KR20220095153A - 형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도 - Google Patents
형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220095153A KR20220095153A KR1020210189870A KR20210189870A KR20220095153A KR 20220095153 A KR20220095153 A KR 20220095153A KR 1020210189870 A KR1020210189870 A KR 1020210189870A KR 20210189870 A KR20210189870 A KR 20210189870A KR 20220095153 A KR20220095153 A KR 20220095153A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hepatic stellate
- cell line
- liver
- stellate cell
- hepatocyte
- Prior art date
Links
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 157
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 220
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 29
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 108010051742 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 101710164680 Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 108
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 74
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 58
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 57
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 33
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 21
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 16
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 claims description 15
- 101000901149 Drosophila melanogaster Collagen alpha-1(IV) chain Proteins 0.000 claims description 14
- 101001078133 Homo sapiens Integrin alpha-2 Proteins 0.000 claims description 14
- 102100025305 Integrin alpha-2 Human genes 0.000 claims description 14
- 102100027448 Laminin subunit beta-1 Human genes 0.000 claims description 14
- 101710186246 Laminin subunit beta-1 Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 14
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 13
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 13
- 101000935036 Ovis aries Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 10
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 10
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 claims description 10
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 9
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 108010003894 Protein-Lysine 6-Oxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 102100026858 Protein-lysine 6-oxidase Human genes 0.000 claims description 6
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 claims description 5
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 26
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 43
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 41
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 41
- 108010081668 Cytochrome P-450 CYP3A Proteins 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 29
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 28
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 27
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 23
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 23
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 20
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 18
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 18
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 16
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 16
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 16
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 16
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108010086524 Hepatocyte Nuclear Factor 4 Proteins 0.000 description 15
- 102000015902 Hepatocyte nuclear factor 4-alpha Human genes 0.000 description 15
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 15
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 15
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 15
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 12
- 102100039205 Cytochrome P450 3A4 Human genes 0.000 description 11
- 208000004930 Fatty Liver Diseases 0.000 description 11
- 206010019708 Hepatic steatosis Diseases 0.000 description 11
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 11
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 11
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 11
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 11
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 11
- 231100000240 steatosis hepatitis Toxicity 0.000 description 11
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 10
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 10
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 9
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 9
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 9
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 9
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 8
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 101710183399 Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 8
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 8
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 7
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 7
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 6
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 5
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 5
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 5
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 5
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 5
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 4
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 4
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 4
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 108010031374 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 101150068639 Hnf4a gene Proteins 0.000 description 2
- 101000692455 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor beta Proteins 0.000 description 2
- 102100039364 Metalloproteinase inhibitor 1 Human genes 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 2
- 102100034792 Phosphoenolpyruvate carboxykinase [GTP], mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010020070 Cytochrome P-450 CYP2B6 Proteins 0.000 description 1
- 102100038739 Cytochrome P450 2B6 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100026262 Metalloproteinase inhibitor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 101100398650 Mus musculus Lamb1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108010031372 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-2 Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229930185229 antidesmin Natural products 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000035289 cell-matrix adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003570 cell-matrix junction Anatomy 0.000 description 1
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000010528 free radical solution polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000010224 hepatic metabolism Effects 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000030786 positive chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 간성상세포주는 약물에 대한 응답성 향상을 나타내고 간세포와의 공배양 시 간세포의 기능 저해를 보이지 않아 기내 배양 모델에서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 형질전환된 인간 간성상세포주(hepatic stellate cell line) 및 이의 용도에 관한 것으로서, 특히 인체의 정상 간 조직에서 유래하고 무한 증식가능한 인간 불멸화 간성상세포주(immortalized hepatic cell line, 이하 HSC로 지칭함) 및 이의 용도에 관한 것이다.
일반적으로, 인체 유래 간세포는 인종, 성별, 개인에 따라 약물 분해능이 달라지기 때문에 환자 맞춤형 질환 모델의 개발에서 1차 간세포(primary human hepatocytes, PHH)의 확보는 중요한 이슈가 되어 왔다. 1차 간세포는 일반적인 2차원 배양에서 장기 배양이 어렵고 약물 분해능의 저하가 수반되므로 3차원 배양이 최근에 주목받고 있다.
한편, 간성상세포(hepatic stellate cell)는 질환 모델에서 간조직의 세포 구성원 중 간세포 다음으로 다수를 차지하며, 특히 간 섬유화와 간경변 등에 큰 영향을 미친다고 알려져 있다. LX-2를 포함하여 상용화된 여러 간성상세포주들이 존재하고 있으나, 이들 간성상세포주들은 실제 환자 맞춤형 질환 모델에 사용되기 어려운 여러 한계점을 가지고 있다.
첫째, 간성상세포는 기내(in vitro) 배양을 시작하게 되면 자연적으로 근섬유모세포(myofibroblast)로 분화하게 되고, 상기 근 섬유모세포는 간 섬유화를 유발한다. 실제 간성상세포와 간세포를 공배양하면 간성상세포의 근섬유아세포로의 분화가 둔화된다고 알려져 있으나 근섬유아세포로의 분화조절에 한계가 있다.
둘째, 전술한 바와 같이 간성상세포는 기내 배양시 근섬유모세포로의 높은 분화도를 갖기 때문에 섬유화 유도인자에 대한 반응성이 나빠진다. 따라서, 간성상세포는 간 섬유화 모델을 제조하여 간 섬유화-촉진- 혹은 간 섬유화-억제 약물을 테스트하기 힘든 면이 있다. 게다가, 간성상세포를 간세포와 공배양하는 경우 간성상세포의 비율이 높아지면 간세포의 활성도 자체가 저하되어 약물에 의한 간세포 대사 저하를 확인하기 어렵게 된다.
셋째, 약물대사에서 종간의 차이로 인해 설치류를 사용하는 실험 모델은 한계가 있고, 가장 인체에 근접한 실험 모델은 1차 인간 간세포를 이용한 3차원 공배양 모델이지만, 현재까지 1차 인간 간세포 및 간성상세포로 이루어진 최적화된 모델은 존재하지 않는다.
따라서, 3차원 배양 환경에서 간세포의 기능을 저해하지 않으면서 약물의 효과에 의해 간 섬유화를 유도할 수 있는 간성상세포주가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 정상적인 3차원 배양 환경에서 간세포의 기능을 저해하지 않으면서도 약물로 유도되는 간 섬유화 실험에서 대조군(종래 간성상세포주 LX-2)보다 약물에 의한 섬유화 유도 정도가 높은 간성상세포주를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 위의 조건에 부합하는 간성상세포주를 제조하였고, 이를 포함하는 조성물이 정상적인 조건에서 간대사 유지 혹은 증진, 그리고 약물 유도 간섬유화 모델의 조성물로 활용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, 증가된 간 섬유화 활성을 갖는 형질전환된 인간 간성상세포주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 인간 간 조직 유래 불멸화된 인간 간성상세포주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환된 인간 간성상세포주 및 간세포를 포함하는 인공 간 구조체 제조를 위한 세포 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 측면은 상기 세포 조성물을 배양하여 제조된 간 스페로이드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 세포 조성물을 스캐폴드와 함께 배양하여 제조된 인공 간 구조체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 인간 간성상세포주를 포함하는 3차원 배양 모델 및 이를 이용한 질환 모델을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환된 간성상세포주 및 간세포를 3차원 공배양하는 것을 포함하는 간 섬유화 모델을 제조하는 방법, 및 상기 방법으로 제조된 간 섬유화 모델을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 간 스페로이드, 상기 간 구조체 또는 상기 간 섬유화 모델에 간 섬유화 조절 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는 간 섬유화 조절제를 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환된 인간 간성상세포주는 간세포와 공배양 시에 간세포의 기능 저해를 보이지 않으면서 약물에 의한 간 섬유화 유도가 가능하여 간 섬유화, 지방간 등 간 질환 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 인간 간성상세포주는 각종 기내(in vitro) 배양에서 단일 혹은 공배양의 구성세포로서 사용할 수 있으며, 또한 체내 이식을 위한 세포주로도 사용이 가능하다.
도 1은 인간 간 조직으로부터 제조된 형질전환 간성상세포주로서 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 및 SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen) 유전자가 도입되어 무한 증식 가능한 불멸화된 인간 간성상세포주에 관한 것이다. 도 1a는 인간 간 조직으로부터 제조된 불멸화된 인간 간성상세포주의 현미경 사진이고; 도 1b는 불멸화된 인간 간성상세포주에서 발현된 hTERT와 SV40 대형 T-항원을 PCR로 확인한 결과이고; 도 1c는 형질전환된 간성상세포주에서 간세포 마커인 알부민(Albumin)과 PEPCK는 약하게 발현되고, HNF4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha) 및 CK18은 발현되지 않으며, 간성상세포 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein), 데스민(desmin), 엔도글린(endoglin), 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA)이 발현되는 것을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타내고; 도 1d는 HepG2 간세포주 및 불멸화된 인간 간성상세포주에서 간세포 마커인 HNF4α 및 알부민과 간성상세포 마커인 비멘틴(vimentin)의 발현 정도를 실시간(real-time) PCR (RT-PCR)로 확인한 결과로서, 간 세포 마커인 HNF4α 및 알부민의 발현은 낮은데 반해 간성상세포 마커인 비멘틴(vimentin)의 발현이 높다는 점을 도시하고; 도 1e는 불멸화된 간성상세포주의 계대배양 이후에도 간성상세포 마커인 GFAP, 데스민, 엔도글린, 네스틴(nestin), α-SMA, I형 콜라겐(Col-1A1) 및 PDGFRB(platelet derived growth factor receptor beta)이 발현됨을 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRIBB-HSC(K-HSC) 세포주에 관한 것이다. 도 2a는 간성상세포의 특징을 동질성 있게 갖는 세포만을 분리해 질환 모델에 활용하기 위하여 자기 활성 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting, MACS)을 이용하여 분리한 PDGFRB+(CD140b+) 세포의 현미경 사진이고; 도 2b는 상기 PDGFRB+ 세포가 98.3% 순도로 분리되었음을 FACS(fluorescence-activated cell sorting)로 검증한 결과를 나타내고; 도 2c는 상기 HSC/PDGFRB+ 세포를 전장 유전체 시퀀싱(whole genome sequencing)을 통해 삽입 염기 서열(insertion site)와 변이체(variants)를 확인한 결과를 나타내고; 도 2d는 상기 K-HSC 세포주(PDGFRB+ 세포)에서 간성상세포 마커인 GFAP, α-SMA, 데스민 및 PDGFRB의 발현 정도를 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타내고; 도 2e는 차후 활용시 편리성을 위한 목적으로 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 포함한 레트로바이러스를 이용하여 제조된 GFP-HSC의 현미경 사진이다.
도 3은 불멸화된 인간 간성상세포주와 종래 간성상세포주인 LX-2를 비교한 것이다. 도 3a는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2 각각을 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지와 윌리엄스(Williams) E 배지에서 5회 계대배양 후에 간성섬유아세포 특이 마커의 발현 정도를 RT-PCR로 측정·비교한 결과를 나타내고; 도 3b는 간성상세포 마커인 α-SMA, Col-IA1, PDGFR-β과 세포외기질 마커인 콜라겐 타입 IV 알파 3(Col-4A3)의 발현을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타내고; 도 3c는 세포외기질의 주요 단백질인 콜라겐 타입 IV 알파 1(Col-4A1), 라미닌 서브유닛 베타 1(LamB1), 피브로넥틴(FN), 인테그린 서브유닛 알파 2(ITGA2) 및 인테그린 서브유닛 베타 1(ITGB1)의 발현 차이를 배지별, 세포별로 분석한 결과를 나타내고; 도 3d는 윌리엄스(Williams) E 배지에서 배양한 미분화된 간세포주인 HepaRG, 불멸화된 인간 간성상세포주 및 LX-2에서 간세포 성장인자 HGF 및 간 섬유화 유도 인자 TGF-β1의 발현 정도를 세포별로 RT-PCR로 분석한 결과로서, 미분화된 HepaRG 대비 불멸화된 인간 간성상세포주 및 LX-2에서의 HGF 및 TGF-β1의 발현 정도가 낮았으나 LX-2는 불멸화된 인간 간성상세포주보다 TGF-β1 발현 정도가 높아 근섬유아세포로의 분화도가 더 높다는 점을 나타낸다.
