标)、以及(e)G418中任意抗生素的情况下，均得到了细胞的集落。
<7.利用各种抗生素进行的功能性肝前体细胞的制备(2)>
通过下面的步骤，由作为人ES细胞的SEES5细胞(Akutsu,H.et al.,Regen.Ther.,2015；1:18-29,doi:10.1016/j.reth.2014.12.004)制备功能性肝前体细胞。除了使用Essential8培养基(Gibco)代替hiPS培养基之外，通过与上述(2-1)相同的步骤形成EB。回收EB并使其悬浮于XF32培养基。以20EBs/孔的浓度将EB接种于胶原包覆的24孔板，在37℃、5％CO2下进行10天粘附培养。然后，更换为HD培养基(由从XF32培养基中仅去除bFGF后的组成构成)培养10天，再更换为改性SCM-6F8培养基培养7天。然后，更换为添加有各种抗生素的改性SCM-6F8培养基。所使用的抗生素及其浓度、以及培养天数如下所示。
表6.抗生素及培养条件(由SEES5细胞制备功能性肝前体细胞)
抗生素 产品信息 浓度 培养时间
腐草霉素 InvivoGen,ant-ph-1 40μg/ml 3天
潮霉素 InvivoGen,ant-hg-1 100μg/ml 3天
杀稻瘟菌素S InvivoGen,ant-bl-1 10μg/ml 3天
Zeocin(商标) InvivoGen,ant-zn-1 1000μg/ml 3天
G418 InvivoGen,ant-gn-1 200μg/ml 3天
嘌呤霉素 Wako,160-23151 5μg/ml 3天
将结果示于图11。在使用(a)腐草霉素、(b)潮霉素、(c)杀稻瘟菌素S、(d)Zeocin(商标)、(e)G418、以及(f)嘌呤霉素中的任意抗生素的情况下，均得到了细胞的集落。另外还确认，这些细胞也均以显著较高的水平表达了CYP3A4，它们是功能性肝前体细胞(数据省略)。
<8.利用氨进行的功能性肝前体细胞的制备>
除了使用iPSC-O细胞代替iPSC-K细胞之外，通过与上述(2-1)及(2-2)相同的步骤，由iPSC-O细胞制备通过嘌呤霉素选择后的功能性肝前体细胞；针对该功能性肝前体细胞以及上述7中由SEES5细胞制备的通过嘌呤霉素选择后的功能性肝前体细胞，通过下面的步骤利用氨进一步进行选择培养。从由iPSC-O细胞制备的功能性肝前体细胞或由SEES5细胞制备的功能性肝前体细胞的培养物(10cm培养皿)中去除培养基，并通过5ml的D-PBS(Gibco)清洗。然后，向各个培养物中加入添加有5mg/ml的氨的改性SCM-6F8培养基或添加有8mg/ml的氨的改性SCM-6F8培养基10ml，并在37℃、5％CO2条件下培养2天。然后，去除培养基，通过5ml的D-PBS(Gibco)清洗，并添加10ml新的改性SCM-6F8培养基。
将利用氨进行选择培养后的由iPSC-O细胞制备的功能性肝前体细胞的培养物示于图12(a)，由SEES5细胞制备的功能性肝前体细胞的培养物示于图12(b)。培养物中均形成了集落。
接下来，对通过氨选择后的来自iPSC-O细胞的功能性肝前体细胞的集落进行增殖培养，在改性SCM-6F8培养基中，在37℃、5％CO2条件下培养7天，从而分化诱导为肝细胞。针对得到的肝细胞，按照与上述3相同的步骤，通过qRT-PCR针对甲胎蛋白、CYP3A4、氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)及鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的表达水平进行定量。另外，通过不施行在氨存在下的选择并且针对经历同等程度时间的传代培养而得到的来自iPSC-O细胞的功能性肝前体细胞进行分化诱导，将由此获得的肝细胞作为对照来使用。
表7.qRT-PCR中使用的引物组(2)
基因 正向和反向引物(5'→3') 序列号
CPS1 CAAGTTTTGCAGTGGAATCG 13
GGACAGATGCCTGAGCCTAA 14
OCT TTTCCAAGGTTACCAGGTTACAA 15
CTGGGCAAGCAGTGTAAAAAT 16
将结果示于图13。由此确认到：在分化诱导通过氨选择的功能性肝前体细胞而获得的肝细胞(NH3(+))中，氨代谢酶CPS1及OTC的表达水平均升高(图13(c)及(d))。另外还确认：CYP3A4的表达水平也通过利用氨进行选择而进一步升高(图13(b))。由上述结果表明，通过除利用抗生素进行选择之外还利用氨进行选择，可以制备具有优异的药物代谢能力及氨代谢能力的功能性肝细胞。
<9.功能性小肠上皮前体细胞的制备>
按照“Uchida,H.et al.,JCI Insight.,2017；2(1):e86492”中记载的步骤，由来自经血的iPS细胞Edom-iPS细胞(PLoS Genet.,2011；7(5):e1002085,doi.org/10.1371/journal.pgen.1002085)制备肠类器官。将经过3个月后的肠类器官在2mg/ml或400mg/ml的嘌呤霉素的存在下培养2天。
将嘌呤霉素处理前的肠类器官示于图14，处理后的肠类器官示于图15。在2mg/ml的嘌呤霉素(图15(a))或400mg/ml的嘌呤霉素(图15(b))的存在下进行培养，由此得到了具有药物代谢能力的功能性小肠上皮前体细胞。
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序列表
<110> （日本）国立研究开发法人国立成育医疗研究中心
<120> 一种制备功能性肝前体细胞或肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的方法
<130> 3008-PCT
<150> JP 2017-251725
<151> 2017-12-27
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AFP F-引物
<400> 1
agcttggtgg tggatgaaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> AFP R-引物
<400> 2
ccctcttcag caaagcagac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ALB F-引物
<400> 3
tggcacaatg aagtgggtaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ALB R-引物