도 4는 불멸화된 간성상세포주 또는 종래 간성상세포주인 LX-2를 간세포주와 함께 공배양하여 제조된 간 스페로이드에 관한 것이다. 도 4a는 간세포주 HepaRG와 불멸화된 간성상세포주를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드(HSCs Co) 및 간세포주 HepaRG와 LX-2를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드(LX-2 Co)에서의 간 세포 분화 마커인 HNF4α, 알부민, 사이토크롬 3A4 효소 및 담관 세포로의 분화 마커인 CK-19의 발현도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내며, 간세포주 HepaRG와 불멸화된 간성상세포주를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드는 LX-2 및 간세포주(HepaRG)를 공배양하여 제조한 스페로이드에 비해 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민(albumin), 사이토크롬 3A4의 효소 발현이 향상(4:6의 비율에서)되거나 비슷한 발현 정도(8:2의 비율에서)를 나타내어 간세포의 분화를 저해하지 않는 것으로 나타나고, 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민 및 CYP3A4 효소, 담관 세포로의 분화 마커인 CK-19 모두에서 높은 발현을 나타내어 LX-2 대비 더 우수하게 간세포의 기능 저하를 보이지 않는 것으로 나타나며; 도 4b는 생성된 스페로이드 내의 간성상세포의 섬유화 마커의 변화도를 RT-PCR로 확인한 결과로서, LX-2 및 간세포주(HepaRG)를 공배양하여 제조한 스페로이드는 간세포주 HepaRG와 불멸화된 간성상세포주를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드보다 간 세포 분화 마커가 전반적으로 낮게 발현되면서도 2차원 배양과 달리 초기 간 섬유화 정도가 LX-2와 유사하게 나타났다. 발현정도는 세포 비율에 맞춰 정량화하여 비교되었다.
도 5는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주의 2차원 배양시 근섬유모세포 마커 활성화 여부 및 불멸화된 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체에 관한 것이다. 도 5a는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2 의 2차원 배양후 면역화학염색법을 통해 간성상세포 마커 PDGFRβ 및 근섬유모세포 마커 Collagen 발현을 확인한 결과를 나타내며; 도 5b는 간세포주 HepaRG, LX-2 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 다양한 농도의 피브린젤, 및 인공소재인 폴리에틸렌글라이콜/하이알루론산/RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드로 구성된 하이브리드 하이드로젤에 1:1의 비율로 포집하여 21일간 3차원 공배양 후 네트워크 형성을 액틴-팔로이딘(actin-phalloidin) 형광 염색을 통해 공초점 현미경으로 관찰하였을 때 불멸화된 인간 간성상세포주가 LX-2 대비 하이브리드 하이드로젤에는 세포 부착능이 저조하다는 점을 확인한 결과를 나타내고; 도 5c는 다양한 농도의 피브린젤에서 불멸화된 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 결과로서, 불멸화된 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체를 구성하는 세포의 피브린젤 친화도가 유사함을 나타내고; 도 5d 및 5e는 간세포주(HepaRG), 불멸화된 간성상세포주와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체 및 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체에서의 알부민 분비 및 리팜피신(rifampicin)으로 유도된 사이토크롬 3A4(CYP3A4) 효소의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 결과를 나타낸다.
도 6은 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 간세포주와 함께 천연소재인 라미닌 코팅된 바이오실크에서 3차원 공배양하여 제조된 간 유사체에 관한 것이다. 도 6a는 간세포주 HepaRG와 불멸화된 인간 간성상세포주를 1:1의 비율로 라미닌 코팅된 바이오실크에 포집/부착시킨 결과를 나타내고; 도 6b는 간세포주 HepaRG를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양한 경우, 간세포주 HepaRG 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양한 경우, 또는 간세포주 HepaRG 및 LX-2를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양한 경우 각 세포의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 결과로서, 간세포주 HepaRG 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양하거나 간세포주 HepaRG 및 LX-2를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양하더라도 세포의 활성도는 유사하게 나타났음을 나타내고; 도 6c 및 6d는 HepaRG의 5일간 배양 이후, HepaRG 및 LX-2의 5일간 공배양 이후 또는 HepaRG 및 불멸화된 인간 간성상세포주의 5일간 공배양 이후 각각 알부민 및 CYP3A4 효소의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 후 비교한 결과로서, 불멸화된 인간 간성상세포주를 포함한 실험군이 LX-2를 포함한 실험군보다 공배양 환경에서 간세포 활성을 증가시킨다는 점을 나타낸다.
도 7은 약물을 투여하지 않은 대조군(cont)과 2가지 약물인 아세트아미노펜(apap) 및 메토트렉세이트(MTX) 중 하나를 투여한 실험군, 그리고 섬유화를 유도하는 TGF-β1를 투여한 양성 대조군으로 구성하여, 다양한 마크로머 농도 및 초기 경도(stiffness)를 가지는 하이브리드 하이드로젤 내에서 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 간세포주 HepaRG와 6:4의 비율로 공배양 후 간 섬유화 진행정도를 RT-PCR로 정량화한 결과를 나타낸다. 간성상세포주들의 섬유화 진행 정도를 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA)(도 7a), 1형 콜라겐(Col-1A1)(도 7b), 리실 옥시다제(lysyl oxydase, LOX)(도 7c), 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP1)(도 7d)의 발현 정도를 통해 확인한 것이다.
도 8a 내지 도 8d는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 각각 다양한 마크로머 농도 및 초기 경도(stiffness)를 가지는 하이브리드 하이드로젤 내에서 간세포주와 공배양했을 때, 공배양한 간세포주 HepaRG의 분화도(HNF4α) 변화(도 8a), 알부민 생산능 변화(도 8b), 및 세포부착 단백질인 피브로넥틴의 발현 차이(도 8c)를 비교한 그래프이고; 도 8d는 불멸화된 인간간성상세포주와 LX-2 를 약물처리 없이 24일간 단일 3차원 배양시 하이드로젤에서의 형상 차이를 확인한 결과로서, 불멸화된 인간 간성상세포주가 LX-2 대비 장기 배양에서 세포의 응축이 나타남을 도시한다.
도 9a 내지 도 9d는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 간세포주 HepaRG와 함께 정상 간 조직의 경도(4.5% 마크로머) 혹은 간경화 조직의 경도(8% 마크로머)를 모사하는 두 가지 마크로머 농도를 가지는 하이드로젤 내에서 1:1의 비율로 포집하여 공배양 후 간 세포 성장인자 HGF(hepatocyte growth factor) 투여 유무에 따른 간 섬유화 마커의 발현을 RT-PCR로 정량화한 결과를 나타낸다. 대조군으로 하이드로젤 포집 전 2D 단일층(monolayer)에서의 마커의 발현과 비교하였다. 간성상세포주들의 섬유화 마커 발현 정도는 1형 콜라겐(Col-1A1)(도 9a), 평활근 액틴 알파(α-SMA)(도 9b), 리실 옥시다제(LOX)(도 9c) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(TIMP1)(도 9d)의 발현이 마크로머 농도 및 간 세포 성장인자 HGF의 투여 유무에 따라 통계적으로 유의미한 변화를 갖는다는 점을 확인한 결과를 도시한다.
도 10a 내지 도 10c는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 간세포주(HepaRG)와 1:1의 비율로 포집 또는 자가결합시키고 다양한 3차원 배양체(세포자가결합 스페로이드, 하이드로젤, 생분해성 폴리락티사이드(polylacticide) 나노입자 포집 하이드로젤(NP-하이드로젤))에 적용 후 간 손상 모사를 위하여 메토트렉세이트(MTX)를 투여하고, 간 섬유화 유도를 위하여 TGF-β1를 투여하여 3차원 배양체에 따른 간 손상 모사도를 비교한 결과를 나타낸다. 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2의 간 모사도는 CYP3A4 효소의 활성도(도 10a) 및 약물대사의 민감도(fold change, rifampicin 약물 투여 3차원 배양체와 단순 DMSO 노출 3차원 배양체의 CYP3A4 효소 activity 비율)(도 10b) 및 알부민 생성능(도 10c)을 통해 확인되며, LX-2 및 불멸화된 인간 간성상세포주는 스페로이드 형태에서 낮은 CYP3A4 효소 활성 및 알부민 생성능을 갖는 것으로 나타났으나, 하이드로젤 및 생분해성 폴리락티사이드(polylacticide) 나노입자 포함하는 NP-하이드로젤에서 MTX 및 TGF-β1에 의하여 CYP3A4 효소 활성 및 기능저하를 모사하는 것으로 나타났다.
도 11a 내지 도 11f는 3차원 하이드로젤 환경에서 불멸화된 인간 간성상세포주의 다양한 부착단백질과의 친화성, 간세포 기능 및 간손상 모사성을 확인한 것이다. 도 11a는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 부착단백질인 RGD, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 포집된 하이드로젤에 도포 후 12시간 동안 2차원 배양한 뒤 광학 형광 현미경으로 확인한 결과이고; 도 11b는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 간세포주 HepaRG와 함께 RGD, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 포집된 하이드로젤에서 5일간 3차원 배양 후 공초점 현미경으로 확인한 결과이며, 도 11c 내지 도 11f는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 간세포주 HepaRG와 1:1 비율로 RGD, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 포집된 하이드로젤에서 7일간 3차원 배양 및 TGF-β1를 투여한 뒤 CYP3A4 효소의 활성도(도 11c) 및 RT-PCR로 정량한 알부민 생성능(도 11d), 평활근 액틴 알파(α-SMA)(도 11e) 및 1형 콜라겐(Col-1A1)(도 11f)의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 불멸화된 인간 간성상세포주와 1차 인간 간세포를 1:1의 비율로 하이드로젤 또는 생분해성 폴리락티사이드(polylacticide) 나노입자 포함하는 하이드로젤(NP-하이드로젤)에 포집하고 섬유화 유도 인자인 TGF-β1을 첨가하여 24일간 배양 후 하이드로젤에서의 외형의 변화(도 12a), 배양 2일차, 배양 11일차 및 배양 24일차의 알부민 생성능(도 12b), 및 간섬유화 마커의 발현 차이(도 12c)를 확인한 결과로서 1차 인간 간세포 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 이용한 간 모사에 하이드로젤 시스템이 더 적합하다는 점을 확인한 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 분화된 간세포주 HepaRG와 6:4(간세포: 간성상세포)의 비율로 회전식 진탕(70 rpm)을 통한 물리적 자극의 존재 하에 2% 혈청을 포함하는 윌리엄스 E 배지에서 3일간 자가결합하여 3차원 배양 형태인 스페로이드를 형성하고, 이후 무혈청 윌리엄스 E 배지로 전환하고 4일간 배양 후 생성된 스페로이드에 섬유화 유도 인자인 TGF-β1을 첨가하여 24시간 노출 후 성장인자 없는 배지에 24시간 노출시키는 것을 1 cycle로 5회 반복한 후 TGF-β1의 노출 유무에 따른 스페로이드의 간성상세포의 섬유화 마커 발현(도 13a) 및 스페로이드의 간세포 분화도(도 13b)를 확인한 결과를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 분화된 간세포주 HepaRG와 1:1의 비율로 4% 하이드로젤에 포집하고 섬유화 유도 인자인 TGF-β1 및 그 저해제 A를 각각 혹은 동시에 투여한 실험군과 이들을 투여하지 않은 대조군으로 나누어 18일간 배양 후 세포 네트워크 형성(도 14a) 및 간성상세포 마커 및 간섬유화 마커의 발현(도 14b)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 KRIBB-HSC(K-HSC) 세포주에 관한 것이다. 도 2a는 간성상세포의 특징을 동질성 있게 갖는 세포만을 분리해 질환 모델에 활용하기 위하여 자기 활성 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting, MACS)을 이용하여 분리한 PDGFRB+(CD140b+) 세포의 현미경 사진이고; 도 2b는 상기 PDGFRB+ 세포가 98.3% 순도로 분리되었음을 FACS(fluorescence-activated cell sorting)로 검증한 결과를 나타내고; 도 2c는 상기 HSC/PDGFRB+ 세포를 전장 유전체 시퀀싱(whole genome sequencing)을 통해 삽입 염기 서열(insertion site)와 변이체(variants)를 확인한 결과를 나타내고; 도 2d는 상기 K-HSC 세포주(PDGFRB+ 세포)에서 간성상세포 마커인 GFAP, α-SMA, 데스민 및 PDGFRB의 발현 정도를 면역형광염색법으로 확인한 결과를 나타내고; 도 2e는 차후 활용시 편리성을 위한 목적으로 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 포함한 레트로바이러스를 이용하여 제조된 GFP-HSC의 현미경 사진이다.
도 3은 불멸화된 인간 간성상세포주와 종래 간성상세포주인 LX-2를 비교한 것이다. 도 3a는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2 각각을 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지와 윌리엄스(Williams) E 배지에서 5회 계대배양 후에 간성섬유아세포 특이 마커의 발현 정도를 RT-PCR로 측정·비교한 결과를 나타내고; 도 3b는 간성상세포 마커인 α-SMA, Col-IA1, PDGFR-β과 세포외기질 마커인 콜라겐 타입 IV 알파 3(Col-4A3)의 발현을 면역형광염색법을 통해 확인한 결과를 나타내고; 도 3c는 세포외기질의 주요 단백질인 콜라겐 타입 IV 알파 1(Col-4A1), 라미닌 서브유닛 베타 1(LamB1), 피브로넥틴(FN), 인테그린 서브유닛 알파 2(ITGA2) 및 인테그린 서브유닛 베타 1(ITGB1)의 발현 차이를 배지별, 세포별로 분석한 결과를 나타내고; 도 3d는 윌리엄스(Williams) E 배지에서 배양한 미분화된 간세포주인 HepaRG, 불멸화된 인간 간성상세포주 및 LX-2에서 간세포 성장인자 HGF 및 간 섬유화 유도 인자 TGF-β1의 발현 정도를 세포별로 RT-PCR로 분석한 결과로서, 미분화된 HepaRG 대비 불멸화된 인간 간성상세포주 및 LX-2에서의 HGF 및 TGF-β1의 발현 정도가 낮았으나 LX-2는 불멸화된 인간 간성상세포주보다 TGF-β1 발현 정도가 높아 근섬유아세포로의 분화도가 더 높다는 점을 나타낸다.
도 4는 불멸화된 간성상세포주 또는 종래 간성상세포주인 LX-2를 간세포주와 함께 공배양하여 제조된 간 스페로이드에 관한 것이다. 도 4a는 간세포주 HepaRG와 불멸화된 간성상세포주를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드(HSCs Co) 및 간세포주 HepaRG와 LX-2를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드(LX-2 Co)에서의 간 세포 분화 마커인 HNF4α, 알부민, 사이토크롬 3A4 효소 및 담관 세포로의 분화 마커인 CK-19의 발현도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내며, 간세포주 HepaRG와 불멸화된 간성상세포주를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드는 LX-2 및 간세포주(HepaRG)를 공배양하여 제조한 스페로이드에 비해 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민(albumin), 사이토크롬 3A4의 효소 발현이 향상(4:6의 비율에서)되거나 비슷한 발현 정도(8:2의 비율에서)를 나타내어 간세포의 분화를 저해하지 않는 것으로 나타나고, 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민 및 CYP3A4 효소, 담관 세포로의 분화 마커인 CK-19 모두에서 높은 발현을 나타내어 LX-2 대비 더 우수하게 간세포의 기능 저하를 보이지 않는 것으로 나타나며; 도 4b는 생성된 스페로이드 내의 간성상세포의 섬유화 마커의 변화도를 RT-PCR로 확인한 결과로서, LX-2 및 간세포주(HepaRG)를 공배양하여 제조한 스페로이드는 간세포주 HepaRG와 불멸화된 간성상세포주를 4:6 및 8:2의 비율로 배양하여 생성된 스페로이드보다 간 세포 분화 마커가 전반적으로 낮게 발현되면서도 2차원 배양과 달리 초기 간 섬유화 정도가 LX-2와 유사하게 나타났다. 발현정도는 세포 비율에 맞춰 정량화하여 비교되었다.
도 5는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주의 2차원 배양시 근섬유모세포 마커 활성화 여부 및 불멸화된 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체에 관한 것이다. 도 5a는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2 의 2차원 배양후 면역화학염색법을 통해 간성상세포 마커 PDGFRβ 및 근섬유모세포 마커 Collagen 발현을 확인한 결과를 나타내며; 도 5b는 간세포주 HepaRG, LX-2 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 다양한 농도의 피브린젤, 및 인공소재인 폴리에틸렌글라이콜/하이알루론산/RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드로 구성된 하이브리드 하이드로젤에 1:1의 비율로 포집하여 21일간 3차원 공배양 후 네트워크 형성을 액틴-팔로이딘(actin-phalloidin) 형광 염색을 통해 공초점 현미경으로 관찰하였을 때 불멸화된 인간 간성상세포주가 LX-2 대비 하이브리드 하이드로젤에는 세포 부착능이 저조하다는 점을 확인한 결과를 나타내고; 도 5c는 다양한 농도의 피브린젤에서 불멸화된 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 결과로서, 불멸화된 간성상세포주 또는 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체를 구성하는 세포의 피브린젤 친화도가 유사함을 나타내고; 도 5d 및 5e는 간세포주(HepaRG), 불멸화된 간성상세포주와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체 및 LX-2와 간세포주(HepaRG)를 피브린젤에서 공배양하여 제조된 간 유사체에서의 알부민 분비 및 리팜피신(rifampicin)으로 유도된 사이토크롬 3A4(CYP3A4) 효소의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 결과를 나타낸다.
도 6은 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 간세포주와 함께 천연소재인 라미닌 코팅된 바이오실크에서 3차원 공배양하여 제조된 간 유사체에 관한 것이다. 도 6a는 간세포주 HepaRG와 불멸화된 인간 간성상세포주를 1:1의 비율로 라미닌 코팅된 바이오실크에 포집/부착시킨 결과를 나타내고; 도 6b는 간세포주 HepaRG를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양한 경우, 간세포주 HepaRG 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양한 경우, 또는 간세포주 HepaRG 및 LX-2를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양한 경우 각 세포의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 결과로서, 간세포주 HepaRG 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양하거나 간세포주 HepaRG 및 LX-2를 라미닌 코팅된 바이오실크 내 공배양하더라도 세포의 활성도는 유사하게 나타났음을 나타내고; 도 6c 및 6d는 HepaRG의 5일간 배양 이후, HepaRG 및 LX-2의 5일간 공배양 이후 또는 HepaRG 및 불멸화된 인간 간성상세포주의 5일간 공배양 이후 각각 알부민 및 CYP3A4 효소의 활성도를 측정하고 이를 ATP로 정규화한 후 비교한 결과로서, 불멸화된 인간 간성상세포주를 포함한 실험군이 LX-2를 포함한 실험군보다 공배양 환경에서 간세포 활성을 증가시킨다는 점을 나타낸다.
도 7은 약물을 투여하지 않은 대조군(cont)과 2가지 약물인 아세트아미노펜(apap) 및 메토트렉세이트(MTX) 중 하나를 투여한 실험군, 그리고 섬유화를 유도하는 TGF-β1를 투여한 양성 대조군으로 구성하여, 다양한 마크로머 농도 및 초기 경도(stiffness)를 가지는 하이브리드 하이드로젤 내에서 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 간세포주 HepaRG와 6:4의 비율로 공배양 후 간 섬유화 진행정도를 RT-PCR로 정량화한 결과를 나타낸다. 간성상세포주들의 섬유화 진행 정도를 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA)(도 7a), 1형 콜라겐(Col-1A1)(도 7b), 리실 옥시다제(lysyl oxydase, LOX)(도 7c), 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP1)(도 7d)의 발현 정도를 통해 확인한 것이다.
도 8a 내지 도 8d는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 각각 다양한 마크로머 농도 및 초기 경도(stiffness)를 가지는 하이브리드 하이드로젤 내에서 간세포주와 공배양했을 때, 공배양한 간세포주 HepaRG의 분화도(HNF4α) 변화(도 8a), 알부민 생산능 변화(도 8b), 및 세포부착 단백질인 피브로넥틴의 발현 차이(도 8c)를 비교한 그래프이고; 도 8d는 불멸화된 인간간성상세포주와 LX-2 를 약물처리 없이 24일간 단일 3차원 배양시 하이드로젤에서의 형상 차이를 확인한 결과로서, 불멸화된 인간 간성상세포주가 LX-2 대비 장기 배양에서 세포의 응축이 나타남을 도시한다.
도 9a 내지 도 9d는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 간세포주 HepaRG와 함께 정상 간 조직의 경도(4.5% 마크로머) 혹은 간경화 조직의 경도(8% 마크로머)를 모사하는 두 가지 마크로머 농도를 가지는 하이드로젤 내에서 1:1의 비율로 포집하여 공배양 후 간 세포 성장인자 HGF(hepatocyte growth factor) 투여 유무에 따른 간 섬유화 마커의 발현을 RT-PCR로 정량화한 결과를 나타낸다. 대조군으로 하이드로젤 포집 전 2D 단일층(monolayer)에서의 마커의 발현과 비교하였다. 간성상세포주들의 섬유화 마커 발현 정도는 1형 콜라겐(Col-1A1)(도 9a), 평활근 액틴 알파(α-SMA)(도 9b), 리실 옥시다제(LOX)(도 9c) 및 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(TIMP1)(도 9d)의 발현이 마크로머 농도 및 간 세포 성장인자 HGF의 투여 유무에 따라 통계적으로 유의미한 변화를 갖는다는 점을 확인한 결과를 도시한다.
도 10a 내지 도 10c는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 간세포주(HepaRG)와 1:1의 비율로 포집 또는 자가결합시키고 다양한 3차원 배양체(세포자가결합 스페로이드, 하이드로젤, 생분해성 폴리락티사이드(polylacticide) 나노입자 포집 하이드로젤(NP-하이드로젤))에 적용 후 간 손상 모사를 위하여 메토트렉세이트(MTX)를 투여하고, 간 섬유화 유도를 위하여 TGF-β1를 투여하여 3차원 배양체에 따른 간 손상 모사도를 비교한 결과를 나타낸다. 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2의 간 모사도는 CYP3A4 효소의 활성도(도 10a) 및 약물대사의 민감도(fold change, rifampicin 약물 투여 3차원 배양체와 단순 DMSO 노출 3차원 배양체의 CYP3A4 효소 activity 비율)(도 10b) 및 알부민 생성능(도 10c)을 통해 확인되며, LX-2 및 불멸화된 인간 간성상세포주는 스페로이드 형태에서 낮은 CYP3A4 효소 활성 및 알부민 생성능을 갖는 것으로 나타났으나, 하이드로젤 및 생분해성 폴리락티사이드(polylacticide) 나노입자 포함하는 NP-하이드로젤에서 MTX 및 TGF-β1에 의하여 CYP3A4 효소 활성 및 기능저하를 모사하는 것으로 나타났다.
도 11a 내지 도 11f는 3차원 하이드로젤 환경에서 불멸화된 인간 간성상세포주의 다양한 부착단백질과의 친화성, 간세포 기능 및 간손상 모사성을 확인한 것이다. 도 11a는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 부착단백질인 RGD, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 포집된 하이드로젤에 도포 후 12시간 동안 2차원 배양한 뒤 광학 형광 현미경으로 확인한 결과이고; 도 11b는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 간세포주 HepaRG와 함께 RGD, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 포집된 하이드로젤에서 5일간 3차원 배양 후 공초점 현미경으로 확인한 결과이며, 도 11c 내지 도 11f는 불멸화된 인간 간성상세포주와 LX-2를 간세포주 HepaRG와 1:1 비율로 RGD, 피브로넥틴(fibronectin) 또는 라미닌(laminin)이 포집된 하이드로젤에서 7일간 3차원 배양 및 TGF-β1를 투여한 뒤 CYP3A4 효소의 활성도(도 11c) 및 RT-PCR로 정량한 알부민 생성능(도 11d), 평활근 액틴 알파(α-SMA)(도 11e) 및 1형 콜라겐(Col-1A1)(도 11f)의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c는 불멸화된 인간 간성상세포주와 1차 인간 간세포를 1:1의 비율로 하이드로젤 또는 생분해성 폴리락티사이드(polylacticide) 나노입자 포함하는 하이드로젤(NP-하이드로젤)에 포집하고 섬유화 유도 인자인 TGF-β1을 첨가하여 24일간 배양 후 하이드로젤에서의 외형의 변화(도 12a), 배양 2일차, 배양 11일차 및 배양 24일차의 알부민 생성능(도 12b), 및 간섬유화 마커의 발현 차이(도 12c)를 확인한 결과로서 1차 인간 간세포 및 불멸화된 인간 간성상세포주를 이용한 간 모사에 하이드로젤 시스템이 더 적합하다는 점을 확인한 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 분화된 간세포주 HepaRG와 6:4(간세포: 간성상세포)의 비율로 회전식 진탕(70 rpm)을 통한 물리적 자극의 존재 하에 2% 혈청을 포함하는 윌리엄스 E 배지에서 3일간 자가결합하여 3차원 배양 형태인 스페로이드를 형성하고, 이후 무혈청 윌리엄스 E 배지로 전환하고 4일간 배양 후 생성된 스페로이드에 섬유화 유도 인자인 TGF-β1을 첨가하여 24시간 노출 후 성장인자 없는 배지에 24시간 노출시키는 것을 1 cycle로 5회 반복한 후 TGF-β1의 노출 유무에 따른 스페로이드의 간성상세포의 섬유화 마커 발현(도 13a) 및 스페로이드의 간세포 분화도(도 13b)를 확인한 결과를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 불멸화된 인간 간성상세포주 또는 LX-2를 분화된 간세포주 HepaRG와 1:1의 비율로 4% 하이드로젤에 포집하고 섬유화 유도 인자인 TGF-β1 및 그 저해제 A를 각각 혹은 동시에 투여한 실험군과 이들을 투여하지 않은 대조군으로 나누어 18일간 배양 후 세포 네트워크 형성(도 14a) 및 간성상세포 마커 및 간섬유화 마커의 발현(도 14b)을 확인한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은, hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 및 SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen) 유전자 또는 상기 hTERT 또는 SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen)의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자가 도입되고, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 베타(PDGFR-β) 마커 발현에 대해 양성을 나타내는, 형질전환된 인간 간성상세포주를 제공한다.