<400> 4
ctgagcaaag gcaatcaaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CYP1A2 F-引物
<400> 5
caatcaggtg gtggtgtcag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CYP1A2 R-引物
<400> 6
gctcctggac tgttttctgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CYP2B6 F-引物
<400> 7
tcctttctga ggttccgaga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CYP2B6 R-引物
<400> 8
tcccgaagtc cctcatagtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CYP3A4 F-引物
<400> 9
caagacccct ttgtggaaaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CYP3A4 R-引物
<400> 10
cgaggcgact ttctttcatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> UBI F-引物
<400> 11
ggagccgagt gacaccattg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> UBI R-引物
<400> 12
cagggtacga ccatcttcca g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CPS1 F-引物
<400> 13
caagttttgc agtggaatcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CPS1 R-引物
<400> 14
ggacagatgc ctgagcctaa 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OCT F-引物
<400> 15
tttccaaggt taccaggtta caa 23
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OCT R-引物
<400> 16
ctgggcaagc agtgtaaaaa t 21

Claims (17)

1.一种制备功能性肝前体细胞或功能性肝细胞或者功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞的方法，其包括如下培养步骤：在抗生素存在下培养包含肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞的分离细胞群，
其中所述抗生素是0.1μg/ml～100μg/ml的嘌呤霉素，
所述培养步骤在分化诱导因子的存在下进行，
其中，所述分化诱导因子选自由细胞因子、细胞生长因子、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、ALK抑制剂以及细胞外基质所构成的组，
其中所述肝前体细胞或肝细胞或者小肠上皮前体细胞或小肠上皮细胞不包含所述抗生素的抗性基因。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离细胞群是来自肝组织或小肠上皮组织的原代培养物。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离细胞群是从干细胞分化诱导而成的。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述干细胞是胚胎干细胞（ES细胞）。
5.如权利要求3所述的方法，其中，所述干细胞是人工多能性干细胞（iPS细胞）。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述iPS细胞来自健康个体。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述iPS细胞来自药物性肝损害患者或药物性小肠损害患者。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其还包括在氨的存在下培养所述分离细胞群的步骤。
9.一种功能性肝前体细胞或功能性肝细胞，其通过权利要求1～8中任一项所述的方法来获得。
10.一种功能性小肠上皮前体细胞或功能性小肠上皮细胞，其通过权利要求1～8中任一项所述的方法来获得。
11.一种包含功能性肝前体细胞的实质上均匀的分离细胞群，其中，所述功能性肝前体细胞由权利要求1～8中任一项所述的方法来获得，CYP3A4在所述功能性肝前体细胞中的表达水平与其在HepaRG（注册商标）细胞株中的表达水平相比至少增大5倍，所述实质上均匀的分离细胞群至少以90%的比例包含功能性肝前体细胞。
12.如权利要求11所述的分离细胞群，其中，所述功能性肝前体细胞以高于所述HepaRG（注册商标）细胞株的水平来表达选自由甲胎蛋白、白蛋白、CYP1A2以及CYP2B6所构成的组中的至少一种。
13.如权利要求11或12所述的分离细胞群，其中，所述功能性肝前体细胞是CD44阳性和/或EpCAM阳性。
14.如权利要求11或12所述的分离细胞群，其中，所述分离细胞群被永生化。
15.一种功能性肝前体细胞，其以保藏编号BP-02591和/或BP-02592保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心。
16.一种用于治疗肝功能损害的药物组合物，其包含权利要求11～14中任一项所述的分离细胞群而成。
17.一种供试化合物的毒性评价方法，其包括：
（1）使通过将权利要求11～14中任一项所述的分离细胞群或者权利要求15中所述的功能性肝前体细胞进行分化诱导而获得的功能性肝细胞与供试化合物进行接触的步骤；以及
（2）分析所述功能性肝细胞的损害的程度的步骤。
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