한편, 본 발명의 상기 hTERT 및 SV40 대형 T-항원의 유전자 서열 또는 상기 hTERT 또는 SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen)의 폴리펩타이드 아미노산 서열 정보는 공지의 데이터 베이스(예를 들어, NCBI의 GenBank) 등에서 얻을 수 있다.또한, 상기 hTERT 및 SV40 대형 T-항원의 염기 서열 또는 hTERT 또는 SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen)의 폴리펩타이드 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스에서 수득할 수 있는 염기서열 또는 아미노산 서열 정보와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 서열동일성을 가질 수 있다.
또한, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 무한 증식 가능한 불멸화된 인간 간성상세포주일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 19회 이상, 31회 이상, 최대 62회까지 계대 배양이 가능함을 확인하였다.
본 발명자들은 인간에서 분리된 간성상세포에 hTERT 유전자 및 SV40 대형 T-항원 유전자를 도입하여 형질전환된 인간 간성상세포주가 간 섬유화 활성이 증가되고 간 세포와 공배양되는 경우에 간 세포의 활성을 저해하지 않음을 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 hTERT 유전자 및 SV40 대형 T-항원 유전자의 도입은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, hTERT을 암호화하는 뉴클레오타이드 및 SV40 대형 T-항원을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환될 수 있다. 상기 뉴클레오타이드는 하나의 발현 벡터로 전달되거나 각각 상이한 발현 벡터로 전달될 수 있다. 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있고, 예컨대, 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 혈소판 유래 증식 인자 수용체 베타(PDGFR-β)는 간성상세포의 가장 강력한 분열과 증식 촉진 사이토카인인 PDGF와 결합하는 수용체 중 하나로 간성상세포의 간 섬유화 활성을 나타내는 마커일 수 있다.
상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 PDGFR-β마커에 대해 양성인 세포를 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 PDGFRB+ 세포의 순도가 약 98.3%이다.
상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA)가 과발현된 것일 수 있다.
상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 증가된 간성상세포 마커 발현을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA), 리실 옥시다제(LOX), 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP1) 및 혈소판 유래 증식 인자 베타(PDGFR-β)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 간성상세포 마커의 발현이 증가된 것일 수 있다.
또한, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 증가된 세포외기질 마커 발현을 나타낼 수 있다. 구체적으로 콜라겐 타입 IV 알파 1(Col-4A1), 콜라겐 타입 IV 알파 3(Col-4A3), 라미닌 서브유닛 베타 1(LamB1), 피브로넥틴(FN), 인테그린 서브유닛 알파 2(ITGA2) 및 인테그린 서브유닛 베타 1(ITGB1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포외기질 마커의 발현이 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는, 공지된 인간 간성상세포주인 LX-2 세포주 대비, 상기 간성상세포 및/또는 세포외기질 마커 발현이 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상일 수 있다. 또한, 공지된 인간 간성상세포주인 LX-2 세포주 대비, 상기 간성상세포 및/또는 세포외기질 마커 발현이 최대 25배일 수 있다. 특히, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 LX-2 세포주 대비, α-SMA의 발현이 10배 이상 증가된 것일 수 있다. 이 때, 상기 세포주는 DMEM 배지 또는 윌리엄스 E 배지에서 배양된 것일 수 있다.
상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 간 섬유화 활성을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명에서 간 섬유화 활성을 나타낸다는 것은 간성상세포가 세포증식(proliferation), 수축(contraction), 염증성 사이토카인 분비(chemoattraction), 이동(migration), 세포외기질 분비(secretion of extracellular matrix) 등 간 섬유화를 유발함을 의미한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주 및 간세포를 포함하는 인공 간 구조체 제조를 위한 세포 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "인공 간 구조체"는 인간의 간 기능을 모사하는 3차원의 세포 덩어리를 의미한다. 상기 인공 간 구조체는 간성상세포와 간세포가 직접 결합을 통해 형성된 간 스페로이드일 수 있다. 또한, 상기 인공 간 구조체는 스캐폴드(지지체)와 함께 간성상세포와 간세포가 3차원 배양되어 형성된 3차원 간 유사체일 수 있다.
상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 전술한 바와 같다.
상기 간 세포는 1차 인간 간세포, 불멸화된 간세포주, 또는 줄기세포 유래 간세포일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포 조성물은 간성상세포주 및 간세포를 유지하거나 배양하기 위한 배지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 세포 조성물을 배양하여 제조된 간 스페로이드를 제공한다.
상기 간 스페로이드는 간 섬유화 또는 간 섬유화와 관련된 간 질환, 지방간 등의 간 질환 모델에서 생체 환경을 모사할 수 있다. 따라서, 상기 간 스페로이드는 간 섬유화 또는 관련 간 질환, 지방간 등의 간 질환 모델에서 후보 약물의 효능, 안전성, 독성 등 약물 평가에 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 조성물의 배양 시에, 형질전환된 인간 간성상세포주가 간세포와 직접 접촉되는 경우에도, 간세포 단독 배양 대비, 간 세포 분화 마커인 HNF4a, 알부민 및 CYP3A4 효소의 증가되거나 유사한 정도의 발현을 나타내었고, LX-2와 공배양된 스페로이드 대비, 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민 및 CYP3A4 효소, 담관 세포로의 분화 마커인 CK-19 모두에서 높은 발현을 나타내어, 상기 간 스페로이드는 우수한 간 세포 기능을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 간 스페로이드는 간성상세포의 섬유화 진행 마커인 Col-1A1, α-SMA, TIMP1 및 LOX의 발현 정도가 LX-2와 공배양된 스페로이드와 유사하여 초기 간 섬유화 활성을 나타내었다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 세포 조성물을 스캐폴드와 함께 배양하여 제조된 인공 간 구조체를 제공한다.
상기 스캐폴드는 천연 소재 기반 또는 인공 소재 기반의 3차원 매트릭스일 수 있다. 구체적으로, 상기 스캐폴드는 폴리에틸렌글라이콜-함유 하이드로젤, 피브린젤 또는 바이오실크일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 스캐폴드 기반 배양은 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드, 피브린 또는 라미닌을 스캐폴드 내에 가교하거나 코팅함으로써 이루어질 수 있다.
상기 인공 간 구조체는 간 섬유화 또는 간 섬유화와 관련된 간 질환, 지방간 등의 간 질환 모델에서 생체 환경을 모사할 수 있다. 따라서, 상기 인공 간 구조체는 간 섬유화 또는 관련 간 질환, 지방간 등의 간 질환 모델에서 후보 약물의 효능, 안전성, 독성 등 약물 평가에 활용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인공 간 구조체는, LX-2 세포주와의 공배양으로 얻어진 인공 간 구조체 대비, 간세포가 높은 알부민 분비와 CYP3A4 효소 활성을 나타내어, 우수한 약물 대사능 및 간세포 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
종래 간성상세포주인 LX-2 세포주와 비교하여 보면, 본 발명의 간성상세포주는 조직의 수축에 관여하는 α-SMA가 과발현되어 있는 것으로 확인되었으며(도 3a 및 도 3b), 이로부터 LX-2 세포주와 달리 3차원 하이드로젤 배양체의 수축을 통해 질환 모델의 경도 모사가 가능함을 알 수 있다(도 7a 내지 도 7d 및 도 8d). 한편, 본 발명의 간성상세포주는 질환 혹은 부상에서 회복하기 위한 조직의 재생에서 중요한 역할을 하는 4형 콜라겐과 라미닌(LamB1)의 발현이 기존 세포주인 LX-2 세포주보다 유의미하게 증가되어 있는 것으로 확인되었고(도 3c), 이것은 LX-2 세포주 대비 간세포주의 높은 분화 마커 발현 및 활성도 유지의 원인이 될 수 있다(도 4; 도 5d 및 도 5e; 도 6c 및 도 6d; 도 13b). 이러한 특성은 본 발명의 간성상세포주가 간세포와의 공배양을 통해 간 질환 모델 연구에 적용될 수 있음을 나타낸다(도 13; 도 14; 표 1).
또한, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 HNF4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha), 알부민, 비멘틴, 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA), I형 콜라겐(Col-1A1), 리실 옥시다제(LOX), 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP1), 혈소판 유래 증식 인자 베타(PDGFR-β), 콜라겐 타입 IV 알파 1(Col-4A1), 콜라겐 타입 IV 알파 3(Col-4A3), 라미닌 서브유닛 베타 1(LamB1), 피브로넥틴(FN), 인테그린 서브유닛 알파 2(ITGA2), 인테그린 서브유닛 베타 1(ITGB1), 사이토크롬 3A4(CYP3A4), CK-19, GFAP, 데스민 및 네스틴의 유전자 서열 또는 아미노산 서열 정보는 공지의 데이터 베이스(예를 들어, NCBI의 GenBank) 등에서 얻을 수 있다. 또한, 상기 HNF4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha), 알부민, 비멘틴, 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA), I형 콜라겐(Col-1A1), 리실 옥시다제(LOX), 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP1), 혈소판 유래 증식 인자 베타(PDGFR-β), 콜라겐 타입 IV 알파 1(Col-4A1), 콜라겐 타입 IV 알파 3(Col-4A3), 라미닌 서브유닛 베타 1(LamB1), 피브로넥틴(FN), 인테그린 서브유닛 알파 2(ITGA2), 인테그린 서브유닛 베타 1(ITGB1), 사이토크롬 3A4(CYP3A4), CK-19, GFAP, 데스민 및 네스틴의 유전자 서열 또는 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스에서 수득할 수 있는 염기서열 또는 아미노산 서열 정보와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 서열동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환된 인간 간성상세포주 및 간세포를 3차원 공배양하는 것을 포함하는 간 섬유화 모델을 제조하는 방법 또는 상기 방법으로 수득된 간 섬유화 모델을 제공한다.
상기 형질전환된 인간 간성상세포주 및 간세포는 전술한 바와 같다.
상기 3차원 공배양은 스캐폴드 없이 또는 스캐폴드와 함께 이루어질 수 있으며, 스캐폴드 또는 스캐폴드 기반 배양에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 3차원 공배양은 간 섬유화의 경도 모사를 위해 배양 배지에 마크로머를 추가하여 이루어질 수 있다. 상기 마크로머는 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상, 7% 이상, 8% 이상일 수 있으며, 4% 내지 8%가 사용될 수 있으나 이러한 수치로 제한되지 않는다. 상기 간 섬유화 모델은 간 스페로이드 또는 인공 간 구조체일 수 있으며, 간 스페로이드 및 인공 간 구조체에 대해서는 전술한 바와 같다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 간 섬유화 모델은 스캐폴드 기반 배양 시에 부착단백질의 종류와 관계없이 일정한 간세포 기능 및 간손상 모사도를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 간 섬유화 모델은 스캐폴드 기반 배양 시에 배양체의 수축을 통해 간 섬유화 또는 간 섬유화 관련 질환의 경도 모사가 가능함을 확인하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주를 이용하여 제조한 간 섬유화 또는 지방간 모델은 종래 사용되던 인간 간성상세포주를 이용하여 제조한 간 섬유화 또는 지방간 모델보다 간섬유화 유도인자인 TGF-β1에 대한 민감성이 높다. 또한, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주는 장기간 배양하여도 간세포의 분화나 알부민 생성에 직접적인 영향을 미치지 않으므로, 상기 형질전환된 인간 간성상세포주를 이용하여 제조한 간 섬유화 또는 지방간 모델은 간세포의 약물 또는 성장인자에 의한 섬유화 및 대사 저하에 대한 민감도 향상을 특징으로 하므로 생체환경을 근접하게 묘사할 수 있고 질환 모델링에서 더 민감한 반응도를 확보할 수 있다(도 13 참조).
본 발명의 또 다른 측면은 상기 간 스페로이드 또는 상기 인공 간 구조체를 포함한 간 섬유화 모델에 간 섬유화 조절 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는 간 섬유화 조절제를 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "간 섬유화 조절"은 간 섬유화를 억제하거나 활성화하는 것을 의미할 수 있으며, 간 섬유화를 억제하는 물질은 간 섬유화 또는 간 섬유화 관련 간 질환, 지방간 등의 간 질환의 예방 또는 치료 물질일 수 있다. 상기 간 섬유화 관련 간 질환은 간섬유화, 간경화, 간경변, 간암을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 간 섬유화 조절제를 평가하는 것은 간 섬유화를 억제하거나 활성화하는 후보 물질의 효능, 안전성, 독성 등을 평가하거나, 간 섬유화 또는 간 섬유화 관련 간 질환, 지방간 등의 간 질환의 치료제를 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다.
발명의 실시를 위한 형태
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법 1. RT-PCR
RT-PCR을 위해, 세포주의 전체 RNA를 TRIzol(Thermo Fisher; 15596018) 시약을 이용하여 분리한 후, TOPScriptTM RT DryMIX(Ezynomics; RT200)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. RT-PCR은 합성한 cDNA를 주형으로, FAST SYBR® Green Master Mix(Applied Biosystems; 4385614) 시약과 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 수행하였다. 사용된 프라이머를 하기 표 2에 나타내었다.
| Target gene | Primer (Forward) | SEQ ID NO. | Primer (Reverse) | SEQ ID NO. |
| HNF4α | GGC CAA GTA CAT CCC AGC TTT | 서열번호 1 | CAG CAC CAG CTC GTC AAG G | 서열번호 2 |
| 알부민 | TTTATGCCCCGGAACTCCTTT | 서열번호 3 | AGTCTCTGTTTGGCAGACGAA | 서열번호 4 |
| 비멘틴 | GAGTCCACTGAGTACCGGAG | 서열번호 5 | ACGAGCCATTTCCTCCTTCA | 서열번호 6 |
| α-SMA | GTGGCTATTCCTTCGTTACT | 서열번호 7 | GGAAACGTTCATTTCCGATG | 서열번호 8 |
| Col-IA1 | ATTAGTAGGTGTGCTGTGTG | 서열번호 9 | AAGCGTTTGCGTAGTAATTG | 서열번호 10 |
| LOX | GACACATCCTGTGACTATGG | 서열번호 11 | GGGGTTTACACTGACCTTTA | 서열번호 12 |
| TIMP1 | GACCACCTTATACCAGCGTT | 서열번호 13 | TAAACAGGGAAACACTGTGC | 서열번호 14 |
| PDGFRβ | CCTCTTGGATATGCCTTACC | 서열번호 15 | CAGCTCAGCAAATTGTAGTG | 서열번호 16 |
| Col-4A1 | ATTAGTAGGTGTGCTGTGTG | 서열번호 17 | AAGCGTTTGCGTAGTAATTG | 서열번호 18 |
| LamB1 | GAGAGGTGATATTTCGTGCT | 서열번호 19 | CAGAAGCAATTTCCTCGAAC | 서열번호 20 |
| FN | AGTTTCCCATTATGCCGTTG | 서열번호 21 | TCCCAAGACATGTGCAGCTC | 서열번호 22 |
| ITGA2 | GGCCAGGTCATTATCTACAG | 서열번호 23 | GGTTCCAGGCTCATTTGATA | 서열번호 24 |
| ITGB1 | AGAGCTGAAGACTATCCCAT | 서열번호 25 | GTGTTGTGCTAATGTAAGGC | 서열번호 26 |
| CYP3A4 | TTTTGTCCTACCATAAGGGC | 서열번호 27 | CATAAATCCCACTGGACCAA | 서열번호 28 |
| CK-19 | AGCATGAAAGCTGCCTTGGA | 서열번호 29 | CCTGATTCTGCCGCTCACTATC | 서열번호 30 |
실험방법 2. 면역형광염색
면역형광염색을 위해, 배양 3~4일 후 세포주를 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 15분간 고정하였다. 이후 0.25% Triton X-100을 이용하여 15분간 세포주의 세포막을 투과화하였다. 1차 항체를 4% 소 알부민 포함 버퍼에 희석하여 16시간 동안 4℃에서 반응시켰고, 이후 1차 항체 특이적이고 형광물질이 부착된 2차 항체를 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응하였다. 형광현미경을 이용하여 해당 마커 이미지를 획득하였다. 이 때, 면역형광염색을 위해 사용한 1차 항체는 다음과 같다.
| Antibodies | Catalog No. | Company | Dilution |
| anti-GFAP | Z0334 | DAKO | 1:200 |
| anti-데스민 | AB907 | Millipore | 1:100 |
| anti-엔도글린 | AF1097 | R&D | 1:40 |
| anti-α-SMA | A5228 | Sigma | 1:100 |
| anti-네스틴 | MAB5326 | Millipore | 1:100 |
| anti-I형 콜라겐 | ab34710 | abcam | 1:50 |
| anti-PDGFRB | ab32570 | abcam | 1:50 |
I. 불멸화된 형질전환 간성상세포주의 제조
실시예 1. 불멸화된 형질전환 인간 간성상세포주 Kribb-HSC(K-HSC)의 제조
인간 간성상세포는 환자로부터 분리된 간 조직(충남대학교 인체자원은행)을 37℃에서 2 mg/mL 콜라게나제 I(Worthington, USA)로 30분간 처리하여 분리하고, 100 μm 포어 크기의 메시(mesh)로 여과하여 단일 세포(single cell)로 회수하였다. 이렇게 얻어진 세포를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 1차 간세포 유지 배지(primary hepatocyte maintenance media) CM4000(ThermoFisher)에서 16 내지 18시간 배양한 후에, pLenti-SV40와 pLenti-hTERT 바이러스(abm, US)를 4 μg/mL 폴리브렌(polybrene)(Sigma)과 함께 16 내지 18 시간 배양함으로써 불멸화되었다. 이후 간세포 유지 배지에서 배양하였다.
단일 세포 콜로니를 간성상세포주 배지(DMEM/F12(Thermofisher 11330), 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양하여 무한증식 가능한 간성상세포주(Immortalized Human Hepatic Stellate Cells, HSC)를 확보하였다. 상기 간성상세포주는 단일세포콜로니로부터 확립되었다. 상기 세포주의 형태학적 특징을 현미경을 통해 확인하고, hTERT와 SV40 대형 T-항원 발현을 PCR로 확인하였다(도 1a 및 도 1b).
또한, 상기 제조된 간성상세포주의 간성상세포 마커(GFAP, 데스민, 엔도글린 및 α-SMA) 발현을 면역형광염색을 통해 확인하고, 간성상세포주와 간세포주 HepG2(ATCC)의 발현 마커를 RT-PCR 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 상기 제조된 간성상세포주는 간세포 마커인 알부민과 PEPCK는 약하게 발현하였고, HNF4α와 CK18은 거의 발현하지 않았으며, 간성상세포주 마커인 GFAP, 데스민, 엔도글린 및 α-SMA를 발현하였다(도 1c). 한편, HepG2 간세포와 비교하여 간세포 마커인 HNF4α와 알부민의 발현은 현저히 낮은 수준을 보이는 반면, 간성상세포 마커인 비멘틴의 발현은 증가된 수준을 보였다(도 1d).
상기 간성상세포주가 계대배양 이후에도 간성상세포 특성을 유지하는지를 확인하기 위하여, 간성상세포주 배지에서 최대 19회까지 간성상세포주 배지(DMEM/F12(Thermofisher 11330), 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 계대 배양하고, 면역형광염색을 수행하였다. 그 결과, 상기 세포주는 계대배양 이후에도 간성상세포 마커인 GFAP, 데스민, 엔도글린, 네스틴, α-SMA, I형 콜라겐 및 PDGFRB를 발현하는 것으로 확인되었다(도 1e).
상기 계대배양된 세포들 중에서 간성상세포 특징을 동질성 있게 나타내는 세포들을 분리하여 질환 모델로 활용하기 위하여, PDGFRB+(CD140b+) 세포를 자기 활성 세포 분리법(magnetic-activated cell sorting, MACS)을 이용하여 분리하였고, 분리된 세포를 유세포 분석기(Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS)로 확인한 결과, 상기 PDGFRB+ 세포의 순도는 약 98.3%였다(도 2a 및 도 2b). 상기 세포를 KRIBB-HSC(K-HSC) 세포주라 명명하고, 전장 유전체 시퀀싱을 통해 삽입 염기 서열과 변이체를 확인하였다(도 2c).
상기 K-HSC 세포에서 간성상세포 마커인 GFAP, α-SMA, 데스민 및 PDGFRB의 발현 정도를 면역형광염색법으로 확인한 결과, 간성상세포 마커를 잘 발현하였다(도 2d).
실시예 2. GFP-간성상세포주의 제조
향후 사용의 편의를 위해 GFP(green fluorescence protein) 유전자를 포함한 레트로바이러스를 이용하여 K-HSC-GFP를 제작하였다. 실시예 1에서 제조된 간성상세포주 1×105 개 세포를 6 well 배양 접시에 접종하고, 다음날, 바이러스를 감염시키기 1시간 전에 바이러스 감염 효율을 높이기 위하여 8 ng/ml polybrene 시약(Santa Cruz Biotechnology, USA)로 전처리하였다. 이후, 5 MOI(multiplicity of infection)의 GFP-레트로바이러스를 세포에 처리하고 하루 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 다음날 새 배양배지로 바꿔준 후 배양을 지속하였고, 48시간 이후부터 강한 GFP 발현 시그널을 확인하여 K-HSC-GFP 간성상세포주를 확보하였다(도 2e).
실험예 1. 간성상세포주 K-HSC의 섬유화 활성도 확인
실시예 1에서 제조한 간성상세포주(K-HSC) 및 상용화된 간성상세포주인 LX-2(Millipore, USA)를 액체 질소에 보관한 후, 동일한 로트를 해동하여 각각 2% FBS를 포함한 윌리엄스 E 배지(Sigma, USA)와 DMEM 배지(Sigma, USA)에서 5회 계대배양하였다. 그 후, RT-PCR 분석을 통해 간성상세포 특이적 마커를 비교하였다. LX-2를 DMEM 배지에 배양한 경우의 간성상세포 특이적 마커 발현을 1로 놓고 상대적인 mRNA 발현을 측정하였다.
본 발명에 따른 K-HSC는 윌리엄스 E 배지에서 LX-2와 비교하여 간 섬유화 마커인 α-SMA, Col-IA1, LOX, TIMP1 및 간성상세포 마커인 nestin과 PDGFR-β가 더 많이 활성화되고, 특히, 조직의 수축에 관여하는 근섬유아세포 마커인 α-SMA의 활성도는 10배 이상 증가되어 있음을 확인하였다(도 3a). 이를 세포형광염색을 통해 검증하였다(도 3b). 이로부터 실시예 1에서 제조된 K-HSC가 LX-2 세포 대비 섬유화 활성도가 우수한 것을 알 수 있다.
세포외기질을 구성하는 여러 물질의 마커들(Col-4A3, Col-4A1, LamB1, FN, ITGA2 및 ITGB1)의 발현 정도를 세포형광염색 및 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 K-HSC는 LX-2 대비 증가된 발현을 나타내었다(도 3b 및 3c). 이는 세포-세포 및 세포-매트릭스 간 부착성이 우수하고 세포 건강도가 우수함을 의미한다.
간세포 성장인자인 HGF(hepatocyte growth factor)와 섬유화 유도 인자인 TGF-β1(transforming growth factor beta 1)의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 K-HSC와 기존 LX-2는 미분화된 간세포주인 HepaRG 대비 현저히 낮은 발현을 나타내었으나, TGF-β1의 경우 LX-2가 K-HSC 대비 증가된 발현도를 나타내었다(도 3d). 이는, 본 발명의 K-HSC의 근섬유아세포로의 섬유화 정도가 더 높아질 수 있음을 의미한다.
II. 불멸화된 형질전환 간성상세포주와 간세포주의 공배양을 통한 간 스페로이드 제조
실시예 3. 간성상세포주 K-HSC와 간세포주의 3차원 공배양 (자가결합방식)
실시예 1에서 제조된 K-HSC 간성상세포주가 간세포에 미치는 영향을 확인하기 위해 간성상세포주들와 간세포의 공배양을 수행하였다.
상용화된 간세포주 HepaRG(Biopredic, France)와 실시예 1에서 제조된 K-HSC를, HGF(hepatocyte growth factor, 10 ng/mL)와 EGF(epidermal growth factor, 2 ng/mL)를 포함하는 윌리엄스 E 배지 기반의 무혈청 배지를 이용하여 1.5% 아가로스로 코팅된 48-웰 플레이트의 표면 위에 각각 4:6 및 8:2의 간세포/간성상세포 비율로 도포하여 7일간 배지교환 없이 회전식 진탕(70 rpm)을 통해 자가결합을 유도하면서 3차원 배양하여 스페로이드를 형성하였다. 이 때, 총 세포 농도는 3×105 세포/mL였다. 비교를 위해 간성상세포주 없이 간세포주 HepaRG만을 동일한 방식으로 배양하여 간세포 분화 정도의 기준으로 설정하였다. 대조군으로, 상용화된 간성상세포주 LX-2를 동일한 방식으로 간세포주 HepaRG와 공배양하였다.
실험예 2. 간성상세포주 K-HSC와 간세포주의 3차원 공배양을 통해 제조된 간 스페로이드의 간 세포 활성 및 섬유화 활성 확인
실시예 3에서 제조된 간 스페로이드에서 소재기반의 매트릭스 없이 간성상세포주와의 직접 접촉이 간세포의 분화도에 미치는 영향을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과, 실시예 1에서 제조된 K-HSC는 간세포주와 공배양 시에 간세포주(HepaRG)로만 이루어진 스페로이드에 비해 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민 및 CYP3A4 효소 발현이 향상(간세포주와 간성상세포주의 비율이 4:6인 경우)되거나 비슷한 발현 정도(간세포주와 간성상세포주의 비율이 8:2인 경우)를 나타내어 간세포의 분화를 저해하지 않음을 확인할 수 있었다(도 4a). 또한, 본 발명에 따른 K-HSC와 간세포주의 공배양으로 얻어진 스페로이드는, LX-2와 공배양된 스페로이드 대비, 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민 및 CYP3A4 효소, 담관 세포로의 분화 마커인 CK-19 모두에서 높은 발현을 나타내어 LX-2 대비 더 우수하게 간세포의 기능 저하를 보이지 않음을 확인하였다(도 4a).
한편, 간성상세포의 섬유화 진행 마커인 Col-1A1, α-SMA, TIMP1 및 LOX의 경우에는 LX-2 대비 전반적으로 높은 발현을 나타내었던 2차원 배양시(도 3a 및 3b)와는 달리 LX-2와 유사한 초기 간 섬유화 정도를 나타내었다(도 4b).
위 결과는 간 섬유화 혹은 지방간과 같은 질환 모델에서 실시예 1에서 제조된 K-HSC를 이용한 스페로이드가 생체 환경을 좀 더 근접하게 모사할 수 있으며, 3차원 배양을 통한 질환모델링에서 좀 더 유리한 초기 조건을 확보할 수 있음을 보여준다. 또한, 실시예 1에서 제조된 K-HSC가 LX-2와 달리 간세포주의 활성을 향상시키고, 약물 또는 성장인자에 의한 섬유화 및 대사 저하에 대한 민감도를 향상시킨다는 점을 나타낸다.
III. 형질전환 간성상세포주 K-HSC와 간세포주의 스캐폴드 기반 공배양을 통한 간 유사체의 제조
실시예 1에서 제조된 K-HSC를 간세포와 함께 스캐폴드에 포집하여 3차원 공배양을 수행하였다. 실시예 3에서와 동일하게, 간세포로는 불멸화된 분화 간세포주인 HepaRG를 사용하였고, 상용화된 간성상세포주인 LX-2를 대조군으로 사용하였다. 3차원 배양 매트릭스에서 장기 배양 후 세포의 네트워크 형성을 액틴-팔로이딘(actin-phalloidin) 형광 염색을 통해 공초점 현미경을 통해 확인하고, 세포의 활성도를 ATP 분석을 통해 확인하였다. 또한, 간세포의 주요 기능인 약물 대사는 리팜피신(rifampicin)으로 유도된 사이토크롬 3A4 효소의 활성도를 측정하여 확인하고, 알부민 생성은 ELISA를 통해 확인하였다. 또한, 세포 기반의 3차원 배양 모델인 스페로이드 배양을 이용하여 세포주간의 직접 접촉이 간세포주의 분화도에 미치는 영향을 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과, 상기 간성상세포주는 LX-2와 달리 간세포주의 활성을 향상시키는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 피브린젤 스캐폴드를 이용한 간 유사체 제조
실시예 1에서 제조된 간성상세포주 K-HSC 및 LX-2를 간성상세포 마커인 PDGFR-beta와 간성상세포가 분화된 근섬유모세포(myofibroblast) 마커인 콜라겐(collagen)으로 면역형광염색한 후 비교하였을 때, K-HSC는 LX-2와 달리 간성상세포와 분화된 근섬유모세포의 마커가 모두 활성화 되어 있는 것으로 나타났다(도 5a).
한편, 실시예 1에서 제조된 간성상세포주 K-HSC를 피브린젤 스캐폴드에서 3차원 배양시 세포부착능 향상 여부 및 네트워크 형성능을 확인하였다.
구체적으로, 3차원 배양 매트릭스로 천연 소재 기반의 피브린젤과 대조군으로 인공 소재 기반의 폴리에틸렌글라이콜/하이알루론산/RGD 펩타이드를 포함하는 하이브리드 하이드로젤을 사용하여 간 유사체를 제조하였다.
10% 소 태아 혈청, 항생제, 인슐린, 하이드로코르티손이 포함된 윌리엄스 E 배지에 유지된 간세포주 HepaRG와 2% 소 태아 혈청을 함유한 것을 제외하고 동일한 성분의 배지에 유지된 실시예 1에서 제조된 간성상세포주 K-HSC를 트립신 처리하였다. 그 후, PBS와 트롬빈 용액에 넣고 동일 부피의 피브리노겐(GreenPlast Q®, 녹십자, 한국) 용액(PBS로 각각 1/2, 1/6 및 1/8로 희석한 용액)을 섞어 최종적으로 2×107 세포/mL의 농도와 5:5의 간세포/간성상세포의 비율을 가지는 40 μL 젤을 만들었다. 이어서, 생성된 젤을 배양기에 15분간 넣어 젤화(gelation)을 진행하였다.
한편, 상기 트립신 처리된 간성상세포주와 간세포주에 3 또는 4개의 알킬기 스페이서(Sigma, USA)를 가지는 폴리에틸렌글라이콜(Sigma, USA) 기반 하이드로젤 마크로머를 합성하고 6%의 농도로 1.5 MDa 하이알루론산 (Lifecore Biomedical, USA) 0.36%, 그리고 가교가 가능한 1 μM/mL RGD 펩타이드(Bachem, USA, JenKem, China)와 혼합하여 젤화를 자외선 조사를 통한 광중합을 이용해 진행하였다. 이때 광중합 개시제로 Irgacure® 2959(Sigma, USA)를 70% 에탄올 용액에 용해 후 최종적으로 0.1% 농도로 첨가하여 진행하였다. 슬라이드 커버 글라스 두 개를 1 mm 간격으로 고정시키고 사이에 30 μL 부피의 젤-세포-중합체 용액을 첨가하고 4분 30초간 양 면을 각각 자외선 조사 후 하이드로젤 기반 3차원 간 유사체를 중합하였다. 이렇게 얻어진 젤을 24-웰 디쉬(24-well dish)로 옮겨 10% 소 태아 혈청을 포함한 배지로 2일마다 교환하여 16일(공초점 현미경 이미징, 도 5b) 혹은 21일(간세포 대사 및 활성 측정, 도 5c 내지 5e) 동안 배양하였다. 배양물을 PBS로 씻어내고 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 그 후, 팔로이딘(phalloidin)으로 액틴을 염색하고 Hoechst로 세포핵을 염색하여 세포간 네트워크 형성을 공초점 현미경으로 관찰하였다.
실시예 1에서 제조된 K-HSC는 피브린젤에서는 우수한 부착능 및 네트워크 형성능을 보였으나, 하이브리드 하이드로젤에서는 LX-2 대비 저조한 세포 부착능을 보였다(도 5b).
실험예 3. 피브린젤 스캐폴드를 이용하여 제조된 간 유사체의 간세포 활성 확인
실시예 4에서 피브린젤에 포집된 세포들을 다음 날 배지를 교환하면서 두 가지 실험군으로 분류하여 한 군은 1.7% DMSO를 포함하는 간세포 분화 배지, 다른 한 군은 10% 소 태아 혈청을 포함하는 일반 배지로 나누어 14일간 배양한 후에 두 군 모두 DMSO가 없는 일반 배지로 교환하여 3일간 더 배양하였다.
마지막 배양일에 상등액을 회수하여 Bethyl사의 ELISA kit를 이용하여 알부민을 정량하고, 20 μM 리팜피신이 포함된 배지로 교환하여 48시간 동안 CYP3A4 효소의 활성을 유도하였다. Promega사의 kit (P450-Glo CYP3A4 assay kit, V9002)를 이용하여 광도를 측정함으로써 상기 효소의 활성을 확인하였다.
피브린젤 시료들은 Promega사의 CellTiter Glo kit를 이용하여 용해시킨 후 포집된 세포의 ATP 양을 측정하고, 측정된 ATP의 양으로 세포의 친화도, CYP3A4 효소의 활성도,및 알부민 생산량을 정규화하여 비교하였다.
또한, 세포 활성도를 나타내는 ATP 분석에서 실시예 1에서 제조된 간성상세포주 K-HSC는 LX-2와 차이를 보이지 않아 세포의 피브린젤 친화도는 유사한 것으로 나타났다(도 5c). 그러나, 간세포주인 HepaRG와 K-HSC 또는 LX-2 비율이 1:1 인 공배양에서 피브린젤 농도에 따른 사이토크롬 3A4 (CYP3A4) 효소의 활성도 차이가 나타났다. K-HSC 및 HepaRG의 공배양에서 HepaRG의 알부민 분비 및 CYP3A4 효소의 활성도가 LX-2와 HepaRG의 공배양 대조군에 비해 높게 나타났기에, K-HSC가 공배양 환경에서 간세포의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다(도5d 및 도 5e).
실시예 5. 라미닌(laminin) 코팅된 바이오실크 포움(biosilk foam) 스캐폴드를 이용한 간 유사체 제조
실시예 1에서 제조된 K-HSC를 또 다른 천연소재 기반의 라미닌 코팅된 바이오실크 포움 내에서 3차원 공배양을 수행하였다. 간세포주 HepaRG와 간성상세포주를 1:1의 비율로 2×107 세포/mL의 최종 농도로 바이오실크 용액(Biosilk®521, BioLamina, Norway)과 혼합 후 약 40 μL 부피로 24 well plate의 well에 도포하고 37℃ 세포배양기에서 20분간 젤화 후 배지를 첨가하고 매 2일마다 배지를 교환하였다. 그 결과, K-HSC는 우수한 부착능을 보였다(도 6a).
실험예 4. 바이오실크 스캐폴드를 이용하여 제조된 간 유사체의 간세포 활성 확인
실시예 5에서 라미닌 코팅된 바이오실크 포움에서 3차원 공배양된 간세포주에 대해서, 실험예 2와 동일한 방법으로 세포의 친화도, CYP3A4 효소 활성 및 알부민 분비능을 측정하였다.
라미닌 코팅된 바이오실크 포움에서 공배양된 간세포주는, 피브린 겔에서와 유사하게, 라미닌 코팅된 바이오실크 포움 친화도는 LX-2와 유사한 것으로 확인되었고(도 6b), 간세포주인 HepaRG와의 공배양에서 피브린젤 스캐폴드를 이용한 경우와 유사하게 CYP3A4 효소의 활성도 차이를 보여주었으며, LX-2와의 공배양 대조군에 비해 높은 알부민 분비와 CYP3A4 효소 활성을 나타내었다(도 6c 및 도 6d). 이로부터 본 발명의 K-HSC가 간세포와의 공배양 환경에서 간세포의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.
위 결과는 본 발명의 간성상세포주는 간세포 공배양 실험에 적용될 수 있는 세포주임을 보여주었다.
IV. 간성상세포주의 특성 확인
실험예 5. 본 발명에 따른 간성상세포주 K-HSC의 약물 투여에 대한 반응성 확인
실시예 1에서 제조된 K-HSC가 약물로 유도된 간 섬유화 모델로 적용 가능한지를 확인하기 위하여, 다양한 초기 경도(stiffness)를 갖도록 4%, 5% 및 6% 마크로머(macromer) 농도를 포함시켰다. 구체적으로, 3 또는 4개의 알킬기 스페이서(Sigma, USA)를 포함한 폴리에틸렌글라이콜(Sigma, USA) 기반 하이드로젤 전구체와 1.5 MDa 하이알루론산(Lifecore Biomedical, USA)을 각각 0.24% (4% 마크로머), 0.3% (5% 마크로머), 0.36% (6% 마크로머)의 비율로 첨가하고, 가교가 가능한 1 μM/mL RGD 펩타이드(Bachem, USA, JenKem, China)와 최종 혼합 후 70% 에탄올 용액에 용해된 Irgacure® 2959(Sigma, USA)를 0.1% 농도로 첨가하여 중합을 진행하였다. 슬라이드 커버 글라스 두 개를 1 mm 간격으로 고정시키고 사이에 30 μL 부피의 젤-세포-중합체 용액을 첨가하고 4분 30초간 양 면을 각각 자외선 조사 후 하이드로젤 기반 3차원 간 유사체를 중합하였다. 상기 K-HSC와 간세포주 HepaRG를 6:4의 비율로 공배양하였다. 대조군으로 LX-2를 동일한 방법으로 공배양하였다.
구체적으로, 상기 하이브리드 하이드로젤에 2×107 개/mL의 농도와 약 30 μl의 부피로 간성상세포를 인캡슐레이션하였다. 상기 간세포주는 인캡슐레이션 전에 14일간 DMSO 환경에서 배양하여 분화시키고 분화된 세포를 회수하여 사용하였다. 1차 인간 간세포는 액체 질소에서 냉동 상태에서 회수하여 해동 후 바로 사용하였다. 24시간 배양 후 무혈청 배지로 전환하였다. 그 후, 3일간 배양하고 24시간 약물 투여-24시간 무혈청 배지의 사이클을 7회 실시하였다. 약물을 투여하지 않은 대조군(cont), 아세트아미노펜(apap) 및 메토트렉세이트(MTX)를 약물로 각각 투여한 실험군, 섬유화를 유도하는 TGF-β1를 투여한 양성 대조군의 4개 군으로 실험을 수행하였다. 그 후, 세포를 회수하여 섬유화 마커인 α-SMA, Col-IA1, LOX와 TIMP-1의 발현 정도를 RT-PCR로 측정하여 간성상세포들의 섬유화 진행 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 7a 내지 7d를 참조하면, 실시예 1에서 제조된 K-HSC는 LX-2에 비해, 특히 5% 마크로머 매트릭스에서, 약물 민감도가 더 높고 간 섬유화가 잘 유도되는 것으로 나타났다.
또한, 간세포 마커인 HNF4α와 알부민의 발현 정도, 세포부착 단백질인 피브로넥틴의 발현 정도를 RT-PCR로 정량 분석하였다. 그 결과, 실시예 1에서 제조된 K-HSC는 약물 투여에 따라 간세포의 분화도를 나타내는 HNF4α의 발현과 간세포의 기능을 나타내는 알부민 발현의 차이가 커 약물 반응에 민감한 것으로 확인되었으며, 간세포의 분화나 알부민 생성능에 직접적인 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(도 8a 및 8b). 또한, 본 발명의 K-HSC는 섬유화 지표인 피브로넥틴의 발현 정도도 우수한 것으로 확인되었다(도 8c). 반면, LX-2가 사용된 대조군에서는 전반적으로 낮은 분화도와 기능을 보여 약물 투여에 따른 차이를 볼 수 없었다. 한편, 실시예 1에서 제조된 K-HSC를 단독으로 하이드로젤에 포집하여 약물처리 없이 24일간 단일 3차원 배양 후 하이드로젤의 형상을 관찰하였다. 세포-하이드로젤 포집은 자외선 조사를 통한 광중합을 이용해 진행하였다. 이때 광중합 개시제로 Irgacure® 2959(Sigma, USA)를 70% 에탄올 용액에 용해 후 최종적으로 0.1% 농도로 첨가하여 진행하였다. 최종 세포 농도는 2×107 세포/mL 하이드로젤로 고정하였다. 슬라이드 커버 글라스 두 개를 1 mm 간격으로 고정시키고 사이에 30 μL 부피의 RGD를 포함한 젤 마크로머-세포-중합체 용액을 첨가하고 4분 30초간 양 면을 각각 자외선 조사 후 3차원 간성상세포 포함하는 배양체를 중합하였다.
실시예 1에서 제조된 간성상세포주는 LX-2 세포군에 비해 더 큰 세포 응축을 나타내어 섬유화 활성화가 우수함을 확인하였다(도 8d). 따라서, 실시예 1에서 제조된 간성상세포주는 LX-2 대비 우수한 간섬유화 모델의 세포주가 될 수 있음을 확인하였다.
실험예 6. 본 발명에 따른 간성상세포주 K-HSC의 지지체 경도에 따른 초기 반응성 확인 및 간세포성장인자 제거에 대한 반응성 확인
정상(4.5% 마크로머) 혹은 섬유화 질환(8% 마크로머) 간 조직의 경도를 모사하는 하이브리드 하이드로젤 시스템에 실시예 1에서 제조한 K-HSC와 간세포주 HepaRG를 1:1 비율로 포집하여, 지지체 경도 변화에 대한 간성상세포주의 반응 여부와 간세포성장인자(HGF)의 투여 유무에 따른 초기 섬유화 마커들의 변화를 확인하였다. LX-2를 대조군으로 사용하였다. 각 마크로머 농도를 달리한 하이드로젤에 간세포주 HepaRG와 간성상세포주 혹은 LX-2를 1:1 비율로 혼합하고 총 세포 농도를 2×107 세포/mL 하이드로젤로 고정하고 1 mM/mL RGD와 0.1% Irgacure® 2959 개시제와 혼합 후 9분간 광중합하여 3차원 간 유사체를 제조하였다. 1일간 10%의 소혈청이 포함된 배지에서 배양 후 10 ng/mL의 HGF가 첨가된 무혈청 배지(콘트롤배지)와 첨가하지 않은 배지로 교환 후 매 2일에 한 번 배지 교환을 실시하여 8일간 더 배양하고(총 9일: 간모사체 구성 초기 조건) 3차원 간 유사체를 회수한 후에 Trizol(ThermoFisher, USA) 처리 후 RT-PCR 분석을 실시하였다.
도 9a 내지 도 9d를 참조하면, 초기 지지체 경도의 차이 (4.5%: 8%)에 따라 섬유화 마커인 Col-1A1, α-SMA, LOX, 및 TIMP1의 발현이 LX-2 대조군에 비해 통계적으로 유의미하게 변화하는 것을 볼 수 있었고 특히, Col-1A1 및 α-SMA는 경도 변화에 따라 발현 정도가 증가하였고 이는 K-HSC 세포주가 경도에 대한 반응성을 보인다는 것을 의미한다. HGF 성장인자 유무에 따라서는 TIMP-1 유전자만이 유의미한 변화를 보였는데 HGF가 첨가된 배지에서 경도가 낮을 경우에 발현이 증가하였고 HGF를 제거해 주었을 때 높은 경도에서의 수치와 비슷하게 감소됨을 확인하였다. 즉 낮은 경도의 4.5% 마크로머 하이드로젤에서는 HGF 투여 여부가 마커 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. 본 발명에 따른 불멸화된 형질전환 간성상세포주 K-HSC의 배양체에 따른 간손상 모사도 확인 (자가결합을 이용한 스페로이드, 나노입자-하이드로겔 및 하이드로겔)
실시예 1에서 제조된 K-HSC의 3차원 배양체에 따른 간손상 모사도를 비교하기 위하여, 하나는 5% 마크로머 농도의 하이브리드 하이드로젤 내에 K-HSC와 간세포주 HepaRG를 포집하여 배양하였고, 다른 하나는 K-HSC와 간세포주 HepaRG를 자가결합을 이용한 스페로이드 형태로 배양하였으며, 비교군으로 K-HSC와 간세포주 HepaRG를 생분해성 폴리락티사이드(polylactide) 나노입자-하이드로젤(NP-하이드로젤)에서 배양하였으다. 대조군으로 LX-2를 상기와 동일한 방법으로 공배양하였다.
이후, 간손상을 모사하기 위한 목적으로 메토트렉세이트(MTX)를 투여하거나, 또는 간섬유화 유도를 위하여 TGF-β1을 투여한 후, 실험예 2와 동일한 방법으로 CYP3A4 효소의 활성도, 평균 발현량(효소의 활성 비율) 및 알부민 생성능을 확인하였다.
그 결과, K-HSC와 LX-2 모두 자가결합을 이용한 스페로이드 형태로 배양할 경우 낮은 CYP3A4 효소 활성과 알부민 생성능을 나타낸는 것을 확인하였으며, 하이드로젤 또는 나노입자-하이드로젤에서 배양할 경우 약물 및 유도효과에 따른 활성저하 및 기능저하를 모사함을 확인하였다(도 10a 내지 10c). 이로부터 자가결합을 이용한 스페로이드 시스템에 비해 나노입자 하이드로젤 또는 하이드로젤 시스템이 간 손상 모사에 더 적합함이 확인되었다.
실험예 8. 본 발명에 따른 간성상세포주 K-HSC의 부착단백질에 따른 친화성, 간세포 기능 및 간손상 모사도 확인
3차원 하이드로젤 환경에서 다양한 부착단백질과의 친화성을 비교하기 위해 RGD 펩타이드를 포함하는 하이드로젤 및 LX-2 세포주를 대조군으로 하여 피브로넥틴(fibronectin)과 라미닌(laminin)이 함께 포집된 5% 마크로머 하이브리드 하이드로젤에서 12시간 2차원 배양 후 광학 현미경으로 표면 부착을 관찰하였으며, K-HSC와 LX-2를 간세포주 HepaRG와 함께 부착단백질이 포집된 하이드로젤에서 5일간 3차원 배양 후 공초점 현미경으로 관찰하여 세포의 네트워크 형성을 비교하였다.
도 11a 및 도 11b를 참조하면, 2차원 및 3차원 배양에서 부착단백질에 따른 부착 패턴이나 밀도의 차이가 거의 없음을 확인하였다.
한편, 부착단백질에 따른 간세포의 기능에의 영향을 보기 위해 간성상세포주(LX-2 또는 K-HSC)를 분화된 HepaRG와 1:1의 비율로 하이드로젤에 포집하고 배양하여 부착단백질에 따른 CYP3A4 효소와 알부민 형성을 비교하였으며, 부착단백질에 따른 간섬유화 모사도에의 영향을 보기 위해 평활근 액틴 알파(α-SMA) 및 1형 콜라겐(Col-1A1)의 발현 정도를 비교하였으나 간섬유화 모사도, 간세포의 기능 및 간 손상 모사 모두 부착단백질 종류가 다르더라도 통계적으로 유의미한 차이를 나타내지 않았다(도 11c 내지 도 11f).
이는, 본 발명에 따른 K-HSC의 간세포 기능 및 간 손상 모사성은 부착단백질의 종류와 관계없이 일정하다는 것을 보여준다.
실험예 9. 본 발명에 따른 간성상세포주 K-HSC의 배양체에 따른 간손상 모사도 확인 (나노입자-하이드로겔 및 하이드로겔)
실시예 1에서 제조한 K-HSC를 1차 인간 간세포(primary human hepatocytes, PHH, Corning, USA)와 1:1 비율로 실시예 4에서 기술한 바와 같이 4.5% 폴리에틸렌 글라이콜/하이알루론산/RGD 하이드로젤 내에 광중합반응을 이용하여 포집하였다. 질소 냉동된 세포를 회수 배지(Recovery media, ThermoFisher, USA)를 이용해 해동, 원심 분리 후 세포 수를 측정하고 K-HSC와 같이 하이드로젤 내 포집 후 10% 소혈청을 포함하는 1차 인간 간세포 플레이팅 배지(ThermoFisher, USA)에서 1일간 배양하였다. 1차 인간 간세포 전용 무혈청 배지(Corning, USA)으로 전환하고 5일 후에 24시간 간 섬유화를 유도하는 TGF-β1을 10 ng/mL의 농도로 첨가하고 익일에 첨가하지 않은 무혈청 배지로 다시 전환하여 3 사이클을 진행하고 총 24일 배양한 후에 하이드로젤의 외형 변화를 관찰하고, 알부민 생성능 및 섬유화 마커의 발현 정도를 RT-PCR을 통해 측정하였다.
그 결과, 상기 K-HSC와 1차 인간 간세포가 공배양된 하이드로젤 및 나노입자-하이드로젤은 TGF-β1을 포함하거나 포함하지 않은 대조군에서 모두 외형적인 변화를 나타내지 않았고(도 12a), TGF-β1 존재 시 대조군 대비 알부민 분해능의 저하를 보였다(도 12b). 한편, 간 섬유화 마커 발현에서 나노입자-하이드로젤은 대조군 대비 유의미한 변화를 보이지 않았다(도 12c). 이로부터 1차 인간 간세포를 포함하는 연구/임상에서는 하이드로젤 시스템이 간손상 모사에 더 적합함이 확인되었다.
실험예 10. 본 발명에 따른 간성상세포주 K-HSC의 TGF-β1 민감도 확인
실시예 1에서 제조한 K-HSC와 분화된 간세포주 HepaRG를 윌리엄스 E 배지 기반의 무혈청 배지를 이용하여 1.5% 아가로즈로 코팅된 48-웰 플레이트의 표면 위에 6:4의 간세포/간성상세포 비율로 도포하여 총 7일간 회전식 진탕(70 rpm)을 통한 물리적 자극의 존재 하에 2% 혈청을 포함하는 윌리엄스 E 배지에서 3일간 자가결합하여 3차원 배양 형태인 스페로이드를 형성하였다. 이때, 총 세포 농도는 3×105 개/스페로이드였다. 이후, 배양 3일차에 무혈청 윌리엄스 E 배지로 배지를 전환하고 4일간 배양한 후, 간섬유화 유도 인자인 TGF-β1을 24시간 투여 후 성장인자 없는 배지에 다시 24시간 노출시키는 것을 1 cycle로 5회 반복 (5 cycles)한 후 회수하여 RT-PCR로 정량 분석하였다. 상기 분화된 간세포주 HepaRG는 3차원 스페로이드 형성 전에 14일 이상의 장기간 DMSO 환경에서 배양하여 분화시키고 분화된 세포를 회수하여 사용하였으며, 대조군으로, LX-2를 동일한 방식으로 본화된 간세포주 HepaRG와 공배양하였다.
그 결과, K-HSC와 간세포주 HepaRG로 구성된 공배양 스페로이드는 LX-2와 간세포주 HepaRG로 구성된 공배양 스페로이드에 비해 간섬유화 마커인 평활근 액틴 알파(α-SMA), 1형 콜라겐(Col-1A1), TIMP-1, TIMP-2 및 피브로넥틴(fibronectin)의 발현에서 TGF-β1 투여에 따른 증가된 발현도의 차이를 보였다(도 13a). 이는, 본 발명의 K-HSC가 LX-2에 비해 TGF-β1 민감도가 전반적으로 높다는 것을 의미한다.
또한, 간세포의 분화 마커인 HNF4a, 알부민(albumin), CYP2B6와 CYP3A4의 효소 발현이 TGF-β1을 투여하지 않은 대조군에서 상대적으로 높은 상태로 유지되는 것을 확인하였으며, 담관세포 분화 마커인 CK19도 높은 발현 정도를 나타내는 것을 확인하였다(도 13b). 이는, 본 발명의 K-HSC가 간세포의 분화나 알부민 생성에 직접적인 영향을 미치지 않음을 의미한다.
이를 통해, 상기 K-HSC가 좀 더 생체환경을 근접하게 묘사할 수 있으며, 3차원 배양을 통한 질환모델링에서 좀 더 민감한 반응도를 확보할 수 있음이 확인되었다.
한편, 상기 K-HSC를 간세포주 HepaRG와 1:1 비율로 4% 하이드로젤에 포집 후 3차원 배양하였으며, 섬유화 유도물질인 TGF-β1과 그 저해제 A를 각각 혹은 동시에 투여한 실험군과 투여하지 않은 대조군으로 나누어 18일 배양 후 간 유사체 내 세포 네트워크 형성 및 섬유화 마커의 발현 차이를 확인하였다.
그 결과, 8일간 배양 후 하이드로젤 내 네트워크 형성에 있어서 유의미한 차이를 보였고(도 14a), 간섬유화 마커의 발현에서는 평활근 액틴 알파(α-SMA)와 리실 옥시다제(LOX)를 제외한 모든 마커에서 TGF-β1에 대한 반응성을 확인하였고 저해제 A의 TGF-β1 저해 작용도 확인하였다(도 14b).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> TRANSFORMED HUMAN HEPATIC STELLATE CELL LINE AND USE THEREOF
<130> FPD/202112-0058
<150> KR 10-2020-0186058
<151> 2020-12-29
<160> 30
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNF4alpha Forward Primer
<400> 1
ggccaagtac atcccagctt t 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNF4alpha Reverse Primer
<400> 2
cagcaccagc tcgtcaagg 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Albumin Forward Primer
<400> 3
tttatgcccc ggaactcctt t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Albumin Reverse Primer
<400> 4
agtctctgtt tggcagacga a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vimentin Forward Primer
<400> 5
gagtccactg agtaccggag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vimentin Reverse Primer
<400> 6
acgagccatt tcctccttca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alpha-SMA Forward Primer
<400> 7
gtggctattc cttcgttact 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alpha-SMA Reverse Primer
<400> 8
ggaaacgttc atttccgatg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col-IA1 Forward Primer
<400> 9
attagtaggt gtgctgtgtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col-IA1 Reverse Primer
<400> 10
aagcgtttgc gtagtaattg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOX Forward Primer
<400> 11
gacacatcct gtgactatgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LOX Reverse Primer
<400> 12
ggggtttaca ctgaccttta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIMP1 Forward Primer
<400> 13
gaccacctta taccagcgtt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TIMP1 Reverse Primer
<400> 14
taaacaggga aacactgtgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFRbeta Forward Primer
<400> 15
cctcttggat atgccttacc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFRbeta Reverse Primer
<400> 16
cagctcagca aattgtagtg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col-4A1 Forward Primer
<400> 17
attagtaggt gtgctgtgtg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Col-4A1 Reverse Primer
<400> 18
aagcgtttgc gtagtaattg 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LamB1 Forward Primer
<400> 19
gagaggtgat atttcgtgct 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LamB1 Reverse Primer
<400> 20
cagaagcaat ttcctcgaac 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN Forward Primer
<400> 21
agtttcccat tatgccgttg 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FN Reverse Primer
<400> 22
tcccaagaca tgtgcagctc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA2 Forward Primer
<400> 23
ggccaggtca ttatctacag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA2 Reverse Primer
<400> 24
ggttccaggc tcatttgata 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGB1 Forward Primer
<400> 25
agagctgaag actatcccat 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGB1 Reverse Primer
<400> 26
gtgttgtgct aatgtaaggc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP3A4 Forward Primer
<400> 27
ttttgtccta ccataagggc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CYP3A4 Reverse Primer
<400> 28
cataaatccc actggaccaa 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CK-19 Forward Primer
<400> 29
agcatgaaag ctgccttgga 20
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CK-19 Reverse Primer
<400> 30
cctgattctg ccgctcacta tc 22
Claims (16)
- hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 및 SV40 대형 T-항원(SV40 large T-antigen) 유전자가 도입되고, 혈소판 유래 증식 인자 수용체 베타(PDGFR-β) 마커 발현에 대해 양성을 나타내는, 형질전환된 인간 간성상세포주.
- 제1항에 있어서,
상기 간성상세포주는 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA)가 과발현된 것인, 형질전환된 인간 간성상세포주. - 제1항에 있어서,
상기 간성상세포주는 증가된 간성상세포 마커 발현을 나타내는 것인, 형질전환된 인간 간성상세포주. - 제3항에 있어서,
상기 간성상세포 마커는 평활근 액틴 알파(smooth muscle actin alpha, α-SMA), 리실 옥시다제(LOX), 매트릭스 메탈로프로테이나제의 조직 저해제 1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP1) 및 혈소판 유래 증식 인자 베타(PDGFR-β)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 형질전환된 인간 간성상세포주. - 제3항에 있어서,
상기 증가된 간성상세포 마커 발현의 수준은, LX-2 세포주의 간성상세포 마커 발현 수준을 1로 했을 때 1.5 이상인, 형질전환된 인간 간성상세포주. - 제3항에 있어서,
상기 간성상세포주는 콜라겐 타입 IV 알파 1(Col-4A1), 콜라겐 타입 IV 알파 3(Col-4A3), 라미닌 서브유닛 베타 1(LamB1), 피브로넥틴(FN), 인테그린 서브유닛 알파 2(ITGA2) 및 인테그린 서브유닛 베타 1(ITGB1)으로부터 선택된 하나 이상의 세포외기질 마커의 증가된 발현을 나타내는 것인, 형질전환된 인간 간성상세포주. - 제1항에 있어서,
상기 간성상세포주가 간 섬유화 활성을 나타내는, 형질전환된 인간 간성상세포주. - 제1항에 따른 형질전환된 인간 간성상세포주 및 간세포를 포함하는 인공 간 구조체 제조를 위한 세포 조성물.
- 제8항에 있어서,
상기 간세포는 1차 인간 간세포, 불멸화된 간세포주, 또는 줄기세포 유래 간세포인, 세포 조성물. - 제8항에 따른 세포 조성물을 배양하여 제조된 간 스페로이드.
- 제8항에 따른 세포 조성물을 스캐폴드와 함께 배양하여 제조된 인공 간 구조체.
- 제11항에 있어서,
상기 스캐폴드가 폴리에틸렌글라이콜-함유 하이드로젤, 피브린젤 또는 바이오실크인, 인공 간 구조체. - 제1항에 따른 형질전환된 인간 간성상세포주 및 간세포를 3차원 공배양하는 것을 포함하는, 간 섬유화 모델을 제조하는 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 간세포는 1차 인간 간세포, 불멸화된 간세포주, 또는 줄기세포 유래 간세포인, 간 섬유화 모델을 제조하는 방법. - 제13항에 따른 방법으로 수득된 간 섬유화 모델.
- 제10항에 따른 간 스페로이드 또는 제11항에 따른 인공 간 구조체에 간 섬유화 조절 후보 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 간 섬유화 조절제를 평가하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200186058 | 2020-12-29 | ||
| KR20200186058 | 2020-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220095153A true KR20220095153A (ko) | 2022-07-06 |
Family
ID=82260662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210189870A KR20220095153A (ko) | 2020-12-29 | 2021-12-28 | 형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20220095153A (ko) |
| CA (1) | CA3213112A1 (ko) |
| WO (1) | WO2022145975A1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI294461B (en) * | 2004-12-28 | 2008-03-11 | Ind Tech Res Inst | Cell culture and method for screening for a compound useful in the treatment or prevention of hepatic cirrhosis |
-
2021
- 2021-12-28 CA CA3213112A patent/CA3213112A1/en active Pending
- 2021-12-28 KR KR1020210189870A patent/KR20220095153A/ko not_active Application Discontinuation
- 2021-12-28 WO PCT/KR2021/020054 patent/WO2022145975A1/ko active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3213112A1 (en) | 2022-07-07 |
| WO2022145975A1 (ko) | 2022-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112111444B (zh) | 脐带间充质干细胞重编程为肝脏细胞的方法及所制备的肝脏类器官 | |
| Cai et al. | Myogenic differentiation of primary myoblasts and mesenchymal stromal cells under serum-free conditions on PCL-collagen I-nanoscaffolds | |
| CN101978047A (zh) | 干细胞聚集体及制备和使用方法 | |
| JP6523358B2 (ja) | バイオ人工近位尿細管システム及びその使用方法 | |
| TW201522638A (zh) | 多能性幹細胞的製備方法、使用該製備方法而製備出多能性幹細胞、改善劑、以及該多能性幹細胞之分化誘導方法 | |
| AU2010244121A1 (en) | Lung tissue model | |
| US20210054343A1 (en) | Endocardium-derived adult stem cells and method for producing same | |
| US9969978B2 (en) | Method for producing cardiomyocytes from human or mouse embryonic stem cells in a medium consisting of a serum-free medium and N2 supplement | |
| JP2019033732A (ja) | 立体的肝臓組織構造体及びその製造方法 | |
| WO2012133942A1 (ja) | 生体の臍帯又は脂肪組織から単離できる多能性幹細胞 | |
| EP3384011B1 (en) | Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells | |
| KR20200005345A (ko) | 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법 | |
| WO2011016485A1 (ja) | ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法 | |
| Nazbar et al. | Molecular imprinting as a simple way for the long-term maintenance of the stemness and proliferation potential of adipose-derived stem cells: An in vitro study | |
| AU2009257925A1 (en) | Multipotent stem cell cultures | |
| KR20220095153A (ko) | 형질전환된 인간 간성상세포주 및 이의 용도 | |
| WO2021221179A1 (ja) | ヒト膵癌オルガノイドを用いたマウスモデルの樹立 | |
| TW202227615A (zh) | 心肌幹/前驅細胞之製作方法及心肌纖維化抑制方法 | |
| JP7064189B2 (ja) | 骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または神経細胞に分化可能な前駆細胞、その作製方法、およびその使用方法 | |
| JP2019129707A (ja) | ヒト由来細胞を含むヘテロスフェロイド | |
| JP2007014273A (ja) | 肝組織・臓器及びその製造方法 | |
| JP7191041B2 (ja) | 機能的肝前駆細胞もしくは肝細胞または機能的小腸上皮前駆細胞もしくは小腸上皮細胞を調製する方法 | |
| KR101587231B1 (ko) | 체세포에서 간세포로의 직접교차분화 촉진용 조성물 및 방법 | |
| Hwang et al. | Differentiation of stem cells isolated from rat smooth muscle | |
| Kureel et al. | Soft substrate maintains proliferative and adipogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells on long term expansion by delaying senescence |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |